专利名称：奶牛乳房炎多联灭活菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种兽用生物制品及其制备方法，更确切地说，涉及一种预防奶牛乳房炎的多联灭活菌苗及其制备方法。
背景技术：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛乳腺组织的炎症，主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是奶牛的常见病、多发病。根据临床表现可分为隐性型和临床型乳房炎。引起奶牛乳房炎的致病菌约为一百五十多种，以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占整个奶牛乳房炎病例的90％以上。其主要特征是乳汁发生理化性质及细菌学变化，乳腺组织发生病理学变化。乳汁最重要的变化是颜色发生改变，乳汁中有凝块及大量细胞。发生乳房炎时，虽然在许多病例乳腺出现肿大及疼痛，但大多数隐性奶牛乳房炎病例在用手触诊时难以发现异常，肉眼检查也难以观察到病理变化。
目前对奶牛乳房炎的防治，仍然以抗生素治疗和环境卫生控制为主，但抗生素治疗常常因为耐药性的产生而疗效不佳，造成严重的乳中抗生素残留，危害人类身体健康。针对这一问题，国内外近些年来已经开始研究和使用菌苗免疫方法来预防和控制本病，并收到了一定的效果，如Ze′ev Trainin等人从金黄色葡萄球菌中分离出三种菌株，用其制成灭菌疫苗以防治牛羊乳房金黄色葡萄球菌感染(专利申请WO99/33954)，罗金印等人(《中国兽医科技》，2003，33(4)61-63)以金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌按一定比例混合辅以佐剂制成了铝胶疫苗、油乳剂疫苗、蜂胶疫苗、脂质体疫苗和脂质体蜂胶疫苗，在临床乳牛免疫接种实验中蜂胶疫苗、油乳剂疫苗和铝胶疫苗均表现出一定的效果，但总体免疫水平还不够高。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种成本低、安全、能够用于预防奶牛隐性和临床型乳房炎的多联灭活菌苗及其制备方法。
本发明奶牛乳房炎多联灭活菌苗，包含由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的灭活菌液以等量的比例(在混合前，金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的各自浓度均为6×1010CFU/ml。)混合得到的菌液，还包含经灭菌的20％氢氧化铝凝胶，其中混合菌液与20％氢氧化铝凝胶的按体积比例为4∶1。
本发明的多联灭活菌苗的制备方法如下(1)选用临床型奶牛乳房炎致病菌株作为制苗菌株；(2)制备菌苗生产用的种子液和增菌菌液；(3)纯检与灭活；(4)配制铝胶多联灭活菌苗；(5)无菌检验、安全性检验和效力检验。
具体步骤如下(1)选用临床型奶牛乳房炎致病菌株作为制苗菌株将金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌划线接种于含5％绵羊鲜血琼脂培养基，大肠杆菌划线接种于伊红美蓝和麦康凯培养基，37℃培养24h，观察菌落生长情况，生化特性按常规方法进行。各菌株形态及主要生化特性应符合各自菌株的特征，如金黄色葡萄球菌致病性检测具有如下特征能够产生荚膜和溶血毒素，甘露醇发酵、过氧化氢酶、血浆凝固酶、溶纤维蛋白酶、耐热Dnase试验均为阳性。
(2)制备菌苗生产用的种子液和增菌菌液将菌种分别接种于10％绵羊血琼脂培养基，37℃培养24h，经生物学特性检定合格的纯粹培养物，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌分别接种于适量的BHI液体培养基，大肠杆菌接种于TSB液体培养基中，在37℃震荡培养20～24h，置于2～8℃保存，作为种子液。将种子液按1～2％的量分别接种于BHI和TSB液体培养基中，在37℃培养20～24h，振荡培养或连续通气培养。菌悬液置2～8℃保存备用。
