专利名称：提高抗肝纤维化作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，涉及提高抗肝纤维化作用的药物，具体涉及含丹酚酸B盐与虫草多糖的药物组合物及其在制备治疗慢性肝病药物中的用途。
背景技术：
肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经病理过程，其形成与发展是影响肝病预后、转归的关键，也是慢性肝病治疗中最为棘手的问题之一。目前临床上尚无应用于抗肝纤维化的西药，在我国，已进入临床应用的中药有鳖甲软肝片，扶正化瘀胶囊等中药复方，已进入临床试验的中药有效组分或成分有苦参素、丹酚酸B盐，但临床治疗效果还有待于进一步观察。
丹酚酸B盐是自中药唇形科植物丹参(Salvia miltionrrhiza Bge)的干燥根及根茎中提取出的有效成分，分子式C36H28MgO16，性质黄色粉末，分子量740。虫草多糖(Cordyceps Polysaccharide，CP)从人工虫草菌丝中提取。迄今为止，尚未见有将上述中药有效的联合应用于治疗肝纤维化的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以提高抗肝纤维化作用的中药组合物，具体涉及一种治疗慢性肝病的含丹酚酸B盐与虫草多糖的药物组合物。
本发明所述的药物组合物由丹酚酸B盐与虫草多糖组成，其组分重量百分比为丹酚酸B盐60％-10％；虫草多糖40％-90％。
所述的丹酚酸B盐由中科院上海药物所提取自原生药丹参，纯度65％；虫草多糖(Cordyceps Polysaccharide，CP)从原生药人工虫草菌丝中提取。
本发明将丹酚酸B盐与虫草多糖联合应用，可按常规方法制成药物组合物临床常用制剂，所述药物组合物制剂的剂型，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。
本发明所述药物组合物经动物模型试验，结果证实，可显著降低模型大鼠肝组织Hyp含量和I型胶原蛋白的表达水平，同时显著降低TGF-β1及其受体的表达，上述作用优于各自单用的效果。表明所述组合物中2种组分联合应用可以提高抗肝纤维化的效果，能有效治疗和预防各种慢性肝病，包括肝纤维化、肝硬化和脂肪性肝病等病症。
图1.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织I型胶原表达的影响。
其中采用Western印迹杂交法，提取50μg肝组织蛋白，不经高温变性，10％SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转膜，多克隆I型胶原抗体(1∶200)，孵育，二抗结合后，ECL曝光，I型胶原140&120kD相对分子量。泳道1-5分别为正常组；模型组；丹酚酸B组；虫草多糖组；本发明药物组。
图2.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TGF-β1表达的影响。
其中采用Western印迹杂交法，提取50μg肝组织蛋白，100℃变性，10％SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转膜，多克隆TGF-β1抗体(1∶200)，孵育，二抗结合后，ECL曝光，TGF-β1 25kD相对分子量。泳道1-5分别为正常组；模型组；丹酚酸B组；虫草多糖组；本发明药物组。
图3.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TβR I表达的影响。
其中采用Western印迹杂交法，提取50μg肝组织蛋白，100℃变性，10％SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转膜，多克隆TβR I抗体(1∶200)，孵育，二抗结合后，ECL曝光，TβR I 53kD相对分子量。泳道1-5分别为正常组；模型组；丹酚酸B组；虫草多糖组；本发明药物组。
图4丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TβR II表达的影响。
其中采用Western印迹杂交法，提取50μg肝组织蛋白，100℃变性，10％SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转膜，多克隆TβR II抗体(1∶200)，孵育，二抗结合后，ECL曝光，TβR II 45kD相对分子量。泳道1-5分别为正常组；模型组；丹酚酸B组；虫草多糖组；本发明药物组。
具体实施例方式
本发明中药组合物的有益效果通过下述实验证实实施例1 制备药物组合物临床常用制剂根据所述重量百分比，取丹酚酸B盐60％-10％(中科院上海药物所)；与虫草多糖40％-90％(从原生药人工虫草菌丝中提取)，按常规方法制成药物组合物临床常用制剂，所述药物组合物制剂的剂型，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。
实施例2A体内实验一、材料1.药物二甲基亚硝胺，东京化成工业株式会社产品。丹酚酸B盐由中科院上海药物所提取，纯度65％。虫草多糖(Cordyceps Polysaccharide，CP)从人工虫草菌丝中提取。丹参为丹酚酸B提取的原生药。虫草菌丝为虫草多糖提取的原生药。
2.实验动物Wistar大鼠100只，雄性，清洁级，体重(150±10)g，中科院上海实验动物中心提供。
