专利名称：细胞骨架样基因jwa在抑制帕金森兴奋性氨基酸毒性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞神经生物学领域，涉及一种调节细胞内氨基酸摄取能力的基因，更具体的，本发明涉及一种调节特定细胞内谷氨酸摄取能力的基因及其在制备抑制帕金森病兴奋性氨基酸毒性作用的药物中的用途。
背景技术：
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的神经系统退行性病变。James Parksion于1817年首次描述了这种疾病的主要临床表现，即静息性震颤、运动迟缓、强直和姿势反射障碍。黑质致密带(substantia nigra pars compacta，SNpc)中含有神经黑色素的多巴胺神经元进行性死亡为帕金森病的主要病理改变(每年约损失5％)。目前对该病还缺乏有效的诊断和治疗手段。
谷氨酸是哺乳动物大脑中主要的兴奋性氨基酸。中枢神经系统中谷氨酸的大量积累会导致神经死亡，被称为兴奋性毒性。帕金森病的病因目前还不完全清楚，遗传、感染、内源性或外源性氧自由基及线粒体功能异常均可能在发病和进展中起重要作用。氧化应激在该病发病过程中所扮演的角色正受到越来越多的关注。在帕金森病大脑，基底神经节的神经回路功能异常，如丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)投射到黑质的谷氨酸能传出神经纤维功能亢进(Rodriguez等，Ann Neurol 1998；44S 175-S88；Obeso等，Neurology 2000；55S7-S12)，兴奋性氨基酸谷氨酸过度释放。目前认为，丘脑底核谷氨酸能神经元介导的兴奋性氨基酸毒性作用是黑质多巴胺神经元进行性死亡的基本原因之一(Benazzouz等，Cell Transplant 2000；9215-21)。
有鉴于此，人们认为，控制丘脑底核谷氨酸能神经元的过度活跃状态可减缓甚至中止帕金森病的病情发展的进程(Rodriguez等，Ann Neurol 1998；44S175-S88)。动物实验的结果显示，毁损丘脑底核可以防止6-羟基多巴胺所致的黑质多巴胺能神经元死亡(Piallat等，Eur J Neurosci 1996；81408-14；PiallatB等，J Neural Transm Suppl 1999；5571-7.；Nakao等，Ann Neurol1999；45640-51)。近年来，国际上利用高频刺激(如深部脑刺激，DBS)抑制丘脑底核兴奋性神经元的过度兴奋，治疗部分帕金森病患者取得了较好的效果。此外，还有人将表达抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的合成酶谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)基因的载体注射入丘脑底核，使该区域过度兴奋谷氨酸能神经元的活动得到抑制，也获得了较好的保护黑质多巴胺神经元的效果(Luo等，Science 2002；298425-429)。上述资料均表明，减少黑质谷氨酸的异常升高是控制黑质多巴胺神经元死亡的极其关键的一环。
虽然深部脑刺激的应用取得了较大成功，但该方法成本高、具有一定副作用，并且仅适用于部分帕金森病患者，不适合于早期患者，本质上属症状性治疗。如何找到其它有效地减少黑质谷氨酸的异常升高，进而保护黑质多巴胺神经元的方法是当前帕金森病治疗亟需解决的问题。
细胞外谷氨酸水平的增高可引起神经元的损伤，由于这一过程在帕金森病以外的其它中枢神经系统退行性疾病，如老年性痴呆和舞蹈病(Coyle等，Science 1993；262689-695；Meldrum等，Trends Pharmacol.Sci.1990；11379-387.)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化，以及其它病理状态，如癫痫、创伤性脑损伤、高糖血症、脑缺血、缺氧(Choi，Neuron 1988；1623-634)等的发生和发展过程中也起重要的作用，因此，这一问题的解决具有显著的普遍意义。
在中枢神经系统中，存在快速除去突触裂隙中的谷氨酸并迅速使其返回突触前的机制。这个机制被称为谷氨酸-谷氨酰胺循环(Daikhin和Yudkoff，JNutr 2000；1301026S-1031S)。存在于突触空隙中的谷氨酸通过兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporter，EAAT)迅速被转运进入附属的胶质细胞。EAAT是一类钠离子、钾离子依赖的转运体。EAAT，共包含五个成员，分别是EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4及EAAT5，以往研究工作表明EAAT1、EAAT2主要存在于神经元中，而EAAT3、EAAT4主要存在于胶质细胞中，EAAT5则主要存在于视觉神经系统中(Niels C.Danbolt，Prog Neurobiol2001；651-105)，而EAAT3还存在于肝脏、肾脏等系统中。
