专利名称：一种纳米微凝胶、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学、高分子化学和药物制剂领域，提供了一种蛋白质/多糖纳米微凝胶。本发明还提供了该纳米微凝胶的制备方法和应用。
背景技术：
微米尺寸和纳米尺寸的药物载体引起了科学界和工业界的广泛兴趣，这些载体可以是胶体、囊泡或者微球。它们可以装载活细胞、酶、香味油、药物、维生素、农用化学品、催化剂等，并且具有很多优势液体可以包埋在固体里面，当作固体来使用；毒性物质可以安全地处理；不稳定的化合物可以被保护起来；气味和口感可以被有效地屏蔽；药物可以被控制和有选择地释放等(InternationalJournal of Pharmaceutics 242(2002)163-166)。在食品、医药和化妆品工业中，天然大分子形成的药物/营养物载体由于具有生物利用性和生物降解性因而受到特别的青睐。到目前为止，有通过乳化、喷雾干燥的方法，将豆油装入酪蛋白微胶囊是(J.Agric.Food Chem.49(2001)1934-1938)；用两种不同的蛋白质或者蛋白-多糖混合物在溶液中共凝聚的方法制备药物微胶囊包埋体系(InternationalJournal of Pharmaceutics 242(2002)l63-166；Journal Microencapsulation 19(2002)549-558)；酪蛋白与含有还原性糖的碳水化合物进行Maillard反应后的产物用乳化、干燥的方法包裹对氧气敏感的油(US Patent Application 20030185960)；磷酸钙作为内核，将要装载的药物或者蛋白质与磷酸钙结合后用酪蛋白将表面包裹起来作为口服药物(United States Patent Application 20020054914)。然而，这些由生物大分子形成的药物/营养物载体还存在以下不足之处对带电荷的亲水小分子药物不能有效的包埋、富集和控制释放；载体的粒径偏大，都在微米尺度；有的体系不稳定，需要加稳定剂；制备不简便。
微凝胶作为药物载体有其独特的优势1、相对于实心的胶体粒子，微凝胶的低密度结构可以为药物分子提供更大的容载空间；2、相对于空心球结构的胶体粒子，微凝胶的网络结构可以提供更多的药物结合位点，有利于药物分子的高浓度富集；3、带有弱酸/弱碱基团的微凝胶，其自身的电荷性质可以随溶液的pH值而改变，因此与带有电荷的小分子之间的相互作用也随pH值而变化，所以可以通过pH的调节而有效地富集和释放带电荷的药物分子。目前，利用微凝胶作为约物载体的研究已经越来越多(Nature 394(1998)459-462)。作为微凝胶的基体材料大多为合成高分子和部分改性的天然高分子，制备的方法有乳液聚合、阴离子共聚、相邻聚合物链交联、反相微乳液聚合等(Advances in Colloid and InterfaceScience 80(1999)1-25)。然而，这些方法的实施都有一定的难度并且不适合作为口服药物和营养物载体。因此，有必要发展更简单、有效和通用的方法制备纯天然的生物大分子微凝胶。
蛋白质是一类重要的生物大分子，具有许多生理和生物功能。食品蛋白质是人类的主要营养物之一并且在食品科学中发挥着重要的作用，如增稠、凝胶、乳化、发泡、粘接、结合水、油脂和香料等(Food Proteins and Their Applications，S.Damodaran and A.Paraf，1997，Marcel Dekker，Inc.New York.1-24)。蛋白质是两性大分子，其分子所带的电荷与溶液的pH有关当pH小于其等电点时，分子带正电荷；pH大于其等电点时，分子带负电荷；pH在其等电点时，分子的净电荷为零。蛋白质受热以后会破坏其特定的空间结构；蛋白质分子的疏水基团会从分子内部转移到分子表面而引起分子间的疏水缔合；含有巯基和分子内二硫键的蛋白质分子会形成分子间的二硫键而引起分子聚集。对于大多数食品蛋白质水溶液，在远离其等电点的pH值下加热时，蛋白质首先变性形成珠子状的聚集体，然后进一步聚集形成透明的宏观凝胶体；当溶液的pH值在蛋白质的等电点附近时，蛋白质热变性后会形成无规的聚集体，然后进一步聚集形成混浊的宏观凝胶体；当溶液的pH位于上述之间时，蛋白质在加热变性时会形成上述两种聚集体和半透明的凝胶体(Food Proteins and Their Applications，S.Damodaran and A.Paraf，1997，Marcel Dekker，Inc.New York.327-330)。多糖是另一类常见的生物大分子，一些多糖的水溶液加热后也可以形成宏观凝胶体。天然的食品蛋白质和多糖可以食用而且价格低廉，是制备微凝胶的理想基体材料。虽然食品蛋白质和多糖在加热时很容易形成宏观凝胶，但是到目前为止，还没有发现利用蛋白质和多糖制备微凝胶的报道。另外，还没有发现利用简单的加热方法制备纳米微凝胶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可食用的蛋白质和多糖微凝胶。
本发明的另一个目的是提供一种简单、方便、高效、通用的蛋白质/多糖微凝胶的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述微凝胶的应用。
