专利名称：pp3774基因在抑制细胞生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤相关新基因，尤其涉及pp3774基因的功能应用。pp3774基因可抑制细胞生长、诱发细胞凋亡、影响细胞周期、并与已知基因JAB1结合，因而pp3774基因具有作为药物筛选靶点用于筛选药物(促进或抑制pp3774和JAB1结合的物质)等潜在用途。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成和科学技术的不断进步，以对基因(尤其是致病基因)功能研究为主要内容的“后基因组时代”已经来临。尽管国内外相继克隆了与各种功能相关的基因、并对其初步生物学功能和作用机制进行了研究，本发明人进行的以细胞生长为基础的大规模功能筛选发现并克隆了372个新基因[Wan等，PNAS(2004)101(44)15724-15729]。
pp3774基因就是利用此功能筛选技术平台从人胎盘cDNA文库中克隆到的新基因，该基因全长约1747bp，定位于染色体10q24，含10个外显子，编码361个氨基酸。该基因的cDNA序列本室已于2000年4月18日在GeneBank登录(登录号为AF258563)。
pp3774基因与Li等从小鼠肝cDNA文库克隆到的并于1999年8月10日在GeneBank登录(登录号为AF176814)Aph2基因[Li等，J Biol Chem 277(2002)28870-28876]具有96％的同源性，Aph2基因全长约1817bp。
目前，虽然有众多基因序列是已知的，然而人们并不知道或了解其功能。pp3774基因就是功能未知的基因之一。
基于许多生理反应和疾病与基因或蛋白的功能有关，因此，为了全面了解各种基因，本领域迫切需要确定各种功能未知基因的确切功能。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种功能未知基因pp3774基因的确切功能。本发明的研究表明，pp3774基因可抑制细胞生长、影响细胞周期、调节细胞凋亡并与pp3774-JAB1的相互作用。
本发明的另一目的是基于上述功能，提供pp3774基因的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种筛选pp3774促进剂的方法，它包括步骤(a)在测试组中，向细胞培养物中添加待选的候选物和pp3774，并检测细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞的增殖情况与对照组中细胞的增殖情况进行比较，其中，所述的对照组包括(i)组未添加待选的候选物，也未添加pp3774的细胞培养物；(ii)组添加待选的候选物但不添加pp3774的细胞培养物；和(iii)组未添加待选的候选物但添加pp3774的细胞培养物；其中，如果测试组中的细胞的增殖在统计学上低于(优选明显低于)对照组(iii)并且对照组(i)和对照组(ii)的细胞增殖情况无显著差异，那么就表明该候选物是pp3774促进剂。
其中所述的pp3774基因的序列如SEQ ID NO1所示。
在一优选例中，所述的细胞是癌细胞，更优选的是肝癌细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种筛选pp3774和JAB1结合的促进剂的方法，它包括步骤(a)在测试组中，向使pp3774和JAB1结合的培养物中添加待筛选的候选物，并检测pp3774和JAB1的结合情况；(b)将步骤(a)测试组中pp3774和JAB1的结合情况与未添加候选物的对照组中pp3774和JAB1的结合情况进行比较，如果测试组中pp3774和JAB1的结合在统计学上高于(优选明显高于)对照组，就表明该候选物是促进pp3774和JAB1结合的化合物。
在本发明的另一方面，提供了一种筛选pp3774和JAB1结合的抑制剂的方法，它包括步骤(a)在测试组中，向使pp3774和JAB1结合的培养物中添加待筛选的候选物，并检测pp3774和JAB1的结合情况；(b)将步骤(a)测试组中pp3774和JAB1的结合情况与未添加候选物的对照组中pp3774和JAB1的结合情况进行比较，如果测试组中pp3774和JAB1的结合在统计学上低于(优选明显低于)对照组，就表明该候选物是抑制pp3774和JAB1结合的化合物。
在本发明的另一方面，提供了一种pp3774基因或蛋白的用途，包括用于(a)制备抑制癌细胞生长的组合物；或(b)制备调节细胞调亡的组合物。
在一优选例中所述的组合物是药物组合物，其中所述的组合物含有0.001-99.9wt％pp3774蛋白，按组合物的总重量计。
在另一优选例中所述的组合物还含有pp3774蛋白的促进剂。
本发明提供了pp3774基因明确的功能可抑制细胞生长、诱发细胞凋亡、影响细胞周期、并与已知基因JAB1结合，并且将pp3774基因作为靶点用于筛选药物(促进或抑制pp3774和JAB1结合的物质)等，提供了它丰富的使用前景。
图1显示了pp3774-GFP融合蛋白在细胞中的定位。
图2显示了pp3774 mRNA在各种肿瘤细胞系中的RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果。
图3显示了人肝癌及癌旁组织的免疫组化检测结果。
图4显示了SMMC-7721和COS-7细胞的细胞凋亡分析结果。
图5显示了pp3774基因和JAB1缺失突变体的构建及体外蛋白结合试验(Pull down)的结果。
图6显示了pp3774基因缺失子pp3774-Δ4和JAB1蛋白及体内免疫共沉淀试验的结果。图中，vector是空载体。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现，pp3774基因可抑制细胞生长、诱发细胞凋亡、影响细胞周期、并与已知基因JAB1结合，因而pp3774基因具有作为药物筛选靶点用于筛选药物(促进或抑制pp3774和JAB1结合的物质)等潜在用途。在此基础上，完成了本发明。