细胞骨架样基因JWA(谷氨酸转运子EAAC1相关蛋白(glutamate transporterEAAC1-associated protein)，GTRAP3-18)，分子量22kDa左右，是一个新近发现的微管相关蛋白，它普遍存在于哺乳动物全身多个系统中。在神经系统，该基因主要存在于神经元中(Inoue K等，Neurosci Lett.2005；386184-8)。有资料表明，JWA能够和EAAT3相互作用，影响EAAT3的活性从而下调谷氨酸的重摄取，这部分工作主要是在293T细胞(含有一定的EAAT3表达)中完成，即JWA(GTRAP3-18)高表达，谷氨酸吸收下降(Chien-liang Glenn Lin等，Nature2001；410，84-88)。另外，该文献中也在富含神经元的鼠脑元代培养物中获得了相似的结果。文献资料还表明，破坏肌动蛋白(肌动蛋白)的药物，如松胞菌素(cytochalasin)B或松胞菌素(cytochalasin)D，也对谷氨酸吸收有影响(Thorlin等，FEBS Lett 1998；425453-459)。但JWA基因对胶质细胞谷氨酸的重摄取是否有影响尚不得而知。
中枢神经系统由两大类细胞组成，主要是神经元和胶质细胞。后者包括星形胶质细胞、寡突胶质细胞和小胶质细胞。星形胶质细胞具有很多重要的生理功能，包括对神经元的支持，离子平衡，对神经递质的释放以及免疫系统的神经调节。星形胶质细胞的另一个重要功能就是在中枢神经系统受到损伤后形成物理屏障使病灶得到隔离，参与自身组织的愈合。参与这个过程的星形胶质细胞会被大量激活，形态上呈现过度肥大，称之为反应性星形胶质细胞。因此，反应性星形胶质细胞的出现和状态在很大程度上提示了大脑损伤的发生和/或炎症反应的存在，结合目前脑内成像技术的飞速发展，因而也有可能有助于疾病的诊断。
因此，研究调节胶质细胞，特别是星形胶质细胞对谷氨酸重摄取的方法，阻止细胞外谷氨酸的异常升高，以保护黑质多巴胺神经元，进而减缓甚至中止帕金森病的病情发展进程，是目前现有技术中急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可促进胶质细胞，特别是星形胶质细胞对谷氨酸重摄取的基因，从而可阻止细胞外谷氨酸的异常升高，保护黑质多巴胺神经元，减缓甚至中止帕金森病的病情发展的进程。
在本发明的第一方面，提供了细胞骨架样蛋白JWA在制备抑制帕金森病兴奋性氨基酸毒性作用的药物中的应用。
在本发明的一个优选例中，所述的帕金森病兴奋性氨基酸为谷氨酸。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其含有有效量的JWA基因表达产物或可表达JWA蛋白的细胞，以及药学上可接受的载体。
在本发明的一个优选例中，所述的可表达JWA蛋白的细胞为转染有含JWA基因的载体的哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的载体选自哺乳动物细胞转染用载体或病毒。
在本发明的一个优选例中，所述的哺乳动物细胞为胶质细胞；特别是星形胶质细胞。
在本发明的第三方面，提供了JWA蛋白或基因在制备治疗帕金森病的药物中的应用。所述的应用比如利用特定多肽序列将JWA蛋白输送入细胞内，或制备表达JWA的细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种筛选调节细胞内JWA基因表达的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)在测试组中，向胶质细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测其中JWA蛋白的表达量；(b)将步骤(a)测试组中JWA蛋白的表达量与未添加候选物的对照组中JWA蛋白的表达量进行比较，如果测试组的JWA蛋白表达量在统计学上高于(优选显著高于)对照组，就表明该候选物是JWA蛋白表达的促进剂；如果测试组的JWA蛋白表达量统计学上低于(优选显著低于)对照组，就表明该候选物是JWA蛋白表达的抑制剂。
在本发明的第五方面，提供了一种JWA蛋白的表达促进剂的用途，用于制备治疗帕金森疾病的药物。
在本发明的第六方面，提供了一种用前面所述的方法获得的可促进细胞内JWA基因表达的化合物。
