专利名称：一种抗高血压核酸疫苗及其制备方法
技术领域：
在医学领域中，本发明提供了一种治疗和预防高血压的核酸疫苗。
背景技术：
血压水平与心血管疾病风险呈连续性相关。世界卫生组织把高血压定义为未服抗高血压药情况下，收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg。而高血压诱因很多主要有遗传因素，环境因素，脏器病变因素。其中研究最为透彻的是肾素—血管紧张素(RAS)系统，而且大部分的药物也是针对肾素—血管紧张素系统(RAS)起效的。RAS系统是高血压形成的最重要的途径，其升高血压的机制如下肾脏近球小动脉的近球细胞分泌肾素，把肝脏分泌的血管紧张素原转化为血管紧张素I，血管紧张素I在肺上皮细胞的血管紧张素转换酶(ACE)作用下降解为血管紧张素II(AngII)，AngII与血管紧张素受体结合，而血管紧张素受体主要存在于血管，以及心，脑，肾，从而引起血管的强烈收缩，并刺激醛固酮的分泌，引起血压升高，同时使心肌重构造成心肌肥厚，加重高血压的病情。
AngII水平升高与醛固酮水平增加相协同，可使冠状动脉通透性增加生长因子渗入心肌间质，引起纤维组织增生，心肌壁增厚变硬，形成心室充盈不良，进而再增强RAS系统活动，抑制纤维蛋白溶解。研究表明AngII抑制纤维连接素而刺激纤维蛋白溶酶原抑制因子表达，因而减低纤溶，促进血栓形成。AngII可加重急性脑血管病人的多脏器衰竭。
目前全世界约有20％的成人患高血压，其中大约有50％的高血压病人还没有被诊断出来，已经被确诊的高血压患者中又有半数未接受治疗，而在接受治疗者中，血压真正得到有效控制的也仅占半数。高血压不仅是一个独立的疾病，而且是心脏病、脑卒中、肾功能衰竭等疾病的主要危险因素。国外研究显示，得了高血压，不经治疗，任其发展，三到五年就出现了部分心、脑、肾的损害，这组病人平均患病年龄32岁，平均死亡年龄51岁。
目前市场上所用的针对RAS系统抗高血压药物，主要是化学合成药物，他们可分为两种1.血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)，2.血管紧张素受体拮抗剂(ARB)。ACEI和ARB需要病人长期用药，给药间隔短，而本发明可长期抑制高血压，用药后可两周保持血压稳定，而且直接针对AngII产生抗体，降血压效果明显。疫苗作为生物制品，具有完全不同于现有化学药物的本质和作用机制，通过激活人自身的免疫系统，产生具有保护效力并可在体内维持相当长时间的抗体，故抗高血压疫苗的开发为安全有效地预防和治疗高血压提供了一个新思路和新方法。
AngII是八肽组成的升高血压的效应分子，血压的升高与之直接相关。本发明诱导体内产生针对AngII的抗体，屏蔽AngII的升血压作用，从而产生药效。白介素IV是一种细胞因子，可以增强免疫刺激作用，并且介导Th1(T辅助细胞)转为Th2免疫。由于Th1细胞参与许多器官特异性自身免疫疾病，而Th2细胞则起抑制作用，白介素IV可以使基因疫苗的所引起的细胞免疫和体液免疫，变为以体液免疫为主，从而升高抗体滴度，增强药效，减少副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗高血压的核酸疫苗。
本发明的另一目的是提供生产该抗高血压核酸疫苗的方法。
本发明的还有一个目的是该抗高血压核酸疫苗的用途。
在本发明的第一个方面，提供了一种抗高血压核酸疫苗。该质粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII载体结构框架图见说明书附图1，测序图见附4，除具有真核表达载体基本元件外，还包含有编码乙肝核心蛋白(HBc)的核苷酸序列，该HBc序列中已引入一个限制性内切酶的识别位点，并且引入了六段重复AngII序列。由于人源AngII是人体内固有短肽，自身无免疫原性，被自身免疫系统所耐受，若采用AngII直接作为免疫原，则无法产生理想的免疫效果。为增强AngII II的免疫原性，打破免疫耐受，我们采用乙肝核心蛋白(HBc)颗粒作为免疫载体。HBc具有在真核细胞大量表达，并自身装配成不具传染性的病毒样颗粒的独特性质。该颗粒由240个HBc单体组成，表面呈现有120个刺突，HBc的主要免疫区(MIR)即位于刺突的尖端。HBc病毒样颗粒易于被专职抗原递呈细胞摄取，有显著刺激B细胞、T辅助细胞及细胞毒T细胞产生免疫反应的能力。使用六段重复AngII多肽作为表位可以增强机体针对血管紧张素II的免疫作用。
白介素IV(IL-4)具有免疫刺激作用。该质粒(pIL-4)结构框架图见图2，测序图见图3。IL-4可作为佐剂，增强核酸疫苗的免疫效果，而且其本身在治疗自身免疫性疾病方面也发挥独特作用，抑制自身免疫性疾病的发生。