具体地，本发明的试验表明，pp3774蛋白主要定位于细胞内质网中，生物信息学分析结果表明该基因与小鼠Aph2基因在氨基酸水平具有96％的同源性；本发明人以前的研究结果也显示该基因在正常人组织中均有不同程度的表达，具体表现为骨骼肌和心肌最高，胎盘、胰腺和肝其次，肾和脑中等，而在肺组织中呈现低表达，预示该蛋白是一个进化上保守的基因。
在本发明中，术语“pp3774蛋白”、“pp3774多肽”或“肿瘤相关蛋白pp3774”可互换使用，都指具有人pp3774氨基酸序列(SEQ ID NO2或AAG23766(gi10834672)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的pp3774多肽。
在本发明中，术语“pp3774基因”、“pp3774多核苷酸”或“肿瘤相关基因pp3774”可互换使用，都指具有人pp3774核苷酸序列(SEQ ID NO1或AF258563(gi10834671)的核酸序列。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的pp3774蛋白或多肽”是指pp3774多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化pp3774蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。pp3774多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人pp3774蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人pp3774蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人pp3774多肽”指具有人pp3774蛋白活性的SEQ ID NO2序列[AAG23766(gi10834672)]的多肽。该术语还包括具有与人pp3774蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列[AAG23766(gi10834672)]的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人pp3774蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人pp3774 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人pp3774多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人pp3774多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人pp3774多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人pp3774多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供人pp3774蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人pp3774多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人pp3774蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID N02[AAG23766(gi10834672)]的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID N01所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
编码SEQ ID NO2[AAG23766(gi10834672)]的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”，的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码pp3774蛋白的多聚核苷酸。
本发明的人pp3774核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al. Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或pp3774蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的pp3774多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人pp3774多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人pp3774多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人pp3774编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Clo1ing，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人pp3774蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进pp3774蛋白功能的促进剂、配体或其他小分子化合物。例如，用表达的重组人pp3774蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人pp3774蛋白功能的多肽分子。
