专利名称：一种禽流感病毒基因重配株d3/f－r2/6及其构建方法
技术领域：
本发明涉及应用反向遗传技术。特别是将一株H5N1亚型禽流感病毒(简称H5N1亚型AIV)的两个外部基因和一株H9N2亚型禽流感病毒(简称H9N2亚型AIV)的6个内部基因，构建成8个基因全部来自AIV的基因重配病毒株，用于制造疫苗。
背景技术：
RNA病毒的反向遗传操作技术是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，即将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项技术。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补等改造。该技术不仅可以用于研究RNA病毒的基因复制和表达调控机理、抗病毒策略、基因治疗，而且可用于构建新的疫苗病毒。
流感病毒的基因组由8个单股RNA构成，病毒的不同节段在决定病毒致病性方面有着不同的作用，其中起主要作用的是HA蛋白。首先它可以识别宿主细胞的受体并与其结合，流感病毒HA蛋白受体的特异性取决于宿主的种属。其次是HA被蛋白酶裂解为HA1和HA2的特性[甘孟侯主编.禽流感.第二版，北京农业出版社，2002.]，HA被蛋白酶裂解的特性受裂解位点处的氨基酸序列和位点附近糖基化的影响。低致病力毒株在裂解位点处只有一个碱性氨基酸精氨酸(R)，而高致病力毒株有多个碱性氨基酸[Bosch FX，GartenW，Klenk HD，et al.Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutininprimary structure of the connecting site of avian influenzavirus.Virology，1981，113(2)725-735]。多数高致病性流感病毒在HA1的C端为精氨酸(R)，HA2的N端为甘氨酸(G)，也有少部份HA1的C端为赖氨酸(K)[Gunther I，Glatthaar B，Doller G，et al.A H1 hemagglutinin of a humaninfluenza A virus with a carbohydrate-modulated receptor binding site and anunusual cleavage site.Virus Res，1993，27(2)147-160.]，H5亚型HA1C端上游的脯氨酸(P)和谷氨酸(Q)在不同毒株中保守。所有从自然界分离的低致病力H5毒株在Q和G之间大部分具有四个保守氨基酸R-E-T-R，即-P-Q-R-E-T-R↓G(“↓”为裂解位点)；而高致病力的H5毒株当HA裂解位点附近无糖基化侧链时，其序列为-P-Q-B-X-B-R↓G(B为任何碱性氨基酸)，若HA裂解位点附近有糖基化侧链时，则须插入任何两个氨基酸，序列为-P-Q-X-X-B-X-B-R↓G或-P-Q-B(X)-X(B)-B-X-B-R↓G，否则致病力不高[SenneDA，Panigrahy B，Kawaoka Y，et al.Survey of the hemagglutinin(HA)cleavagesites sequence of H5 and H7 avian influenza virusesamino acid sequence at theHA cleavage site as a marker of pathogenicity potential.Avian Dis，1996，40(2)425-37.]。
因为流感病毒有很多亚型，而且同一亚型还有不同的变异株，这使选择生产流感疫苗用合适的毒株有很大的困难。此外，有些分离株不能增殖出足够高滴度，需要花费力气浓缩以生产有足够保护力的疫苗[Palese P，García-Sastre.Influenza A Vaccinespresent and future.Clinical Investigation，2002，1109-13.]；同时由于流感病毒抗原的易变异性，每年都要重新评价疫苗的匹配性，这个过程费时又费力。但是反向遗传操作技术大大加速了这个过程，只需要将流行株的HA和NA基因与预先构建好的内部基因的质粒组合共转染细胞，就可以获得所需要的疫苗株。如Subbarao K等[Subbarao K，Chen H，Swayne D，et al.Evalution of a Genetically Modified Reassortant H5N1Influenza A Virus Vaccine Cadidate Generated by Plasmid-Based ReverseGenetics.Virology，2003，305192-200.]构建了H5N1/PR8重配病毒，该病毒的HA来自A/Hong Kong/97(H5N1)的HA，经基因修饰去除HA裂解部位的5个碱性氨基酸，采用12质粒系统产生H5N1/PR8病毒，使之成为弱毒株，所产生的病毒对小鼠和鸡都是致弱的。Chen H等采用同样方法构建产生H9N2/PR8病毒，其中H9N2是禽源A/CK/HK/G9(H9N2)株[Chen H，Subbarao K，SwayneD.et al.Generation and Evaluation of a high-growth Reassortant H9N2 InfluenzaA virus as a Vaccine Candidate.Vaccine，2003，21，1983-1988.]