专利名称：用于节育的药物组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高体外受精(IVF)后的植入率的方法，该方法用于治疗妇女不育症，用于治疗和预防妇女早期妊娠失败，该方法使用一种氧化氮合成酶底物(L-精氨酸)、一种氧化氮原料物质或两者都用，单独或与黄体酮和/或雌激素结合使用。本发明还涉及新的节育方法，该方法是以抑制子宫内膜的接受能力、防止植入和用NOS抑制剂诱发月经为基础的，NOS抑制剂优选iNOS抑制剂，并结合使用黄体酮拮抗剂和/或黄体酮合成酶抑制剂。
背景技术：
人类体外受精是非常不成功的。在美国，每个IVF治疗周期的总出生率约为14％(国际医学辅助生殖技术研究会(SART)，美国生育学会(1992)，《生育与不育》515)，在英国，这个数字为12.5％(《人类受精与胚胎学权威年报》，伦敦1992)。
当同时转移一个以上的胚胎时，成功率会更高一些。不过，多个胚胎的同时转移提高了多胎妊娠的发生率和流产与早产的可能性。IVF后妊娠率低的原因尚不完全为人所知。胚胎与子宫环境的质量影响着成功率。一般来说，处于生育周期的妇女自发的早期流产率较高。自然怀孕后，多达50-60％可能性的早期妊娠是失败的(Winston ML，Handyside AH(1993)，“人类体外受精所面临的新的挑战”，《科学》260932-935)。这可归因于胚胎转移时的孕体异常和发生在胚胎与子宫内膜之间的不同步。
既然IVF后胚胎转移的成功率降低而授精后的时间增加，因此大多数妊娠失败都可归因于孕体异常或培养条件不适(Winston ML，Handyside AH(1993)，“人类体外受精所面临的新的挑战”，《科学》260932-935)。
为了克服培养介质中可能存在的不足，已经在具有完整输卵管的妇女体内直接将卵母细胞或受精卵转移至输卵管(配子的输卵管内转移-GIFT或受精卵的输卵管内转移-ZIFT)。不过，这些努力仅仅稍微提高了IVF后的生育力和出生率(Edwards RG(1995)， “人类植入法过程中提高子宫接受能力的临床方法”，《人类繁殖》10增刊360-67)。
子宫环境对IVF后生育率的作用同样重要。已充分证实，胚胎转移后妊娠成功的确定既需要健康的胚泡，也需要具有接受能力的子宫。转移至一个易感性不足的子宫中的胚胎是不可能植入的。在所有哺乳动物中，子宫内膜仅在排卵后的特定时间阶段对植入具有接受能力。该黄体期被称为“植入窗”。就妇女而言，仅在组织学上定义的28天周期中的第15-20天之间、也就是在黄体酮水平最高的阶段，植入才能成功(Navot D，Scott RT，Droesch KD，Veeck LL，Hung Ching Liu，Rosenvaks Z(1991)，“胚胎转移的窗口与人类体外受孕的效率”，《生育与不育》55114-118)。植入所需的最佳条件确定为正常周期的第20-22天，即LH波动后7天(Bergh PA，Navot D(1992)，“胚胎发育与子宫内膜成熟对植入时机的影响”，《生育与不育》58537-542)。
子宫内膜具有足够的黄体酮易感性对成功的植入来说是必要的，因此在黄体期用一种抗孕酮处理将会完全防止植入(Chwalisz K，Stckemann K，Fuhrmann U，Fritzemeier KH，Einspanier A，GarfieldRE(1995)，“妊娠子宫中抗孕酮的作用机制”，Henderson D，PhilibertD，Roy AK，Teutsch G(eds)，“类固醇受体和抗激素”，《纽约科学会年鉴》761202-224)。在生育周期中，黄体酮调节受精卵通过输卵管的转运，诱发植入子宫内膜所需的分泌改变。哺乳动物中，植入是精确计时的事件。所分泌的子宫内膜蛋白质(Beier HM，Elger W，Hegele-Hartung C，Mootz U，Beier-Hellwig K(1992)，“人类植入法中黄体、子宫内膜和胚泡的分化研究”，《生育与繁殖杂志》92511-523)，可能还有其他细胞内及细胞表面的蛋白质，如子宫内膜上皮细胞受黄体酮刺激而产生的整联蛋白、细胞因子和生长因子，是实施植入法所必需的(Edwards RG(1995)，“人类植入法的生理与分子面面观”，《人类繁殖》10增刊21-14)。
以前，胚胎发育与子宫内膜发育之间的不同步性被认为是可能引起IVF后植入失败的原因之一(Beier HM，Elger W，Hegele-Hartung C，Mootz U，Beier-Hellwig K(1992)，“人类植入法中黄体、子宫内膜和胚泡的分化研究”，《生育与繁殖杂志》92511-523)。不过，迄今尚不能得到提高植入率的有效方法。人类植入法最先进的阶段的特征在于滋养层细胞侵入蜕膜和血管生成(Loke YW，King A(1995)，“人类植入法”，《细胞生物学与免疫学》，剑桥大学出版社)。由于黄体酮拮抗剂也干扰早期妊娠，该阶段也是依赖于黄体酮的(Chwalisz K，Stckemann K，Fuhrmann U，Fritzemeier KH，Einspanier A，GarfieldRE(1995)，“妊娠子宫中抗孕酮的作用机制”，Henderson D，PhilibertD，Roy AK，Teutsch G(eds)，“类固醇受体和抗激素”，《纽约科学会年鉴》761202-224)。在早期妊娠过程中，足够的血液流向子宫对胚胎发育来说是必要的。流向子宫的血液不足会危及妊娠(EdwardsRG(1995)，“人类植入法过程中提高子宫接受能力的临床方法”，《人类繁殖》10增刊360-67)。向血流不畅的患者给予阿斯匹林以改善血流。小剂量的阿斯匹林被认为可提高前列环素与凝血噁烷A2的比例，藉此提高胎盘的灌流。不过，阿斯匹林对子宫血流的作用仅仅是次要的(Goswamy RK，Williams G，Steptoe PC(1988)，“子宫灌流降低-不育症的一个原因”，《人类繁殖》3955-959；Wada I，Hsu CC；Williams G，Macnamee MC，Brinsden PR(1994)，“子宫灌流不足的妇女在辅助怀孕过程中进行小剂量阿斯匹林疗法的好处”，《人类繁殖》91954-1957)。