图1显示了成年大鼠不同脑区的JWA表达情况，其中A代表胼胝体，B代表海马，C代表室管膜，D代表室管膜下，E代表第三脑室，F代表黑质区域的JWA表达情况。
图2显示了在大鼠帕金森病模型中，药物注射1周后损伤侧黑质区域JWA阳性星形胶质细胞相比对照侧有大量增生。
图3显示了JWA阳性星形胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞的照片。
图4显示了6-OHDA损毁大鼠内侧前脑束后1周、2周和5周的大脑冠状切片免疫组织化学统计结果。
图5显示了刀片损伤大脑皮层造成外伤的模型大鼠中，未见有JWA阳性星形胶质细胞出现。
图6显示了不同浓度6-OHDA处理细胞后JWA蛋白水平变化的检测，呈现一定的剂量依赖。
图7显示了表达载体pcDNA-JWA和pEGFP-JWA在培养的胶质细胞中表达后，经过Western blot分析，发现其表达产物与预期的一致。
图8显示了各种细胞分别转染pEGFP、pEGFP-JWA或pSEc-siRNA-JWA表达载体后，利用Transwell在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的诱导下进行细胞迁移实验的结果。
图9显示了稳定表达EGFP-JWA融合蛋白的HBE细胞株(B1-B4)向对侧生长的速度明显低于对照组(A1-A4)。
图10显示了HBE细胞相对于对照的迁移率情况。
图11显示了分别转染有pEGFP、pEGFP-JWA、pcDNA-JWA、pSEc-siRNA-JWA表达载体的星形胶质细胞在体外培养6小时后的生长伸展情况。
图12显示了细胞铺展试验中，细胞面积定量统计图。
图13显示了通过免疫荧光试验，该结果提示JWA可通过抑制F-actin的形成来发挥抑制迁移的作用。
图14显示了分别用pEGFP、pEGFP-JWA表达载体转染C6细胞后所拍摄照片。图14A、B分别用pEGFP、pEGFP-JWA表达载体转染C6细胞后所拍摄照片；图14C、D为各自对应的明场。
图15显示了转染有pEGFP、pEGFP-JWA表达载体的C6细胞株谷氨酸重摄取结果。
具体实施例方式
本发明提出了解除导致帕金森病黑质多巴胺能神经元慢性死亡因素的新方法，即通过提高胶质细胞，特别是星形胶质细胞重摄取谷氨酸的能力，缓解过度释放的谷氨酸对黑质神经元的损伤，从而达到防治帕金森病的目的。
在本发明中，所述的JWA基因是指具有GenBank登录号AF070523.1或其功能片断的基因，其蛋白质分子量在22kDa左右，该蛋白是一个新近发现的微管相关蛋白，它普遍存在于哺乳动物全身多个系统中。所述的JWA基因可通过常规的基因工程技术来制备，比如可采用人工合成的方法来制备。
在本发明中，用于克隆入目的基因的载体包括任何哺乳动物细胞转化或转染用载体，或病毒载体，尤其是各种市售的载体或病毒载体。包括但不限于pcDNA3.1、pEGFP、pSEc neo等。将目的基因克隆入载体中的特定部位是本技术领域普通人员熟知的技术，比如可在目的基因和载体上分别设计相对应的酶切位点，利用限制性内切酶和DNA连接酶来进行酶切和连接，从而获得携带有目的基因的重组载体。
在本发明中，可用于转染所述含有JWA基因的载体的细胞为哺乳动物细胞，比如胶质细胞、C6、CHO、HBE细胞等；优选的为胶质细胞，特别是星形胶质细胞。
将特定DNA转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达所述的JWA蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
在本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将具有活性的成分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述的载体可以是液体或固体。
在本发明中，所述的“药物组合物”中的有效成分包括但不限于a)由JWA基因表达的具有活性的蛋白；b)由JWA基因表达的具有活性的蛋白与特定的多肽(如HIV-1的TAT多肽)连接而成的融合蛋白，所述的多肽能够将所述的蛋白携带至人体的胶质细胞(特别是星形胶质细胞)，并且穿透所述细胞，从而使所述细胞中JWA蛋白的含量上升；c)可表达JWA蛋白的细胞。
本发明的药物组合物，它含有上述的有效成分，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药；优选的，可将所述的药物进行局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的有效成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
