专利名称：一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法
技术领域：
本发明关于血管抑制剂干预口腔癌动物模型的方法，特别关于反应停干预口腔癌动物模型的方法。
背景技术：
口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。由于其易转移，预后差，口腔癌的预防尤为重要。癌化学预防目前已经成为降低口腔癌发生率最有希望的手段之一。鉴于癌化学预防药物的长期应用性，开发以天然植物或食物为基础的药物是当前癌化学预防的方向所在。
活血化淤是中医治疗肿瘤的基本治则之一。临床研究表明活血化淤药有改善微循环、抗凝血、抑制癌细胞生长和转移、提高机体免疫功能等多种作用。长期的临床实践也证实，运用活血化淤药治疗各种肿瘤可获得较好的结果。
在众多的活血化瘀中药中，丹参是临床中最为常用的一味活血化淤药。目前对于丹参保护心脏微血管内皮细胞、抑制血管内皮生长因子的血管通透性、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用方面已有深入的研究，并认为丹参酮是丹参中主要的抗肿瘤成分。丹酚酸B是丹参水溶性成分中含量最高、活血化瘀作用最强的一种。对于丹酚酸B是否同样具有抗肿瘤作用，目前尚无系统的研究报道。
血管生成对肿瘤的生长和转移起着重要的作用。研究结果表明，肿瘤相关性血管的生成始于癌前病变阶段，这些新生血管与癌前病损的恶性转变密切相关，并认为癌前病变进展到血管期可能是细胞恶性转变的重要步骤。周曾同等对金地鼠颊囊癌变模型的癌变全过程进行观察发现白斑作为一种癌前病变，伴随其上皮异常增生程度的加重，即有血管生成。因此，通过抗血管生成治疗很有可能抑制一些癌前病变如口腔白斑的恶性转变，从而达到预防口腔癌的目的。
反应停最初是以一种镇静止吐药物上市的。由于其具有严重的致畸作用，上市不久该药就被禁止使用了。近年来，研究显示反应停具有明显抑制血管生成的作用，而且目前已有大量的研究证实该药抗血管生成的作用能抑制肿瘤中新生血管的生成，进而抑制肿瘤的生长。然而有关该药对口腔癌的作用，尚缺乏完整的资料。
本发明使用口腔癌动物模型，初步探讨丹酚酸B和反应停对口腔癌的防治功效，为活血化淤中药和血管抑制剂在癌化学预防及肿瘤治疗中的应用提供科学理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的(1)建立口腔癌动物模型、(2)反应停药物干预、(3)组织学检查、(4)病理评价。
在口腔癌和癌前病变的研究中，需要提供一个重复性好、稳定又容易建立的、具有与人类口腔癌和癌前病变相似生长特性和生物学行为的动物模型。DMBA诱导的金地鼠颊囊癌变模型是深入研究口腔癌前病变和口腔癌的理想工具，其发生发展以及组织学的变化过程与人口腔癌的发展过程极为相似，可再现口腔癌发生过程中的多个步骤，即正常上皮，单纯性上皮增生，异常增生，原位癌，和浸润癌。
本发明结果显示给予金地鼠颊囊黏膜连续6周DMBA刺激后，在第18周时，金地鼠颊囊黏膜表现出白斑样损害、乳头状瘤和癌三种病损，其上皮可表现出正常、单纯性增生、异常增生和鳞状细胞癌等多种组织病理学表现。本发明中阳性对照组鳞癌的发生率为47.1％，其中约70％的鳞癌是从乳头状瘤发展而来。这一结果与Ning Li等报道的结果相近。然而，本发明癌变率明显较以往报道的癌变率低，以往报道的癌变率大多在75％以上。分析其原因可能与本发明致癌剂诱导的时间和停止诱导后观察的时间较短有关。本发明涂DMBA的时间仅有6周，停涂致癌剂后观察12周。而以往的研究涂致癌剂的时间为12-16周，停止DMBA刺激后继续观察8-14周。本发明仅给金地鼠颊囊黏膜6周的DMBA刺激的目的在于诱导形成口腔癌诱癌晚期阶段模型，用该模型模拟临床上具有口腔白斑等癌前病变以及曾经接触过致癌剂的口腔癌高危人群，如有吸烟史或正在吸烟的人群。
本发明结果还显示丹酚酸B将金地鼠颊囊粘膜癌诱癌晚期模型的癌变率从47.1％降低到5.6％，可见该药能有效防止金地鼠颊囊黏膜从癌前阶段向癌演变，对金地鼠颊囊粘膜的癌变过程表示出显著的阻断作用。尽管从病理检查结果来看，丹酚酸B组有相当一部分动物的颊囊粘膜上皮表现出不同程度的异常增生，不排除随时间的延长这些动物中部分甚至全部有癌变的可能性(这有待于在以后的实验中延长实验观察时间来证实)，但丹酚酸B防止金地鼠颊囊粘膜癌变的有效性仍然是显而易见的，至少它在早期能显著抑制颊囊粘膜癌变，推迟颊囊粘膜癌出现的时间。
