专利名称：人工植入体的抗凝血表面修饰方法
技术领域：
本发明属于抗凝血材料技术领域，涉及一种用硅橡胶涂层作软支撑共价键合多层肝素薄膜修饰人工植入体使其表面具有抗凝血性能的方法。
背景技术：
在小口径动脉血管重建手术中，对动脉假体的血液相容性要求非常高。为了保证术后的长期通畅性，通常要使用自体隐静脉作为动脉假体。但是，当患者无法提供自体隐静脉时，就必须采用人工血管来替代。尽管膨体聚四氟乙烯已成功地应用于较大直径血管的制造，但对于直径小于6mm的血管，由于血液凝结或组织堵塞的原因，这些材料无能为力。虽然在经过不断的改进和修饰后，长期通畅率有一定的提高，但与自体隐静脉相比仍不能获得满意的效果，血液相容性问题还远未解决，给动脉搭桥手术带来一系列问题。小口径动脉假体不仅应具备充分的柔韧性以利于其与动脉血管之间的吻合，还应具备优良的血液相容性，不会引起凝血反应，以保持长期的通畅性。
因为只有人工血管的表面与血液接触，所以目前的工作主要集中在对现有材料表面修饰与改性上，以达到血管植入的要求。通过将肝素分子固定在人工血管的表面上来提高其抗凝血性能的方法一直是研究的热点。早期的研究人员使用4价铵离子来键合肝素，然后通过长的烷基链使离子与聚合物基体络合。离子键合的肝素从表面缓慢溶解下来与抗凝血酶-III(AT-III)在表面附近粘结在一起形成活的抗凝血剂。这种方法适用于短期血液导管，但由于溶解作用，肝素很快耗尽，因此对长期血液导管和人工血管无效。第二种方法是将肝素通过共价键直接连接于基体表面。虽然对于固定化肝素的稳定性而言，通过共价键结合的远较离子键合的高，但就固定化肝素的抗凝血性能来说，一般却正好相反。因为硬连接的肝素不仅降低了人工血管的弹性而且不能与抗凝血酶很好的配合。因此，如何提高共价键合肝素的抗凝血性，同时又不影响材料的本体性能，一直是生物材料肝素化研究的主要内容。研究表明如果使肝素分子与聚合物表面保持一定距离将提高抗凝血性能。此外，为了使固定肝素具有较高的抗凝血性，除了减少固定化对肝素生物活性的影响外，还应该提高材料表面固定化肝素的浓度。
肝素本身具有强的负电荷、亲水性和较多的活性官能团。但是，构成人工血管的聚四氟乙烯等聚合物具有很强的化学惰性和疏水性，不能与肝素分子直接反应。因此，共价结合法的主要步骤是对聚合物材料表面进行化学预处理，使其具有和肝素的反应能力，然后再键合肝素分子。目前虽然存在多种对人工血管预处理的方法，但均存在所需仪器设备昂贵、对材料本体结构有影响、操作工艺复杂等问题，难以广泛使用。
硅橡胶具有优良的弹性、柔软性、耐高热性和耐老化性，可高压蒸气消毒；与人体组织及血液相容，是涂覆人工血管的理想材料。硅橡胶虽有一定的抗凝作用，但其仍难以满足临床要求，必须在硅橡胶涂层的表面上进一步固定肝素分子以提高其抗凝血性能。但是，硅橡胶与构成人工血管的材料一样，具有很强的化学惰性和疏水性，不能与肝素分子直接反应。
Nafion(全氟磺酸)具有很高的稳定性和生物惰性，因而具有很好的生物相容性。由于Nafion具有与Teflon(特氟龙)相似的疏水氟碳骨干分子结构，使Nafion与硅橡胶之间具有强的疏水作用，有利于在硅橡胶的表面形成Nafion涂层。Nafion吊链上的亲水的磺酸基可为进一步固定肝素分子提供活性基团。
近十年来静电吸引层层自组装技术受到国内外广泛重视，其基本方法和原理是通过聚阳离子和聚阴离子的静电引力作用在基底表面交替吸附聚阴离子和聚阳离子的多层聚合物分子膜。该技术不仅可方便地在分子水平上控制膜的组成及结构，而且可以在纳米尺度上控制膜的厚度。但该方法的不足之处在于离子键合的分子膜在极性溶剂中的稳定性差。
发明内容
本发明的目的在于针对硬连接的肝素降低人工血管的柔韧性且抗凝血性能不够好、共价键合的单分子层肝素浓度太低、而静电吸引层层自组装技术存在离子键合的分子膜在极性溶剂中的稳定性差的缺点，提供一种人工植入体的抗凝血表面修饰方法，该方法以硅橡胶涂层作软支撑组装重氮树脂和肝素多层膜，既充分利用了层状静电组装的简单性这一特点，又结合了重氮基团与硫酸基团在膜内的光化学反应，使膜内的离子键转变成共价键，从而使肝素多层膜的稳定性大大提高。本发明是这样实现的a、将人工植入体浸泡在有机溶剂中，超声清洗30～120分钟，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小时；b、将医用硅橡胶作为常温固化粘合剂，使其溶解在有机溶剂中，制备硅橡胶溶液；c、在人工植入体的内表面上涂覆医用硅橡胶作为软支撑；d、在硅橡胶涂层的表面上涂覆全氟磺酸；e、将带正电荷的聚阳离子和带负电荷的聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到全氟磺酸涂层的表面上；f、利用紫外光照射人工植入体内壁，通过光化学反应使膜内层间的离子键转变成共价键，得到抗凝血表面超薄膜。