更具体的，本发明主要包括以下方面(1)研究了JWA在正常大鼠脑内的表达模式。利用免疫组织化学的方法，本发明人发现，在正常大鼠中胼胝体、海马、室管膜、室管膜下、第三脑室均有星形胶质细胞表达JWA；其中只有胼胝体JWA阳性细胞较为丰富，而黑质区域JWA阳性星形胶质细胞少见。
(2)在大鼠帕金森病模型中，6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射可以引起损伤侧黑质区域星形胶质细胞的过度增生，而这些细胞部分为JWA阳性。具体表现为药物注射1周后损伤侧黑质区域即出现多巴胺能神经元死亡，并伴有大量JWA阳性的星形胶质细胞(Glial fibrillary acidic protein阳性，即GFAP阳性)，数目约为原来基数水平的5倍左右，而在损伤对侧则JWA阳性的星形胶质细胞未见有明显增加，随着时间的延长，在药物注射2周直到5周后，JWA阳性的星形胶质细胞数目又逐渐下降恢复至正常水平。
此外，本发明人还观察到由于机械损伤(该类损伤常见于日常生活中)，如吸取大脑皮质以及在大脑皮层中插入刀片，造成的大脑外伤不能激活JWA阳性星形胶质细胞。表明，JWA在黑质区域的表达有一定特异性。
在体外用不同浓度6-OHDA处理培养的星形胶质细胞后，JWA蛋白表达上调，且呈一定剂量-效应依赖。说明JWA在黑质区域的表达具有独特的时空特点，并在6-OHDA作用下表达水平显著提高。
(3)JWA通过调节F-肌动蛋白的表达水平和位置变化，来抑制细胞的迁移。主要有如下三个实验结果证明第一、用pEGFP-JWA载体转染293T细胞使之过表达JWA基因后，利用Transwell作细胞迁移实验(在下层培养液加入脂多糖(的情况下)，考察JWA基因上调对293T细胞的影响，结果发现，高表达JWA的细胞株的迁移率均受到明显抑制，而细胞株中JWA表达水平较低和下层培养液存在LPS的情况下，均能较快地迁移穿孔；同样现象可以在利用其它高表达JWA基因的细胞株，如C6、CHO和JWA稳定表达的HBE细胞株进行的细胞迁移实验得到证实。
第二、划痕实验。利用高表达JWA基因的HBE细胞株所作的划痕实验中，与对照相比，高表达JWA的细胞向对侧生长的速度明显低于对照组。
第三、用免疫荧光染色方法来观察JWA与细胞骨架蛋白F-肌动蛋白表达分布及相互关系，结果显示，在JWA蛋白高表达区域，F-肌动蛋白的表达明显下降，提示JWA通过抑制F-肌动蛋白的形成，从而抑制细胞的伸展，并最终使细胞迁移能力下降。
(4)利用电穿孔的方法将pEGFP、pEGFP-JWA转染到C6细胞中，并作3H标记的谷氨酸重摄取实验，结果发现，高表达JWA的C6细胞重摄取胞外谷氨酸的能力显著增加，这一结果与高表达JWA的293T细胞重摄取胞外谷氨酸的能力下降(Lin等，Nature 2001；410，84-88)正好相反。
与现有技术相比，本发明的主要优点(1)本发明找到了JWA的新的功能和作用机制。在胶质细胞中，JWA表达上调，可导致谷氨酸重摄取能力的提高。JWA基因的这一新功能的发现，为今后药物的开发提供了靶分子。即可以设计相应药物，通过调控JWA的表达水平，对帕金森病起到预防和治疗的效果。
(2)现有帕金森病治疗手段，无论是药物的还是手术(如深部脑刺激)，均为疾病后期的对症性治疗，主要用于患者症状的解除，而通过本发明获得的治疗药物为从源头上解决导致细胞死亡这一难题提供了新的途径。
(3)本发明人发现，JWA在正常情况下主要由神经元表达，但在帕金森病动物模型(PD模型)中，该基因的表达则出现在激活的星形胶质细胞。根据国内外研究资料和本发明人自己已有的研究成果(发明名称一种识别反应性星形胶质细胞的标记分子及其应用，申请号200310107855.6)，激活的星形胶质细胞常出现在疾病早期，因此，JWA基因在这些细胞的表达为疾病早期阻止病变的继续发展提供了极好的机会。
(4)本发明的实验还表明，JWA还与细胞的迁移能力有关。本发明人通过多种手段(基于transwell的细胞迁移，划痕实验以及细胞铺展实验)发现，JWA上调，能够抑制细胞的迁移，提示JWA的这一作用是通过影响丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)的积聚来发挥的。
中枢神经系统的退行性疾病伴有胶质细胞的增殖和迁移。在PD大鼠模型中，6-OHDA损伤1周时，损伤侧黑质致密带和网状带特异性引起JWA表达的阳性星形胶质细胞增生，而酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目则明显减少。也就是说，正常胶质细胞JWA处于较低水平，在PD模型中，JWA发生上调。