本发明提供了一种纳米微凝胶，该纳米微凝胶是由在相同pH条件下带有不同电荷的两种蛋白质或者是由一种蛋白质和一种多糖通过加热使蛋白质变性形成的。
本发明的微凝胶具有核一壳结构，核含有一种蛋白质，而壳含有另一种蛋白质或者一种多糖；核和壳所带的电荷受溶液pH的影响当微凝胶由两种不同的蛋白质组成时，pH小于两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带正电荷，当pH大于两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带负电荷，当pH位于两种蛋白质的等电点之间时，微凝胶的核和壳带相反电荷，当pH等于组成微凝胶壳的蛋白质的等电点时，微凝胶的壳不带电荷；当微凝胶由蛋白质和多糖组成时，pH位于蛋白质等电点和多糖电离常数pK之间时，微凝胶的核和壳带相反电荷，对于碱性多糖，当pH大于其pK+2时，微凝胶的壳不带电荷，对于酸性多糖，当pH小于其pK-2时，微凝胶的壳不带电荷。
在本发明的另一方面，还提供了工种上述微凝胶的制备方法。
利用两种具有不同等电点的蛋白质或者带有不同电荷的蛋白质和多糖，在特定的条件下，即溶液的pH值位于这两种蛋白质的等电点之间或者使溶液中的蛋白质/多糖带有相反电荷时，这两种分子生成静电复合物、胶束或者沉淀，然后改变溶液的pH值到某一蛋白质的等电点附近，搅拌或者静置一段时间使分子发生重组位于等电点附近的蛋白质由于本身的电荷趋于零而倾向于聚集，而远离等电点的另一种蛋白质或者带有电荷的多糖由于自身带有大量的同种电荷而互相排斥倾向于远离。此时将溶液加热使蛋白质变性，位于等电点附近的蛋白质会形成几乎不带电荷的无规聚集体，而另一种蛋白质或者多糖会在其周围形成含有大量同种电荷的线性的聚集体，因此就形成了纳米尺度的微观凝胶。这种微观凝胶通常具有一定的核壳结构，即位于等电点附近的蛋白质主要位于微凝胶的内部而远离等电点的蛋白质或者多糖主要富集在微凝胶的外部。微凝胶形成之后，在微凝胶内部的分子由于发生了分子间的疏水、氢键作用以及二硫键的交联，因而非常稳定；而微凝胶外部的分子由于带有同种电荷而互相排斥，因而使微凝胶粒子在溶液中可以长期稳定的存在。
基于上述原理，本发明提供了一种通用的制备蛋白质微凝胶或者蛋白质和多糖微凝胶的方法。该方法包括以下步骤(1)分别将在相同pH条件下带有不同电荷的两种蛋白质或者蛋白质和多糖配制成水溶液并使其混合形成静电复合物、胶束或者沉淀；(2)其次，调整混合溶液的酸碱度，使其pH值与混合溶液中任一种蛋白质的等电点差值为0～3，搅拌或者静置以使沉淀溶解或者使静电复合物扩散均匀，但不要使静电复合物完全解离；(3)最后，加热混合溶液使其中的蛋白质变性，从而得到微凝胶。
(1)中使用两种蛋白质时，这两种蛋白质具有不同等电点；当使用多种蛋白质时，其中至少有两种蛋白质具有不同的等电点；当使用蛋白质和多糖时，二者在一定的pH范围内带有相反的电荷。
本发明中可以采用不同的蛋白质组合或者蛋白质/多糖组合。蛋白质可以是任何水溶性的蛋白质，而水溶性食品蛋白质较佳，多糖必须是带有电荷的多糖，所形成的蛋白质组合或者蛋白质和多糖组合必须在混合时带有相反电荷，或者在某一pH条件下带有相反电荷，如卵清白蛋白和卵清溶菌酶、牛血清白蛋白和卵清溶菌酶、αs-酪蛋白和卵转铁球蛋白、卵清白蛋白和卵转铁球蛋白、β-酪蛋白和卵清溶菌酶、αS-酪蛋白和卵清溶菌酶、κ-酪蛋白和卵清溶菌酶、酪蛋白和卵清溶菌酶、壳聚糖和卵清白蛋白、壳聚糖和αS-酪蛋白、海藻酸盐和卵清溶菌酶组合等等。
在本发明中，(1)中配制成水溶液时，先将蛋白质或者多糖配制成质量百分浓度大于0且小于10％的水溶液，再将带有不同电荷的蛋白质或者蛋白质和多糖按摩尔比为0.05～20的比例混合。配制的水溶液浓度在8％以下较佳。
多糖和蛋白质在溶解时可能需要加入额外的酸(如醋酸)或者碱(如氢氧化钠)来帮助其溶解或者调整其溶液的pH值。
在本发明中，(1)中当两种溶液混合时，混合溶液的pH值应使两种蛋白质或者蛋白质和多糖产生强烈的静电吸引力；较佳地，使混合溶液pH值为其中任意两个蛋白质等电点的中间值，或者是任意一个蛋白质等电点与多糖电离常数pK的中间值。
在本发明中，用稀酸或者稀碱调整混合溶液的pH值。调节混合溶液pH值时所用的酸是盐酸、醋酸、磷酸或者柠檬酸中的任一种；所用的碱是氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或者醋酸钠中的任一种。浓度可以采用0.01～1.0mol/L。
然后再将混合溶液的pH值调整到任何一个蛋白质的等电点附近，具体pH值的确定和搅拌时间与所选择的蛋白质和多糖有关，pH值确定的标准是两个蛋白质间或者蛋白质与多糖间的静电相互作用力很弱或者为零，通常使混合溶液的pH值与其中一个蛋白质的等电点差值为0～3；较佳地，两者的差值为0～2；更佳地，两者的差值为0～1。
在本发明中，调节好混合溶液的酸碱度后，可以搅拌或者静置0-24小时，搅拌或者静置时间确定的标准是两种分子之间的宏观沉淀溶解或者静电复合物扩散均匀但不要使静电复合物完全解离。时间过长，不能获得很好的目标产物。