本发明的方法具有以下优点(1)不需要对人工植入体进行化学预处理，既经济又可避免由于预处理对材料本体性能造成的损害。
(2)在人工植入体的表面涂覆硅橡胶不仅增加了人工植入体的柔韧性，而且为人工植入体肝素化提供了软支撑，使肝素分子与人工植入体表面有一定距离，从而提高其抗凝血性能，克服了在传统肝素化方法中将肝素硬连接到材料的表面使抗凝血性能降低的缺点。
(3)不仅可方便地在分子水平上控制膜的组成及结构，而且可以在纳米尺度上控制共价键合的膜的厚度。可以根据需要通过增加肝素的层数提高表面固定化肝素的浓度，克服了传统的单层肝素固化方法中存在肝素浓度过低、由于溶解或生物降解而消耗过快的缺点。
(4)原位光化学反应使得层间的离子键转变为共价键，避免了由于肝素分子从人工植入体表面释放之后留下带正电荷的表面而引起的血小板的吸附和聚集。
(5)膜内层与层间是共价键连接的，克服了用传统静电自组装制备的离子键合膜性能不够稳定等缺点。
(6)本发明工艺简单，反应条件温和，易操作，重现性好，环境友好，适用于多种复杂体型的材料表面、生物医用装置和多孔组织工程支架材料及其宏观制品的抗凝血表面修饰，具有良好的应用前景。
图1为组装在预先涂覆了硅橡胶和Nafion的石英玻璃片上的多层膜(DR/Hep)n(n＝1，2，3，4，5)的吸收光谱随DR/Hep双层数目的变化关系图，图2为组装在预先涂覆了硅橡胶和Nafion的石英玻璃片上的(DR/Hep)5多层膜的吸收光谱随紫外光照射时间的变化关系图，图3为肝素化人工血管的抗凝血活性变化关系图，图4为人工血管上光化学交联后多层肝素薄膜对凝血酶失活的影响随DR/Hep双层数目的变化关系图，图5为人工血管上光化学交联后的(DR/Hep)5和(DR/Hep)10多层肝素薄膜对凝血酶失活的影响关系变化图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式是这样实现的a、将人工植入体浸泡在有机溶剂中，超声清洗30～120分钟，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小时；b、将医用硅橡胶作为常温固化粘合剂，使其溶解在有机溶剂中，制备硅橡胶溶液；c、在人工植入体的内表面上涂覆医用硅橡胶作为软支撑；d、在硅橡胶涂层的表面上涂覆全氟磺酸；e、将带正电荷的聚阳离子和带负电荷的聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到全氟磺酸涂层的表面上；f、利用紫外光照射人工植入体内壁，通过光化学反应使膜内层间的离子键转变成共价键，得到抗凝血表面超薄膜。
本实施方式中，清洗人工植入体用的有机溶剂为无水乙醇、丙酮或者它们的混合物。
本实施方式中，用于溶解硅橡胶的有机溶剂为烷烃溶剂(正己烷或其它烷烃溶剂)。
本实施方式中，人工植入体可以是包括膨体聚四氟乙烯在内的各种材料制成的各种口径的人工血管，也可以是各种材料制成的各种口径的血导管、聚合物膜或多孔支架，以及用玻璃、陶瓷、硅、各种金属或各种聚合物等材料制成的各种形状的生物医学装置。
本实施方式中，聚阴离子可选用肝素、硫酸肝素、海藻素钠、聚苯乙烯磺酸钠、硫酸葡萄糖、硫酸软骨素、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸中的一种或几种的混合物。上述阴离子还可选用具有两性电荷性质的各种蛋白、生长因子和分行诱导因子，这些蛋白、生长因子和分化诱导因子可通过调节pH值来得到不同的带电性质。
本实施方式中，聚阳离子为二苯胺-4-重氮树脂或取代二苯胺重氮树脂，比如3-甲氧基二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-4-重氮树脂、2-硝基二苯胺-4-重氮树脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-2-重氮树脂等中的一种或几种的混合物。