综上所述，本发明人的研究结果提示，JWA是在神经系统发生退行性病变后激活的星形胶质细胞的特异性标志物之一，并发挥其本身抑制细胞迁移和增强胞外谷氨酸重摄取的功能，对机体产生一定神经保护作用，为研究退行性病变的早期诊断和治疗药物提供了新思路和新方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 测定JWA在正常大鼠脑内的表达模式采用免疫组织化学和细胞计数的方法。脑片经常规方法固定，用PBST(PBS含0.01％tritonX-100)漂洗后用4％羊血清孵育30分钟，再用含1％羊血清的JWA抗体(该抗体购自美国Research Genetics公司。抗原为该公司合成的JWA-C20短肽(LEQQEEGINRLTDYISKVKE)，并与匙孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)相偶联；将该多肽与完全佐剂混合后，免疫新西兰大白兔，以后每隔3周加强免疫一次；加强4次后，取血，经凝血后获得抗血清)。在4℃孵育48小时，再用PBST漂洗。然后在生物素化第二抗体(羊抗兔IgG，购自Sigma，美国)中孵育1.5小时，然后进行常规ABC法反应，再行DAB显色反应。用光学显微镜下经放大200倍进行细胞计数。
实验结果表明，在正常大鼠中胼胝体、海马、室管膜、室管膜下、第三脑室均有星形胶质细胞表达JWA；其中只有胼胝体JWA阳性细胞较为丰富，而黑质区域JWA阳性星形胶质细胞少见。结果见图1，其中，A为胼胝体的JWA表达情况，B为海马的JWA表达情况，C为室管膜的JWA表达情况，D为室管膜下的JWA表达情况，E为第三脑室的JWA表达情况，F为黑质区域的JWA表达情况。
实施例2 动物模型试验将180-220克Sprague-Dawley大鼠固定在小动物立体定位仪上。将4微升6-OHDA(2.5μg/μl溶于0.2mg/ml抗坏血酸)(Sigma，St.Louis，MO，美国)注射入大鼠右侧内侧前脑束(相对于前囟的定位坐标AP-4.4，ML+1.2，DV+7.8)，注射速度为0.4微升/分钟，注射完停针10分钟后再将注射器缓慢退出。手术后一周腹腔注射阿朴吗啡(0.05毫克/公斤体重)(Sigma，St.Louis，MO，美国)，测试大鼠旋转，一般需要旋转6圈/分钟以上作为成功的帕金森病大鼠模型。
大鼠机械(刀片)损伤大脑皮层模型是在大鼠皮层中竖直插入5毫米长，2毫米深，1毫米宽的刀片，一周后灌注并固定。
6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射结果显示，其可以引起损伤侧黑质区域星形胶质细胞的过度增生，而这些细胞部分为JWA阳性。具体表现为药物注射1周后损伤侧黑质区域即出现多巴胺能神经元死亡，并伴有大量JWA阳性的星形胶质细胞(胶质细胞原纤维酸性蛋白阳性，即GFAP(Sigma，St.Louis，MO)阳性)，数目约为原来基数水平的5倍左右，而在对照侧则JWA阳性的星形胶质细胞的数量则未见有明显增加，见图2，其中图2A表示对照侧，图2B表示损伤侧。随着时间的延长，在药物注射2周直到5周后，JWA阳性的星形胶质细胞数目又逐渐下降恢复至正常水平。6-OHDA损毁大鼠内侧前脑束后1周、2周和5周的大脑冠状切片免疫组织化学结果统计结果见图4。
JWA阳性星形胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞见图3C1，图3C1显示JWA阳性星形胶质细胞(红色标记)，图3C2显示了GFAP阳性星形胶质细胞(绿色标记)，图3C3为前两图的合并处理图。
本发明人还观察到，由于机械损伤(该类损伤常见于日常生活中)，如吸取大脑皮质以及在大脑皮层中插入刀片，造成的大脑外伤不能激活JWA阳性星形胶质细胞。见图5，刀片损伤大脑皮层造成外伤的模型大鼠中，未见有JWA阳性星形胶质细胞出现。
实施例3 JWA通过调节F-肌动蛋白的表达水平和位置变化，来抑制细胞的迁移1.重组质粒的构建本实施例中使用的基因表达载体均以市售的质粒如pcDNA3.1(美国Invitrogen，公司)、pEGFP(美国Clontech公司)、pSEc neo(美国Ambion公司)为基础，利用DNA连接酶(Takara中国大连)将经过限制性内切酶处理的JWA全长cDNA等插入上述相应的质粒。这些基因表达质粒可分别导入不同的细胞(包括星形胶质细胞、293T、CHO、C6)。星形胶质细胞为原代培养的大鼠黑质星形胶质细胞。制备过程简述如下取出生后1-2天的大鼠黑质，将其切成0.5mm3的小块，用胰蛋白酶消化后机械性打散使其成为单细胞悬液，按5×104细胞/厘米2培养。所用培养基为DMEM/F12。293T、CHO、C6细胞株均购自ATCC或中科院上海细胞库。
重组的质粒pEGFP-JWA的构建通过EcoRI和Kpnal两个限制性酶切位点，将大鼠JWA全长cDNA序列插入到pEGFP表达载体(美国Clontech公司，Palto Alto，CA，USA)。