在本发明的第二方面，提供生产抗高血压核酸疫苗的方法，其技术路线详述如下1.抗高血压核酸疫苗质粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII及相应基因工程菌的构建根据血管紧张素II的多肽序列设计3条引物，用加端PCR方法扩增得到编码六段重复AngII的DNA片段，插入本实验室构建pCR3.1-X8-HBc的质粒载体中的AgeI的酶切位点中，组成融合表达的重组质粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII，重组质粒转化大肠杆菌DH-5α，获得重组基因工程菌。
2.工程菌发酵及抗高血压核酸疫苗重组质粒的获得以LB培养基为基础和发酵培养基，发酵参数如下温度36-38℃，PH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌。用碱裂解法对工程菌中的质粒DNA进行粗提，粗提液经阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，在TE(pH8.0)中以NaCl溶液进行梯度洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(如蛋白质、低分子量RNA)洗脱除去，然后用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，并将收集液用两倍体积无水乙醇沉淀，离心所得沉淀即为纯化质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的重组质粒纯度。
3高血压核酸疫苗最终制备把提取的pIL-4的质粒与pCR3.1-X8-HBc-sixANGII质粒在生理盐水中按1∶5的比例混合。
在本文的第三方面是抗高血压核酸疫苗的用途。将抗高血压核酸疫苗重组质粒直接免疫动物，通过宿主细胞的转译系统在机体内表达出表面呈现有AngII表位的重组HBC病毒样颗粒，激发机体产生针对AngII的特异性抗体。抗AngII抗体能与体内内源AngII结合，阻断AngII与其受体结合，从而降低血压，避免心肌重构，减少心肌纤维化。另一方面白介素IV(IL-4)可以通过改变局部的细胞因子水平，诱导Th1转化为Th2免疫，即增强了核酸疫苗的体液免疫效果，降低了由细胞免疫引起的自身免疫损伤。
图1pCR3.1-X8-HBc-six ANGII质粒结构2pIL-4质粒结构3pIL-4质粒测序4pCR3.1-X8-HBc-six ANGII中部分HBC和六段AngII测序5大鼠收缩压用药前后比较图。结果显示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII可以使高血压大鼠收缩压下降20mmHg(汞柱)。
图6大鼠舒张压用药前后比较图。结果显示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+Il-4可以使高血压大鼠舒张压下降10mmHg(汞柱)。
图7大鼠心肌肥厚各组比较图。结果显示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4免疫大鼠可以减轻大鼠心肌肥厚程度。
图8ELISA抗体检测图。ELISA测定结果显示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠，可以使大鼠产生最高的抗体滴度。
图9血清中血管紧张素II放免测定。结果显示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠，可以有效的降低血清中血管紧张素II的浓度。
图10心肌纤维化切片图。结果显示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠可以有效得保护心肌，减轻心肌的肥厚程度和纤维化的程度。
具体实施例方式
(1)菌株，细胞系和质粒宿主菌Escherichia coli DH-5α是基因工程常用工具菌种，与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pCR3.1uni购自Invitrogen公司。
(2)乙肝病毒提取自南京市第二医院HBcAg阳性病人血清(3)酶和试剂分子克隆工具酶购自MBI公司试剂PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品乙肝病毒基因组提取试剂盒为Qiagen公司产品其它试剂为上海生工生物工程有限公司订购(4)培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
(5)Cellouse-DEAE52为Whatman公司产品。
(6)辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠二抗为武汉博士德公司产品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(Sigma)公司产品。