具体实施方式
二本实施方式是这样实现的
1)清洗人工血管将膨体聚四氟乙烯人工血管浸泡在有机溶剂中，超声30～120分钟，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小时。
2)溶解硅橡胶将医用硅橡胶作为常温固化粘合剂，使其溶解在有机溶剂中，制备体积浓度为0.1～100v/v％的硅橡胶溶液。
3)涂覆硅橡胶将人工血管和注射器连接，竖立，然后用注射器将硅橡胶溶液从人工血管的末端注入其腔内，直到管腔填满为止。接着用注射器从人工血管的末端移去硅橡胶溶液，放在空气中室温下干燥2～100小时。
4)浸泡硅橡胶涂层密封人工血管的末端，在其管腔内填满无水乙醇，静置0.5～10小时。
5)配制Nafion溶液将从Aldrich公司购买的5wt％Nafion溶液用旋转蒸发仪除去溶剂，再加入新有机溶剂配制1～20wt％Nafion溶液，所述新有机溶剂为正己烷或其它烷烃溶剂。
6)涂覆Nafion用注射器将Nafion溶液从人工血管的末端注入其腔内直到管腔填满为止，移去Nafion溶液用氮气吹干。重复注入、移去、氮气吹干三步过程2～100次。
7)静电吸引层层自组装二苯胺重氮树脂和包括肝素在内的聚阴离子超薄膜用注射器将浓度为0.001～100mg/ml带正电荷的二苯胺重氮树脂溶液从人工血管的末端注入其腔内，直到管腔填满为止，吸附时间为0.5～30分钟，待人工血管内壁吸附上一层二苯胺重氮树脂后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，这时表面带上正电荷；用同样的方法将为0.001～100mg/ml带负电荷的聚阴离子溶液注满人工血管，吸附时间为0.5～30分钟，待人工血管内壁吸附上一层聚阴离子后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，这时表面带上负电荷。重复上述步骤，使二苯胺重氮树脂和聚阴离子交替组装在人工血管的内壁上，直至达到所需要的层数为止(厚度一般为1～1000nm)。反应结束后，取出溶液用去离子水洗涤干净，室温下真空干燥至恒重。
8)利用紫外光将自组装膜层间的离子键转变成共价键用波长为365nm的紫外光或者可见光照射人工血管内壁，发生光化学反应，使二苯胺重氮树脂和包括肝素在内的聚阴离子之间的离子键转变成共价键。
本实施方式步骤1)中，超声时间优选为30分钟，干燥温度优选为60℃，干燥时间优选为0.5小时。
本实施方式步骤2)中，溶解硅橡胶的浓度优选为50v/v％。
本实施方式步骤3)中，在空气中和室温下干燥的时间优选为24小时。
本实施方式步骤4)中，用无水乙醇浸泡硅橡胶涂层的时间优选为2小时。
本实施方式步骤6)中，配制Nafion溶液用有机溶剂为甲醇、无水乙醇或者它们的混合物。Nafion溶液的浓度优选为5wt％，注入、移去Nafion溶液、氮气吹干等三步过程循环次数优选为20次。
本实施方式步骤7)中，二苯胺重氮树脂和聚阴离子水溶液浓度优选0.1～10mg/ml，吸附时间优选为1分钟。
本实施方式在人工血管等生物医学装置的表面上涂上硅橡胶作为软支撑，再在硅橡胶涂层的表面上涂上Nafion为层层静电组装提供活性基团。然后将带正电荷的二苯胺重氮树脂和带负电荷的肝素分子通过静电吸引作用交替沉积到Nafion涂层的表面上。接着，将人工血管置于紫外光下，DR的重氮基带正电荷，肝素的硫酸基带负电荷，通过静电吸引作用，诱导重氮基团与肝素的硫酸基团之间发生光化学反应，二者形成离子复合物，生成硫酸酯，使膜内的离子键转变成共价键，便制得了共价键合的多层膜，使肝素在膜中的稳定性大大提高。肝素分子经层层自组装和光化学反应后仍然保持其原有的生物活性，具有明显的抗凝血作用。本实施方式所制备的肝素薄膜的表面具有活性基团，还可在其表面继续组装其它材料的薄膜，如聚电解质、生物功能分子、导电聚合物等。肝素(Hep)和二苯胺重氮树脂(DR)的光化学反应方程式为具体实施方式
三本实施方式是这样实现的a、将膨体聚四氟乙烯人工血管浸泡在无水乙醇中，超声30分钟，然后在60℃下干燥1小时。
b、将医用硅橡胶作为常温固化粘合剂，使其溶解在有机溶剂中，制备50v/v％硅橡胶溶液；c、将人工血管和注射器连接，直立，然后用注射器将50v/v％硅橡胶溶液从人工血管的末端注入其腔内，直到管腔填满为止。移去硅橡胶溶液，在空气中室温下干燥24小时。用夹子夹紧人工血管的末端，在其管腔内填满无水乙醇，静置2小时。