在一个优选例中，提供了一种筛选pp3774蛋白促进剂的方法，它包括步骤
(a)在测试组中，向细胞培养物中添加待选的候选物和pp3774，并检测细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞的增殖情况与对照组中细胞的增殖情况进行比较，其中，所述的对照组包括(i)组未添加待选的候选物，也未添加pp3774的细胞培养物；(ii)组添加待选的候选物但不添加pp3774的细胞培养物；(iii)未添加待选的候选物但添加pp3774的细胞培养物；其中，如果测试组中的细胞的增殖在统计学上低于(优选明显低于)对照组(iii)并且对照组(i)和对照组(ii)的细胞增殖情况无显著差异，那么就表明该候选物是pp3774促进剂。
另一方面，本发明还包括对人pp3774 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人pp3774基因产物或片段。较佳地，指那些能与人pp3774基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人pp3774蛋白的分子，也包括那些并不影响人pp3774蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人pp3774基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人pp3774基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人pp3774蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人pp3774蛋白功能的抗体以及不影响人pp3774蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人pp3774基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人pp3774基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人pp3774蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人pp3774蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人pp3774蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人pp3774蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人pp3774蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人pp3774蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人pp3774蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与pp3774蛋白发生相互作用的物质，如受体、激动剂或促进剂等。
本发明蛋白及其抗体、激动剂或促进剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供所需的效果(如抑制肿瘤细胞生长)。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明pp3774多肽或其激动剂或促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
此外，本发明的pp3374多肽还可与其他治疗剂(如顺铂，5-FU等)一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的pp3774蛋白或其激动剂或促进剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
能与人pp3774蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人pp3774蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人pp3774蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人pp3774蛋白水平，可以用作解释人pp3774蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断pp3774蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在pp3774蛋白的方法是利用pp3774蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与pp3774蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在pp3774蛋白。
pp3774蛋白的多聚核苷酸可用于pp3774蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，pp3774蛋白的多聚核苷酸可用于检测pp3774蛋白的表达与否或在疾病状态下pp3774蛋白的异常表达。如pp3774 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断pp3774蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用pp3774蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测pp3774蛋白的转录产物。