本发明制备的微凝胶是通过加热使蛋白质变性得到的，加热温度和加热时间的选择标准是使溶液中的蛋白质可以充分变性。在本发明中，可采用50～100℃，并保持1分钟～3小时；更佳地，采用70～90℃加热30～120分钟。
本发明制备的微凝胶具有核-壳结构，核主要由一种蛋白质组成，而壳主要由另一种蛋白质或者多糖组成，微凝胶的核和壳所带的电荷随着溶液pH的改变而不同。例如，使用两种具有不同等电点的蛋白质制备的微凝胶，当溶液的pH低于这两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带有正电荷；当溶液的pH高于这两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带有负电荷；当溶液的pH位于这两种蛋白质的等电点之间时，微凝胶的核和壳带相反的电荷；当溶液的pH值在位于微凝胶壳的蛋白质的等电点附近时，微凝胶的壳不带电荷因而微凝胶会进一步聚集，但这种聚集会随着溶液pH的变化而重新分散开来。图2是利用卵清白蛋白(等电点4.7)和卵清溶菌酶(等电点10.7)所制备的微凝胶(实施例1)在不同pH时所带电荷的示意图。
利用本发明获得的微凝胶，具有很好的单分散性，利用动态光散射、透射电子显微镜和原子力显微镜表征微凝胶近似为球形，粒径随两种蛋白质或者蛋白质和多糖的组成及比例而变化，大约在40～700nm之间。
利用本发明方法可以得到1％或者浓度更高的微凝胶水溶液。所制备的微凝胶可以在水溶液中长期保存，图1显示出利用卵清白蛋白和卵清溶菌酶所制备的微凝胶(实施例1)在水溶液中存放120天以后，其粒径和粒径分布几乎没有变化。所制备的微凝胶可以经过冷冻抽干后将得到的干燥粉末进行保存，这种粉末可以再次分散到水溶液中并且保持其原有的粒径和粒径分布。
本发明的制备方法不需要特殊设备，产品不需要分离，可以直接用来包埋药物。
在另一方面，本发明还提供了上述微凝胶制备方法的应用，即得到的微凝胶通过扩散方式将小分子包裹在微凝胶中。扩散过程的条件视具体情况而定，例如，将待包裹的小分子溶于微凝胶溶液中，或者将微凝胶溶于待包裹的小分子溶液中。
本发明制备的微凝胶可以作为药物和营养物的载体。
由于本发明制备的微凝胶属于纳米材料(具体见图3)，而且整个过程全部采用天然大分子以及可食用的酸和碱，没有加入其他化学物质，因此所制备的微凝胶不仅其包埋效果好，食用吸收效果也良好，可以用于口服药物的纳米载体。
同理，本发明制备的微凝胶可以作为营养物的纳米载体。
本发明制备的微凝胶将药物或者营养物包裹在其中后，可以通过人的消化道或者蛋白酶的水解方式将药物或者营养物从微凝胶中释放出来。
本发明制备的微凝胶可以用于制备染料、香料和化妆品纳米载体。
本发明制备的微凝胶将药物、营养物、染料、香料、化妆品包裹在其中后，可以通过改变溶液酸碱度的方式将其从微凝胶中释放出来。
利用本发明制备的微凝胶对带电荷的小分子具有很好的包埋和释放效果。例如图2所示的微凝胶，可以在pH 4.7时通过扩散富集带有负电荷的小分子药物；将溶液保持在酸性或者中性pH，被包埋的小分子不会从微凝胶释放出来；只有当溶液的pH大于10.7时，带负电荷的小分子药物才会释放出来；另一方面，利用食品蛋白质和多糖制备的微凝胶在人的消化道可以被降解，因此可以释放出所包埋的小分子药物。
本发明可以通过选择不同的蛋白质-蛋白质配对或蛋白质-多糖配对而制备具有特定核、壳电荷性质的微凝胶，因而可以包埋多种药物、营养物、染料、香料和化妆品。
利用本发明制备微凝胶，整个过程全部采用天然大分子以及可食用的酸和碱，没有加入其他化学物质，因此所制备的微凝胶可以作为口服药物/营养物载体，不仅其包埋效果好，食用吸收效果也良好。
利用本发明获得的微凝胶具有包裹带电荷的小分子药物/营养物的良好效果，由于其可食用性，因此作为药物/营养物的载体有其广阔的应用前景。尤其是利用本发明获得的微凝胶十分适合运用包埋对环境敏感的物质。
图1是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制备的微凝胶在水溶液中存放120天时的粒径和粒径分布图。
图2是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制备的微凝胶在不同pH水溶液中所带电荷的示意图。
图3是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制备的微凝胶的透射电镜图片。
图4是用卵清白蛋白和卵清溶菌酶制备的微凝胶水溶液的粒径和粒径分布。
具体实施例方式
例1.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵清溶菌酶(Lysozyme)在碱性水溶液中形成微凝胶。
将卵清白蛋白和卵清溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将1.2mL白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.1mol/L NaOH调节溶液的pH为10.3并适当搅拌60分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热1.5小时，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液平均粒径为147nm，多分散系数为0.127(图4)。透射电子显微镜测量出该微凝胶经过干燥后其平均粒径只有80nm(图3)。该微凝胶溶液极其稳定，在4℃的冰箱内存放了120天无明显的变化(图1所示)。
