专利名称：一种t淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法
技术领域：
本发明属生物组织细胞技术领域，涉及免疫功能重建和肿瘤转移复发的免疫干预，构建免疫功能重建模型的方法。具体涉及一种T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法。
背景技术：
在肿瘤的治疗中，寻找新的而且可以代替当前治疗不足的治疗策略是很多研究者孜孜以求的研究目的之一。研究发现，T细胞免疫在肿瘤免疫中起着重要的作用。尽管肿瘤组织中存在淋巴细胞的浸润，但是这并没有使肝癌的病情进展速度减缓。而有效、且特异性强的研究模型的缺乏，增多了对研究的影响和难度。所以应用T细胞作为干预肿瘤复发和转移的手段，长期以来，一直是生物治疗研究以及免疫治疗的热点之一。目前，有研究应用各种方法建立了各种模型进行肿瘤转移的研究和探讨，但效果欠佳，缺乏一种有效实用的免疫功能重建模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫功能重建和肿瘤转移复发的免疫干预，构建免疫功能重建模型的方法。具体涉及一种T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法。
本发明利用T细胞免疫功能重建在裸鼠体内建立研究模型。
本方法采用正常Balb/c小鼠的胸腺细胞建立在无胸腺的Balb/c nu/nu裸鼠体内，通过提取小鼠T淋巴细胞；采用裸鼠尾静脉多次注射T淋巴细胞的方法，在裸鼠体内建立T淋巴细胞免疫体系；进行T细胞免疫功能重建效果评价等步骤，建立T淋巴细胞免疫功能重建模型。
本方法包括下述步骤(一)提取小鼠T淋巴细胞取健康雄性正常小鼠，处死后无菌取胸腺，置不完全培养液中，于200目金属网上研压，收集细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次并重新悬浮；将悬浮的细胞再次离心，计数，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞层(胸腺细胞)，用PBS重新悬浮，并计数；将分离的单个核细胞用T淋巴细胞分离柱进行分离，收集分离到的T淋巴细胞。
(二)在裸鼠体内建立T淋巴细胞免疫体系取健康雄性裸小鼠，分为T细胞免疫功能重建组和未重建组。第1天取T淋巴细胞分别经尾静脉注入小鼠体内，细胞数量为6-8×106/0.3ml/只。此后每周尾静脉注射T淋巴细胞1次，3周后处死小鼠。
(三)T细胞免疫功能重建效果评价1.淋巴细胞表型鉴定分别取T细胞免疫重建和未重建的小鼠的外周血淋巴细胞以及脾细胞，于流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8细胞的百分比及CD4/CD8比值。每组随机抽取7例样本进行检测。
2.淋巴细胞功能检测采用混合淋巴细胞反应。取免疫重建后的裸鼠脾脏以及未进行免疫功能重建的裸鼠的脾脏，按常规方法分离淋巴细胞。将淋巴细胞和肿瘤细胞按20∶1加入96孔圆底培养板，培养72h后，每孔加入3H-TdR 1μCi，继续培养16h收集细胞，液闪记数仪测cpm值。
本发明具有以下特点1)所采用的两种小鼠种系相同，高、低转移的细胞株亦是小鼠来源，排除了MHC限制性对研究的影响，与常规在SCID小鼠体内模拟人体内的免疫环境不同。2)T细胞免疫是肿瘤细胞的免疫主要内容。该方法在裸鼠体内较为单纯地模拟了T细胞免疫功能的重建，经过流式细胞仪检测裸鼠的外周血和脾脏T淋巴细胞的表达，证实了该免疫重建模型的有效性。3)所采用的Balb/c nu/nu裸鼠为胸腺缺如的小鼠。
本方法利用胸腺细胞进行免疫功能重建，可以较好的模拟免疫环境，便于深入进行研究。在研究免疫与肿瘤转移方面具有较大的价值，可以为进一步进行肿瘤免疫方面的研究及临床治疗效果的探讨提供技术平台。
本方法在裸鼠体内建立起一个以T细胞免疫功能重建为基础的模型，为进一步进行免疫与肿瘤的转移和复发的关系提供实验平台。本发明以裸鼠为模型，应用高、低转移潜能的细胞系，可以进一步研究不同转移潜能肝癌和宿主免疫状态之间的关系。
图1是流式细胞仪检测免疫功能重建后高、低转移组的CD4、CD8表达的检测，免疫重建后波峰大小均高于免疫功能未重建组。
