专利名称：一种适用于基因输送的载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有效输送基因的高分子载体及其制备方法。
二、技术背景基因治疗是通过将正常的基因导入靶细胞来弥补某些代谢酶基因的缺陷而达到治疗的目的，它为治疗人类疾病和输送药物提供了一条新的途径，引起了人们的极大关注[Kevin R.Smith，“Archives of Medical Research”，第247-268页(2003年)]。寻求安全有效的转染模式一直是研究的核心。输送基因的主要技术障碍是缺少理想的基因输送的载体。只要足量的基因被输送至靶细胞，就有可能取得良好的效果。现在已经建立了转基因的手段和策略，包括磷酸钙沉淀法、电穿孔法、质脂体输送、以及受体介导的基因输送方式等，虽然它们已用于动物的培养细胞，但是有效地将基因导入体内的靶细胞还有一些困难。例如，用逆转录病毒或腺病毒做载体可以产生较高的转染效率，特别是，逆转录病毒已经成功地将外源基因导入活跃地分化细胞。但是，病毒载体易引发免疫炎症和致癌等缺陷也限制了它在临床的应用[Vladislav A.Lanzov，“Molecular Genetics andMetabolism”，第276-282页(1999年)]；质脂体虽然相对于病毒载体有较低的免疫原性和易制备的优点，但对细胞毒性大转染率较低也是其主要缺点[Sang-ohHan等人，“Molecular Therapy”，第303页(2000年)]。
聚阳离子高分子有很多优点，有希望成为基因输送的最佳选择。通过调节反应条件可以获得各种分子量大小的分子；许多活性官能团可以偶连细胞特异性受体识别的配体，从而提高基因输送的靶向性，也可能赋予载体良好的生理和理化性质；静电吸引可以使带负电的DNA和带正电的高分子形成纳米复合物，它易被细胞吞噬，并保护DNA免受酶的降解；低成本和易制备也是其优点。
目前，作为非病毒载体的聚阳离子高分子有以下几种聚乙烯亚胺(PEI)[Bettinger T等人，“Bioconjugation Chemistry”，第558-561页(1999年)]是目前研究最多的载体，它容易制备、能携带大量的DNA，有较高的转染效率，但是它毒性较大，且在体内不能降解；多聚赖氨酸[Wu G等，“Journal ofbiological chemistry”，262卷，第4429-4432页(1987年)]是一种多肽型的载体，它有良好的生物相容性和生物可降解性，但是，它在生理pH条件下，溶解性差，而且毒性较大，制备困难，价格较贵；壳多糖是唯一天然的聚阳离子高分子，分布广泛，生物相溶性好，无毒无副作用，但是它较难溶于水，转染效率不如PEI[Koping-Hoggard，“Gene Therapy”，第1108-1112(2001年)]。
一种理想的基因输送载体应该具备以下条件1，良好的生物相容性；2，能有效结合DNA；3，无毒，无致癌作用；4，低粘度，水溶性好，容易为细胞所摄取；5，易制备，成本低。
目前，以天冬氨酸为原料合成的生物材料有以下几种α，β-poly(N-2-hydroxyethyl)-D，L-aspartamide(PHEA)[Paolo Neri，“MedicalChemistry”，第893-899(1973年)]，是一种良好的血浆替代品和非离子型药物载体[G.Pitarresi，“Biomaterial”，第4333-4343(2004年)]，其结构式如下 它是一种中性大分子，不适合输送DNA；另外一种是a，β-polyasparthylhydrazide(PAHy)[Gaetano iammona，“PolymerInternational”，第93-98(2000年)]，是一种新的聚阳离子载体，其结构式如下 其合成要用到无水的肼，肼易燃易爆，操作困难；另外，分子链上的伯胺基携带DNA能力较弱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是要公开一种用于基因输送的载体聚阳离子高分子化合物(PDAI)及其制备方法，它包括原料聚天冬氨酸和3-二甲氨基丙胺及溶剂N，N-二甲基甲酰胺。
本发明的方案为1、载体的结构本发明所述用于基因输送的载体是含有叔氨基的聚天冬氨酸的阳离子衍生物，分子量为12万，其结构式 2、载体的合成方法及反应条件用磷酸做催化剂，在高温下，天冬氨酸聚合成为聚天冬酰胺；聚天冬酰胺再与3-二甲氨基丙胺反应，用透析提纯，最后冷冻干燥，获得产物PDAI。其合成路线为
3、载体的分子量及叔氨基含量测定方法采用高效凝胶过滤色谱和染料比色法。
4、载体的毒性评价将L929、Hela和HepG2三种细胞分别在含有PDAI的培养基中培养，采用MTT法，绘制细胞生长曲线。
5、载体的转染效率用β-半乳糖苷酶的基因作为报告基因，将质粒DNA与PDAI复合，选择L929、Hela和HepG2三种细胞为考察对象，通过测定β-半乳糖苷酶表达量来衡量PDAI的转染效果。
本发明合成了一种新的生物降解性聚阳离子高分子化合物(PDAI)，其优点是合成步骤简单，操作容易，安全性高，不需要特殊的设备和通风条件；其结构的骨架依然是聚天冬氨酸，但侧链上引入了叔氨基团，它比伯氨基团更容易结合质子，携带阳离子的能力更大。