。Hoffmann E等利用8质粒拯救系统产生了H1N1/PR8，H9N2/PR8，H3N2/PR8，H6N1/PR8株[Hoffmann E，Krauss S，Perez D，et al.Eight-plasmid system for rapidgeneration of influenza virus vaccines.Vaccine，2002，Aug，19；20(25-26)3165.]。Liu M等构建的H5N3/PR8弱毒株在鸡胚上的HA效价高达1∶211，灭活疫苗能保护鸡对强毒的攻击，与商品化疫苗相比，能更明显地阻止排毒[Liu M，Wood JM，Ellis T.Preparation of a standardized，efficacious agricultural H5N3vaccine by reverse genetics.Virology，2003，314580-90.]。卢建红等利用8质粒拯救系统产生H5N1/WSN和H5N2/WSN的致弱的H5亚型重配流感病毒，但是在鸡胚中的复制滴毒不高，直接接种SPF鸡产生的抗体也很低(21～3)[卢建红，龙进学，邵卫星，等.用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重配流感病毒.微生物学报，2005，45(1)53-57]。目前国内已有注册的H5N1/PR8病毒禽流感疫苗。但是以上研究产生的重配病毒，其内部基因均来自人源流感病毒A/PR/8/34(H1N1)或A/WSN/33(H1N1)株。在实验室内人工将人流感病毒的内部基因和AIV的表面基因重配成新的A型流感病毒，由于流感病毒是分节段的负链RNA病毒，基因重配形成新型的流感病毒引起人流感大流行的可能性非常大，因此其可能存在的公共卫生威胁，已引起一些专家的担忧，而将弱致病性AIV的内部基因与致弱的高致病性AIV的表面基因进行重配，产生8基因全禽源病毒，这种危险性要小得多。
发明内容
本发明第一个目的在于发明一种8个基因全部来自AIV的致弱的H5N1亚型AIV基因重配株D3/F-R2/6，用于生产禽流感疫苗，可避免采用人流感病毒的内部基因和AIV的表面基因重配成新的流感病毒生产禽流感疫苗时，对公共卫生可能造成的威胁。
本发明禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6的保藏号为CGMCC NO1386，基因组长度为13.5Kb，由H5N1亚型AIV的两个外部基因和MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS构成，所述H5N1亚型AIV的两个外部基因分别是HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因和致弱的HA基因。
HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的致弱的HA基因DNA序列为atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc60attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt120
actgttacgc atgcccaaga catactggaa aaggcacaca acgggaaact ctgcgatcta 180gatggagtga agcctctaat tttgggagat tgtagtgtagc tggatggctc ctcggaaac 240cctatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtggg gaaggccagt 300ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360ttgagcagaa taaaccactt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat 420catgaagcct catcaggggt gagcgcggca tgtccatacc atgggaagcc ctcctttttc 480agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac 540aataacacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgca 600gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tctccgttgg aacatcaaca 660ttaaaccaga gattggtccc aaaaatagct actagatcca gagtaaacgg gcaaagtgga 720agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccataaattt cgagagtaat 780gggaatttca ttgctccaga atacgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840argaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actagactca gaaatacccc tcaaagagag 