检测pp3774基因的突变也可用于诊断pp3774蛋白相关的疾病。pp3774蛋白突变的形式包括与正常野生型pp3774 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的主要优点在于pp3774基因具有明确的功能可抑制细胞生长、诱发细胞凋亡、影响细胞周期、并与已知基因JAB1结合，因而pp3774基因具有作为靶点用于筛选药物(促进或抑制pp3774和JAB1结合的物质)等潜在用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1pp3774蛋白细胞定位利用含有限制性酶切位点的特异性引物，用PCR的方法扩增pp3774基因的编码区，以EcoRI/BamHI酶切位点装入真核表达载体EGFP-N1(购自Clontech公司)，使其能够表达C末端带有GFP标签的pp3774融合蛋白，经酶切鉴定和测序验证无误，即构建成pp3774-EGFP-N1融合表达载体，脂质体转染法转染SMMC-7721细胞，荧光观察PP3774-GFP融合蛋白的细胞定位。
亚细胞定位是利用pp3774基因转染COS-7活细胞加入内质网特异性荧光示踪剂ER-Tracker Blue-White DPX孵育后在荧光显微镜和ISIS图像分析系统完成的。
结果显示空载体标签蛋白GFP在细胞核、质均匀分布，而pp3774-EGFP-N1融合表达载体转染SMMC-7721细胞，荧光观察发现PP3774-GFP融合蛋白定位于细胞质(图1a、b)，进一步用内质网特异性荧光示踪剂ER-TrackerBlue-White DPX共定位显示PP3774蛋白主要定位于内质网(图1c-e)。
实施例2半定量逆转录-聚合酶链反应(Semi-Q RT-PCR)a)用Trizol试剂抽提生长状态良好的人肝癌细胞系SMMC-7721，BEL-7402，MHCC-LM3，MHCC-97L，Huh-7，Hep3B，HepG2和人永生化肝细胞L-02，其他肿瘤细胞系如胆囊癌细胞系GBC-SD，黑色素瘤细胞系A375，宫颈癌细胞HeLa，白血病细胞系K562，HL60以及人肝癌组织、癌旁组织总RNA，紫外分光光度计法定量及检测纯度，并取少量总RNA进行变性胶电泳，检查RNA是否降解；
b)将经DNase I处理过的细胞总RNA 9μl(5μg)与Oligo dT 1μl混合，72℃加热5min后，立刻置于冰上10min；c)加入8μl反转录混合液(10×RT Buffer 2μl，25mM MgCl22μl，10mMdNTP混合物1μl，0.1mM DTT 2μl，RNase抑制剂1μl)；d)在PCR仪上42℃加热5min后，加入1μl(50U)SuperScript II逆转录酶，42℃反应50min；e)70℃加热15min，终止反应，置冰浴；f)加入1μl RNase H，37℃ 20min，PCR混合物取逆转录产物各1μl，10mM dNTP 0.5μl，25mM MgCl22μl，5U/μl Taq聚合酶0.1μl，10×反应缓冲液2.5μl，10pmol引物RTF，RTR，反应体积为25μl，反应条件为94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，25个循环；72℃ 10min终止反应；g)PCR扩增看家基因β-actin作为检验反转录是否成功的标准；h分别取5μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统测定其每条扩增带的光密度值，将每一种目的DNA扩增片段光密度与内参照β-actin扩增片段光密度的比值(e/c)作为其mRNA表达水平的半定量指标，并作统计分析。
引物序列为pp3774 RTF5′-CTGGCTGGTAGACAACGTGA-3′(20bp)(SEQ ID NO3)pp3774 RTR5′-GAAAGGAGAAGGTGGGTGGT-3′(20bp)(SEQ ID NO4)逆转录扩增产物大小为521bp；β-肌动蛋白上游5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′(20bp)(SEQ IDNO5)β-肌动蛋白下游5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(20bp)(SEQ ID NO6)逆转录扩增产物大小为234bp。
结果表明，pp3774 mRNA在7个肝癌细胞系中的表达为BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表达，SMMC-7721、MHCC-LM3及永生化人肝细胞系L-02中度表达，而在Hep3B中低表达(图2)；而在18对肝癌和癌旁组织中的表达表现为13例癌旁高于癌，1例癌与癌旁基本相同，4例癌高于癌旁，配对t-test分析结果显示总体为癌旁高于癌(P＜0.05)。
实施例3免疫细胞化学和肝癌组织芯片免疫组化检测a)所有用于免疫细胞化学检测的单层细胞培养片和用于免疫组化检测的组织标本用10％中性缓冲福尔马林固定；b)组织标本采用石蜡包埋，5μm厚连续切片，HE染色进行普通病理组织学观察，肝癌组织的病理学分级和制备肝癌组织芯片前的定位，含有214对人肝癌及癌旁组织、18例肝硬化组织、10例正常肝组织的组织芯片制备方法完全按照本实验室业已建立的技术平台；c)用兔抗pp3774多克隆抗血清分离IgG作为第一抗体，应用EnvisionSystem-HRP(rabbit)，DAB显色，Mayer氏苏木素复染核，进行免疫细胞化学和免疫组化检测该基因在7株肝癌细胞系即SMMC-7721，BEL-7402，MHCC-LM3，MHCC-97L，Huh-7，Hep3B，HepG2，胆囊癌细胞系GBC-SD，黑色素瘤细胞系A375，宫颈癌细胞HeLa，白血病细胞系K562，HL60和人正常肝组织、肝硬化、癌旁肝和肝癌组织中的表达差异。