在上述体系中，将白蛋白与溶菌酶的摩尔比控制在0.05～5的范围内，溶液的pH调节到9.0～11.0的范围内，均可得到窄分散的、粒径为80～300nm范围内的稳定的微凝胶。
将上述微凝胶溶液冷冻抽干，将所得的固体粉末用去离子水溶解，用0.1mol/L的HCl或NaOH调节溶液的pH值至酸性或碱性，仍可得到上述稳定的微凝胶溶液。
例2.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵清溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将卵清白蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将600μL白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.06mol/L NaOH调节溶液的pH为10.0并适当搅拌3分钟使之混合均匀，再用0.01mol/L HCl快速调节溶液的pH为5.0，然后迅速将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热10分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液平均粒径为71.4nm，多分散系数为0.224。
在上述体系中，将白蛋白与溶菌酶的摩尔比控制在0.05～5的范围内，溶液的pH调节到4.0～6.5的范围内，均可得到粒径为50～300nm范围内的稳定的微凝胶。
例3.牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)和溶菌酶(Lysozyme)在碱性或者酸性水溶液中形成微凝胶。
将牛血清白蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成2.838mg/mL和0.624mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将1.5mL牛血清白蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.1mol/L NaOH调节溶液的pH为8.90并适当搅拌15分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热1小时，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为151.8nm，多分散系数为0.0880。
在上述体系中，将牛血清白蛋白与溶菌酶的摩尔比控制在0.05～5的范围内，溶液的pH调节到4.0～6.5或8.0～11.0的范围内，均可得到粒径为50～300nm范围内的稳定的微凝胶。
例4.αs-酪蛋白(αs-Casein)和卵转铁球蛋白(Ovotransferrin)在中性水溶液中形成微凝胶。
将αs-酪蛋白和卵转铁球蛋白分别溶解在去离子水中，配成4mg/mL和0.5mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将38.4μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL卵转铁球蛋白的水溶液中，以0.04mol/L NaOH调节溶液的pH为6.97并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热1小时，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为138nm，多分散系数为0.214。
在上述体系中，将αs-酪蛋白和卵转铁球蛋白的摩尔比控制在0.05～5的范围内，溶液的pH调节到5.3～8.5的范围内，均可得到粒径为50～500nm范围内的稳定的微凝胶。
例5.卵清白蛋白(Ovalbumin)和卵转铁球蛋白(Ovotransferrin)在中性水溶液中形成微凝胶。
将卵清白蛋白和卵转铁球蛋白分别溶解在去离子水中，配成11.2mg/mL和0.5mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将40μL白蛋白的水溶液滴加到3mL卵转铁球蛋白的水溶液中，以0.04mol/L NaOH调节溶液的pH为7.0并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热1小时，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为142.4nm，多分散系数为0.161。