有进一步改进避孕方法的需要。对于进一步减少避孕药的每月总剂量和摄入频率应当给予特别关注。近十年来，有人建议了用抗孕酮节育的几种可能性，这些方法是以在性交后或黄体初期处理后抑制排卵或防止植入为基础的(Spitz IM，Bardin CV(1993)，“RU 486-一种抗孕酮和抗糖皮质激素的临床药理学”，《避孕》48403-444)。不过，只有在性交后用米非司酮处理(Glasier A，Thong KJ，Dewar M，Mackie M，Baird DT(1992)，“米非司酮(RU 486)与大剂量雌激素及孕激素用于性交后紧急避孕的比较”，《新英格兰医学杂志》3271041-4)和在黄体初期LH+2给药(Gemzell-Danielsson K，Westlund P，Johannisson E，Swahn ML，Bygdeman M，Sepp l(1966)，“每周小剂量的米非司酮对卵巢功能和子宫内膜发育的作用”，《人类繁殖》11256-264)已被证实对妇女有效。这些方法中米非司酮的避孕作用很可能是由其对子宫内膜的作用所产生的。性交后用米非司酮处理的方法只能偶尔使用，否则会干扰排卵和诱发闭经。在LH+2时使用米非司酮尤其不方便，因为在每个周期中都必须对LH波动进行判断。可得到的关于抗孕酮的数据建议，有可能研制出一种诱发月经和避孕的每月服用一次的药丸。这样一种方法能用于紧急情况，但也可用于平时。性交后立即给以抗孕酮RU 486，发现其对植入的抑制是高效的(Glasier A，Thong KJ，Dewar M，Mackie M，Baird DT(1992)，“米非司酮(RU 486)与大剂量雌激素及孕激素用于性交后紧急避孕的比较”，《新英格兰医学杂志》3271041-4)。不过，作为一种每月服用一次的避孕药，在黄体后期单独给以RU 486(即，不给以前列腺素)并不有效中止妊娠(Couzinet B，le Strat N，Silvestre L，Schaison G.(1990)，“对正常妇女在黄体后期给以抗黄体酮RU 486对月经周期和节育的影响的长期研究”，《生育与不育》541039-1044)。不考虑剂量的话，单用RU 486中止妊娠的功效在停经后10天内约为80-85％，在闭经的56天内约为65％，在之后的抗妊娠阶段小于40％(Van LookPFA，Bygdeman M(1989)，“抗妊娠类固醇人节育的新尺度”，《牛津生殖生物学评论》111-60)。对闭经7周或不到7周的妊娠妇女给以RU 486诱发了65-85％治疗者的完全流产。不过，前列腺素的加入使功效提高到95％以上(Van Look PFA，BygdemanM(1989)，“抗妊娠类固醇人节育的新尺度”，《牛津生殖生物学评论》111-60，Aubeny E，Baulieu EE(1991)，“RU 486和口服活性前列腺素结合使用的抗妊娠活性，《Comptes Rendus deL’Academie des Science》312539-45)。这些研究表明，另外采用前列腺素治疗提高了抗孕酮中止稍后阶段的妊娠的功效。不过，在早期妊娠过程中、即闭经的第一周内是否也能达到同样的协同作用尚不清楚。此外，已知前列腺素可诱发胃肠道副作用，这在避孕的规则用药中是不能接受的。
最近，最令人激动的生物学与医学进展之一是发现内皮细胞产生氧化氮，而且该氧化氮参与调节血管状况、血小板的聚集作用、神经传递和免疫的激活作用。氧化氮是一种重要的肌肉平滑肌的松弛介质，以前被认为是EDRF(内皮产生的松弛因子)(Furchgott RF和ZawadzkiJV(1980)，“内皮细胞通过乙酰胆碱在松弛动脉平滑肌中的必不可少的作用”，《自然》288373-376；Moncada S，Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药理学评论》43109-142)。在至少三种不同异构体的含核黄素的酶、氧化氮合成酶的作用下，通过L-精氨酸的胍基氮的氧化脱氨基作用合成氧化氮(Moncada S，Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药理学评论》43109-142)。已表明，下列L-精氨酸类似物竞争性抑制氧化氮的合成NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、NG-单乙基-L-精氨酸(LMMA)、N-亚氨乙基-L-鸟氨酸(L-NIO)、L-单甲基-L-精氨酸(L-NNMA)、L-NG-甲基精氨酸(LNMA)和Nw-硝基-L-精氨酸(L-NA)。
氧化氮升高血管平滑肌内cGMP(单磷酸1，4，5-环鸟苷)的水平，从而产生松弛作用和降低血管紧张(Moncada S，Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药理学评论》43109-142)。这些化合物被认为是氧化氮。现在将硝基血管舒张剂归属于氧化氮原料物质类，因为它们被代谢或自发释放出氧化氮(Moncada S，Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药理学评论》43109-142)。长期使用的硝基血管舒张剂可被认为是失败的生理学机制的替代疗法。氧化氮也可由巨噬细胞和其他免疫细胞产生。