活血通经、改善微循环是丹酚酸B的主要功效之一。已知缺氧是机体内血管生成的一种启动信号，它可以通过缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)诱导一系列血管生成因子的表达，如血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor)，可诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase)等。由此推测丹酚酸B通过改善全身和局部组织的血液循环，增加组织的血供和营养，改善局部的缺氧状况，避免HIF-1α的激活，进而抑制血管生成因子的表达，避免血管生成开关的开启。已有报道丹酚酸B在体外能显著抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管通透性增高作用。至于丹酚酸B是否还影响到与肿瘤血管生成过程中其它一些相关的生长因子，以及HIF-1α是否参与丹酚酸B预防口腔癌前病变癌变以及其具体的作用机制，我们正在进行进一步的研究。
另一方面，丹酚酸B还具有很强的抗脂质氧化和自由基清除作用。这两种机制是否也参与了丹酚酸B防止口腔癌前病变的癌变过程，尚需要进一步的研究加以探讨。
本发明显示反应停能显著抑制金地鼠颊囊黏膜癌的形成，将患癌率从47.1％降低到5.9％。这一结果与Hoon Myoung等的结果出入较大。Hoon等在口腔癌的移植瘤模型中没有观察到反应停对口腔癌生长的抑制作用。我们推测这可能与实验所选用的动物模型和实验设计的差异有关。移植瘤模型形成的是异位肿瘤，这种肿瘤在生物特性和血管生成等方面与发生在口腔内的肿瘤相比可能具有较大的差异。而且，目前已有学者提出抗血管生成药物的抗血管特性也具有器官特异性，这种特性可能也是造成反应停不能抑制移植于老鼠皮肤下的口腔癌生长的原因之一。然而，本发明中值得注意的一个问题是，反应停组有3只动物在实验中途出现单侧眼睑麻痹，不能睁眼，同侧上肢淤血、僵硬、坏死最后感染致死的情况。我们推测这可能是单侧肢体发生静脉栓塞造成的。而其它几组动物都未出现这种情况。由此可见，反应停虽然具有显著的抗肿瘤作用，但其毒副作用较大，也是在临床使用中不可忽视的一个问题。
至于丹酚酸B和反应停对口腔癌的抑制作用还有待于在今后的研究中进一步加以证实，其具体的抑癌机制也有待于深入的研究。
本发明所公开一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法其优点表现在(1)合理地选用DMBA诱导金地鼠颊囊癌变模型，本发明仅给金地鼠颊囊黏膜6周的DMBA刺激的目的在于诱导形成口腔癌诱癌晚期阶段模型，用该模型模拟临床上具有口腔白斑等癌前病变以及曾经接触过致癌剂的口腔癌高危人群，如有吸烟史或正在吸烟的人群；(2)本发明药物干预时间从第7周开始连续12周，实验时间适中，便于本发明实施；(3)本发明选用药量为100mg.kg-1.d-1，灌服途径作用于动物，充分发挥了反应停的作用效果。
图1显示正常颊囊黏膜(HE染色，放大倍数400)
图2显示单纯性增生(HE染色，放大倍数400)图3显示异常增生(HE染色，放大倍数400)图4显示乳头状瘤(HE染色，放大倍数100)图5显示乳头状瘤癌变(HE染色，放大倍数100)图6显示鳞癌(HE染色，放大倍数100)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1一.实验动物和药品1.实验动物的选择和分组6-8周龄，体重80-100克的雄性叙利亚金黄地鼠80只，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供〔许可证号SCXK(沪)2002-2003〕。分笼饲养，每笼5只，饲以金地鼠专用饲料，饮用水为蒸馏水。随机分为A、B、C、D和E 5组，A、B和C组各20只，D组和E组各10只。
2.化学致癌剂将二甲基苯丙蒽(7，12-Dimethylbenz(a)anthracene，DMBA)(sigma)与分析纯丙酮溶液配制成5g/L的DMBA溶液。
3.药物丹酚酸B原药由第二军医大学药学院天然药化教研室提供并鉴定。反应停原药由常州制药厂提供。
二.实验方法1.口腔癌动物模型的建立用大直镊翻开金地鼠右侧颊囊，用蘸有0.5％DMBA丙酮溶液的1号油画笔在颊囊中心1cm×1cm的范围内作10次圆周运动。涂药后禁食禁水2小时。每周一、三、五各涂药1次，共涂6周。
2.药物干预(1)A组从第1周至第6周，按上述方法诱导口腔癌。从第7周开始连续12周每日灌服1ml生理盐水，作为阳性对照组。
(2)B组前六周处理同A组。从第7周开始连续12周每日灌服丹酚酸B溶液。给药量定为成人常规用量的10倍，即10mg.kg-1.d-1。