在上述体系中，当卵清白蛋白和卵转铁球蛋白的摩尔比控制在0.05～10的范围内，溶液的pH调节到5.3～8.5的范围内，均可得到粒径为50～500nm范围内的稳定的微凝胶。
例6.壳聚糖(Chitosan)和卵清白蛋白(Ovalbumin)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将壳聚糖溶解在2％的醋酸中，配成浓度为2％的粘稠的壳聚糖醋酸水溶液；将卵清白蛋白溶解在去离子水中，配成0.5mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将161μL壳聚糖的醋酸水溶液滴加到3mL白蛋白的水溶液中并适当搅拌10分钟使之混合均匀，以0.2mol/LNaOH调节溶液的pH为5.30并搅拌5分钟。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热20分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为508.9nm，多分散系数为0.386。
在上述体系中，当壳聚糖/卵清白蛋白的重量比在0.1～10的范围内，溶液的pH调节到4.0～8.0的范围内，均可得到粒径为100～1000nm范围内的稳定的微凝胶。
例7.β-酪蛋白(β-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将β-酪蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成10mg/mL和0.624mg/mL的蛋白质水溶液。在磁力搅拌下将120/μLβ-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl调节溶液的pH为4.46并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为222.6nm，多分散系数为0.0692。
在上述体系中，当β-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在4.0～7.5时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例8.β-酪蛋白(β-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在碱性水溶液中形成微凝胶。
将β-酪蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成10mg/mL和0.624mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将120μLβ-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.06mol/L NaOH调节溶液的pH为10.28并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为195.9nm，多分散系数为0.177。
在上述体系中，当β-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在8.5～11.0时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例9.αS-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将αS-酪蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成4mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力搅拌下将300μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl调节溶液的pH为5.30并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为191nm，多分散系数为0.125。
在上述体系中，当αS-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在4.0～7.0时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例10.αS-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在碱性水溶液中形成微凝胶。
将αS-酪蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成4mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力搅拌下将300μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.04mol/L NaOH调节溶液的pH为10.2并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为172.9nm，多分散系数为0.207。