已分离鉴定出三种密切相关的NOS酶。它们包括内皮NOS(e-NOS，III型)、神经元NOS(n-NOS，II型)和可诱导NOS(i-NOS，I型)(Knowles RG和Moncada S(1994)，“哺乳动物中的氧化氮合成酶”，《生物化学杂志》298249-258；Sessa WC.(1994)，“氧化氮合成酶类蛋白质”，《血管研究杂志》1994；31131-143；Nathan C(1992)，“作为哺乳动物细胞分泌产物的氧化氮”，《美国实验生物学会联合会会志》(FASEBJ)6301-3064)。结构异构体e-NOS和b-NOS最初分别在内皮组织和神经元组织中被鉴别，它们在碱性条件下迅速、短暂地产生少量NO。i-NOS异构体是可被细胞因子或内毒素(LPS)诱导的，它以与Ca2+无关的方式数小时或数天产生大量的NO。在碱性条件下，细胞在表达iNOS时并不产生NO。e-NOS形式的酶在内皮细胞、心肌细胞、血小板和某些神经元中表达。e-NOS产生的NO是最重要的血管舒张剂。它以较低水平释放，保持恒定的血管舒张和正常的血压。n-NOS被认为起到神经递质的作用。它被认为在参与实现胃肠道能动性和阴茎勃起等功能中起到重要作用。
动物实验得出的一个具体证据表明，氧化氮的缺乏是大量疾病的病机，如高血压、动脉硬化症和糖尿病(Moncada S，Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药理学评论》43109-142)。最近的多项研究表明，抑制氧化氮合成酶会急骤地升高血压。用氧化氮合成酶抑制剂对妊娠大鼠和豚鼠给药，产生与惊厥前期相同的症状(Chwalisz K和Garfield RE(1994)，“黄体酮在妊娠过程中的作用分娩和惊厥前期的模型”，《Z.Geburtsh.u.Perinat》198170-180)。惊厥前期的特征在于血压及外周血管阻力升高、胎儿生长迟缓、蛋白尿和浮肿。在人类中，组织病理学与临床的证据(胎儿生长迟缓、胎儿死亡)说明，胎盘灌流降低是惊厥前期中观察到的最早和最主要的一致性改变(Roberts JM和RedmanCWG(1993)，“惊厥前期不仅仅是妊娠诱发的高血压”，3411447-1451；Friedman EA(1988)，“惊厥前期前列腺素的作用评论”，《妇产科学》71122-137)。
L-精氨酸-NO系统存在于子宫中(Garfield RE和YallampalliC(1993)，“子宫肌层收缩性的调节与分娩”，《足月与提前出生调节的基本机制》，K.Chwalisz，RE Garfield编，纽约Springer-Verlag出版公司，pp.1-29；Chwalisz K和Garfield RE(1994)，“在诱发分娩中的抗孕酮”，《纽约科学会年鉴》734387-413；BuhimschiI，Yallampalli C，Dong Y-L和Garfield RE(1995)，“氧化氮-单磷酸环鸟苷参与调节妊娠期人子宫收缩性”，《美国妇产科学杂志》1721577-1584；Sladek SM，Regenstrin AC，Lykins D等(1993)，“妊娠兔子宫中氧化氮合成酶的活性在妊娠的最后一天降低”，《美国妇产科学杂志》1691285-1291)。该系统在调节子宫收缩性、维持妊娠、引发分娩以及胎儿灌流中扮演重要角色。L-精氨酸和硝酸引起接近妊娠期中期的大鼠子宫磨带(uterine strips)自发活性的快速和真正的松弛(BuhimschiI，Yallampalli C，Dong Y-L和Garfield RE(1995)，“氧化氮-单磷酸环鸟苷参与调节妊娠期人子宫收缩性”，《美国妇产科学杂志》1721577-1584；Garfield RE和YallampalliC(1993)，“子宫肌层收缩性的调节与分娩”，《足月与提前出生调节的基本机制》，K.Chwalisz，RE Garfield编，纽约Springer-Verlag出版公司，pp.1-29；Sladek SM，Regenstrin AC，Lykins D等(1993)，“妊娠兔子宫中氧化氮合成酶的活性在妊娠的最后一天降低”，《美国妇产科学杂志》1691285-1291；Natuzzi ES，Ursell PC，Harrison M.等(1993)，“妊娠子宫中氧化氮合成酶的活性在分娩时降低”，《生物化学生物物理学研究通讯》194108-114；JenningsRW，MacGillvray TE和Harrison MR.(1995)，“氧化氮抑制恒河猴提前分娩”，《J Mat Fet Med》2170-175)。
使用单克隆抗体，用免疫印迹法研究大鼠子宫中NOS酶的表达。在子宫(子宫肌层)中检测到了i-NOS和e-NOS。处于足月和早产的动物在分娩过程中，子宫内的子宫i-NOS酶降低。而在子宫颈中观察到了相反的变化(BuhimschiI，Ali M，Jain V，Chwalisz K和GarfieldRE(1996)，“妊娠和分娩过程中氧化氮在子宫和子宫颈中的不同调节作用”，《Human Reproduction(人类繁殖)》(印刷中))。