结果显示7株肝癌细胞系中野生型pp3774蛋白表达均很低。在10例正常肝组织和18例肝硬化组织中pp3774蛋白均为高表达。在214例肝癌-癌旁标本中194例癌旁组织高于癌组织，占90.65％(194/214)；8例癌旁组织与肝癌组织表达无明显差异，占3.74％(8/214)；12例则呈现癌高于癌旁组织，占5.61％(12/214)；总体上表现为正常肝、硬化肝和癌旁肝组织阳性反应明显高于肝癌组织(图3a-p)。肝癌旁组织阳性细胞主要有肝细胞，胆管上皮细胞，部分血管内皮也呈阳性反应；肝癌组织中呈阳性反应细胞主要是肝癌细胞。该基因编码的蛋白pp3774蛋白在肝癌和癌旁组织中的表达呈现癌旁组织明显高于肝癌组织，这与抑癌候选基因的特点是相符的。
实施例4pp3774基因转染细胞凋亡检测pp3774-HA融合基因和空载体pcDNA-HA瞬时转染SMMC-7721细胞进行的凋亡分析。
结果表明，尽管一般来说pp3774-HA融合基因的转染率略低于空载体pcDNA-HA转染细胞，但pp3774基因转染细胞的凋亡率高于空载体组10％左右(10.5％)(图4)，预示pp3774基因抑制细胞生长其诱发凋亡是原因之一。
实施例5pp3774与JAB1体内外的相互作用本发明人用酵母双杂交的方法以pp3774为诱饵蛋白从人的胎盘文库和胎脑cDNA文库中寻找可以与PP3774相互作用的蛋白，得到6个阳性克隆，经测序后发现6个阳性克隆均编码同一蛋白JAB1。JAB1全长1510bp，编码334个氨基酸。
为了确定pp3774与JAB1相互作用的关键性区域，分别构建了pp3774和JAB1的不同缺失子，利用酵母双杂交系统检测pp3774和JAB1的不同缺失子之间的相互作用。发现pp3774的zf-DHHC功能域是pp3774与JAB1相互作用的关键性区域，而JAB1的羧基端对于JAB1与pp3774的相互作用是不可豁缺的(图5A)。
为了证实pp3774与JAB1的相互作用，还进行了体外pull-down实验。
pp3774和JAB1的相互作用将不同PP3774缺失子以及PP3774全长基因克隆入pGBKT7载体，并和pACT2-JAB1共转染入Y187细胞，此外将不同的JAB1缺失子克隆入pACT2载体，并和pGBKT7-3774共转染Y187细胞，通过检测报告基因His3和LacZ的表达确定两者之间的相互作用。
图5B显示含有zf-DHHC功能域的不同pp3774缺失子以及pp3774全长基因均可以在体外诱导表达，JAB1能够被上述pp3774缺失子以及pp3774全长pull-down，从而在体外证实了pp3774与JAB1之间的相互作用(图5C)。
图5的结果显示pp3774中与JAB1相互作用的关键性区域存在于100-150位氨基酸，这一区域正是zf-DHHC功能域所在区。而JAB1的羧基端284-334位氨基酸对于JAB1与pp3774的相互作用是不可缺少的。
为了在体内证实pp3774与JAB1的相互作用，进行了体内pp3774与JAB1的共沉淀。用带有GFP标签的pp3774质粒和JAB1质粒共同转染COS-7细胞，转染后36小时裂解细胞，提取细胞总蛋白，分别用抗GFP和抗JAB1抗体沉淀后，用western-blot检测。
图6的结果显示pp3774和pp3774-Δ4可以分别被JAB1共沉淀，而JAB1也可以被pp3774和pp3774-Δ4共沉淀。为了检测沉淀的特异性，还检测了GFP蛋白与JAB1之间是否存在相互作用，结果发现GFP不能被JAB1共沉淀，从而说明了pp3774与JAB1相互作用的特异性。
实施例6筛选pp3774促进剂在测试组中，向SMMC-7721细胞培养物中添加待选的候选物和pp3774，并检测细胞的增殖情况；同时，设立以下3个对照组包括(a)未添加待选的候选物，也未添加pp3774的SMMC-7721细胞培养物；(b)添加待选的候选物但不添加pp3774的SMMC-7721细胞培养物；(c)未添加待选的候选物但添加pp3774的SMMC-7721细胞培养物；将测试组中细胞的增殖情况与对照组中细胞的增殖情况进行比较，同时比较各对照组之间的细胞的增殖情况。
结果(a)为细胞正常生长的空白对照；(b)显示待选的候选物对细胞的单独促进或抑制作用；(c)为pp3774蛋白对细胞生长的单独抑制作用；对照组(b)细胞增殖如果高于(a)，则添加待选的候选物为细胞生长促进剂，如果低于(a)则为细胞生长抑制剂；步骤(1)测试组中细胞如果增殖比对照组(c)高，表明待选的候选物为pp3774蛋白的拮抗剂；如果步骤(1)测试组中细胞增殖比对照组(c)低，表明待选的候选物为pp3774蛋白的协同促进剂。
筛选了数种候选物质，发现一种候选物可促进pp3774蛋白对SMMC-7721细胞的生长抑制作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市肿瘤研究所<120>pp3774基因在抑制细胞生长中的应用<130>058127<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1747<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(158)..(1243)<223>