在上述体系中，当β-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在8.5～11.0时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例11.κ-酪蛋白(αS-Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性和中性水溶液中形成微凝胶。
将κ-酪蛋白和溶菌酶分别溶解在去离子水中，配成8.2mg/mL和0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力搅拌下将120μLαS-酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl调节溶液的pH为4.74并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为288.8nm，多分散系数为0.0828。
在上述体系中，当κ-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在4.0～8.0时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例12.酪蛋白(Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将酪蛋白加入去离子水中，并加入0.1mol/L NaOH搅拌过夜使之溶解，配成10.0mg/mL的pH值为7.2的酪蛋白水溶液。将溶菌酶溶解在去离子水中，配成0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力搅拌下将120μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.01mol/L HCl调节溶液的pH为4.50并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为230.6nm，多分散系数为0.121。
在上述体系中，当酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在4.0～7.0时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例13.酪蛋白(Casein)和溶菌酶(Lysozyme)在碱性水溶液中形成微凝胶。
将酪蛋白加入去离子水中，并加入0.1mol/L NaOH搅拌过夜使之溶解，配成10.0mg/mL的pH值为7.2的酪蛋白水溶液。将溶菌酶溶解在去离子水中，配成0.624mg/mL的蛋白溶液。在磁力搅拌下将120μL酪蛋白的水溶液滴加到3mL溶菌酶的水溶液中，以0.04mol/L NaOH调节溶液的pH为10.3l并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为224.1nm，多分散系数为0.208。
在上述体系中，当β-酪蛋白/溶菌酶的摩尔比在0.05～10的范围内，pH值在9.0～11.0的时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例14.壳聚糖(Chitosan)和αS-酪蛋白(αS-Casein)在酸性水溶液中形成微凝胶。
将壳聚糖溶解在2％的醋酸中，配成浓度为2％的粘稠的壳聚糖醋酸水溶液；将αS-酪蛋白溶解在去离子水中，配成1.03mg/mL的蛋白质溶液。在磁力搅拌下将161μL壳聚糖的醋酸水溶液滴加到3mLαS-酪蛋白的水溶液中并适当搅拌10分钟使之混合均匀，以0.2mol/L NaOH调节溶液的pH为4.20并搅拌5分钟。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为262.8nm，多分散系数为0.316。
在上述体系中，当壳聚糖/αS-酪蛋白的质量比在0.1～10在的范围内，溶液的pH调节到3.5～7.5的范围内，均可得到稳定的微凝胶粒子。
例15.鸡蛋蛋白粉(Chicken Albumin)在水溶液中形成微凝胶。
将鸡蛋蛋白粉溶解在去离子水中，配成2mg/mL的混合蛋白溶液，以0.02mol/L NaOH调节溶液的pH为6.0并适当搅拌5分钟使之混合均匀。然后将混合好的溶液置于80℃的水浴中加热30分钟，即可得到稳定的微凝胶溶液。用动态激光光散射测量所得到的微凝胶溶液粒径为161.4nm，多分散系数为0.350。
在上述体系中，当溶液的pH值在4.0～10.5时，均可得到稳定的微凝胶粒子。
权利要求
1.一种纳米微凝胶，其特征是由在相同pH条件下带有不同电荷的两种蛋白质或者是由一种蛋白质和一种多糖通过加热使蛋白质变性所形成的。