NOS也存在于胎盘组织和子宫动脉中。利用免疫及组织化学的方法，对妊娠豚鼠体内滋养层侵入与NO合成酶异构体表达有关的子宫胎盘动脉，和动脉扩张术进行了对比研究。所宣称的子宫胎盘动脉扩张开始于妊娠中期，直至妊娠结束(Nanaev A，Chwalisz K，Frank H-G，Kohnen G，Hartung C-H和Kaufmann P(1995)，“豚鼠子宫胎盘动脉的生理学扩张取决于绒毛外滋养层(extravillous prophoblast)的氧化氮合成酶活性”，《细胞组织研究》282407-421)。这项研究证明，若在血管附近发现有共同表达内皮及巨噬细胞氧化氮合成酶(eNOS及iNOS)的将要侵入的滋养层细胞，也就是说在滋养层侵入动脉壁之前，即可以看到子宫胎盘动脉的扩张。Conrad等(1993)将NOS定位于人胎盘的合胞体滋养层(syncythiotrophoblast)细胞中(Conrad KP，Vill M，Mcguire PG，Dail WG，Davis AK(1993)，“人胎盘绒毛中通过合胞体滋养层的氧化氮合成酶的表达”，《美国实验生物学会联合会会志》71269-1276)。Morris等(1993)证实了人胎盘绒毛和基板中钙依赖型与钙独立型活性(Morris NH，Sooranna SR，Eaton BM，SteerPJ(1993)，“血压正常的妊娠妇女胎盘床与组织中的NO合成酶活性”，《柳叶刀》342679-680)，Myatt等(1993)说明了胎盘绒毛树合成了NOS的钙依赖型异构体(Myatt L，Brockman DE，Langdon G，Pollock JS(1993)，“人胎盘绒毛血管树中氧化氮合成酶的钙依赖型结构异构体”，《胎盘》14373-383；Myatt L，Brockman DE，EisAL，Pollock JS(1993)，“人胎盘中氧化氮合成酶的免疫组织化学定位”，《胎盘》14487-495)。此外，Buttery等(1994)说明了足孕的内皮NOS局限在脐带动脉及静脉内皮中和胎盘合胞体滋养层中(Buttery LDK，McCarthy A，Springall A等(1994)，“人胎盘中的内皮氧化氮合成酶在胎儿-母体界面的区域分布和建议的调节作用”，《胎盘》15257-267)。而且，Moorhead等(1995)已说明，NADPH心肌黄酶(非特异性反应鉴别氧化氮合成酶)在妊娠早期以各种子宫成分存在(Moorhead CS，Lawhun M，Nieder GL(1995)，“妊娠前半阶段和人工诱导的蜕膜细胞反应过程中NADPH心肌黄酶在小鼠子宫中的定位”，《组织化学细胞化学杂志》431053-1060)。最后，Toth等(1995)证实，NOS活性存在于处于妊娠首三月的人胎盘匀浆中(Toth M，Kukor Z，Romero R，Hertelendy F(1995)，“妊娠首三月的人胎盘中的氧化氮合成酶特征化鉴定和亚细胞分布”，《高血压妊娠》14/3287-300)。
这些结果表明，在妊娠过程中，氧化氮是调节胎盘血流和子宫肌层静止期的重要因素。不过，迄今尚没有公开的研究证明，IVF后或早期妊娠失败的妇女中，NOS抑制对植入的有害作用或者是氧化氮原料物质或底物对植入的有益作用。相反，Haddad等(1995)提出，氧化氮的生成量增加与小鼠早期胚胎丧失有关，iNOS抑制剂可用于治疗早期流产(Haddad EK，Duclos AJ，Baines MG(1995)，“早期胚胎丧失与蜕膜单核细胞局部产生氧化氮有关”，《实验医学杂志》1821143-51)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于提高IVF后植入率的方法，该方法包括将一种氧化氮底物和/或原料物质对哺乳动物给药。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和预防不育症或早期妊娠失败的方法，该方法包括将一种氧化氮底物和/或原料物质对早期妊娠的哺乳动物给药。
本发明的进一步目的是提供一种用于提高植入率、治疗和预防不育症或早期妊娠失败的方法，该方法包括将一种氧化氮底物和/或原料物质给药，其中该氧化氮底物和/或原料物质结合使用黄体酮或一种孕激素试剂。
本发明的另一个目的是提供一种用于雌性哺乳动物提高植入率、治疗和预防不育症或早期妊娠失败的方法，该方法中将一种孕激素试剂与一种雌激素试剂结合一种氧化氮底物和/或氧化氮原料物质给药。
本发明的另一个目的是提供一种节育方法，该方法包括将抗孕酮(例如米非司酮、ORG31710、ORG33628、J867、CDB2914、ZK137316)和/或黄体酮合成酶抑制剂(例如环氧司坦、曲洛司坦)结合一种氧化氮合成酶抑制剂给药。
本发明的另一个目的是提供一种节育方法，该方法包括将一种抗孕酮和/或黄体酮合成酶抑制剂结合一种氧化氮合成酶抑制剂给药，用于每月一次的避孕。
本发明的另一个目的是提供一种节育方法，该方法包括将一种抗孕酮结合一种氧化氮合成酶抑制剂给药，用于中止早期妊娠。
进一步的目的是提供了用于实施本发明方法的药物组合物。在研究了本说明书和所附权利要求书的基础上，本发明的进一步目的和优点对本领域的技术人员来说将变得显而易见。
发明概述以一种方法的方式，本发明涉及一种提高IVF后植入率或治疗早期妊娠失败的方法，该方法包括将一种氧化氮底物和一种氧化氮原料物质之一或两者单独或仅结合黄体酮或进一步结合雌激素，以有效改善症状的量对有症状表现的个体给药，通过升高女性血液循环中的L-精氨酸的血液浓度，该氧化氮合成酶底物和氧化氮原料物质或两者的量足以有效提高植入率和出生率，组合物对该女性的给药量为高出正常的50至1000微摩尔循环浓度至少10至500微摩尔，或者将氧化氮原料物质浓度升高至约10nM至100μM(微摩尔)，孕激素试剂的给药量为10-300mg注射黄体酮的生物当量，雌激素的给药量为每天约2mg雌二醇(戊酸雌二醇R，Schering)的生物当量。