本发明通过对反应条件的摸索，一方面，很好的解决了氨基含量影响载体毒性的问题；另一方面，选择天冬氨酸为原料，具有极好的生物相容性，本发明满足一款理想的基因输送载体的应当具备的条件，达到了更好的输送效果和更高的安全性。
四
图1为PDAI的分子量测定。
图2为PDAI的红外图谱。
图3为PDAI的核磁共振图谱。
图4为PDAI的叔氨基含量测定。
图5(a)、(b)和(c)为PDAI对L929、Hela和HepG2三种细胞毒性实验结果。
图6(a)、(b)和(c)为PDAI对L929、Hela和HepG2三种细胞转染实验结果。
五具体实施例方式
1、载体PDAI的制备将13.1克的天冬氨酸放入圆底烧瓶中，与5ml的85％的H3PO4混合，将烧瓶安装在旋转蒸发器上，维持减压状态在180℃用油浴加热4小时。将产物溶于100ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入200mL的水，使产物沉淀析出，离心，弃上清；用水洗涤沉淀，直到显中性。加热去除水分。
将1.5克的聚天冬氨酸溶于8ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.04mol的3-二甲氨基丙胺，室温搅拌24小时，用0.1mol/l的醋酸调pH＝7，用纯净水透析后冷冻干燥。
2、PDAI的理化性质测定用高效凝胶液相色谱测定PDAI的分子量，用DMF做流动相，流速0.5ml/l，用细胞色素C(13000Da)、牛血清蛋白(67000Da)、β-半乳糖苷酶(116000Da)和碱性磷酸酯酶(140000Da)做对照品，以洗脱体积(Ve)和分子量的对数(LogMr)做回归直线，实验结果见图2，将PDAI的洗脱体积代入回归方程，求得分子量为120000Da。
叔氨基含量可以用Xylidine Tobceau 2R染料的比色滴定法测定，XylidineTobceau 2R是带负电荷的染料，含两个磺酸基团，每个染料分子可与两个正电荷结合，从而使其最大吸收峰(OD505)的OD值会随着体系中叔氨基的浓度上升而下降，达到一个最小值，即染料分子全部反应后，氨基浓度虽然上升而体系的OD值不变，以OD值为Y轴，体系中PDAI溶液的体积为X轴作图，得到两条直线，这两条直线的交点的X值就是含有与体系中染料的阴离子数目相等带正电荷的PDAI的体积，由此可以推断出PDAI的叔氨基的百分含量。
用0.1mol/l的醋酸为溶剂，准确配制1mmol/l染料溶液以及40μg/ml的PDAI溶液，将不同体积的PDAI溶液与一定体积的染料溶液相混合均匀，静置15分钟后，在505nm测吸光度，求得叔氨基含量是52％。
用红外光谱和核磁共振确认PDAI的结构。实验结果见图3和图4。
3、PDAI对L929细胞的毒性评价将96孔板在75％的酒精中浸泡过夜；在超净台中吹干，紫外杀菌；取对数生长期的L929细胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104个细胞的密度接种96孔板，100μl/孔，培养过夜；待细胞贴壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI无血清培液，培养24小时；吸弃培液，每孔加入100μl的无血清培养液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反应4小时；小心吸弃孔内培液，每孔加150μiDMSO，室温培育30min；轻轻振动后通过酶标仪测每孔490nm的光吸收值，绘制细胞生长曲线。
研究发现，PDAI对细胞生长影响较小，PDAI几乎没什么毒性。
4、PDAI对Hela细胞的毒性评价选择Hela细胞为考察对象，具体步骤同实施例3。
将96孔板在75％的酒精中浸泡过夜；在超净台中吹干，紫外杀菌；取对数生长期的Hela细胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104个细胞的密度接种96孔板，100μl/孔，培养过夜；待细胞贴壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI无血清培液，用磷酸钙和PHEA做对照，培养24小时；吸弃培液，每孔加入100μl的无血清培养液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反应4小时；小心吸弃孔内培液，每孔加150μlDMSO，室温培育30min；轻轻振动后通过酶标仪测每孔490nm的光吸收值，绘制细胞生长曲线。
PDAI对细胞生长影响较小，PDAI几乎没什么毒性，而且有促进Hela细胞生长的趋势。
5、PDAI对HepG2细胞的毒性评价选择HepG2细胞为考察对象，具体步骤同同实施例3。
将96孔板在75％的酒精中浸泡过夜；在超净台中吹干，紫外杀菌；取对数生长期的HepG2细胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104个细胞的密度接种96孔板，100μl/孔，培养过夜；待细胞贴壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI无血清培液，用磷酸钙和PHEA做对照，培养24小时；吸弃培液，每孔加入100μl的无血清培养液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反应4小时；小心吸弃孔内培液，每孔加150μlDMSO，室温培育30min；轻轻振动后通过酶标仪测每孔490nm的光吸收值，绘制细胞生长曲线。