1020agaaggagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtggatac 1140gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260aggaggatag aaaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgattcaaat 1380gtcaagaacc tttacaacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440aatggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaaaaaac 1500gggacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagac taaacagaga ggaaataaat 1560ggagtaaaat tggaatcaat gggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680tcgttacaat gcagaatttg catttaaHPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因DNA序列为agcaaaagca ggagttcaaa atgaatccaa atcaaaagat aataaccacc ggatcaatct 60gtatggtaatt ggaatggtta gcttgatgtt gcaaattgg gaacataatc tcaatatggg 120ttagtcattc aattcagaca gggactcaac accgagctga accatgcaat cgaagcatta 180ttaattatga aaacaacacc tgggtaaatc agacatatgt caaaatcagc aacaccaatt 240ttcttactga gaaagctgtg gcttcagtaa gattagtggg caattcatct ctttgcccca 300
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上述MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS序列见GenBank，登录号为AY253750，AY253751，AY253752，AY253753，AY253755，AY253756。禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6于2005年6月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心存活保藏，保藏号为CGMCC NO1386。
本发明可用于制造禽流感疫苗，以避免采用人流感病毒的内部基因和AIV的表面基因重配成新的A型流感病毒制备禽流感疫苗时，对公共卫生构成威胁。
本发明第二个目的在于发明一种禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6的构建方法将MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS和HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因和致弱的HA基因进行重配，构建成禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6。
本发明将一株H5N1亚型AIV的两个外部基因和一株H9N2亚型AIV的6个内部基因，构建成8基因全部来自AIV的基因重配病毒株。由于现在采用的以质粒为基础的流感病毒拯救系统，是使用灵长类动物细胞作为转染细胞，因此全禽源的弱致病性的AIV能否在灵长类动物细胞中产生，还不得而知。在国内外也鲜见8基因都来自AIV尤其H9N2亚型AIV的拯救报道。而F株是弱致病性的H9N2亚型AIV，其在灵长类动物细胞中的复制水平受到限制，既使增加胰酶的含量也不足以能够拯救出病毒。最适合F株AIV复制的宿主是发育鸡胚，在其中繁殖的病毒滴度可达211。为此我们改进了转染方法即将质粒转染细胞后24h，就把转染质粒的细胞接种10日龄SPF鸡胚，孵育48h后再在SPF鸡胚上扩增一次。结果在拯救出了8基因全禽源的中国大陆分离的F株基础上，拯救出禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6。
本发明利用反向遗传技术，将1998年中国大陆分离的MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanhai/F/98(H9N2)的6个内部基因和HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)致弱的HA基因和NA基因进行重配，成功拯救出6+2组合的致弱的8个基因全部来自AIV的基因重配AIV，并对其毒力，致病性及免疫效力进行鉴定后，证明本发明可操作性强，性能稳定，可避免采用人流感病毒的内部基因和AIV的表面基因重配成新的A型流感病毒，制造禽流感疫苗时，对公共卫生构成威胁。
本发明包括以下具体步骤1)扩增鸡胚高度适应的MPAIV A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS。