d、移去乙醇，用注射器将5wt％Nafion溶液从人工血管的末端注入其腔内，直到管腔填满为止。移去Nafion溶液，用氮气吹干后。重复注入、移去、氮气吹干三步过程20次。
e、用注射器将浓度为1mg/ml带正电荷的二苯胺重氮树脂溶液从人工血管的末端注入其腔内，直到管腔填满为止，吸附时间为15分钟，待人工血管内壁吸附上一层二苯胺重氮树脂后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，这时表面带上正电荷。用同样的方法将浓度为1mg/ml肝素溶液注满人工血管，吸附时间为1分钟，待人工血管内壁吸附上一层肝素后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，这时表面带上负电荷。重复上述步骤，使二苯胺重氮树脂和肝素交替组装在人工血管的内壁上，反应结束后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，在室温下真空干燥至恒重。除第一层二苯胺重氮树脂的吸附时间为15分钟外，其余的二苯胺重氮树脂层和所有的肝素层的吸附时间均为1分钟。为了证明DR和Hep可以通过静电作用形成均匀的多层高分子膜，用石英玻璃片代替人工血管作基底重复上述步骤。
从图1可以看出，最大吸收波长为377nm的吸收峰归属于DR上重氮基的π-π*越迁。随着DR/Hep双层数目的增加，在最大波长处的吸光度呈线性增加，有力地证明了DR和Hep可以通过静电吸引作用形成均匀的涂层。这不仅说明了层层静电自组装过程的发生，也说明了DR和Hep形成了均匀的高分子涂层。
f、用细长的长波长紫外灯[365nm，直径0.95cm，长5.4cm]作光源照射DR/Hep多层膜，样品与光源的距离为3cm(相对强度2mW/cm2)。
从图2可以看出，光照时间分别为0s、30s、50s、90s、150s，随着照射时间增加，在377nm处的吸光度显著降低，吸收峰消失；同时，在290nm处出现了一个新的峰，吸光度随照射时间增加而增加。这有力地证明了DR的重氮基团与Hep的硫酸基团之间发生了光化学反应生成硫酸酯，从而使膜内的离子键转变成共价键。
将肝素化的人工血管切成直径为18mm小圆片，放入37℃的Hepes缓冲溶液(20mM Hepes+190mM NaCl+0.5mg/ml BSA+0.02％NaN3)中培养，然后加入人类抗凝血酶(antithrombin，AT-III)，培养5分钟，接着加入凝血酶(thrombin)开始反应。凝血酶和抗凝血酶的最后浓度分别为10nM和20nM。每隔一段时间取出16μL反应液，加入368μL含20mM EDTA的Tris缓冲溶液(50mM Tris+175mM NaCl+0.5mg/ml BSA)以中止反应。加入16μL发色基质S-2238(最终浓度为0.2mM)，在405nm处用UV/vis分光光度计检测凝血酶。
从图3可以看出，与不含肝素的参照样品相比，含肝素的[(PLL/Hep)4和(DR/Hep)4]多层薄膜大大加快了凝血酶失活(PLL是聚-L-赖氨酸)。光交联之前，离子键合的(DR/Hep)4和(PLL/Hep)4相似，由于溶解作用肝素在短时间内很快释放到溶液中，使凝血酶浓度急剧下降。在37℃的PBS缓冲溶液中培养一周之后，由于肝素的溶解损失，(DR/Hep)4和(PLL/Hep)4对凝血酶失活的影响与参照样品很接近。反之，由于光交联使层间离子键转变为共价键，培养一周之后(DR/Hep)4对凝血酶失活的影响没有明显的变化，说明共价键合的肝素薄膜的稳定性大大提高。含肝素的多层薄膜[(PLL/Hep)4和(DR/Hep)4]具有很好的抗凝血活性，以共价键结合的多层薄膜(DR/Hep)4具有更好的稳定性。
从图4可以看出，在四个双层之内，肝素对凝血酶失活的影响随着DR/Hep双层数目增加而增加。大于四个双层后，进一步增加DR/Hep双层数目，对凝血酶失活的影响没有明显的差别。这表明只有最外层的肝素才对凝血酶失活有直接影响。在四个双层之内对凝血酶失活的影响之所以随着双层数目的增加而增加是因为最外层肝素的浓度尚未达到饱和。
从图5可以看出，在37℃的缓冲溶液中培养10天后，肝素化表面仍然保持很好的活性，但在5个双层和10个双层之间没有明显的差别，进一步证明共价键合的肝素多层膜具有较高的稳定性，当双层数目达到4的时候肝素表面浓度已经达到饱和。