PDAI对细胞生长影响较小，PDAI几乎没什么毒性，而且有促进HepG2细胞生长的趋势。
通过四唑盐(MTT)比色法测定，并与血浆替代物PHEA、磷酸钙复合物进行比较。MTT细胞毒性证明PDAI该载体的细胞毒性比脂质体(数据未给出)和磷酸钙复合物低得多，生物相容性很好。
6、PDAI对L929细胞的基因转染评价培养L929细胞40小时左右，至对数生长期；将1ml无血清1640培养液加入到含有300μl裸β-gal质粒储液的1ml无血清1640培养液中，将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
培养L929细胞40小时左右，至对数生长期；将分别含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml无血清1640培养液加入到含有300μl β-gal储液的1ml无血清1640培养液中，使阳离子载体的终浓度为200μg/ml；将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
为确定PDAI载体/DNA复合物转染的最优质量比，我们用不同质量比的复合物分别转染L929细胞，其结果见附图6(a)。从图中可以看出，在载体/DNA质量比是1-5的范围内，该材料介导的L929细胞转染效率与裸质粒无明显提高，但当质量比为6时，转染效率最高，高达50％。
7、PDAI对Hela细胞的基因转染评价选择Hela细胞为考察对象，具体步骤同实施例6。
培养Hela细胞40小时左右，至对数生长期；将1ml无血清1640培养液加入到含有300μl裸β-gal质粒储液的1ml无血清1640培养液中，将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
培养Hela细胞40小时左右，至对数生长期；将分别含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml无血清1640培养液加入到含有300μl β-gal储液的1ml无血清1640培养液中，使阳离子载体的终浓度为200μg/ml；将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
为确定PDAI载体/DNA复合物转染的最优质量比，我们用不同质量比的复合物分别转染HeLa细胞，其结果见附图6(b)。从图中可以看出，在载体/DNA质量比是1-6范围内，该材料介导的HeLa细胞转染效率比裸质粒提高2倍左右。
8、PDAI对HepG2细胞的基因转染评价选择HepG2细胞为考察对象，具体步骤同实施例6。
培养HepG2细胞40小时左右，至对数生长期；将1ml无血清1640培养液加入到含有300μl裸β-gal质粒储液的1ml无血清1640培养液中，将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
培养HepG2细胞40小时左右，至对数生长期；将分别含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml无血清1640培养液加入到含有300μl β-gal储液的1ml无血清1640培养液中，使阳离子载体的终浓度为200μg/ml；将细胞放入37℃培养箱中反应6小时；倒出培养瓶中的废液，1×PBS冲洗，重新加入2ml含血清的1640培养液，培养24-48小时；收集细胞，用血球计数板计数；用紫外分光光度计测酶活性。
为确定PDAI载体/DNA复合物转染的最优质量比，我们用不同质量比的复合物分别转染HepG2细胞，其结果见附图7(c)。从图中可以看出，在载体/DNA质量比是6时，该材料介导的HepG2细胞转染效率有明显提高，特别是在3∶1的时候最高；而当质量比6∶1之后，转染效率明显降低可能是因为过多的正电荷使得HepG2细胞的死亡率增高，降低了转染效率的缘故。
研究表明，本发明对动物细胞安全有效，有较高的转染效率。
权利要求
1.一种用于基因输送的载体，其特征在于载体含有叔氨基的聚天冬氨酸的阳离子衍生物，分子量为12万，其结构为
2.一种权利要求1所述载体的制备方法，其特征是按以下步骤进行将聚天冬氨酸溶于DMF中，加入适量3-二甲氨基丙胺，室温搅拌，用醋酸溶液调pH＝7，用纯净水透析后冷冻干燥，合成路线为
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因输送载体及其制备方法，其结构特点是含有叔氨基的聚天冬酰氨的衍生物，分子量约为12万。该载体用于基因输送，具有较高的基因转染效率，同时具有优良的生物相容性和低毒性，并能促进细胞生长。
文档编号A61K47/34GK1706500SQ20051004026
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月27日 优先权日2005年5月27日
发明者张峻峰, 薛伟华, 鲁维飞, 刁华佳 申请人:南京大学