专利名称：一种以壳聚糖为佐剂的类变应原舌下含服疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及新型疫苗发明领域，具体地说是壳聚糖为佐剂的类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
背景技术：
过敏性疾病(如过敏性哮喘、过敏性鼻炎等)是临床上的常见病和多发病，据2000年WHO/IAACI报告指出近年来哮喘的发病率和死亡率呈上升趋势。全国部分城市对青少年哮喘流行病学统计哮喘发病率为3.3％-5.1％，远较10年前的1％要高；目前我国至少有一千万以上儿童患哮喘。
过敏性疾病是由于各种接触或吸入变应原引起的，变应原大部分为蛋白质，也可为多肽或糖类以及人工合成的物质如药物等。其中尘是强烈的变应原，能引起全身性变态反应包括变应性哮喘、变应性皮炎、变应性荨麻疹等疾病。变应疾病相应约占各种变应疾病的60％左右。自从Voorhorst和Spieksma(1964)首次证实尘螨及代谢产物是屋尘中的主要过敏原以来，世界各国(欧美国家、日本、中国等)变态反应学工作者通过调查也一致证实尘螨是世界性的主要变应原。其他较重要的变应原有花粉变应原、真菌变应原和蟑螂变应原等。与过敏性疾病有关的尘螨主要为屋尘螨(Derpmaatophagoidespteronyssinus，Der p)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae，Derf)，其中屋尘螨在过敏性疾病患者特异性免疫诊断中阳性率为第一位，次其为粉尘螨。粉尘螨和屋尘螨的主要变应原序列具有极高的同源性，其中II类变应原序列同源性为87％，而且两者之间有交叉反应性。变应原免疫治疗又称特异性变态反应疫苗治疗(Specificallergy vaccination，SAV)，是目前唯一的病因性治疗，它将使过敏性疾病(哮喘)个体内的Th2细胞免疫反应优势发生偏离和逆转，重建类似非过敏性个体内的免疫反应调节机制，该治疗方法已得到世界卫生组织(WHO)的充分肯定。研制出粉尘螨变应原疫苗用于治疗是我国卫生界工作者一项十分迫切的任务。
目前国内临床上使用的变应原疫苗多为注射制剂，由于是水性制剂变应原存在着降解快(影响免疫治疗疗效)、需长期反复注射(1-3次/周，患者依从性较差)，并限于6岁以上儿童使用，以及有发生过敏性休克的危险等不足之处，病人依从性差，大大防碍了特异性变应原治疗的实施。因此，探讨新型佐剂、新型给药方式和低变应原性的变应原是当前的热点。本疫苗结合了此三方面的优势，具有安全、高效和方便等特点。
类变应原是采用化学修饰方法对变应原进行处理，得到变应原性减弱，而保留其抗原性的类变应原。一项关于类变应原和传统变应原的SIT比较研究显示，前者有较高的抗原耐受剂量，而且1gG产生加快。这导致只注射7-8针的短期治疗概念的产生。在随后两个多中心研究中，短期SIT治疗被证明临床效果非常令人满意，副作用发生率降低，停止治疗后临床效果可持续3年。变态反应供体经变应原刺激的T细胞体外研究表明，在类变应原刺激时的TH1/TH2转移，比变应原刺激时更明显，有剂量依赖性。加大抗原剂量多次刺激，会导致细胞素的产生增加，其中IFN-γ的增加比IL-4明显。
经舌下含服给药较皮下注射具有以下优点①安全，无严重副反应，尤其是过敏性休克；②无年龄限制，可用于早期防治变态反应性疾病，对2-5岁儿童不适宜注射者亦可以使用；③使用方便。④舌下粘膜较薄且血管丰富，易于对变应原的吸收。舌下含服经多个临床双盲对照实验证实可有效的治疗呼吸道过敏性疾病，如哮喘，过敏性鼻炎。其治疗机理的研究尚处于起步阶段，可能与免疫耐受相关。Bagnasco等人报道，舌下含服的变应原可停留在舌下粘膜长达2h，提示舌下含服途径可促使变应原与粘膜下的郎格罕细胞结合，启动免疫耐受免疫调节反应。故研制出新型高效、安全方便的变应原舌下含服疫苗并探讨其作用机理是当前该研究领域的热点。
壳聚糖是一种从甲壳类动物提取制备的生物可降解性多糖，无生物毒性，具有良好的组织相容性。另外它作为生物粘附剂可延长制剂在用药部位的作用时间，促进粘膜对变应原的吸收；它还能打开上皮细胞间的紧密连接，促进大分子物质通过上皮转运。作为黏膜佐剂可增强局部和系统抗体生成。Kumar等(2003)报道壳聚糖纳米粒子作为佐剂它可选择性激发Th1型CD4+T细胞的免疫应答，分泌IFN-γ，并能刺激IgG2a的分泌，抑制IgE的产生，动物模型也证实对过敏性疾病具有免疫保护和治疗性作用。故壳聚糖是一种良好的变应原舌下疫苗佐剂。