扩增引物序列如下Bm-PB2-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC-3’；Bm-PB2-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3’；Bm-PB1-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA-3’；Bm-PB1-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGA AACAAGGCATTT-3’；Bm-PA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGAT-3’；Bm-PA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTT-3’；Bm-NP-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCA AAAGCAGGGTAGATAATC-3’；Bm-NP-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTC-3’；
Bm-M-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG-3’；Bm-M-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3’；Bm-NS-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG-3’；Bm-NS-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；2)分别扩增HPAIVA/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的HA基因和NA基因，扩增HA和NA基因的引物序列如下Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’；Bm-HA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；Bm-NA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3’；Bm-NA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’；3)修饰H5N1亚型HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的HA基因将HA基因的裂解位点PQRERRRKKR↓GL突变为非致病性流感病毒A/Teal/Hong Kong/W312/97(H6N1)株HA的裂解位点PQIETR↓GL；4)将修饰后的H5N1亚型HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的HA基因cDNA经3分子连接法克隆至pHW2000，构建致弱的A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株HA基因的转录/表达载体质粒pHW504-HA；5)构建6个内部基因的转录/表达质粒在8质粒转录/表达载体pHW2000中，分别插入F株6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)cDNA形成6个转录/表达质粒，即pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS；6)构建HPAIVA/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的NA基因的转录/表达质粒在8质粒转录/表达载体pHW2000中插入HPAIVA/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的NA基因形成pHW506-NA；7)6+2基因重配将来自F株的6个质粒pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS和来自A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的2个质粒pHW504-HA、pHW506-NA，按1∶1的比例混合，将混合的质粒和转染试剂加入COS-1细胞中，置含5％CO2、37℃培养箱中，培养24h后转接种10日龄SPF鸡胚，即获得禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6。
上述步骤4)中通过两对引物分别扩增HA1(1.05kb)和HA2(0.65kb)两个片段，凝胶电泳回收的HA1和HA2经BsmBI酶切、回收，与同样经BsmBI酶切的转录/表达载体pHW2000进行3分子连接反应，16℃作用12h；两对引物分别是Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGG-3’；Bm-HA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；P-MG4-1 5’-ACATCGTCTCACTAGAGGATTATTTGGAGCTAT-3’；P-MG4-2 5’-AGATCGTCTCTTCAATTTGAGGGCTTTTTCTGAGTCC-3’。