重组的质粒pSEc-SiRNA的构建通过EcoRI和HindIII两个限制性酶切位点，将针对JWA第1-19位核苷酸的小干扰RNA(序列为AAATGGAACAACCGCGTAGTG)插入到pSEc neo表达载体(美国Ambion公司，，Austin，TX，USA)。
重组的质粒pcDNA-JWA的构建通过EcoRI和Kpna1两个限制性酶切位点，将JWA全长cDNA序列插入到pcDNA3.1表达载体(美国Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA)。
重组的质粒pcDNA-bFGF由日本九州大学Yoshikazu Yonemitsu博士提供。
2.Western印迹分析星形胶质细胞、293T、CHO、C6细胞被转染了含JWA基因的质粒48小时后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，加入裂解缓冲液(1×PBS，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂混合物)，用细胞刮将细胞刮下(对于脑组织，则是加入裂解缓冲液，用电动匀浆器匀浆。)冰上放置30分钟，然后用细注射器抽吸裂解液，冰上放置30分钟。4℃ 10,000g离心10分钟。取上清。加入上样缓冲液，95℃水浴5分钟。然后SDS-PAGE电泳，然后电转至硝酸纤维素膜，用TBST(1×TBS，0.05％Tween 20)漂洗，然后用含有5％脱脂奶粉的TBST孵育45分钟，再在一抗[JWA抗体或GFAP抗体或Tubulin抗体，Sigma，St.Louis，MO，美国]中孵育45分钟，TBST漂洗后再在辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(购自Sigma，St.Louis，MO，美国)中孵育45分钟，漂洗后按照SuperSignalWest Pico ECL system(Pierce，Rockford，IL美国)操作曝光，显影。
结果见图6，在体外用不同浓度6-OHDA处理培养的星形胶质细胞、293T、CHO、C6后，JWA蛋白表达上调，且呈一定剂量-效应依赖。说明JWA在黑质区域的表达具有独特的时空特点，并在6-OHDA作用下表达水平显著提高。
3.Transwell实验如前所述获得pEGFP-JWA、pSEc-siRNA-JWA，pcDNA-JWA，pcDNA-bFGF重组质粒。将pEGFP、pEGFP-JWA、pSEc-siRNA-JWA，pcDNA-JWA，pcDNA-bFGF质粒转化293T细胞，用pEGFP和pEGFP-JWA转化C6、CHO、HBE细胞。
准备好对照组、转染的或各种处理的细胞。消化计数80,000个/毫升置于一个灭菌的Eppendorf管，加入染料Hochest33342(10微克/毫升，Sigma，美国)，细胞培养箱中孵育60分钟。(数目视细胞不同可变化)1,000g，离心，并加入无血清无其他营养因子的培养液，混匀。将灭菌水清洗净，紫外照射过2小时的Chamber下板上的孔加入100微升左右的完全培养液，或者含有影响细胞迁移的试剂，如LPS等，使液体略为高出孔，由于表面张力，会呈半月形凸起。将所需大小的聚碳酸酯膜(Polycarbonate membrane)置于上面，不能产生气泡。再依次按孔方向放上橡胶垫、上板，对称拧上螺丝。加上第3步准备好的细胞悬液，每孔100微升。放入一个湿盒中，置于培养箱中孵育2小时。(迁移时间视细胞、数目不同可变化)取出Chamber，拧开螺丝，用“细胞刮”将聚碳酸酯膜上面的细胞轻轻刮去(下面的细胞待固定计数)。将聚碳酸酯膜投入原液甲醇，固定15min，再用PBS洗二次，晾干。置于酸泡过的载玻片和盖玻片之间，中间尽量不要留有气泡。40倍(物镜10倍)观察拍照，计数。(观察倍数视细胞、数目不同可变化)关于计数，采用ImageMaster 2D Platinum分析软件(Amersham Pharmacia Biotech，美国)来分析照片计点数，统计。
细胞转染效率的Western blot分析结果见图7，证实有较高的转染效率。
293T细胞株分别转染pEGFP、pEGFP-JWA、pSEc-siRNA-JWA后，利用Transwell在脂多糖(LPS)存在下进行细胞迁移实验(LPS吸引或不吸引)的结果见图8；已知生长因子bFGF可抑制细胞迁移，因此pcDNA-bFGF转染在这里用作阳性对照。结果发现，高表达JWA的细胞株的迁移率均受到明显抑制，而细胞株中JWA表达水平较低和下层培养液存在LPS的情况下，均能较快地迁移穿孔；瞬时高表达bFGF(即这些细胞被转染了pcDNA-bFGF表达质粒)的细胞迁移受到限制作为一个阳性对照。同样现象可以在利用其它高表达JWA基因的细胞株得到证实，如C6、CHO和JWA稳定表达的HBE细胞株转染pEGFP、pEGFP-JWA后作Transwell实验，具体结果见图8。