以一种方法的方式，本发明涉及一种节育方法，该方法包括将一种氧化氮抑制剂和一种抗孕酮单独或结合一种黄体酮合成酶抑制剂对雌性哺乳动物给药。该节育方法的一种实施方式是在植入前进行。氧化氮抑制剂优选为iNOS抑制剂，可结合一种抗孕酮用于在排卵周期附近抑制给药后植入(LH峰+/-4天)，作为紧急避孕法(即，在没有采取防护措施的性交后72小时内)，用连续的每天处理的方式用于抑制子宫内膜的接受能力，用每周一次的处理方式用于抑制子宫内膜的接受能力，用于诱发月经(即，生育周期中闭经的第一周内)，或用于诱发每28+/-3天一次规则的月经。
以一种产品的方式，本发明涉及一种药物组合物，该组合物含有至少一种氧化氮合成酶底物(L-精氨酸)和一种氧化氮原料物质(例如硝普钠或三硝酸甘油)，单用或进一步结合一或多种黄体酮/孕酮和/或雌二醇/雌激素，每单位剂量中该氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物质或两者的量相当于将循环中的L-精氨酸血液浓度升高至高出正常的50至1000μM循环浓度至少10至500μM，或者将氧化氮原料物质浓度升高至约10nM至100μM，雌激素的量为约2mg雌二醇(例如戊酸雌二醇R，Schering)的生物当量，黄体酮的量为5至300mg注射黄体酮的生物当量。
以一种产品的方式，本发明涉及一种药物组合物，该组合物含有至少一种有效剂量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂(例如L-NMMA、L-NIO、L-NIL、氨基胍、AMT、4-甲基-2-氨基吡啶(piridine)、6，4-二甲基-2-氨基吡啶或2-氨基吡啶)，结合单独一种抗孕酮或/和进一步结合一种黄体酮合成酶抑制剂。
公开内容详述本发明的方法提高了表现出其症状的妊娠女性IVF后植入率和出生率，治疗早期妊娠失败。
氧化氮合成不足或低于正常以下，使子宫对胎体的血液供应不足，这会产生或加重植入率降低及出生率降低和早期妊娠失败，因此，氧化氮合成酶底物、例如L-精氨酸，和氧化氮原料物质、例如硝普钠、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、单硝酸异山梨酯、二硝酸异山梨酯和二乙撑三胺/NO(DETA/NO)，可用于改善症状，本发明方法的一个方面即是这两种物质的组合使用。
若将一种孕激素试剂和/或雌激素试剂与氧化氮底物和/或氧化氮原料物质同时给药，会实现附加的作用。在雌性哺乳动物的情况下，孕激素试剂可以与雌激素同时给药或代替雌激素给药。
因此，本发明的方法方式和本发明的药物组合物方式使用了氧化氮底物和氧化氮原料物质之一或两者都使用了，以及可选的一或多种雌激素(例如戊酸雌二醇R，Schering)或孕酮(例如黄体酮或羟基黄体酮己酸酯(己酸羟孕酮RDepot)等)。
在本发明有关节育的方法方式中，若将一种黄体酮受体拮抗剂(抗孕酮)和/或一种黄体酮合成酶抑制剂与一种氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂同时给药，会实现协同或附加作用。
典型NO-底物和NO-原料物质的(口服)剂量范围实例为总剂量L-精氨酸 500mg-10g口服硝普钠 500-2000μg/kg/天硝酸甘油 0.5-10mg单硝酸异山梨酯 10-100mg二硝酸异山梨酯 10-100mg能与氧化氮底物和/或氧化氮原料物质同时给药的活性试剂的组合实例为下列雌激素与孕酮，以及雌激素与孕酮活性试剂和氧化氮底物或原料物质的典型的口服剂量范围。
雌激素每日剂量的生物当量约为每天1至2mg，例如，马雌激素(Premarin)R，Wyeth-Ayerst，0.625mg/天，雌二醇25-100μg/天，透皮或阴道给药的雌二醇凝胶或乳膏。
孕酮每日剂量的生物当量约为50-300mg黄体酮/天，例如，己酸羟基黄体酮肌肉注射，使其每周剂量为100-1000mg，或者以片剂或糖衣丸给药，提供微粉化黄体酮的有效口服剂量，或者以黄体酮的阴道凝胶给药，每日剂量为2-300mg/天。
下面列出孕酮的实例产品 组成 剂量己酸羟孕酮RDepot(Schering) 己酸羟基黄体酮250-1000mg/周肌肉注射黄体酮-Depot(Jenapharm)己酸羟基黄体酮 250-1000mg/周肌肉注射下面列出雌激素的实例产品 组成剂量Climaval(Sandoz) 戊酸雌二醇 0.5-4mg戊酸雌二醇(Schering) 戊酸雌二醇 0.5-4mg下面列出抗孕酮的实例11β-[4-N，N-(二甲氨基)苯基]-17a-羟基-17β-(3-羟丙基)-13a-甲基-4，9(10)-甾二烯-3-酮，11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17a-(3-羟基丙-1(Z)-烯基)-4，9(10)-雌二烯-3-酮(EP-A 0 190 759)，11β，19-[4-(氰基苯基)-o-亚苯基]-17b-羟基-17a-(3-羟基丙-1(Z)-烯基)-4-雄烯-3-酮(WO-A 93/23020)，11β，19-[4-(3-吡啶基)-o-亚苯基]-17β-羟基-17a-(3-羟基丙-1(Z)-烯基)-4-雄烯-3-酮(WO-A 93/23020)。