3.主要试剂血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒、血清门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、血清白蛋白(Alb)测定试剂盒、血清总蛋白(TP)测定试剂盒，均购自卫生部上海生物制品研究所。Transforming growthfactor β1(TGF-β1)、transforming growth factor beta type I receptor(TβR I)、transforming growth factor beta type II receptor(TβR II)抗体(多克隆)，购自R&D公司。I型胶原抗体(多克隆)，购自Oal Biochem公司，批号B 39984。辣根过氧化物标记驴抗兔抗体(2抗)，(Anti-Rabbit Ighorseradish，peroxide linked whole antibody，from donkey)，批号A934V1/93/01，Amersham life science公司。辣根过氧化物标记驴抗鼠抗体(2抗)，(Anti-mouse Ig horseradish，peroxide linked whole antibody，fromdonkey)，批号A934V1/93/01，Amersham life science公司。
二、方法1.制备动物模型参照Alakkok方法。0.9％(m/V)NaCl稀释DMN为0.5％(Vol/Vol)浓度，以10μl DMN.kg-1大鼠体重的剂量，以2ml.kg-1大鼠体重容积腹腔注射DMN，每d1次，每w连续3d，共4w。
2分组与治疗100只Wistar大鼠，随机选取8只大鼠做为正常组，其余随机分为模型组、丹酚酸B组、虫草多糖组、本发明药物组合物组、丹参组、虫草菌丝组、丹参+虫草菌丝组，共8组。造模结束后，模型组使用自来水10ml.kg-1灌胃，其余各组使用相应药物灌胃。治疗4周。
治疗4W后，以2％戊巴比妥钠按2ml·kg-1剂量腹腔注射麻醉大鼠，后腔静脉采血，离心分离血清，取肝脏左叶组织，10％福尔马林固定，脱水，透明，石蜡包埋，用于胶原和免疫组化染色。其余肝组织分装在1.5ml离心管备用。
3.指标检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，赖氏法；血清白蛋白(Alb)，溴钾酚绿比色法；均按卫生部上海生物制品研究所试剂盒说明进行。肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量测定Jamall氏法[1]。肝组织TGF-β1、TβR I、TβR II、I型胶原、α-SMA，Western印迹法取50μg肝组织总蛋白经10％SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉TTBS液(TBS+0.1％Tween-20)封闭后，分别与TGF-β1、TβR I、TβR II、I型胶原(1∶200)孵育过夜，洗涤后再加入相应二抗，经ECL(Pierce公司)底物化学发光自显影。每项试验均重复三次。
4.统计学处理所有数据均使用SPSS11.0软件包进行统计学分析。计量资料均写成平均数±标准差(x±s)形式。正常组与模型组比较用t检验，模型组与各治疗组比较使用SNK-q检验。
结果显示1.药物对肝纤维化大鼠肝功能的影响与正常大鼠比较，模型大鼠血清ALT水平明显升高(P＜0.01)，白蛋白明显降低(P＜0.05)，总蛋白较正常组明显降低(P＜0.01)。各药物组对ALT、AST活性无明显影响，对白蛋白含量有不同程度促进作用，以虫草多糖最为显著，丹酚酸B与虫草多糖合用、丹参与虫草菌丝合用后均无明显协同效应。表1是丹酚酸B、虫草多糖对DMN模型大鼠血清肝功能的影响(x±s))
表1.
注※P＜0.01，vs正常组；*P＜0.05，**P＜0.01，vs模型组2.药物对肝纤维化大鼠肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量的影响与正常大鼠比较，模型大鼠Hyp明显升高(P＜0.01)；各药物组与模型组相比，Hyp明显降低(P＜0.01)，各药物组之间虽无统计学差异，但丹参与虫草菌丝二种药物、丹酚酸B与虫草多糖二种成分配伍后均优于各自单用，且成分配伍组优于单味药物配伍组。(表2)表2.丹酚酸B、虫草多糖对DMN模型大鼠肝组织羟脯氨酸的影响(x±s)
注※P＜0.01，vs正常组；*P＜0.01，vs模型组3.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织I型胶原表达的影响Western bloting检测肝组织I型胶原的表达，结果显示，模型组I型胶原表达明显增加，经药物治疗后，I型胶原表达量明显减少(P＜0.01)，抑制程度依次为本发明药物组＞丹酚酸B＞虫草多糖(P＜0.01)，本发明药物组抑制作用最为显著。(表3)
表3.丹酚酸B、虫草多糖对肝组织I型胶原表达的影响(x±s)
注※P＜0.01，vs正常组；*P＜0.01，vs模型组；△P＜0.01，vs丹酚酸B+虫草多糖组；▲P＜0.01，vs虫草多糖组。