4.划痕实验取传代长势良好的HBE细胞制备单细胞悬液，将细胞加入35mm皿中，于5％CO2培养箱内37℃孵育至满度约为80％，用无菌1000ml枪头垂直划出一无细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型。相差显微镜下拍照记量伤口宽度，此时作为划痕后0天，以后分别继续培养2、4、6、36小时后测定同一处，至划痕创面基本愈合。三次独立实验。
图9显示，与对照相比，稳定表达EGFP-JWA融合蛋白的HBE细胞株(高表达JWA的细胞)(B1-B4)向对侧生长的速度明显低于对照组(A1-A4)。图10显示，HBE细胞相对于对照的迁移率显著降低。划痕后的HBE细胞迁移伸展率见表1，可知HBE细胞每天迁移率被抑制了4.14％。
表1
5.F-肌动蛋白染色暨细胞铺展实验在原代培养的星形胶质细胞长到大约80％的满度，利用fugene 6(购自Roche Diagnostics，美国)将pEGFP、pEGFP-JWA、pcDNA-JWA、或pSEc-siRNA-JWA转入，然后使用胰酶消化，将细胞种入预先用胶原(collagen)铺备的培养板中，6小时后甲醇固定，使用F-肌动蛋白染料Phalloidin(Sigma，美国)染30min，封片荧光显微镜观察。然后将所得图片使用ImageMaster 2DPlatinum(Amersham bioscience)计算细胞数及细胞面积。
分别转染有pEGFP、pEGFP-JWA、pcDNA-JWA、pSEc-siRNA-JWA星形胶质细胞种植6小时后的生长伸展情况(红色标记F-肌动蛋白)分别见图11A-D。结果提示，过表达JWA基因的星形胶质细胞(转染有pEGFP-JWA、pcDNA-JWA)铺展缓慢，因此与对照(转染有pEGF)相比，细胞面积相应较小。而利用pSEc-siRNA-JWA下调JWA基因的表达后，细胞面积与正常相比无显著性差别。细胞面积定量统计图见图12。
6.免疫荧光双色标记大鼠脑切片经常规方法固定，用PBST(PBS含0.01％tritonX-100)漂洗后用4％羊血清孵育30分钟，再用含1％羊血清的JWA抗体在4℃孵育48小时，再用PBST漂洗，将脑片与生物素结合的二抗(羊抗兔IgG，购自Sigma，美国)孵育1.5小时，漂洗，再与结合有卵白素的荧光素FITC(购自Sigma，美国)孵育1小时，漂洗。然后4％多聚甲醛固定20分钟，漂洗，用4％羊血清孵育30分钟，然后与细胞标记分子的抗体(如GFAP，美国Sigma公司；JWA抗体)孵育，漂洗，然后与荧光素Texas Red标记的二抗(羊抗小鼠IgG，购自Sigma，美国)孵育，漂洗。Phalloidin(Sigma)被用来显示F-肌动蛋白。用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，照相。
结果见图13，图13A-C为对照组中F-肌动蛋白表达情况及定位(绿色表示GFP，红色标记F-肌动蛋白)；图13D-F为转染有pEGFP-JWA的星形胶质细胞中JWA和F-肌动蛋白表达情况及相互关系(绿色表示GFAP-JWA，红色标记F-肌动蛋白)。在JWA蛋白高表达区域，F-肌动蛋白的表达明显下降，提示JWA抑制F-肌动蛋白的形成，从而抑制细胞的伸展，并最终使细胞迁移能力下降。
实施例4 谷氨酸重摄取试验培养的C6细胞株用KRH(NaCl128mmol/l，KCl5mmol/l，CaCl22.7mmol/l，MgSO41.2mmol/l，Na2HPO41.2mmol/l，HEPES20mmol/l)培养基预温育60分钟，弃掉KRH，加入500μl KRH培养基(包含10nM，50Ci/mmol3H-Glu；30uM未标定的谷氨酸)启动，37度温育5分钟，用冰冷的500微升KRH培养基洗两次终止，然后立即用冰冷的0.1N NaOH裂解细胞。最后，细胞裂解液加入一定量的闪烁液，使用液体闪烁仪进行测定。
分别用电穿孔方法转染pEGFP、pEGFP-JWA到C6细胞后所拍摄照片可见图14。图14A和B为转染pEGFP、pEGFP-JWA到C6细胞后所拍摄照片；图14C和D为各自对应的明场。
转染有pEGFP、pEGFP-JWA的C6细胞株谷氨酸重摄取结果图15，高表达JWA的C6细胞(电穿孔方式转染，效率较高，可达80％以上)重摄取胞外谷氨酸的能力显著增加了约1.5倍，这一结果与高表达JWA的293T细胞重摄取胞外谷氨酸的能力下降(Lin等，Nature 2001；410，84-88)相反。
