专利名称：一种具有抗疱疹病毒活性的木豆提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。
背景技术：
木豆(Cajanus cajan)原产于印度，目前全世界种植面积约520万公顷，主要分布在亚洲、非洲和南美洲(赵真忠，2003)。我国栽培木豆主要分布于热带、亚热带地区，即云南、广西、四川、重庆、广东、贵州、海南、福建、湖南、江西、江苏等省区(谷勇等，2000)。
木豆全身是宝，经济、生态价值极高，同时还具有多种显著的药用和保健功效。木豆的药用价值是在我国最早开发利用的，早在《陆川本草》中记载木豆叶“平、淡、有小毒”。《中华药海》中进一步指出木豆叶主治小儿水痘，痛肿。近年来，我国研究木豆中提取、分离有关药用成分的报道较少，主要有中国医学科学院药用植物开发研究所(年度)曾研究木豆叶中的抗消炎成分，得出11种结晶成分(李正红等，2001)，鉴定为牡荆苷、水杨酸、三十一烷、β-谷甾醇、柚皮素-4′，7-二甲醚及β-香树脂醇等。此外，林励(年度)等以抑菌试验指导植物有效成分的提取分离，从海南产木豆叶提取物萃取的乙酸乙酯部分分离和鉴定了6个化合物，牡荆苷，异牡荆苷，芹菜素，木犀草素，柚皮素-4′，7-二甲醚和β-谷甾醇，在这些已知的成分中，具有较高药理活性的植物黄酮类化合物占绝大多数。
近年来对木豆的药理活性方面也有一些研究报道，主要是中药木豆叶对治疗股骨头缺血性坏死有神奇功效。海南省人民医院根据民间经验，用木豆治疗外伤、烧伤感染和褥疮等已经取得了较好的疗效(刘中秋等，1998)。孙绍美等(1995)研究木豆叶有效成分木豆素的药理作用表明木豆素制剂具有明显的抑制毛细血管的通透性、镇痛、消炎作用，毒性小，在有效剂量范围内动物无不良反应，且其抗炎作用强于水杨酸。刘中秋(1998)等在证实木豆的抗菌消炎作用的基础上，以抗炎等药效学为指标，对生脉成骨片中的主药——木豆叶的不同提取物进行筛选，分别用醇提取物、水提取物进行小鼠抗炎作用的药理研究，结果表明，木豆叶水提部分的抗炎作用最强，验证了民间利用木豆叶水煎剂可解毒消肿的功效。虽然关于木豆有效成分的提取和分离工艺有待进一步研究，但是可以肯定的是植物黄酮类化合物在其发挥药理药效活性过程中起了至关重要的作用。
病毒是最小的病原微生物，但病毒的传播最广，是目前世界上发病率最高的传染性疾病之一。在临床上较多的疾病与病毒感染有关。据国外统计资料报道，近3/4的传染病是由病毒引起的，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要针对该病毒的抗病毒药物治疗。
疱疹是由疱疹病毒引起的感染性皮肤病，表现为疼痛或浅感觉障碍，是临床常见病多发病之一，好发于春秋季节。带状疱疹的临床症状虽不是很严重，但有时可引起严重的并发症，且带状疱疹患者因有刺样痛或烧灼痛，而出现紧张、恐惧，心情烦躁、焦虑，常常影响工作和睡眠，因此危害较大。(尚小红，2005；伍伟祯，2004)疱疹病毒分为单纯疱疹、带状疱疹、巨细胞病毒和E-B病毒，该类病毒在人体中可形成潜伏感染，引起不同组织疾病，在一定的环境下反复发作。
单纯疱疹病毒(HSV)分为HSV-1型和HSV-2，近年来进行的深入研究后又发现HSV-6，7，8型。HSV感染是一种全身性疾病，病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破损皮肤进入人体，可潜于人体正常粘膜、血液、唾液以及局部感觉神经节和多数器官内，几乎所有的内脏和粘膜表皮内都可分离到HSV。原发感染主要见于免疫功能低下婴幼儿或严重营养不良或有其它感染的儿童。原发感染消退后，病毒可持续潜居体内。正常人中约有半数以上为本病毒的携带者，可通过口、鼻分泌物而成为传染源，由于HSV在人体中不产生永久免疫力，故每当机体抗病能力减退时，如患某种发热性传染病，胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染、过度疲劳、情绪环境改变时，体内潜伏的HSV即被激发而发病。因而，寻求新的抗疱疹病毒药物成为当务之急。