(3)纯检与灭活菌液培养完成后，分别取样作纯检并计算菌数，合格菌液中分别加入终浓度为0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振荡培养24h，灭活彻底后，在4℃条件下，7000rpm/min离心20min，应用生理盐水或pH7.2的PBS洗涤3次，得灭活菌悬液。其中金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的各自浓度均为6×1010CFU/mL。各灭活菌液分别加入0.01％的硫柳汞，混匀后置于2～8℃保存。
(4)配制铝胶多联灭活菌苗将所得5种灭活菌液等体积混匀，每4份菌液加入1份经灭菌的20％氢氧化铝胶，混匀，分装，制成铝胶多联灭活菌苗；菌苗充分振荡后进行无菌检验、安全性检验和效力检验，合格后，放冷暗处保存。
(5)无菌检验、安全性检验和效力检验采用本发明的方法生产的产品可用于预防奶牛隐性和临床型乳房炎。
本发明的产品优点体现在(1)由于该制苗菌液经甲醛彻底灭活，所以安全，绝无散毒危险。
(2)作为免疫原性强的多个菌株制备多联灭活菌苗，其免疫效果好，特异性强。
(3)生产工艺先进、性能稳定，生产成本低，产品附加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广阔。
具体实施例方式
通过下面给出的本发明的具体实施例和安全性及免疫效力试验可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例不是对本发明的限定。
实施例1取金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌划线接种于含5％绵羊鲜血琼脂培养基，大肠杆菌划线接种于伊红美蓝和麦康凯培养基，37℃培养24h，观察菌落生长情况并用常规生化方法鉴定其特性。
分离出的菌种分别接种于10％绵羊血琼脂培养基，37℃培养24h，经生物学特性检定合格的纯粹培养物，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌分别接种于适量的BHI液体培养基，大肠杆菌接种于TSB液体培养基中，在37℃震荡培养24h，置于4℃保存，作为种子液。将种子液按1.5％的量分别接种于BHI和TSB液体培养基中，在37℃培养24h，振荡培养或连续通气培养。所得菌悬液置4℃保存备用。
菌液培养完成后，分别取样作纯检，同时计算菌数，通过离心、浓缩，将金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的浓度均调整为6×1010CFU/mL。各菌液中分别加入终浓度为0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振荡培养24h，灭活彻底后，在4℃条件下，7000rpm/min离心20min，应用生理盐水或pH7.2的PBS洗涤3次，得灭活菌悬液。各灭活菌液分别加入0.01％的硫柳汞，混匀后置于4℃保存。
将所得5种灭活菌液等体积混匀，每4份菌液加入1份经灭菌的20％氢氧化铝胶，混匀，分装，制成铝胶多联灭活菌苗；菌苗充分振荡后进行无菌检验、安全性检验和效力检验，合格后，放冷暗处保存。
实施例2(1)安全性试验选择21-25日龄标准小白鼠10只腹腔接种1mL菌苗，健康家兔5只，背部皮下接种1mL菌苗，观察14d。结果均正常，未见异常症状。
选择健康育成牛、正常泌乳牛和怀孕母牛各4头，分别接种实施例1所得多联灭活菌苗，每头牛皮下分点注射10mL，观察7d，检查接种局部和全身的反应。结果只有1头育成牛注射部位肿胀，1周左右恢复正常；其他接种牛均无明显局部和全身反应。精神、体温、食欲、呼吸和脉搏正常，泌乳母牛产奶量正常，怀孕母牛胎儿正常，无流产现象。
(2)免疫效力试验取健康标准小白鼠50只，分成两组，每组25只。一组小白鼠每只皮下注射实施例1所得多联灭活菌苗0.5mL，另一组皮下注射生理盐水0.5mL。15d后，两组分别应用致死量的(107CFU/mL)金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌液体培养物攻毒，每组各菌株分别腹腔接种5只小白鼠，每只接种1mL，观察一周。结果无乳链球菌和乳房链球菌的免疫组和对照组均未见死亡，因为这两种细菌对小白鼠没有致病性；其它试验免疫组中除1只注射停乳链球菌的小白鼠死亡外，其余均健活，对照组全部死亡。