所以，以壳聚糖为佐剂的类变应原舌下含服疫苗具有新型、安全和高效的特点，是具有潜在广阔的市场应用前景的。
发明内容
本发明的目的就是利用具有良好的生物组织相容性、无毒性、生物可降解性、促黏膜吸收的壳聚糖作为佐剂，制备新型、安全和有效的类变应原舌下含服疫苗。
本发明采用生化方法提取并精纯获得天然变应原溶液，将其与甲醛温和作用，制备变应原性大大降低而保留具有T细胞决定簇和免疫原性的类变应原。通过SDS-PAGE检测其生物学特性和竞争性ELISA法检测IgE反应性，免疫动物观察其抗体滴度。然后将壳聚糖与类变应原溶液混合，制备壳聚糖-类变应原舌下含服疫苗。该疫苗克服了传统粉尘螨粗浸液疫苗质量控制难、给药周期长的缺点，具有控释性和保护胃肠道酶降解等优点，可减少超敏反应的发生。该生产工艺简单，具有经济性和实用性等优点。
本发明包括可以通过以下方式实施具体实施方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明实施例1用生化提取技术精提粉尘螨变应原①、样品制备粉尘螨来自深圳大学生命科学学院微生物和基因工程重点实验室，取1克粉尘螨样品，放于-70℃冰箱冷冻10分钟，取出后用剪刀充分剪碎，并加入适量预冷乙醚-丙酮(1∶2)去脂。丙酮连续去脂48小时，期间换液5次(每8～10小时换液一次)，并放于通风厨下让其自然干燥。以上操作均在冰浴上进行。
脱脂后，对样品进行称重，并以一定的比例用碳酸氢盐-盐水提取液(Coca’s)浸泡样品。按1g样品20ml Coca’s液(w/v)的比例加入提取液。同时用柱塞式匀浆机对样品进行充分研磨破碎。将破碎好的样品用Coca’s液提取48hr。期间将样品充分搅拌，并放于4℃冰箱。
离心样品在4℃，15000转离心20分钟。离心后，吸取上清液，去沉淀。
②、透析4℃下，将上清对水透析两天，每天换液2-3次。
③、冷冻干燥根据需要将透析好后的样品进行冷冻干燥，制成粉末，保存于4℃或-20℃，以备使用(也可跳过本步骤)。
④、采用不连续SDS-PAGE体系对粗提液中蛋白质组分进行分离及分子量测定⑤、采用Western-blotting方法对样品的变应原进行免疫学特性鉴定。如鉴定证明提取液具有抗原活性。
⑥、凝胶过滤层析将样品浓缩液浓度以0.02mol/L pH7.2的Tris缓冲液调整为10mg/ml，在FPLC控制系统下，上预先含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L的Tris缓冲液充分平衡的Superdex-75柱，上样后，以相同的缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min。获得分子量为10,000到50,000Da的变应原蛋白样品。
⑦、层析组分的纯度和分子量测定用垂直平板电泳槽，14.4kDa～116.0kDa分子量标准蛋白作对照，并进行SDS-PAGE，再用凝胶成像分析系统测出粉尘螨变应原层析组分的纯度和分子质量。
⑧、收取样品冷冻干燥保存。
用示意图表示具体步骤如下(1)提取样品冰冻↓破碎↓丙酮去脂↓风干↓Coca’s液提取水溶性蛋白↓SDS-PAGE电泳检测↓Western Blotting免疫学特性鉴定↓透析↓冷冻干燥保存
(2)纯化蛋白对0.02mol/L pH7.2的Tris缓冲液透析↓凝胶过滤层析上样↓↓收集流出液进行SDS-PAGE↓Western Blotting免疫学特性鉴定↓收取纯化样品冷冻干燥保存实施例2粉尘螨类变应原的制备在4℃条件下，将1％甲醛水溶液与10％粉尘螨变应原溶液以等体积混合，轻柔搅拌。制备粉尘螨类变应原溶液。
实施例3粉尘螨类变应原的鉴定通过SDS-PAGE鉴定其变应原的分子量；通过竞争性ELISA法检测IgE反应性(变应原性)用粉尘螨变应原溶液包被微孔板，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS；100mmol/L，pH7.4)洗板。孔用200μl含10g/L BSA的PBS(BSA/PBS)封闭过夜。五点定标曲线用BSA/PBS对粉尘螨变应原溶液系列稀释后操作。加入用BSA/PBS 1∶1稀释的免疫球蛋白(粉尘螨特异性IgE)和竞争物(稀释定标物或粉尘螨类变应原)于试管中。每管取出100μl加入微孔板37℃温育2小时，洗板3次，加入100μl辣根过氧化物酶结合山羊抗鼠IgE的BSA/PBS液，37℃2h，洗板三次，用3、3、5、5、四甲基联苯胺作基质测定结合过氧化酶，显色时间30min，加入50μl 1mol/L的HCl终止反应。在酶标仪450nm处读板。结果计算为1Ac/Ao×100其中Ao为未加竞争物的吸光度，Ac为加入竞争物后的吸光度。