抗病毒类药物是近年来发展起来的一大类药物，现已成为国内外医药市场上令人瞩目的活跃药品之一。从1975年发现阿糖腺苷，特别是1977年阿昔洛韦(ACV，无环鸟苷)问世后，抗病毒药物才真正起步，尽管如此，目前上市的该类药物只有20余种，仅为抗感染药物的十四分之一左右，且大多有一定的毒副作用或抗病毒效果不明显，难以为病人所认可。
参考文献赵真忠.一种很有发展潜力的热带亚热带植物——木豆.福建热作科技，2003，28(3)31～32谷勇，周榕，邹恒芳等.木豆栽培技术与综合利用.西南林学院学报，2000，20(4)213～217李正红，周朝鸿，谷勇，张建云.中国木豆研究现状及开发前景.林业科学研究，2001，14(6)647～681刘中秋，周华，林励，廖慧芳，周莉玲.生脉成骨片中木豆叶提取工艺研究.中成药.1998，20(3)7～9孙绍美，宋玉梅，刘俭等.木豆素制剂药理作用研究.中草药，1995，26(3)147～148刘中秋，周华，林励，廖慧芳，周莉玲.生脉成骨片中木豆叶提取工艺研究.中成药.1998，20(3)7～9尚小红.针灸治疗带状疱疹概况.2005，25(2)82～84伍伟祯.不同抗病毒药物治疗带状疱疹的成本-效果分析.国际医药卫生导报，2004，10(16)181～182发明内容本发明以木豆茎叶的乙醇提取物为实验材料，首次经实验证实其具有显著的抗疱疹病毒活性，从而为开发这一新的抗病毒新药奠定了化学和生物学基础，并可直接用于开发抗病毒新药。
图1为木豆提取物制备的工艺流程图。LC/MS/MS分析结果表明，该提取物主成分的分子量为200-600，与标准品相对照，确定主要成份为牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、异鼠李素，见附图2-7。图2为木豆样品总离子流图；图3为牡荆苷质谱图(其中431.0为它的分子离子峰)；图4为异牡荆苷质谱图(其中431.5为它的分子离子峰)；图5为木犀草素的质谱图(其中284.7为它的分子离子峰)；图6为芹菜素的质谱图(其中269.2为它的分子离子峰)；图7为山萘酚的质谱图(其中286.3为它的分子离子峰)；图8为异鼠李素的质谱图(其中315.2为它的分子离子峰)；图9为木豆提取物体外抗病毒活性效果及模式分析图。
具体实施例方式
实施例1木豆提取物的制备木豆提取物通过下列步骤得到(见流程图1)将采收的木豆茎叶阴干，粉碎后加入10倍量的65～80％乙醇，加热回流2～5h，提取物通过滤纸过滤，上清液经0.22μm滤膜过滤除菌，按实验要求进行适当稀释。
实施例2木豆提取物细胞毒分析1.细胞培养RC-37(非洲绿猴肾细胞)在含有5％胎牛血清和均为100mg/ml青霉素与链霉素的DMEM单层培养基中生长。细胞融合时传代。细胞置24孔和6孔板上分别进行细胞毒和抗病毒分析。
2.病毒
HSV-1病毒株由德国海德堡大学药学与分子技术学院(IPMB)提供。当RC-37细胞长成单层后接种病毒，将病毒按滴度稀释后加入培养瓶中，放入CO2培养箱中培养，当细胞病变达到90％以上时，放入-20度冰箱内。反复冻融3次后合并。
3.细胞毒分析(1)将细胞置24孔板上，密度为每孔5*104，37℃培养24h。
(2)移去培养基，加入新鲜的含有适当稀释度的木豆乙醇提取物，每浓度10个重复。含1％乙醇而无药物的1ml培养基作为对照。
(3)4d培养后，移去培养基，中性红方法分析。培养基用含40mg/ml的中性红的DMEM代替，37℃培养3h。