(8)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(9)BESN-11多通道动物无创测压仪，南京德赛生物技术有限公司方法质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
核酸的定量测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
实施例1真核表达载体pCR3.1-X8-HBc的构建用QIAamp DNA Blood Mini Kit从南京市第二医院HBcAg阳性病人血清中提取乙肝病毒基因组RNA。并用市场销售的随机引物将RNA反转录为cDNA，根据乙肝核心抗原基因序列分别合成两对能与该基因互补的引物P1-P4。引物P1、P3和P4的5’端分别含有HindIII、AgeI和XbaI酶切位点，而引物P2的5’端依次含有PstI和AgeI两个酶切位点。第一步以P1和P2为引物，以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板进行PCR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30轮；72℃，10min。扩增得到的PCR产物即HBc的N端用限制性内切酶HindIII和PstI消化，与用相同限制性内切酶消化的pCR3.1uni质粒连接。再以P3和P4为引物，以反转录获得的乙肝病毒DNA为模板进行PGR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30轮；72℃，10min。扩增得到的PCR产物即HBc的C端用限制性内切酶AgeI和XbaI消化，与用相同限制性内切酶消化的第一步构建的质粒连接。这样就在HBcAg序列中的第80、81位氨基酸所对应的核苷酸处引入了AgeI位点。
P15’AAAAAGCTTATGGACATTGACACGTATAAAGAA 3’P25’TTTTTCTGCAGACCGGTTGGGTCTTCCAAATTACTTCC 3’P35’ATCACCGGTCGGGAATTAGTAGTCGGTTATGTCAATG 3’P45’TTGTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGAGATTG 3’设计T1和T2引物3’端25碱基互补，以引物自身为模板PCR得到三段重复AngII的序列并两端引入单酶切位点Age1，在3’末端引入Kpn1酶切位点。设计P3与P2，3’端25碱基互补，以引物自身为模板PCR得到三段重复AngII的序列并两端引入单酶切位点Kpn1。引物由上海博亚合成。
PCR反应体系100pmo1 T1，100pmol T2，2μl dNTP(10mmol/L)以及5单位的PFU DNA聚合酶，总体系为50μl。
100pmol T3，100pmol T2，2μl dNTP(10mmol/L)以及5单位的PFU DNA聚合酶，总体系为50μl。
PCR反应条件94℃ 5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 30s，循环数30；72℃10min。
将扩增纯化后的引物P1与P2，P3和P2扩增出的DNA片段，采用Age1进行酶切，反应体系如下ddH2O 27μl；10×Buffer O+6μl；Ang II DNA片段24μl；AgeI 3μl，共60μl，37℃，反应2h。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒回收。
采用碱裂解法对上步构建的pCR-X8-HBc质粒进行抽提，抽提得到的质粒也用AgeI进行酶切。酶切体系如下ddH2O 39ul，10×Buffer O+6μl，pCR-X8-HBc质粒12μl，AgeI 3μl，共60μl，37℃酶切2h。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒回收，并经0.8％agarose gel电泳检测确证。将该质粒酶切产物进行去磷酸化(CIAP1)处理。CIAP体系如下ddH2O 37μl，10×CIAP Buffer 7μl，pCR-X8-HBc质粒酶切产物24μl，CIAP 2μl，共70μl。CLAP产物经PCR产物纯化试剂盒回收，并经0.8％agarose gel电泳检测，确证CIAP产物已高效回收。将上述酶切回收后得到的P1和P2扩增得到的DNA片段和pCR-X8-HBc质粒片段进行连接。连接反应体系如下10×T4DNA连接酶Buffer 1μl，P1和P2扩增DNA片段4μl；pCR-X8-HBc质粒片段4μl，T4DNA连接酶1μl，共10μl，16℃连接过夜，所得连接产物为pCR-X8-HBc-3×ANGII质粒。