将类变应原溶液免疫小鼠，间隔三周，免疫两次，观察其产生的IgG和IgE抗体滴度(抗原性)。变应原性大大降低而抗原性不变的类变应原为符合标准的产品。
实施例4壳聚糖与粉尘螨类变应原的结合将壳聚糖(SIGMA产)(0 2％w/v)溶解于25mmol/L，pH5.0的醋酸钠溶液中。将类变应原与壳聚糖混合，制备所得产品用SDS-PAGE鉴定。
实施例5壳聚糖-粉尘螨类变应原免疫治疗过敏性哮喘动物采用C57BL/6小鼠，6-8周龄，按随机数字分组法分为5组，每组6只，分别为(1)正常组(2)模型组(3)空白壳聚糖治疗组(4)粉尘螨类变应原治疗组(5)壳聚糖-粉尘螨类变应原治疗组。在0、7、14天，第2-5组用粉尘螨粗浸液(10ug/ml)+10mg/mlAl(OH)3腹腔内致敏。在28、29、30天，第2-5组给予相应的试剂治疗。在44-46天，第2-5组连续给予50ug/50ul粉尘螨粗浸液滴鼻激发，激发后24小时，将所有动物处死，进行支气管肺泡灌洗、肺组织病理检查等实验评价治疗哮喘的效果。实验表明，壳聚糖-粉尘螨类变应原治疗组免疫治疗过敏性哮喘效果良好。
权利要求
1.一种以壳聚糖为佐剂的舌下含服类变应原疫苗的制备方法。具体地说采用生化方法提取并精纯获得天然变应原溶液，将其与甲醛/戊二醛温和作用，制备变应原性大大降低而保留具有T细胞决定簇和免疫原性的类变应原。通过SDS-PAGE检测其生物学特性和竞争性ELISA法检测IgE反应性，免疫动物观察其抗体滴度。将壳聚糖与类变应原混合，制备壳聚糖-类变应原舌下含服疫苗。同时通过建立小鼠粉尘螨变应原哮喘动物模型，给予壳聚糖-类变应原舌下含服疫苗舌下含服干预治疗，证实壳聚糖类变应原舌下含服疫苗对过敏性哮喘具有治疗作用。
2.根据权利要求1所述的通过将化学修饰的粉尘螨类变应原与壳聚糖混合制备以壳聚糖为佐剂的粉尘螨类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
3.根据权利要求1所述的通过将化学修饰的屋尘螨类变应原与壳聚糖混合制备以壳聚糖为佐剂的屋尘螨类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
4.根据权利要求1所述的通过将化学修饰的花粉类变应原与壳聚糖混合制备以壳聚糖为佐剂的花粉类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
5.根据权利要求1所述的通过将化学修饰的真菌类变应原与壳聚糖混合制备以壳聚糖为佐剂的真菌类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
6.根据权利要求1所述的通过将化学修饰的蟑螂类变应原与壳聚糖混合制备以壳聚糖为佐剂的蟑螂类变应原舌下含服疫苗的制备方法。
7.根据权利要求1所述壳聚糖-粉尘螨类变应原舌下含服疫苗用于过敏性哮喘的治疗。
8.根据权利要求1所述壳聚糖-屋尘螨类变应原舌下含服疫苗用于过敏性哮喘的治疗。
9.根据权利要求1所述壳聚糖-花粉类变应原舌下含服疫苗用于过敏性哮喘的治疗。
10.根据权利要求1所述壳聚糖-真菌类变应原舌下含服疫苗用于过敏性哮喘的治疗。
11.根据权利要求1所述壳聚糖-蟑螂类变应原舌下含服疫苗用于过敏性哮喘的治疗。
12.根据权利要求1将上述类变应原舌下含服疫苗联合用于过敏性哮喘的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种以壳聚糖为佐剂的舌下含服类变应原疫苗的制备方法。本发明应用甲醛与天然提取变应原溶液温和作用，制备类变应原，再以壳聚糖为佐剂制备舌下含服疫苗。具体地说采用生化方法提取并精纯获得天然变应原溶液，将其与甲醛温和作用，制备变应原性大大降低而保留具有T细胞决定簇和免疫原性的类变应原。通过SDS－PAGE检测其生物学特性和竞争性ELISA法检测IgE反应性，免疫动物观察其抗体滴度。将壳聚糖与类变应原混合，制备壳聚糖－类变应原疫苗。同时通过建立小鼠变应原哮喘动物模型，给予壳聚糖类变应原舌下含服干预治疗，证实壳聚糖－类变应原舌下含服疫苗对过敏性哮喘具有治疗作用。
文档编号A61P11/00GK1733299SQ20051003647
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者刘志刚, 冉丕鑫, 钟南山, 喻海琼, 吉坤美 申请人:深圳大学, 广州医学院