其中，高转移组免疫功能重建a.CD4，b.CD8；高转移组免疫功能未重建c.CD4，d.CD8；低转移组免疫功能重建e.CD4，f.CD8；低转移组免疫功能未重建g.CD4，h.CD8图2是不同转移潜能肝癌细胞在裸鼠足垫免疫重建前后肿瘤生长曲线。其中，P1免疫重建高转移组；P2免疫未重建高转移组；F1免疫重建低转移组；F2免疫未重建低转移组。
图3是615小鼠肿瘤生长曲线。
其中，P高转移组；F低转移组。
图4是T细胞免疫功能重建前后裸鼠肿瘤生长情况，显示免疫功能重建后肿瘤体积明显的缩小。
其中，AT细胞免疫功能重建前，BT细胞免疫功能重建后。
具体实施例方式
实施例1(一)提取小鼠T淋巴细胞取2只4周龄Balb/c雄性小鼠(购于复旦大学实验动物中心)引颈处死小鼠，70％乙醇浸泡1-2分钟。消毒腹部皮肤，无菌取胸腺，放于不含小牛血清的RPMI1640中，洗去血迹，剪去脂肪及筋膜组织。于200目金属网上研压，收集网下细胞悬液注入无菌离心管中，用不完全培养液洗涤2次并重新悬浮。
将悬浮的细胞再次离心，计数，调整至6ml的体积，与淋巴细胞分离液按照细胞悬液∶分离液＝2∶1的体积小心将细胞悬液加于分离液上方，分层放置。再于600g水平离心20min。小心取出离心管，吸取中间的单个核细胞层(胸腺细胞)，用PBS重新悬浮，并计数。
将分离的单个核细胞用T淋巴细胞分离柱(CEDARLANE，加拿大)进行分离。收集分离到的T淋巴细胞流式细胞。
(二)在裸鼠体内建立T淋巴细胞免疫体系取42只Balb/c nu/nu雄性裸小鼠(购于中科院上海实验动物中心)，分为4组。分别是肿瘤高转移重建组(免疫重建后，接种高转移潜能的肝癌细胞，P1)，高转移未重建组(未进行免疫重建，接种高转移潜能的肝癌细胞，即对照组，P2)，低转移重建组(免疫重建后，接种低转移潜能的肝癌细胞，F1)，低转移未重建组(未进行免疫重建，接种低转移潜能的肝癌细胞，F2)。第1天取T淋巴细胞分别经尾静脉注入小鼠体内，细胞数量为6-8×106/0.3ml/只。此后每周尾静脉注射T淋巴细胞1次，3周后处死小鼠。
(三)T细胞免疫功能重建效果评价1.淋巴细胞表型的鉴定分别取高、低转移组的小鼠的外周血淋巴细胞以及脾细胞(分离方法同上)，配制成大约1×106/ml，按照106细胞量加入10μl小鼠CD3、CD4、CD8流式抗体，避光反应30分钟后，流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8细胞的百分比。每组随机抽取7例样本进行检测。结果表明，T细胞免疫功能重建前后细胞表面标志物有变化，裸鼠T细胞免疫功能重建后的CD4/CD8与对照组相比有明显的差异(p＜0.05)。其中免疫功能重建后裸鼠外周血、脾脏的CD3、脾脏CD4的绝对百分比、脾脏CD4/CD8均高于免疫功能未重建组(p＜0.05)。CD8的绝对百分比在免疫重建组与对照组相比没有显著性差异(p＞0.05)。
表1是T细胞免疫功能重建前后裸鼠脾脏淋巴细胞标志物变化(％)。
2.淋巴细胞功能的检测采用混合淋巴细胞反应，进行体外实验。分别于无菌条件下取两只免疫重建后的裸鼠脾脏以及未进行免疫功能重建的裸鼠的脾脏，按照上述程序分离单个核细胞。进行混合淋巴细胞反应。具体方法将分离的淋巴细胞用PBS洗涤三次，悬浮于完全培养基中，调整细胞浓度为2×106/ml。淋巴细胞和肿瘤细胞按20∶1加入96孔圆底培养板，终体积200μl，每组设5个复孔，37℃、5％CO2条件下培养72h后，每孔加入3H-TdR 1μCi，继续培养16h收集细胞，液闪记数仪测cpm值。用SPSS11.0软件对各组cpm进行t检验，判断淋巴细胞杀伤潜力。结果显示，免疫功能正常的接种高(P)、低(F)转移细胞株的T细胞与相应的肿瘤细胞进行混合淋巴细胞反应后，其cpm值均低于未重建组的cpm值。其中在高转移组(P组)的cpm值明显的小于对照组(p＜0.05)。
表2是裸鼠T细胞免疫功能重建后T淋巴细胞功能检测结果。
实施例2高、低转移肝癌细胞的接种取4×106-6×106Hca-P、Hca-F细胞分别注入615小鼠腹腔内，5天后处死小鼠，无菌条件下取腹水，用生理盐水洗涤2遍后调整肿瘤细胞浓度至6×106/40μl/只，于第1次尾静脉注射胸腺T淋巴细胞后的第2天注入裸鼠左下肢爪的皮垫内，观察成瘤情况和肿瘤生长情况。成瘤后每隔3天测各组肿瘤大小，计算肿瘤体积。结果表明免疫功能重建后肿瘤体积明显的缩小。
本方法所采用的高、低转移肝癌细胞购于大连医科大学或参照文献Hou，L.，et al.，2001.7(4)p.532-6.。