用碱裂解法提取pCR-X8-HBc-3×ANG质粒，用华瞬的质粒纯化试剂盒纯化后用Kpn1酶切。反应体系如下ddH2O 39μl，10×L 6μl，pCR-X8-HBc-3×ANG质粒12μl，KpnI 3μl，共60μl，37℃酶切2h。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒回收，并经0.8％agarose gel电泳检测确证。将该质粒酶切产物进行去磷酸化(CIAP)处理。CIAP体系如下ddH2O 37μl，10×CIAPBuffer 7μl，pCR-X8-HBc质粒酶切产物24μl，CIAP 2μl，共70μl。CIAP产物经PCR产物纯化试剂盒回收，并经0.8％agarose gel电泳检测，确证CIAP产物已高效同收。将上述酶切回收后得到的T3和T2扩增得到的DNA片段和pCR-X8-HBc-3×ANG II质粒片段进行连接。连接反应体系如下10×T4DNA连接酶Buffer 1μl，T3、T2扩增的DNA片段4μI；pCR-X8-HBc-3×ANG质粒片段4μl，T4DNA连接酶1μl，共10μl，16℃连接过夜，所得连接产物为pCR-X8-HBc-sixANG II质粒。
T1TTCACCGGTGACCGTGTTTACATCCATCCGTTCGATCGCGTGTATATTCATCCATTTGAT2TTTACCGGTACCGAACGGGTGGATGTAAACACGGTCAAATGGATGAATATACACGCGATT3AAAGGTACCGACCGTGTTTACATCCATCCGTTCGATCGCGTGTATATTCATCCATTTGA制备E.coli DH-5α感受态细胞，用上述连接液进行转化，将转化后涂布的平板上出现的抗amp的阳性克隆命名为pCR-X8-HBc-sixANG II，采用碱法抽提质粒后，采用PCR筛选挑选出阳性克隆。PCR筛选中用X1、T2进行扩增，如能得到462bp长度的DNA片段即为阳性克隆X15’AAA ATGGACATTGACACGTATAAAGAA 3’白介素IV pIL-4的获得白介素基因由Department of pathology and laboratorymedicine，University of Pennsylvania惠赠，设计了两条引物C1，C2扩增IL-4并引入EcoRI和Kpn I酶切位点装入Ptarget质粒中。
C15’CGAATTATGGGTCTCAACCCC
C25’GGTACCCTACGAGTAATCCATTT实施例2工程菌发酵及抗高血压核酸疫苗重组质粒的大规模制备含pCR3.1-X8-HBc-six ANGII质粒的工程菌培养在1000ml摇瓶中进行。从新鲜转接的平皿中挑取单菌落接入LB液体培养基中，37℃培养8小时至对数期作为一级种子，以1/250接种量接入到含250mlLB液体培养基的1000ml摇瓶中，37℃剧烈振摇继续培养12小时。以5000rpm离心15min收集菌体，将细菌沉淀物充分重悬于9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]中，再加入100μlRNase溶液[10mg/ml RNase，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl]，混匀后冰浴10min。缓慢加入20ml新配制的溶液II
，轻轻混匀后于室温放置5min。加入10ml用冰预冷的溶液III[5mol/L KAc60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml]，充分混匀内容物后冰浴10min。4℃以12000rpm离心30min，取上清，加入0.6体积的异丙醇，室温放置10min。室温以12000rpm离心30min，用70％乙醇洗涤沉淀，用2ml TE(pH8.0)溶解沉淀，即得质粒DNA粗品。将质粒DNA粗品上DEAE纤维素DE52柱(φ1.6cm×30cm)，在TE(pH8.0)中以NaCl进行梯度洗脱，先用0.3mol/L NaCl将杂质(如蛋白质、低分子量RNA)洗脱除去，然后用0.6mol/L NaCl将质粒DNA洗脱收集，并将收集液用两倍体积的无水乙醇沉淀，离心所得沉淀即为纯化质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯化的重组质粒纯度并进行定量。
实施例3抗高血压核酸疫苗的血压药效学研究制作二肾一夹型肾性高血压大鼠模型。取健康SD大鼠，体重180-220g，在水合氯醛的麻醉下，剪毛暴露左肾脏，用玻璃分针剥离肾动脉，套上U型夹缝合肌肉与毛皮，伤口用碘酒消毒并用砂布包裹分笼养，术后连续三天腹腔注射青霉素2-3万单位/只，每天一次。半月后约每3-5天可以测血压，首先连续测压三次，凡是收缩压高于160mmHG即得了肾性高血压。