(3)临床免疫试验在同样饲养管理条件下，试验随机选择了一个奶牛小区无乳房炎临床症状的泌乳期奶牛100头，应用实施例1所得菌苗间隔21d进行两次免疫接种，每次颈部皮下接种5mL，同时设对照组100头。另外还选择了一个奶牛小区无乳房炎临床症状的干奶期奶牛30头，同时设对照组30头。在干奶时、产前30d和产后48h进行3次免疫，每次颈部皮下接种5mL。免疫后观察2周，奶牛的精神、食欲、体温、注射部位和泌乳量均正常。经免疫后整个泌乳期的临床发病情况观察，两个奶牛小区免疫牛群对临床型奶牛乳房炎的保护率分别为60％和81％。
试验证明奶牛乳房炎多联灭活菌苗对育成牛、正常泌乳牛和怀孕母牛均安全、毒性小、无明显副作用；该菌苗免疫小白鼠15d产生较强免疫力，保护率达80％以上；临床应用表明，对临床型乳房炎具有良好的预防效果，尤其是干奶牛免疫效果更好，保护率达81％，免疫持续期最长可达10个月。
权利要求
1.一种奶牛乳房炎多联灭活菌苗，由临床型奶牛乳房炎致病菌的混合灭活菌液和经灭菌的20％氢氧化铝凝胶组成，其中临床型奶牛乳房炎致病菌包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。
2.如权利要求1所述多联灭活菌苗，其中临床型奶牛乳房炎致病菌的混合灭活菌液由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌的灭活菌液以等体积的比例配制而成。
3.如权利要求1或2所述多联灭活菌苗，其混合灭活菌液在混合前金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的各自浓度均为6×1010CFU/ml。
4.如权利要求1或2所述多联灭活菌苗，其特征在于混合菌液与20％氢氧化铝凝胶的按体积比例为4∶1。
5.如权利要求1或2所述的多联灭活菌苗的制备方法，其步骤如下(1)选取临床型奶牛乳房炎致病菌株金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌，生化特性检测合格后作为制苗菌株。(2)金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌分别接种于BHI液体培养基，大肠杆菌接种于TSB液体培养基，37℃培养24h，作为种子液。将种子液按1～2％的量分别接种于BHI和TSB液体培养基中，在37℃振荡或连续通气培养20～24h制备增菌菌液。(3)对步骤(2)所得菌液取样作纯检，同时计算菌数。所得菌液分别加入最终浓度为0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振荡培养24h灭活，灭活彻底后，在4℃条件下，7000rpm/min离心20min，去上清液，沉淀物应用生理盐水或pH7.2的PBS洗涤3次，得灭活菌悬液。其中金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌的各自浓度均为6×1010CFU/mL。各灭活菌液中分别加入0.01％的硫柳汞，混匀后置于2～8℃保存。(4)将所得各灭活菌液等体积混匀，每4份混合菌液加入1份经灭菌的20％氢氧化铝凝胶制成铝胶多联灭活菌苗。(5)对所得铝胶多联灭活菌苗进行无菌检验、安全性检验和效力检验。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防奶牛乳房炎的多联灭活菌苗，该菌苗组成为由4份一定浓度的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌的灭活混合菌液和1份经灭菌的20％氢氧化铝胶组成。本发明还提供了该多联灭活菌苗的制备方法(1)选用临床型奶牛乳房炎致病菌株作为制苗菌株；(2)制备菌苗生产用的种子液和增菌菌液；(3)纯检与灭活；(4)配制铝胶多联灭活菌苗制剂；(5)无菌检验、安全性检验和效力检验。该制剂采用免疫原性强的多个菌株制备而成，其免疫效果好，特异性强，成本低，安全，避免了抗生素的耐药性和污染问题。
文档编号A61P31/00GK1895666SQ200510012160
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月13日 优先权日2005年7月13日
发明者崔玉东, 朱战波, 朴范泽 申请人:崔玉东, 朱战波, 朴范泽