(3)C组前六周处理同A组。从第7周开始连续12周每日灌服反应停混悬液。给药量为100mg.kg-1.d-1。
(4)D组前六周，每周一、三、五在金地鼠右侧颊囊涂布丙酮溶液。从第7周开始每日灌服生理盐水1ml，共12周，作为溶剂对照组。
(5)E组整个实验期间正常饲养，不做任何处理，作为空白对照组。
3.组织学检查和病理评判标准(1)组织学检查切取金地鼠右侧颊囊病变组织约1.0cm×1.0cm大小，10％中性甲醛固定，常规脱水、包埋、切片并作HE染色。
组织学观察结果6周时，部分DMBA处理过的动物颊囊表面局部可见粗糙、颗粒状的表现，伴有不同程度的充血，少数有白斑样损害，但这些动物中没有肿瘤产生。
18周时，DMBA处理过的动物颊囊黏膜在组织学上表现为单纯性增生(图2)、异常增生(图3)、乳头状瘤(图4)和鳞癌(图5和图6)。在形成的鳞癌中，约70％是从乳头状瘤发展而来(图5)。A组有3只动物死亡，8只动物发生肿瘤，均为鳞状上皮细胞癌，有3只动物表现出上皮轻度异常增生，4只表现出上皮中度异常增生，1只表现出上皮重度异常增生。B组有2只动物死亡，1只动物发生鳞状上皮细胞癌，有3只动物的颊囊上皮表现为单纯性增生，11只动物表现出上皮轻度异常增生，2只动物表现出上皮中度异常增生，1只表现出上皮重度异常增生。C组有3只动物死亡，1只动物发生鳞状上皮细胞癌，有4只动物的颊囊上皮表现为单纯性增生，8只动物表现出上皮轻度异常增生，2只动物表现出上皮中度异常增生，2只表现出上皮重度异常增生。3只中途死亡的动物在死亡之前皆出现一侧上肢淤血、僵硬最后坏死的情况，同时还伴有同侧眼睑麻痹，不能睁眼的情况。D组有3只动物颊囊黏膜表现为炎症，其余7只为正常。E组动物的病理观察结果均为正常上皮。与A组相比，丹酚酸B组和反应停组的癌发生率明显降低(分别是47.1％、5.6％和5.9％)(p＜0.005)。
(2)病理评价标准根据WHO口腔癌前病变协作中心12项诊断标准及病变累及上皮的范围进行分级诊断，双人复核。
各组动物颊囊粘膜的病理观察结果详见表1。
表1.各实验组颊囊黏膜不同病理状态的分布情况
·代表治疗组与A组中相同病理状态发生率进行比较的统计学差异(·代表P＜0.05；··代表P＜0.005)4.统计分析各实验组的肿瘤发生率用卡方检验进行比较。当P值＜0.05时记为差异有统计学意义。所有的统计分析均采用SPSS 10.0软件进行。
权利要求
1.一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤(1)建立口腔癌动物模型(2)反应停药物干预。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于(1)步骤中使用金地鼠建立口腔癌金地鼠模型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于(1)步骤中使用0.5％DMBA丙酮溶液建立口腔癌金地鼠模型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于(1)步骤中0.5％DMBA丙酮溶液涂用6周。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于(2)步骤中从第7周开始连续12周每日灌服反应停混悬液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于(2)步骤中反应停混悬液使用量为100mg·kg-1·d-1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括(3)步骤组织学检查。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括(4)步骤病理评价。
全文摘要
本发明涉及一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法，包括以下步骤(1)建立口腔癌动物模型、(2)反应停药物干预、(3)组织学检查、(4)病理评价。本发明所公开一种反应停有效干预口腔癌动物模型的方法其优点表现在(1)合理地选用DMBA诱导金地鼠颊囊癌变模型；(2)药物干预时间从第7周开始连续12周，实验时间适中，便于本发明实施；(3)选用药量为100mg.kg
文档编号A61K49/00GK1727006SQ20051002830
公开日2006年2月1日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者周曾同, 杨娅 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院