模型对照组和生理盐水阴性对照组各8只。用无菌生理盐水将核酸疫苗或载体质粒稀释成1μg/μL，在每只大鼠两后肢胫骨前肌处各分别注射100μL核酸疫苗和20ul的白介素IV(pIL-4)核酸、载体质粒或生理盐水，即核酸疫苗实验组和载体组接种量均为240μgDNA/只。以后每隔2周加强免疫一次，共进行5次免疫。初次免疫后每隔2周眼眶内眦取血一次，血量为1.5ml，离心，取血清冷冻保存。用ELISA检测血清中抗AngII抗体，ELISA结果见图8，发现pCR3.1-X8-HBc-six ANG II和pIL-4按5∶1混合注射能诱发特异的抗Ang II的抗体，而且使大鼠的收缩压降低20mmHg见附图5，同时使大鼠的舒张压降低10mmHg见附图6(T检验P＜0.05)。
实施例4抗高血压核酸疫苗的血压药效学研究产生肾性高血压的大鼠给药后，停药后一个月处死。取心脏分离心脏左心室称重，并计算左心室与体重比值。pCR3.1-X8-HBc-six ANG II和pIL-4按5∶1混合注射能减轻心肌肥厚程度(T检验p＜0.05)，检测指标是左心室与体重的比值，见附图7，pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+pIL-4共注射组左心室肥厚程度比高血压模型对照组轻。切片检测进一步证实了pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+pIL-4共注射对心肌的保护作用见图10。
图10对免疫组，模型组，生理盐水组的心肌进行了切片，发现免疫组的心肌与模型组的心肌相比，免疫组的心肌纤维增厚程度减弱，血管壁增厚有所抑制，心肌纤维组织增生有所抑制。
图10中切片1为生理盐水组，其纤维分布，走行无异常，血管壁无增厚未见心肌增厚。切片2，4为模型组，明显心肌纤维增粗增厚，局部性萎缩，心肌间质纤维组织增生，血管壁增厚，部分纤维化，心脏增大，心肌壁增厚。切片3，4，6为免疫组心肌纤维与模型组相比无明显增厚，增粗；心肌间质无明显纤维组织增生，部分血管壁轻度增厚，心脏轻度增大。
权利要求
1.一种抗高血压的核酸疫苗，其特征为含有编码乙肝核心蛋白(HBc)的DNA序列，并在该HBc序列中引入编码人源血管紧张素II多肽重复片断(以下简称AngII)的DNA序列。该核酸疫苗质粒与白介素4(pIL-4)联合使用用于增强其免疫原性。
2.权利要求1所述的核酸疫苗，其特征为将一限制性内切酶(AgeI)的识别位点引入HBc的第80-81位氨基酸所对应的核苷酸序列中，用于插入外源表位六个重复AngII序列。重复的AngII序列插入后，经转染表达的融合蛋白仍能装配成纳米级颗粒，极大增强AngII的免疫原性。
3.权利要求2所述的核酸疫苗，其特征为HBc颗粒表面插入的抗原表位AngII，其氨基酸序列是Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe。
4.权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于核酸疫苗与白介素4的真核表达质粒混合后注射，可以诱导出针对血管紧张素II的高滴度抗体。白介素4可以特异性的增强体液免疫，并且增强机体对外原性物质的免疫应答，与该核酸疫苗联用可以诱发极强的免疫应答。
5.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于免疫动物后能激发机体产生抗血管紧张素II多肽的抗体，通过该抗体与机体内内源的血管紧张素II结合，调节生物体血压，减少心肌的灌注量，延缓心肌肥厚的形成，治疗高血压和心肌肥厚。
6.根据权利要求1所述核酸疫苗，其特征在于该核酸疫苗与白介素4真核质粒按5∶1的比例混合，能产生较好的免疫刺激作用，减轻本核酸疫苗的细胞免疫带来的副作用，增强体液免疫，诱导产生针对AngII的抗体。
7.根据权利要求1所述抗高血压核酸疫苗，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种治疗高血压的核酸疫苗及增强其药效的方法。该核酸疫苗以乙肝核心蛋白为免疫载体，以及白介素4(IL－4)作为免疫佐剂，用以增强抗原表位血管紧张素II多肽的(ANG II)的免疫原性。该疫苗与白介素4共同作用下，诱发机体产生抗血管紧张素II的抗体，该抗体与内原性血管紧张素II结合，抑制其活性，通过肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAS系统)，降低血压，保护心肌，减缓心肌肥厚等症状。
文档编号A61K48/00GK1706502SQ20051004023
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者刘景晶, 吴若飞, 曹荣月, 刘文涛, 吴洁 申请人:中国药科大学