4.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TGF-β1表达的影响Western bloting检测肝组织TGF-β1的表达，结果显示，模型组TGF-β1蛋白表达明显增加，经药物治疗后，TGF-β1表达量明显减少(P＜0.01)，中药组分配伍组优于各自单用(P＜0.01)。(表4)表4.丹酚酸B、虫草多糖对肝组织TGF-β1表达的影响(x±s)
注※P＜0.01，vs止常组；*P＜0.01，vs模型组；△P＜0.01，vs中药组分配伍组5.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TβR I表达的影响Western bloting检测肝组织TβR I的表达，结果显示，模型组TβR I蛋白表达明显增加，经药物治疗后，TβR I表达量明显减少(P＜0.01)，中药组分配伍组优于各自单用(P＜0.01)。(表5)表5.丹酚酸B、虫草多糖对肝组织TβR I表达的影响(x±s)
注※P＜0.01，vs正常组；*P＜0.01，vs模型组；△P＜0.01，vs中药组分配伍组。
6.丹酚酸B、虫草多糖及丹酚酸B合虫草多糖对肝组织TβR II表达的影响Western bloting检测肝组织TβR II的表达，结果显示，模型组TβR II蛋白表达明显增加，经药物治疗后，TβR II表达量明显减少(P＜0.01)，抑制程度依次为中药组分配伍组＞丹酚酸B＞虫草多糖(P＜0.01或P＜0.05)，合用的抑制作用最为显著(表6)表6.丹酚酸B、虫草多糖对肝组织TβRII表达的影响(x±s)
注※P＜0.01，vs正常组；*P＜0.01，vs模型组；△P＜0.01，vs中药组分配伍组；▲P＜0.05，vs虫草多糖组。
B.体外实验方法①药物直接添加于活化的大鼠肝星状细胞，以3H-TdR掺入法检测细胞增殖，ELISA法/貂肺上皮细胞株-Mv1Lu增殖抑制试验检测TGFβ1的分泌总量及其活性，Western blot法检测胞内信号分子MAPK活性，免疫细胞化学染色法观察受体TβRI、TβRII的变化，RT-PCR法分析I型前胶原、TGFβ1mRNA的表达。②药物血清添加于活化的大鼠肝星状细胞，以MTT比色法观察细胞增殖，以貂肺上皮细胞株-Mv1Lu增殖抑制试验检测TGFβ1的活性。结果1)药物直接添加实验显示①丹参酸乙、虫草多糖及其联合应用均能抑制星状细胞增殖，且联合应用优于丹参酸乙。②丹参酸乙及其与虫草多糖的联合应用能减少TGFβ1分泌总量，抑制TGFβ1活化，虫草多糖仅能减少TGFβ1分泌总量。③活化的星状细胞表达TβRI、TβRII，受体均呈膜浆型分布，各药物组亦均有表达，未见与对照组有显著差异。④丹参酸乙能抑制MAPK活化，虫草多糖及两药的联合应用对MAPK有促进作用。⑤本发明药物组合物组有抑制I型前胶原mRNA表达的趋势。2)药物血清添加实验显示本发明药物组合物组的药物血清能抑制星状细胞增殖、抑制TGFβ1活化，而药物单用血清无此效应。
结果证实丹参酸乙不仅减少TGFβ1分泌总量及抑制TGFβ1活化，而且阻抑MAPK活化，还抑制肝星状细胞增殖。因此，丹参酸乙影响TGFβ1在肝星状细胞中的信号转导及细胞增殖功能是丹参酸乙抗肝纤维化的重要机制之一；虫草多糖能抑制星状细胞增殖，减少TGFβ1分泌总量，从抑制TGFβ1的综合效应看，丹参酸乙优于虫草多糖，本发明药物组合物组两药合用能弥补虫草多糖的不足；本发明药物组合物组丹参酸乙与虫草多糖合用有协同作用，在抑制肝星状细胞增殖、阻抑TGFβ1活化方面皆优于各组分单用。表7是丹酚酸B、虫草多糖对传代HSC增殖的影响(cpm/well，x±s)，表8.丹酚酸B、虫草多糖药物血清对HSC增殖的影响(x±s)。
表7
注aP＜0.01vs对照组；b与丹酚酸B比，P＜0.05。
表8
注aP＜0.05vs造模大鼠血清组。
权利要求
1.提高抗肝纤维化作用的药物组合物，其特征是所述的药物组合物由丹酚酸B盐与虫草多糖组成。
2.按权利要求1所述的提高抗肝纤维化作用的药物组合物，其特征是所述的药物组合物其组分重量百分比为丹酚酸B盐60％-10％；虫草多糖40％-90％。
3.权利要求1或2的药物组合物在制备治疗慢性肝炎的药中的应用。
4.权利要求1或2的药物组合物在制备治疗肝纤维化的药中的应用。
5.权利要求1或2的药物组合物在制备治疗肝硬化的药中的应用。
6.权利要求1或2的药物组合物在制备治疗脂肪肝的药中的应用。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及提高抗肝纤维化作用的药物，具体涉及含丹酚酸B盐与虫草多糖的药物组合物及其在制备治疗慢性肝病药物中的用途。本发明将丹酚酸B盐与虫草多糖联合应用，可按常规方法制成药物组合物临床常用制剂，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。本发明的药物组合物经动物试验，结果证实，可显著降低模型大鼠肝组织Hyp含量和I型胶原蛋白的表达水平，同时显著降低TGF－β1及其受体的表达，上述作用优于各组分单用的效果。所述组合物中可以提高抗肝纤维化的效果，能有效治疗和预防各种慢性肝病，包括肝纤维化、肝硬化和脂肪性肝病等病症。
文档编号A61K31/343GK1915238SQ20051002897
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者胡义扬, 刘平, 朱大元, 刘成海, 王海南, 王晓柠 申请人:上海中医药大学附属曙光医院, 上海中医药大学, 中国科学院上海药物研究所