(4)移去培养基，用含有0.5％甲醛的1％CaCl2中洗1min。
(5)之后细胞在含有1％乙酸的50％乙醇中溶解，在混合器中培养5min，这样与细胞结合的中性红洗提出。
(6)540nm处测OD，测定吸收的中性红；对照组为100％。
实验结果表明，木豆乙醇提取物的最大无毒浓度为48μg/ml。
实施例3木豆提取物体外抗病毒活性效果1.直接蚀斑分析(1)2*103PFU与不同浓度的木豆醇提物在室温下培养1h。
(2)经处理的系列稀释的病毒的37℃下吸附细胞1h。
(3)弃去残余接种体，感染细胞用含有0.5％甲基纤维素的培养基覆盖，6个重复，37℃培养4d。
(4)单层细胞用10％福尔马林固定。
(5)移走固定液，用1％结晶紫染色，几分钟后，移走结晶紫，水洗一次。查蚀斑数，未处理的细胞为对照。
2.抗病毒模式为了确定抗病毒的模式，分为以下四组(1)预处理病毒用木豆提取物预处理病毒，二者室温下孵育1h，加入到6孔板上，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养4d。
(2)吸附病毒在感染前木豆提取物与病毒共同孵育，并立即加入到6孔板上，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养4d。
(3)病毒复制将病毒直接加到6孔板上，37℃培养1h后，同时加入覆盖培养基和提取物，在培养箱中培养4d。
(4)预处理细胞在病毒感染前用木豆提取物预处理细胞，37℃培养1h后，加入病毒，37℃培养1h后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养4d。
实验结果表明，用木豆提取物预处理HSV-1病毒，抑制率可达100％，高于文献报导；对于吸附阶段、复制阶段和用药物预处理细胞的抑制率分别为43％、9％和8％。所以，木豆提取物对HSV-1病毒有明显的抑制作用，有望成为一种治疗带状疱疹的新药。
本发明的组合物可与药学上可接受的载体或溶剂给药，可通过口服、全身或局部给药。组合物的形式可为液体制剂、固体制剂形式给药；对于局部给药来说，该组合物可以在固体支持物如纱布或海绵上给药，也可以制备成软膏、栓剂或喷剂来局部使用。该组合物还可以以饮料、食品或添加剂的形式服用。
权利要求
1.一种具有抗病毒活性的木豆乙醇提取物。该提取物由65％～80％乙醇加热回流2～5h制得。
2.权利要求1所述的乙醇提取物，其主要成分为分子量200-600之间的牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素、山萘酚、异鼠李素。
3.权利要求2所述的乙醇提取物作为活性剂可与药学上可接受的载体形成组合物。
4.权利要求3所述的药物学上可接受的载体，包括本领域常规使用的溶剂、各种赋形剂、解崩剂等。
5.权利要求3所述的组合物为胶囊、片剂、丸剂、注射液、口服液、冲剂、糖浆、粉剂、颗粒剂、栓剂、软膏、喷剂、饮料、食品或添加剂等形式。
6.施用抑制病毒有效剂量的权利要求3的组合物可以治疗由疱疹病毒引起的病毒感染。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗疱疹病毒活性的木豆乙醇提取物，主要成分为具有较高药理活性的黄酮类化合物，LC/MS/MS测得该提取物主成分的分子量为200－600。该提取物抗疱疹病毒效果明显，是一种开发前景广阔的病毒抑制剂。
文档编号A61P31/22GK1739597SQ20051001017
公开日2006年3月1日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者祖元刚, 付玉杰, 王微, 李庆勇, 候春莲, 张琳, 张莹, 陈丽艳, 刘威 申请人:东北林业大学, 祖元刚