图4和图5表明只有最外层的肝素才对凝血酶失活有直接影响。
权利要求
1.人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于它是这样实现的a、将人工植入体浸泡在有机溶剂中，超声清洗30～120分钟，然后，在30～90℃下干燥0.5～2小时；b、将医用硅橡胶作为常温固化粘合剂，使其溶解在有机溶剂中，制备硅橡胶溶液；c、在人工植入体的内表面上涂覆医用硅橡胶作为软支撑；d、在硅橡胶涂层的表面上涂覆全氟磺酸；e、将带正电荷的聚阳离子和带负电荷的聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到全氟磺酸涂层的表面上；f、利用紫外光照射人工植入体内壁，通过光化学反应使膜内层间的离子键转变成共价键，得到抗凝血表面超薄膜。
2.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述清洗人工植入体所用有机溶剂为无水乙醇、丙酮或者它们的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述人工植入体为人工血管、血导管、聚合物膜或多孔支架，或者是用玻璃、陶瓷、硅、各种金属或各种聚合物材料制成的各种形状的生物医学装置。
4.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述溶解硅橡胶的有机溶剂为烷烃溶剂。
5.根据权利要求4所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述烷烃溶剂为正己烷。
6.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述硅橡胶溶液体积浓度为0.1～100v/v％。
7.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述聚阴离子为肝素、硫酸肝素、海藻素钠、聚苯乙烯磺酸钠、硫酸葡萄糖、硫酸软骨素、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸中的一种或几种的混合物。
8.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述聚阳离子为二苯胺-4-重氮树脂或取代二苯胺重氮树脂。
9.根据权利要求8所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述取代二苯胺重氮树脂为3-甲氧基二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-4-重氮树脂、2-硝基二苯胺-4-重氮树脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-2-重氮树脂中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求1所述的人工植入体的抗凝血表面修饰方法，其特征在于所述抗凝血表面超薄膜的厚度为1～1000nm。
全文摘要
人工植入体的抗凝血表面修饰方法，它属于抗凝血材料技术领域。针对硬连接的肝素降低人工血管的柔韧性且抗凝血性能不够好、共价键合的单分子层肝素浓度太低、而离子键合的多层肝素分子膜在极性溶剂中的稳定性差的缺点，本发明是这样实现的a.清洗人工植入体；b.制备硅橡胶溶液；c.在人工植入体的内表面上涂覆医用硅橡胶作为软支撑；d.在硅橡胶涂层的表面上涂覆全氟磺酸；e.将聚阳离子和聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到全氟磺酸涂层的表面上；f.利用紫外光照射人工植入体内壁，通过光化学反应使膜内层间的离子键转变成共价键。本发明工艺简单，反应条件温和，易操作，重现性好，环境友好，具有良好的应用前景。
文档编号A61L33/00GK1748804SQ20051001023
公开日2006年3月22日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者戴志飞, 岳秀丽 申请人:哈尔滨工业大学