图1为修饰D3株HA基因裂解位点示意图。
图2为D3株修饰后的HA基因cDNA经3分子连接法克隆至pHW2000连接示意图。
具体实施例本发明选择的MPAIV和HPAIV毒株，这两个毒株必须具有良好的免疫性、在鸡胚中有较高的复制能力。本发明选择了用作H9N2亚型疫苗的MPAIV A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株，缩写为F株，该毒株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离纯化，经国家流感中心鉴定为H9N2亚型，全基因序列登录在GenBank，登录号为AY253750-AY253756[卢建红，刘秀梵，邵卫星，等.H9N2亚型AIV基因组全长序列测定和各基因的遗传分析.微生物学报，2003，43(4)434-41.]。选择HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株，简称为D3株，该毒株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离纯化，经国家流感中心鉴定为H5N1亚型。
本发明中所用的8质粒病毒拯救系统的准备8质粒病毒拯救系统pHW2000由美国St.Jude儿童研究医院的Robert Webster博士惠赠[HoffmannE，Neumann G，Kawaoka Y，et al.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A Virus from eight plasmids.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，976108～13.]。
步骤一F株和D3株RNA的提取F株和D3株毒种接种于SPF鸡胚，收集尿囊液300ml，6000rpm(30#转子)离心15min，取上清；18000rpm 4℃离心1.5h，用40ml STE(10mMpH8.0 Tris-HCl，100mM NaCl，5mM pH8.0 EDTA)悬浮沉淀。用10％蔗糖垫底，小心加入悬浮液，18000rpm 4℃离心1.5h去杂蛋白，弃上清，沉淀用30mL STE悬浮，18000rpm 4℃离心1h去蔗糖，沉淀用7mL STE悬浮，分装指形管，每管450μL。
用上海生物工程技术服务有限公司的RNA抽提试剂盒提取RNA。取300μL上述的病毒液制备，加入400μL Trizol充分混匀，再加入100μL氯仿/异戊醇(24∶1)，震摇30秒后，12,000rpm离心5分钟；移上清至无菌的1.5mL RNase-free离心管中，加入150μL无水乙醇，混匀；置于MNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm离心1分钟；弃去废液，在柱子中加入450μL Solution RPE，10,000rpm，离心30秒；重复前步一次；弃去废液，10,000rpm，离心15秒；移柱子入无菌、RNase-free离心管中，在柱子中央加入50μL DEPC-H2O，55-80℃放置2分钟，10,000rpm，离心1分钟，收集管内的溶液即为RNA样品。
步骤二F株的6个内部基因和D3株的HA和NA基因的扩增、克隆和序列测定设计引物用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增F株的6个内部基因，D3株的HA和NA基因，分别将各PCR产物克隆测序，并与各基因已公开序列进行对比。
扩增F株6个内部基因的引物序列如下Bm-PB1-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA-3’；Bm-PB1-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGA AACAAGGCATTT-3’；Bm-PA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGAT-3’；Bm-PA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTT-3’，Bm-NP-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATTC-3’；Bm-NP-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTC-3’；Bm-PB2-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC-3’；Bm-PB2-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3’；Bm-M-15’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG-3’；Bm-M-25’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3’；Bm-NS-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG-3’；