<400>1ccgggtccgc tgcctggcgc tgcgggcggc gggccatggt ggtttggatt gagccgggcc 60cggccggggc gccgagtcgg agggggtggc agtgagcggc ggcagaggct acggggctcg120gtttggctga ctggggagtc ggcaggcggc aggaacc atg cga ggc cag cgg agc 175Met Arg Gly Gln Arg Ser1 5ctg ctg ctg ggc ccg gcc cgc ctc tgc ctc cgc ctc ctt ctg ctg ctg 223Leu Leu Leu Gly Pro Ala Arg Leu Cys Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu10 15 20ggt tac agg cgc cgc tgt cca cct cta ctc cgg ggt cta gta cag cgc 271Gly Tyr Arg Arg Arg Cys Pro Pro Leu Leu Arg Gly Leu Val Gln Arg25 30 35tgg cgc tac ggc aag gtc tgc ctg cgc tcc ctg ctc tac aac tcc ttt 319Trp Arg Tyr Gly Lys Val Cys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Asn Ser Phe40 45 50ggg ggc agt gac acc gct gtt gat gct gcc ttt gag cct gtc tac tgg 367Gly Gly Ser Asp Thr Ala Val Asp Ala Ala Phe Glu Pro Val Tyr Trp55 60 65 70ctg gta gac aac gtg atc cgc tgg ttt gga gtg gtg ttc gtg gtc ctg 415Leu Val Asp Asn Val Ile Arg Trp Phe Gly Val Val Phe Val Val Leu75 80 85gtg atc gtg ctg aca ggc tcc att gta gct atc gcc tac ctg tgt gtc 463Val Ile Val Leu Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Ala Tyr Leu Cys Val90 95 100ctg cct ctc atc ctc cga acc tac tca gtg cca cga ctc tgc tgg cat 511Leu Pro Leu Ile Leu Arg Thr Tyr Ser Val Pro Arg Leu Cys Trp His105 110 115
ttc ttc tat agc cac tgg aat ctg atc ctg att gtc ttc cac tac tac 559Phe Phe Tyr Ser His Trp Asn Leu Ile Leu Ile Val Phe His Tyr Tyr120 125 130cag gcc atc acc act ccg cct ggg tac cca ccc cag ggc agg aat gat 607Gln Ala Ile Thr Thr Pro Pro Gly Tyr Pro Pro Gln Gly Arg Asn Asp135 140 145 150atc gcc acc gtc tcc atc tgt aag aag tgc att tac ccc aag cca gcc 655Ile Ala Thr Val Ser Ile Cys Lys Lys Cys Ile Tyr Pro Lys Pro Ala155 160 165cga aca cac cac tgc agc atc tgc aac agg tgt gtg ctg aag atg gat 703Arg Thr His His Cys Ser Ile Cys Asn Arg Cys Val Leu Lys Met Asp170 175 180cac cac tgc ccc tgg cta aac aat tgt gtg ggc cac tat aac cat cgg 751His His Cys Pro Trp Leu Asn Asn Cys Val Gly His Tyr Asn His Arg185 190 195tacttc ttc tct ttc tgc ttt ttc atg act ctg ggc tgt gtc tac tgc 799Tyr Phe Phe Ser Phe Cys Phe Phe Met Thr Leu Gly Cys Val Tyr Cys200 205 210agc tat gga agt tgg gac ctt ttc cgg gag gct tat gct gcc att gag 847Ser Tyr Gly Ser Trp Asp Leu Phe Arg Glu Ala Tyr Ala Ala Ile Glu215 220 225 230act tat cac cag acc cca cca ccc acc ttc tcc ttt cga gaa agg atg 895Thr Tyr His Gln Thr Pro Pro Pro Thr Phe Ser Phe Arg Glu Arg Met235 240 245act cac aag agt ctt gtc tac ctc tgg ttc ctg tgc agt tct gtg gca 943Thr His Lys Ser Leu Val Tyr Leu Trp Phe Leu Cys Ser Ser Val Ala250 255 260ctt gcc ctg ggt gcc cta act gta tgg cat gct gtt ctc atc agt cga 991Leu Ala Leu Gly Ala Leu Thr Val Trp His Ala Val Leu Ile Ser Arg265 