下面列出iNOS抑制剂的实例剂量L-NMMA(NG-单甲基-L-精氨酸) 1-1000mg/天L-NIO(L-N5-(1-亚氨乙基)鸟氨酸) 1-1000mg/天L-NIL(L-N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸) 1-1000mg/天氨基胍 1-1000mg/天AMT(2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4H-1，3-噻嗪)(Abbott)0.1-100mg/天4-甲基-2-氨基吡啶0.1-100mg/天6，4-二甲基-2-氨基吡啶 0.1-100mg/天2-氨基吡啶 0.1-100mg/天本发明所用的药理活性试剂可与常规赋形剂混合后给药，也就是药学上可接受的液体、半液体或固体的有机或无机载体，例如适用于胃肠外或肠内用药的载体，它们不和与它们混合的活性化合物发生有害的反应。适用的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯及二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
可对药物制剂进行灭菌，如果需要的话与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或芳香物质及诸如此类，这些助剂不与活性化合物发生有害的反应。
就胃肠外用药而言，特别适用的是溶液，优选油溶液或水溶液，以及悬液、乳剂或植入剂，包括栓剂、透皮贴剂、和阴道凝胶、乳膏和泡沫。安瓿对单位剂量来说是方便的。
本发明组合物优选的方式是适合于摄取的形式。
就肠内用药而言，特别适用的是单位剂型，例如片剂、糖衣丸或胶囊，含有滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂或诸如此类，载体优选为乳糖和/或玉米淀粉和/或马铃薯淀粉；固体微粒剂，例如胶囊；液体和半液体剂型，例如糖浆和酏剂或诸如此类，其中使用一种具有甜味的赋形剂。可配制成持续释放的组合物，其中将活性化合物用降解程度有差异的包衣保护起来，例如通过微囊法、多层包衣法等。
其中尤其适用于口服给药的是片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂、颗粒剂、悬液和溶液。每单位剂量、例如每羹匙液体或每片或每糖衣丸，含有例如5-5000mg的每种活性试剂。
其中尤其适用于透皮用药的是透皮贴剂和凝胶。
用于胃肠外给药的溶液例如含有0.01-1％的每种活性试剂的水溶液或醇溶液。
氧化氮底物和/或原料物质可作为与雌激素和/或孕激素试剂以及任何其他可选的活性试剂的混合物给药，或作为分离的单位剂型彼此同时或在一天中的不同时间给药。
活性试剂的组合的给药方式优选为每天至少一次(除非给药剂型是连续释放活性试剂的)，更优选为每天若干次，例如分2至6次剂量。剂量一般约为每种活性试剂0.5至1000mg，不过某些活性小的试剂、例如L-精氨酸，需要更高的口服剂量，例如500至10000mg，其他的、例如硝普钠，需要较低的剂量，例如500-2000μg/kg/天。硝酸甘油的剂量一般为口服每天2.6mg×2，舌下给药每天0.8mg×1-4，透皮给药0.2-0.5mg/小时。优选的给药方式是透皮给药。由于这些活性试剂的LD50剂量多数是现有技术已知的，开始可以使用较低的剂量疗法，然后升高剂量，直至出现阳性反应，或者开始可以使用较高的剂量疗法，例如处于危险状况，然后随着症状的减缓将剂量向下调整。既可以连续地使用试剂的组合，也可以顺序地使用试剂的组合。
人体中，L-精氨酸与黄体酮(或生物当量的另一种孕酮)的给药比例所产生的血浆浓度应为50-5000微摩尔L-精氨酸、10-100纳摩尔雌二醇和100至1000纳摩尔黄体酮。
氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂，可作为与抗孕酮和/或黄体酮合成酶抑制剂(例如环氧司坦、曲洛司坦)以及任何其他可选的活性试剂的混合物给药，或作为分离的单位剂型彼此同时或在一天中的不同时间给药。
结合附图考虑，将对本发明各种其他目的、特征和伴随的优点有更好的理解和更完全的正确认识，几幅图中相似的参考字母指的是相同或相似的部分内容，其中图1图1表示L-NAME(NOS抑制剂)对大鼠植入的作用。从动物交配后(记为p.c.)第1天至第7天p.c.，以连续的方式皮下输注给以25和50mg/动物/天的L-NAME。在第12天p.c.进行尸体解剖。
图2图2表示L-NAME(NOS抑制剂)对大鼠植入的作用。在第5至7天(p.c.)，以连续的方式皮下输注法给以25和50mg/动物/天的L-NAME。在第9天p.c.或第12天p.c.进行尸体解剖。
图3图3表示单用L-NAME(NOS抑制剂；50mg/动物/天；连续皮下输注法给药)、单用小剂量阿那司酮(onapristone)(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)和L-NAME(50mg/动物/天；连续皮下输注法给药)加小剂量阿那司酮(onapristone)(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)的组合对大鼠植入的作用。动物在第5-8天p.c.、也就是早期植入期间给药。在第9天p.c.进行尸体解剖。注意到病理植入部位(小的血染色的部位)有显著(p＜0.05)增加，而在用L-NAME加onapristone治疗后植入部位的大小和重量均减小了。
图4图4表示如图3所述单用L-NAME(NOS抑制剂；50mg/动物/天；连续皮下输注法给药)、单用小剂量onapristone(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)和结合使用L-NAME(50mg/动物/天；连续输注法皮下给药)加小剂量onapristone(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)治疗的不同组中的黄体酮浓度。