Bm-NS-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’。
12uni5’-AGCAAAAGCAGG-3’扩增D3株的HA和NA基因的引物序列如下Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’；Bm-NA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3’；Bm-NA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’；Bm-HA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’。
为方便以上8基因片段克隆到转录/表达载体pHW2000(转录/表达载体上有BsmBI酶切位点)中，设计PCR扩增基因片段的引物时，在上游和下游引物的5′端加上克隆的酶切位点BsmBI位点，缩写为Bm，带下划线处为相应酶的识别位点。另外，用所有片段cDNA5′端都具有的12nt设计作RT的通用引物(12uni)，用于反转录。所有引物由宝生物(大连)有限公司合成。
反转录F株和D3株全基因组(25μl反应体系)分别取以上提取的F株或D3株基因组RNA 15μl，加入1μl 50p mol/L12nt引物70℃变性5min，立即置0℃，然后依次加入如下试剂5×RT buffer 5μLRNasin(40U/μL)1μL10mM dNTPs 2μLAMV反转录酶1μL(10U/μL)42℃作用1h，可立即使用或置-20℃备用。
PCR扩增HA和NA全长片段(50μL反应体系)分别取上述RT产物(cDNA)10μL至0.5mL PCR反应管中，其中扩增PB2片段时使用引物Bm-PB2-1和Bm-PB-2；扩增PB1片段时使用引物Bm-PB1-1和Bm-PB1-2；扩增PA片段时使用引物Bm-PA-1和Bm-PA-2；扩增HA片段时使用引物Bm-HA-1和Bm-HA-2；扩增NP片段时使用引物Bm-NP-1和Bm-NP-2；扩增NA片段时使用引物Bm-NA-1和Bm-NA-2；扩增M片段时使用引物Bm-M-1和Bm-M-2；扩增NS片段时使用引物Bm-NS-1和Bm-NS-2。依次加入如下试剂
10×PCR buffer5μL10mM dNTPs1μL上游引物(50pmoL/L)1μL下游引物(50pmoL/L)1μL超纯水(SW)31.5μL瞬时离心，94℃预变性5min，在75-80℃加Expand High Fidelity聚合酶0.5μL(2.5U)；用94℃40s，58℃35s，72℃ 2min 30个循环；最后72℃延伸7分钟，4℃运行10min。
取PCR产物5μL，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR产物的克隆、鉴定和序列测定PCR产物经电泳鉴定，余下产物全部电泳，切割含目的大小片段的凝胶，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收，与pGEM-Teasy vector连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，经EcoRI酶切鉴定，将PCR产物和与T载体连接的产物同时送上海联合基因科技有限公司测序。
用DNASTAR4.0软件，用EditSeq编辑序列，MegAlign中的Clustal方法，将RT-PCR扩增的片段拼接成每个基因的全序列。F株的全基因序列登录在GenBank，登录号为AY253750-AY253756[卢建红，刘秀梵，邵卫星，等.H9N2亚型AIV基因组全长序列测定和各基因的遗传分析.微生物学报，2003，43(4)434～41.]，D3株的HA和NA基因序列见本文。
步骤3D3株HA基因的修饰和构建D3株HA基因的转录/表达质粒通过RT-PCR方法扩增出D3株的HA基因并测序后，根据序列设计突变引物将D3株的HA基因的裂解位点PQRERRRKKR↓GL突变为非致病性流感病毒A/Teal/Hong Kong/W312/97(H6N1)株HA的裂解位点PQIETR↓GL(如图1)，经3分子连接，克隆到8质粒拯救系统转录/表达载体pHW2000上，形成转录/表达质粒pHW504-HA。
用于突变HA基因的下游引物P-MG4-2位于993-1020nt，与上游引物Bm-HA-1配对，扩增cDNA 5’端片段HA1(预期约1.05kb)；上游引物P-MG4-1位于编码区的1036-1055nt，与下游引物Bm-HA-2配对，扩增cDNA 3’端片段HA2(预期约0.65kb)。引物如下Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGG-3’；
Bm-HA-2 5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；P-MG4-1 5’-ACATCGTCTCACTAGAGGATTATTTGGAGCTAT-3’；P-MG4-2 5’-AGATCGTCTCTTCAATTTGAGGGCTTTTTCTGAGTCC-3’；引物由宝生物(大连)有限公司合成。
3分子连接将修饰的HA cDNA克隆入pHW20003分子连接见图2，按上述设计的引物配对扩增HA1(1.05kb)和HA2(0.65kb)两个片段，凝胶电泳回收的HA1和HA2经BsmBI酶切、回收，与同样经BsmBI酶切的转录/表达载体pHW2000进行3分子连接反应，16℃作用12h，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，酶切和PCR鉴定，送上海联合基因公司测序验证。