270 275ggt gag act agc atc gaa agg cac atc aac aag aag gag aga cgt cgg1039Gly Glu Thr Ser lle Glu Arg His Ile Asn Lys Lys Glu Arg Arg Arg280 285 290cta cag gcc aag ggc aga gta ttt agg aat cct tac aac tac ggc tgc1087Leu Gln Ala Lys Gly Arg Val Phe Arg Asn Pro Tyr Asn Tyr Gly Cys295 300 305 310ttg gac aac tgg aag gta ttc ctg ggt gtg gat aca gga agg cac tgg1135Leu Asp Asn Trp Lys Val Phe Leu Gly Val Asp Thr Gly Arg His Trp315 320 325ctt act cgg gtg ctc tta cct tct agt cac ttg ccc cat ggg aat gga1183Leu Thr Arg Val Leu Leu Pro Ser Ser His Leu Pro His Gly Asn Gly330 335 340atg agc tgg gag ccc cct ccc tgg gtg act gct cac tca gcc tct gtg1231Met Ser Trp Glu Pro Pro Pro Trp Val Thr Ala His Ser Ala Ser Val345 350 355atg gca gtg tga gctggactgt gtcagccacg actcgagcac tcattctgct1283Met Ala Val360ccctatgtta tttcaagggc ctccaagggc agcttttctc agaatccttg atcaaaaaga 1343gccagtgggc ctgccttagg gtaccatgca ggacaattca aggaccagcc tttttaccac 1403
tgcagaagaa agacacaatg tggagaaatc ttaggactga catcccttta ctcaggcaaa 1463cagaagttcc aaccccagac taggggtcag gcagctagct acctaccttg cccagtgctg 1523acccggacct cctccaggat acagcactgg agttggccac cacctcttct acttgctgtc 1583tgaaaaaaca cctgactagt acagctgaga tcttggcttc tcaacagggc aaagatacca 1643ggcctgctgc tgaggtcact gccacttctc acatgctgct taagggagca caaataaagg 1703tattcgattt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa1747<210>2<211>361<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>2Met Arg Gly Gln Arg Ser Leu Leu Leu Gly Pro Ala Arg Leu Cys Leu1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Leu Leu Gly Tyr Arg Arg Arg Cys Pro Pro Leu Leu20 25 30Arg Gly Leu Val Gln Arg Trp Arg Tyr Gly Lys Val Cys Leu Arg Ser35 40 45Leu Leu Tyr Asn Ser Phe Gly Gly Ser Asp Thr Ala Val Asp Ala Ala50 55 60Phe Glu Pro Val Tyr Trp Leu Val Asp Asn Val Ile Arg Trp Phe Gly65 70 75 80Val Val Phe Val Val Leu Val Ile Val Leu Thr Gly Ser Ile Val Ala85 90 95Ile Ala Tyr Leu Cys Val Leu Pro Leu Ile Leu Arg Thr Tyr Ser Val100 105 110Pro Arg Leu Cys Trp His Phe Phe Tyr Ser His Trp Asn Leu Ile Leu115 120 125Ile Val Phe His Tyr Tyr Gln Ala Ile Thr Thr Pro Pro Gly Tyr Pro130 135 140Pro Gln Gly Arg Asn Asp Ile Ala Thr Val Ser Ile Cys Lys Lys Cys145 150 155 160Ile Tyr Pro Lys Pro Ala Arg Thr His His Cys Ser Ile Cys Asn Arg165 170 175Cys Val Leu Lys Met Asp His His Cys Pro Trp Leu Asn Asn Cys Val180 185 190Gly His Tyr Asn His Arg Tyr Phe Phe Ser Phe Cys Phe Phe Met Thr195 200 205Leu Gly Cys Val Tyr Cys Ser Tyr Gly Ser Trp Asp Leu Phe Arg Glu210 215 220Ala Tyr Ala Ala Ile Glu Thr Tyr His Gln Thr Pro Pro Pro Thr Phe225 230 235 240Ser Phe Arg Glu Arg Met Thr His Lys Ser Leu Val Tyr Leu Trp Phe245 250 255Leu Cys Ser Ser Val Ala Leu Ala Leu Gly Ala Leu Thr Val Trp His260 265 270Ala Val Leu Ile Ser Arg Gly Glu Thr Ser Ile Glu Arg His Ile Asn275 280 285