2.T细胞免疫功能重建对肿瘤转移的干预治疗提取出T淋巴细胞后，尾静脉注射入实验组的小鼠体内。每周重复注射一次。接种肿瘤细胞3周后，处死各组裸鼠。根据肿瘤的淋巴道转移分站规律，分别取双侧膝关节窝、腹股沟、髂总动脉旁，肾门淋巴结，做H-E染色病理，显微镜下观察肿瘤转移情况。
3.实验结果1)不同转移潜能肿瘤细胞生长速度比较裸小鼠接种肿瘤细胞后，成瘤时间为7.7±0.6天，而在Balb/c小鼠中的成瘤时间为11.5±1.3天。在裸小鼠接种肿瘤细胞成瘤后，P组肿瘤生长速度均明显高于F组。其中对于P、F组小鼠，免疫重建后的小鼠肿瘤生长速度小于免疫功能未重建组(图2，图3，图4)。
2)免疫重建前后不同转移潜能细胞转移程度的差异通过取各组裸小鼠膝关节窝淋巴结、腹股沟淋巴结、髂总动脉旁淋巴结、肾门淋巴结、腋窝淋巴结进行病理H-E染色比较，P组的转移率在重建组与未重建组均高于相应的F组。对于P、F组，免疫功能重建后的转移率小于免疫功能未重建组。在腹股沟淋巴结、髂总动脉旁淋巴结、肾门淋巴结有显著性差异(p＜0.05)。
表3是裸小鼠免疫重建前后不同转移潜能细胞转移程度的差异。
相信根据上述内容，本领域技术人员可以实现本发明。本方法建立T淋巴细胞免疫功能重建模型方法具有方法简便，建立模型的成功率高，实用性强的特点。便于进行基础及临床前研究机理探讨，以及进行临床免疫治疗的效果评价。应用本方法在体内的实验中进一步证实了该方法的可靠性和有效性，并且在基础研究及临床前的体内实验中具有较强的实用价值。
表1 T细胞免疫功能重建前后裸鼠脾脏淋巴细胞标志物变化(％)
*与免疫功能未重建组相比p＜0.05**未重建即未注射胸腺细胞不裸鼠，系空白对照组；P组重建T细胞免疫功能重建后裸 鼠足垫注射高转移潜能的肝癌细胞(Hca-P)；F组重建T细胞免疫功能重建后裸鼠足垫注射低转移潜能的肝癌细胞(Hca-F)。
表2裸鼠T细胞免疫功能重建后T淋巴细胞功能检测
*与未重建组相比，经t检验p＝0.018表3裸小鼠免疫重建前后不同转移潜能细胞转移程度的差异
*重建组与未重建比较，秩和检验p＜0.05**P组与F组比较，秩和检验p＜0.05。
权利要求
1.一种T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法，其特征是采用正常Balb/c小鼠的胸腺细胞建立在无胸腺的Balb/c nu/nu裸鼠体内，包括下述步骤1)提取小鼠T淋巴细胞；2)在裸鼠体内建立T淋巴细胞免疫体系；3)T细胞免疫功能重建效果评价。
2.按权利要求1所述的T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法，其特征是所述步骤2的免疫重建手段采用裸鼠尾静脉多次注射T淋巴细胞的方法。
3.按权利要求1所述的T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法，其特征是所述步骤3的T细胞免疫功能重建效果评价包括表型鉴定和功能检测。
4.按权利要求3的方法，其中步骤3的表型鉴定是检测外重建后裸鼠外周血和脾脏淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD4/CD8值。
5.按权利要求3的方法，其中步骤3的功能检测采用双向混合淋巴细胞反应实验进行评价。
全文摘要
本发明属生物组织细胞技术领域，具体涉及一种T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立方法。本方法采用正常Balb/c小鼠的胸腺细胞建立在无胸腺的Balb/c nu/nu裸鼠体内，通过提取小鼠T淋巴细胞；采用裸鼠尾静脉多次注射T淋巴细胞，在裸鼠体内建立T淋巴细胞免疫体系；进行T细胞免疫功能重建效果评价等步骤，建立T淋巴细胞免疫功能重建模型。本方法以不同转移潜能的肝癌为基础，应用高、低转移潜能的肝癌的免疫干预治疗，取得了较为理想的效果。可进一步研究不同转移潜能肝癌和宿主免疫状态之间的关系。为免疫与肿瘤的转移和复发的关系提供实验平台。
文档编号A61K49/00GK1698905SQ200510026370
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者叶胜龙, 王凯峰, 宋丽杰 申请人:复旦大学附属中山医院