3分子连接反应体系如下10×连接buffer1μLT4 DNA连接酶(3U/μL) 1μLHA1回收酶切产物(0.2μg/μL) 2.5μLHA2回收酶切产物(0.2μg/μL) 4μLpHW2000回收酶切产物(0.2μg/μL) 1.5μL质粒酶切鉴定HA cDNA的253bp处有载体上没有的单一EcoRI位点，载体的645bp处有HA插入片段上没有的单一ApaI位点，阳性质粒用EcoRI和ApaI酶切片段为1.6kb。
步骤四构建F株的6个内部基因和D3株NA基因的转录/表达质粒在8质粒转录/表达载体pHW2000中，分别插入F株6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS cDNA形成6个转录/表达质粒，即pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M和pHW208-NS；插入D3株NA基因形成pHW504-NA转录/表达质粒。
各基因的不同克隆片段经序列分析，选择序列正确的用于克隆至8质粒转录/表达载体pHW2000中。首先用BsmBI酶切F株的6个内部基因、D3株的NA基因和8质粒转录/表达载体pHW2000，BsmBI酶切体系(40μL)如下，质粒DNA(0.3μg/μL)取5μL。55℃作用4h。
10×buffer Y+ 4μL目的基因(0.2μg/μL)5μLBsmBI(10U/μL) 1μLSW 30μL
酶切片段和载体分别经凝胶电泳、回收，再用T4 DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，挑菌落扩大培养，小量提取质粒，用8质粒系统中标准大小的相应质粒作对照，凝胶电泳，大小一致的初步鉴定为阳性克隆，-20℃和-70℃冻存。
步骤五D3/F-R2/6株AIV的拯救和鉴定转染用质粒和转染用细胞的准备将基因片段来自F株的转录/表达质粒pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS的转化菌和来自D3株的质粒pHW504-HA、pHW506-NA的转化菌扩大培养，用QIAGEN公司的小提质粒试剂盒提质粒，并测定含量和纯度，制备高纯度的质粒用于转染。将生长状态良好的COS-1细胞消化后计数，按105个细胞/孔的细胞浓度置于24孔细胞培养板中培养过夜。
病毒拯救将来自F株的6个质粒pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS和来自D3株的2个质粒pHW504-HA、pHW506-NA，按1∶1的比例混合。按照Lipofectin Reagent转染试剂操作说明稍作改进转染即将混合的质粒和转染试剂加入COS-1细胞中，置含5％CO2、37℃培养箱中，培养24h后，刮下转染的细胞接种10日龄SPF鸡胚；培养48h后收获尿囊液继续接种10日龄SPF鸡胚，每日观察鸡胚死亡和病变情况，适时收集鸡胚尿囊液进行病毒鉴定，获救病毒简称D3/F-R2/6株。
病毒鉴定D3/F-R2/6株的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验按OIE标准进行。含F株6个基因的质粒和D3株的pHW504-HA、pHW506-NA的质粒按1∶1的比例共转染COS-1细胞，接种的第一代10日龄SPF鸡胚尿囊液血凝效价达28，将第一代10日龄SPF鸡胚尿囊液稀释103～105倍，无菌接种10日龄SPF鸡胚传代后，血凝效价最高达211。分别用H1和H5AIV阳性血清做D3/F-R2/6株基因重配AIV的HI试验，D3/F-R2/6株可被H5阳性血清抑制，HI效价为29，但不能被H1阳性血清抑制。
序列鉴定用RT-PCR方法获得D3/F-R2/6株AIV中的HA和NS基因，由联合基因上海联众基因研究院测序鉴定，方法见步骤2。结果D3/F-R2/6株AIV的HA基因为D3株的HA基因，其裂解位点为已突变的序列PQIETR↓GL；NS基因为F株的NS基因，登录号为AY253756[卢建红，刘秀梵，邵卫星，等.H9N2亚型AIV基因组全长序列测定和各基因的遗传分析.微生物学报，2003，43(4)434～41.]。说明D3/F-R2/6株AIV是F株和D3株重配病毒。
步骤六D3/F-R2/6株AIV的生物学特性测定D3/F-R2/6株AIV的致病力测定按OIE标准，用0.2mL 1∶10稀释的无菌D3/F-R2/6株尿囊液，经静脉接种10只6周龄SPF鸡后连续观察10天，未发现接种鸡死亡，其IVPI为0，鸡的生长发育正常。
D3/F-R2/6株AIV在SPF鸡体内的复制用接种D3/F-R2/6株后第3、5、7、9、12天采集的接种鸡的气管和泄殖腔棉拭子样品，接种10日龄SPF鸡胚，以分离病毒。在接种鸡气管中接种后有一段时间排毒，但第9天即分离不到病毒；在接种鸡泄殖腔中接种后有一段时间排毒，但第12天即分离不到病毒(表1)。
表1 D3/F-R2/6株AIV在鸡体内复制情况Table 1 Replication of the D3/F-R2/6 AIV in chickens
D3/F-R2/6株AIV接种10日龄SPF鸡3周后HI试验按OIE标准测得平均HI效价是29。