Lys Lys Glu Arg Arg Arg Leu Gln Ala Lys Gly Arg Val Phe Arg Asn290 295 300Pro Tyr Asn Tyr Gly Cys Leu Asp Asn Trp Lys Val Phe Leu Gly Val305 310 315 320Asp Thr Gly Arg His Trp Leu Thr Arg Val Leu Leu Pro Ser Ser His325 330 335Leu Pro His Gly Asn Gly Met Ser Trp Glu Pro Pro Pro Trp Val Thr340 345 350Ala His Ser Ala Ser Val Met Ala Val355 360<210>3<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3ctggctggta gacaacgtga20<210>4<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4gaaaggagaa ggtgggtggt20<210>5<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5ggacttcgag caagagatgg20<210>6<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6agcactgtgt tggcgtacag20
权利要求
1.一种筛选pp3774促进剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向细胞培养物中添加待选的候选物和pp3774，并检测细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞的增殖情况与对照组中细胞的增殖情况进行比较，其中，所述的对照组包括(i)组未添加待选的候选物，也未添加pp3774的细胞培养物；(ii)组添加待选的候选物但不添加pp3774的细胞培养物；和(iii)组未添加待选的候选物但添加pp3774的细胞培养物；其中，如果测试组中的细胞的增殖在统计学上低于(优选明显低于)对照组(iii)并且对照组(i)和对照组(ii)的细胞增殖情况无显著差异，那么就表明该候选物是pp3774促进剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pp3774基因的序列如SEQID NO1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是癌细胞。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的细胞是肝癌细胞。
5.一种筛选pp3774和JAB1结合的促进剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向使pp3774和JAB1结合的培养物中添加待筛选的候选物，并检测pp3774和JAB1的结合情况；(b)将步骤(a)测试组中pp3774和JAB1的结合情况与未添加候选物的对照组中pp3774和JAB1的结合情况进行比较，如果测试组中pp3774和JAB1的结合在统计学上高于(优选明显高于)对照组，就表明该候选物是促进pp3774和JAB1结合的化合物。
6.一种筛选pp3774和JAB1结合的抑制剂的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向使pp3774和JAB1结合的培养物中添加待筛选的候选物，并检测pp3774和JAB1的结合情况；(b)将步骤(a)测试组中pp3774和JAB1的结合情况与未添加候选物的对照组中pp3774和JAB1的结合情况进行比较，如果测试组中pp3774和JAB1的结合在统计学上低于(优选明显低于)对照组，就表明该候选物是抑制pp3774和JAB1结合的化合物。
7.一种pp3774基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制备抑制癌细胞生长的组合物；或(b)制备调节细胞调亡的组合物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的组合物含有0.001-99.9wt％pp3774蛋白，按组合物的总重量计。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的组合物还含有pp3774蛋白的促进剂。
全文摘要
本发明基因pp3774(human Aph2，hAph2)的表达谱及抑制细胞生长的功能涉及肿瘤相关新基因，尤其涉及pp3774基因的功能应用。pp3774基因可抑制细胞生长、诱发细胞凋亡、影响细胞周期、并与已知基因JAB1结合，因而pp3774基因具有作为药物筛选靶点用于筛选药物(促进或抑制pp3774和JAB1结合的物质)等潜在用途。
文档编号A61K48/00GK1952165SQ200510030669
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者李锦军, 张锋锐, 顾建人 申请人:上海市肿瘤研究所