图5图5表示单用L-NAME(NOS抑制剂；50mg/动物/天；连续皮下输注法给药)、单用小剂量onapristone(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)和L-NAME(50mg/动物/天；连续皮下输注法给药)加小剂量onapristone(0.3mg/动物，油注射液皮下给药)的组合对大鼠植入的作用。动物在第1-4天p.c.、也就是在接受前期给药。在第9天p.c.进行尸体解剖。注意到在用L-NAME加onapristone治疗后子宫内膜的接受能力被显著(p＜0.05)抑制了(6/7动物中无植入部位)，而植入部位的大小和重量均明显地地减小了(1/7动物中)。
具体实施例方式
实验1在交配后(p.c.)第1-7天L-NAME对大鼠子宫内膜接受能力和早期植入的作用该实验结果如图1所示，从第1天p.c.直至第7天p.c.、也就是在植入前阶段和早期植入(大鼠体内植入发生在第5天p.c.)过程中，用25和50mg/动物/天的L-NAME治疗妊娠大鼠(n＝6/组)。对照动物给以赋形剂。尸体解剖(第9天p.c.(研究的第1部分)和第12天p.c.(研究的第2部分)；每部分中n＝6/组)过程中，用肉眼确定植入部位，测量其直径，记录分离的植入部位(胚胎和胎盘组织)的重量。
实验2在第5-7天p.c.治疗后L-NAME对大鼠早期植入的作用图2代表妊娠大鼠第二项研究的结果，其中在第5-7天p.c.进行L-NAME治疗(25和50mg/动物/天)，也就是在发生着床后不久。在第12天p.c.进行尸体解剖。将表现为出血改变的植入定义为病理植入部位。从这些结果可以得出的结论是，氧化氮合成酶抑制剂L-NAME对植入具有深刻的影响。对植入部位的大小和重量存在剂量依赖的抑制作用。此外，L-NAME诱发了植入部位的病理改变(主要为出血)。
实验3L-NAME结合小剂量抗孕酮(onapristone)在第5-8天p.c.治疗大鼠后对早期植入的作用该研究的目的是在大鼠早期植入过程中评价氧化氮与黄体酮是否具有相互作用。大鼠(n＝8/组)在第5-8天p.c.接受下列治疗L-NAME(50mg/天，皮下输注法)、堕胎下剂量(皮下0.3mg/天)的onapristone(黄体酮拮抗剂)、L-NAME加当量剂量的onapristone以及赋形剂(对照)。在第9天p.c.除去子宫进行植入部位的形态测定和组织学评价。结果在早期妊娠过程中给药时，L-NAME和小剂量的onapristone均显著(α＝0.05)减小了植入部位的直径和重量(图3)。蜕膜组织的范围在L-NAME和onapristone治疗后也减小了。不过，正常的子宫肌层及抗子宫肌层蜕膜作用得以保持。L-NAME和onapristone的组合显著地减小了植入部位的直径和重量，同时还显著地减小了蜕膜化范围，后者是蜕膜细胞和胚胎的坏死。两种治疗方案对血清黄体酮浓度均没有任何明显影响(图4)，这说明L-NAME加onapristone对植入的作用是一种直接作用的结果。结论NOS的抑制作用不改变子宫内膜的接受能力。不过，当在早期妊娠过程中给药时，NOS的抑制作用与极低剂量的onapristone治疗作用单独削弱了蜕膜化过程，阻碍了植入部位的发育。组合疗法产生协同作用，基本上削弱了植入。
实验4L-NAME结合小剂量抗孕酮(onapristone)在第1-4天p.c.治疗大鼠后对子宫内膜接受能力的作用该研究中，在第1-4天p.c.的接受前期用L-NAME(50mg/动物/天，皮下输注法)结合及不结合小剂量onapristone(0.3mg/动物/天)治疗妊娠大鼠(n＝7/组)。在第9天p.c.进行尸体解剖。研究结果见图5。对照动物(n＝7)用赋形剂治疗。在赋形剂对照组中，所有动物(7/7)表现了正常的植入部位。单用L-NAME治疗对子宫内膜接受胚胎植入的能力几乎没有作用，尸体解剖过程中所有动物(7/7)均肉眼可见正常的植入部位。单用onapristone治疗减少了植入部位的数量，大多数动物(5/7)根本没有植入。与之形成对比的是，用L-NAME加onapristone治疗完全防止了6/7动物的植入。其余两只动物(2/7)中，一只动物植入部位在形态学上是正常的，但是它们的大小非常小(图5)。第二只动物的植入部位形态学异常(出血)，且极小。从该研究可以得出结论，若在接受前期给药，L-NAME加onapristone的组合疗法防止了植入(抑制了子宫对胚胎植入的接受能力)。
实验5氧化氮合成酶(NOS)异构体在小鼠植入部位的时空分布该研究的目的是检测在小鼠着床过程中三种主要的NOS异构体(iNOS、ecNOS和bcNOS)存在与否。检查从妊娠第4天中午到第7天中午的植入部位，以确定NOS异构体的存在。将小鼠麻醉，除去植入部位，固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，用标准的免疫组织化学方法进行切片和染色。使用抗iNOS、ecNOS和bcNOS的多克隆抗体(转导实验室)。在所有进行观察的时间点，iNOS在子宫肌层的内层肌肉层与外层肌肉层之间的巨噬细胞和单核细胞中的染色是最明显的。蜕膜也表现出来散布于组织中的阳性染色反应。朝向植入部位，对iNOS呈阳性的细胞增加了。ecNOS在邻近胚胎抗子宫系膜孔的初级蜕膜区的染色在第6和第7天最为突出。在所有时间点，子宫肌层血管也被染色，以及在植入前，腔上皮细胞基部也被染色。特别针对bcNOS的染色主要位于子宫肌层的外层肌肉层，而在子宫系膜内，在所检查的时间框架中染色没有明显的区别。阴性及阳性对照所显示的染色是适当的。结论是这些数据表明，iNOS和ecNOS都提高了小鼠近植入期的表达。