实施例4 JWA全长cDNA来源利用RT-PCR方法，以人肝细胞株的cDNA为模版，扩增JWA编码区全长序列，共575bp。所用引物为顺向引物(forward)5’-cttcgaattctgatggacgttaatatc-3；逆向引物(reverse)5’-cgcggtaccttccttcactttgctg-3’。人肝细胞的cDNA获得的方法如下总RNA提取将人肝细胞株(Hep G2，中科院上海细胞库)加1ml Trizol充分裂解，将匀浆倒入1.5ml离心管中，室温静置5min；加氯仿0.2ml，振荡混匀后静置2min；4℃离心，12,000g×30min；取上层水相至另一离心管中，加0.5ml异丙醇，混匀后静置10min，4℃离心，12,000g×10min，可见白色RNA沉淀；加75％乙醇1ml洗涤沉淀，4℃离心，7,500g×10min，弃上清，干燥后沉淀重悬于无RNase水中。用DU-650型紫外分光光度计检测定量，将RNA统一稀释成1μg/μl。
RT反应取RNA 4μg(4μl)，oligodT(36)AGC 3μl、ddH2O 9μl，混匀离心后70℃放置4min，冰浴条件下加入5×缓冲液6μl，dNTPs(5×10-3mol/L)1μl，M-MLV 0.5μl，ddH2O 8.5μl，总体积30μl，42℃反应90min，70℃5min灭活反转录酶。即合成cDNA第一条链，作为PCR的模板。
PCRPCR体系共50μl(含R-T反应产物2μl)，条件为95℃预变性5min，随后95℃30s，60℃45s，72℃60s，共35个循环；72℃延伸10min。同时以人基因组DNA为模板作为对照。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果，获得了JWA编码区全长序列的扩增产物，电泳检测显示长度约580bp。另外，用类似方法，制得含大鼠JWA编码区全长序列的PCR扩增产物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.细胞骨架样蛋白JWA在制备抑制帕金森病兴奋性氨基酸毒性作用的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的帕金森病兴奋性氨基酸为谷氨酸。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的JWA基因表达产物或可表达JWA蛋白的细胞，以及药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的可表达JWA蛋白的细胞为转染有含JWA基因的载体的哺乳动物细胞。(在另一优选例中，所述的载体选自哺乳动物细胞转染用载体或病毒)。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的哺乳动物细胞为胶质细胞(特别是星形胶质细胞)。
6.JWA蛋白或基因在制备治疗帕金森病的药物(如利用特定多肽序列将JWA蛋白输送入细胞内，或制备表达JWA的细胞)中的应用。
7.一种筛选调节细胞内JWA基因表达的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)在测试组中，向胶质细胞的培养物中添加待筛选的候选物，并检测其中JWA蛋白的表达量；(b)将步骤(a)测试组中JWA蛋白的表达量与未添加候选物的对照组中JWA蛋白的表达量进行比较，如果测试组的JWA蛋白表达量在统计学上高于(优选显著高于)对照组，就表明该候选物是JWA蛋白表达的促进剂；如果测试组的JWA蛋白表达量统计学上低于(优选显著低于)对照组，就表明该候选物是JWA蛋白表达的抑制剂。
8.一种JWA蛋白的表达促进剂的用途，其特征在于，用于制备治疗帕金森疾病的药物。
9.一种用权利要求7所述的方法获得的可促进细胞内JWA基因表达的化合物。
全文摘要
本发明公开了JWA基因或蛋白在制备抑制帕金森病兴奋性氨基酸毒性作用的药物中的应用。本发明还公开了一种含有有效量的JWA基因表达产物或可表达JWA蛋白的物质的药物组合物。本发明还公开了一种筛选调节细胞内JWA基因表达的化合物的方法。本发明通过提高JWA基因的表达，提高胶质细胞重摄取谷氨酸的能力，缓解过度释放的谷氨酸对黑质神经元的损伤，从而可达到防治帕金森病的目的。
文档编号A61P25/16GK1951503SQ20051003058
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者周嘉伟, 李爱群, 罗小莹, 周建伟, 盛建松, 杨硕 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 南京医科大学