2.根据权利要求1所述的微凝胶，其特征是该微凝胶具有核-壳结构，核含有一种蛋白质，而壳含有另一种蛋白质或者一种多糖；核和壳所带的电荷受溶液pH的影响当微凝胶由两种不同的蛋白质组成时，pH小于两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带正电荷，当pH大于两种蛋白质的等电点时，微凝胶的核和壳都带负电荷，当pH位于两种蛋白质的等电点之间时，微凝胶的核和壳带相反电荷，当pH等于组成微凝胶壳的蛋白质的等电点时，微凝胶的壳不带电荷；当微凝胶由蛋白质和多糖组成时，pH位于蛋白质等电点和多糖电离常数pK之间时，微凝胶的核和壳带相反电荷，对于碱性多糖，当pH大于其pK+2时，微凝胶的壳不带电荷，对于酸性多糖，当pH小于其pK-2时，微凝胶的壳不带电荷。
3.一种如权利要求1所述纳米微凝胶的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤(1)将在相同pH条件下带有不同电荷的蛋白质或者蛋白质和多糖配制成水溶液并使其形成静电复合物或者胶束或者沉淀；(2)其次，调整混合溶液的酸碱度，使其pH值与混合溶液中任一种蛋白质的等电点为0～3，搅拌或者静置以使胶束或者沉淀溶解或者使静电复合物扩散均匀，但不完全解离；(3)最后，加热混合溶液使其中的蛋白质变性，从而得到微凝胶。
4.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是(1)中使用的两种蛋白质具有不同等电点；当使用多种蛋白质时，其中至少有两种蛋白质具有不同的等电点；当使用蛋白质和多糖时，二者在一定的pH范围内带有相反的电荷。
5.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是混合蛋白质或多糖的溶液时，使混合溶液pH值为其中任意两个蛋白质等电点的中间值，或者是任意一个蛋白质等电点与多糖电离常数pK的中间值。
6.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是(1)中先将蛋白质或者多糖配制成质量百分浓度大于0且小于10％的水溶液，再将带有不同电荷的蛋白质与蛋白质或者蛋白质与多糖按摩尔比为0.05～20的比例混合。
7.根据权利要求6所述的微凝胶的制备方法，其特征是先将蛋白质或者多糖配制成质量百分浓度大于0且小于8％的水溶液，再混合。
8.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是混合溶液的pH值用弱酸或弱碱调节。
9.根据权利要求8所述的微凝胶的制备方法，其特征是调节混合溶液pH值时所用的酸是盐酸、醋酸、磷酸或者柠檬酸中的任一种；所用的碱是氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或者醋酸钠中的任一种。
10.根据权利要求8所述的微凝胶的制备方法，其特征是调节混合溶液pH值的弱酸或弱碱浓度为0.01～1.0mol/L。
11.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是混合溶液的pH值与混合溶液中某一个蛋白质的等电点差值为0～2。
12.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是混合溶液的pH值与混合溶液中某一个蛋白质的等电点差值为0～1。
13.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是调节好混合溶液的酸碱度后，搅拌或者静置0-24小时。
14.根据权利要求3所述的微凝胶的制备方法，其特征是加热混合溶液到50～100℃，并保持1分钟～3小时。
15.根据权利要求14所述的微凝胶的制备方法，其特征是加热混合溶液到70～90℃，加热30～120分钟。
16.根据权利要求1所述的微凝胶的应用，其特征是微凝胶形成以后，通过扩散方式将小分子包裹在微凝胶中。
17.根据权利要求1所述的微凝胶的应用，其特征是将该微凝胶作为药物或者营养物的载体。
18.根据权利要求1所述的微凝胶的应用，其特征是将该微凝胶用于口服药物或者营养物的纳米载体。
19.根据权利要求1所述的微凝胶的应用，其特征是将该微凝胶用于制备染料、香料或者化妆品的纳米载体。
全文摘要
本发明提供了一种利用蛋白质/多糖制备的纳米微凝胶及其制备方法，属于生物化学、高分子化学和药物制剂领域。本发明的纳米微凝胶是由在相同pH条件下带有不同电荷的两种蛋白质或者一种蛋白质和一种多糖通过加热使蛋白质变性所形成的。本发明利用在特定pH范围内由两种或两种以上在相同pH条件下带有不同电荷的蛋白质或者蛋白质和多糖分子形成静电复合物、胶束或者沉淀，通过调节溶液pH值并加热，获得具有核—壳结构的纳米微凝胶。该胶体通过包埋/扩散方法，可将药物或者营养物包裹其中，得到可食用的药物或者营养物纳米胶体。亦可将香料或者化妆品或者染料包裹在上述纳米微凝胶中，并在特定环境和特定部位释放。
文档编号A61K47/36GK1654510SQ20051002364
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月27日 优先权日2005年1月27日
发明者姚萍, 喻绍勇, 江明 申请人:复旦大学