这些研究的结果(既从功能上又从组织化学上)说明，氧化氮在植入过程中起到关键作用。它对整个植入过程中的胎盘灌流来说似乎是重要的。子宫中缺乏氧化氮会导致植入部位的再吸收或自发吸收。因此，单用氧化氮原料物质或底物或者结合一种类固醇激素(黄体酮雌二醇)对提高植入率和治疗不育症及早期妊娠失败将被证明是有效的。而且，氧化氮抑制剂与抗孕酮和/或黄体酮合成酶抑制剂的组合将对防止或干扰妊娠有效。
例1体外受精后用氧化氮底物提高植入率。将L-精氨酸对接受IVF的妇女(50-90kg)给药，在妊娠的头2-6周或更长时间每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。
例2体外受精后用氧化氮原料物质提高植入率。在妊娠的头2-6周或更长时间将硝酸甘油(5-15mg/天)对接受IVF的妇女(50-90kg)透皮给药。
例3用氧化氮底物治疗不育症。将L-精氨酸对不育妇女(50-90kg)给药，每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。
例4用氧化氮原料物质治疗不育症。将硝酸甘油(5-15mg/天)对不育妇女(50-90kg)透皮给药。
例5体外受精后用氧化氮底物结合黄体酮提高植入率。在妊娠的头2-6周或更长时间将透皮给药的硝酸甘油(5-15mg/天)结合黄体酮(己酸羟孕酮RDepot(Schering)250-1000mg/周，肌注)对接受IVF的妇女(50-90kg)给药。
例6用氧化氮底物结合氧化氮底物治疗不育症。将透皮给药的硝酸甘油(5-15mg/天)结合L-精氨酸对不育妇女(50-90kg)给药，每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。
例7体外受精后用氧化氮底物结合黄体酮和雌二醇提高植入率。在妊娠的头2-6周或更长时间将透皮给药的硝酸甘油(5-15mg/天)结合黄体酮(己酸羟孕酮RDepot(Schering)250-1000mg/周，肌注)和戊酸雌二醇酯0.5-4mg/天对不育妇女(50-90kg)给药。
例8性交后用氧化氮合成酶抑制剂结合抗孕酮避孕。在性交后72小时内将0.5-400mg抗孕酮/天(例如米非司酮)结合有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
例9每日给以氧化氮合成酶抑制剂结合抗孕酮进行子宫内膜避孕。将每日剂量不会抑制排卵(例如0.1-1mg/天米非司酮)的抗孕酮结合有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
例10每周一次给以氧化氮合成酶抑制剂结合抗孕酮进行子宫内膜避孕。每周一次将剂量不会抑制排卵(例如5-20mg/周米非司酮)的抗孕酮结合有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
例11用氧化氮合成酶抑制剂结合抗孕酮诱发月经。在月经周期的第28+/-3天将0.5-400mg/天的抗孕酮(例如米非司酮)结合有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
例12用氧化氮合成酶抑制剂结合黄体酮合成酶抑制剂诱发月经。在月经周期的第28+/-3天将1-600mg/天的黄体酮合成酶抑制剂(例如环氧司坦)结合有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
例13用氧化氮合成酶抑制剂结合抗孕酮、进一步结合黄体酮合成酶抑制剂诱发月经。在月经周期的第28+/-3天将0.5-400mg/天的抗孕酮(例如米非司酮)结合1-600mg/天的黄体酮合成酶抑制剂(例如环氧司坦)以及有效量的氧化氮合成酶抑制剂、优选为iNOS抑制剂给药。
通过替换概述或具体描述的试剂和/或本发明用于前述实施例所用的操作条件，可同样成功地重复实施前述实施例。
本领域的技术人员从上述说明可以很容易地确定本发明的必要技术特征，在不背离本发明精神和范围的前提下，可对本发明作出各种变化和修改，使其适合于各种用途和条件。
权利要求
1.下面所述组合物用于制备节育的药物的用途，所述组合物包括氧化氮合成酶抑制剂以及一种抗孕酮。
2.权利要求1的用途，其中抗孕酮是米非司酮、ORG 31710、ORG 33628、J867、CDB 2914或ZK 137316。
3.权利要求1的用途，其中所述药物是用于在性交后施用的。
4.权利要求1的用途，其中NOS抑制剂是L-NMMA、L-NIO、L-NIL、氨基胍、AMT、4-甲基-氨基吡啶、6，4-二甲基-2-氨基吡啶或2-氨基吡啶。
5.权利要求1的用途，其中用于节育的药物组合物含有a)氧化氮抑制剂和b)抗孕酮的混合物。
6.氧化氮合成酶抑制剂结合一种抗孕酮用于制备使不需要妊娠且有妊娠风险的雌性哺乳动物节育的药物的用途。
7.权利要求6的用途，其中抗孕酮是米非司酮、ORG 31710、ORG 33628、J867、CDB 2914或ZK 137316。
8.权利要求6的用途，其中所述药物是在性交后施用的。
全文摘要
提供了一种用于提高雌性哺乳动物植入率和/或妊娠率的方法，该方法包括对需要妊娠的雌性哺乳动物给以有效量的(a)一种氧化氮合成酶底物、一种氧化氮原料物质或两者，可选地结合(b)一种孕酮，和(c)可选进一步结合一种雌激素。也提供了一种用于雌性哺乳动物节育的方法，该方法包括对不需要妊娠且有妊娠风险的雌性哺乳动物给以一种有效量的氧化氮合成酶抑制剂结合一种抗孕酮。也提供了药物组合物。
文档编号A61P5/34GK1679939SQ20051000382
公开日2005年10月12日 申请日期1997年5月7日 优先权日1996年5月7日
发明者K·切瓦斯, R·E·加菲尔德 申请人:舍林股份公司