D3/F-R2/6株AIV的ELD50和EID50测定D3/F-R2/6株AIV的ELD50/EID50都是108/0.2mL，鸡胚的平均死亡时间在80～84h.。死亡鸡胚全身轻度水肿、脑充血、腹部表面有出血点、肺部淤血及肝脏轻度坏死。
以上试验说明D3/F-R2/6株AIV是弱致病性的H5N1亚型AIV。
D3/F-R2/6株AIV在SPF鸡胚传代的稳定性和传代后对SPF鸡的致病性由转染COS-1细胞接种的第一代10日龄SPF鸡胚尿囊液，HA血凝效价达28；将第一代10日龄SPF鸡胚尿囊液连续传20代，死亡鸡胚尿囊液的HA效价达到211(1∶2048)(表2)，鸡胚的平均死亡时间80～84h。说明D3/F-R2/6株AIV在鸡胚中具有很高的复制能力。
用RT-PCR方法获得第20代D3/F-R2/6株AIV的HA基因，由联合基因上海联众基因研究院测序，结果证明D3/F-R2/6株AIV的HA基因为D3株的已致弱的HA基因，其裂解位点为PQIETR↓GL。说明D3/F-R2/6株AIV经过传代，其序列没有发生变化。对6周龄SPF鸡的致病性试验显示，在观察的10天内，接种的10只SPF鸡未见死亡，其IVPI为0。说明D3/F-R2/6株AIV经过传代，其弱致病性的生物学特性很稳定。
表2 D3/F-R2/6株AIV在SPF鸡胚中传代的HA效价(2n)Table 2 HA titer of D3/F-R2/6 AIV in embronating chicken egg of SPF origin at 5，10，15，20 Passages(2n)
步骤七D3/F-R2/6株AIV对SPF鸡的免疫保护试验和交叉免疫保护试验将50只1日龄SPF鸡分成5组，每组10只，7日龄时其中两组分别经颈部皮下接种D3/F-R2/6株AIV灭活油苗、一组接种D3株的灭活油苗各0.3mL，一组设为不接种疫苗直接攻毒H5N1亚型AIV，一组为健康对照组。免疫后21天采血分离血清，测抗体效价，分别用107ELD50D3株对D3/F-R2/6株，D3株灭活疫苗免疫组和不接种疫苗直接攻毒组进行滴鼻、滴眼攻毒。连续观察14天，统计发病和死亡情况。
D3/F-R2/6株AIV灭活疫苗对SPF鸡的免疫和交叉免疫保护试验见表3。D3/F-R2/6株AIV灭活油苗免疫后21天的平均HI抗体效价270.25，用鹅源H5N1亚型AIVG5株做抗原，测得的平均HI抗体效价26.5±0.3；D3株灭活油苗免疫后21天的平均HI抗体效价25.5±0.2。D3/F-R2/6株AIV和其母本野生病毒D3株灭活油苗为SPF鸡提供的免疫保护率都是100％；用鹅源H5N1亚型AIV攻毒，其交叉免疫保护率为100％。未免疫组经D3株攻毒后7天内全部死亡，健康对照组鸡正常。免疫后的HI抗体滴度表明D3/F-R2/6株AIV灭活疫苗对H5N1亚型HP禽流感具有更好的保护作用。
表3 D3/F-R2/6株AIV灭活油苗对SPF鸡的免疫和交叉免疫保护效率Table 3 Protective efficacy of D3/F-R2/6 inactivated vaccine in oil emulsion in SPF chickens
步骤八D3/F-R2/6株AIV对商品鸡的免疫保护试验和交叉免疫保护试验试验设计同步骤7，商品鸡的免疫保护试验和交叉免疫保护试验结果见表4。商品鸡的母源抗体为21～3。D3/F-R2/6株AIV灭活油苗免疫后21天的抗体效价为26.5±0.3，用鹅源H5N1亚型AIVG5株做抗原，测得的平均HI抗体效价为26±0.2；D3株灭活油苗免疫后21天的平均HI抗体效价为24.2±0.5。商品鸡的免疫保护率和交叉免疫保护率都是100％。未免疫组经D3株和G5株AIV攻毒后7天内全部死亡，健康对照组鸡正常。免疫后的HI抗体滴度表明D3/F-R2/6株AIV灭活疫苗对H5N1亚型HP禽流感具有更好的保护作用。
表4 D3/F-R2/6株AIV灭活油苗对商品鸡的免疫和交叉免疫保护效力Table 4 Protective eficacy of D3/F-R2/6 inactivated vaccine in oil emulsion in commercial broilerchickens
权利要求
1.一种禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6，其特征在于其保藏号为CGMCC NO1386，基因组长度为13.5Kb，由H5N1亚型AIV的两个外部基因和MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS构成；所述H5N1亚型AIV的两个外部基因分别是HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因和致弱的HA基因；HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的致弱的HA基因DNA序列为atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120actgttacgc atgcccaaga catactggaa aaggcacaca acgggaaact ctgcgatcta 180gatggagtga agcctctaat tttgggagat tgtagtgtagc tggatggctc ctcggaaac 240cctatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtggg gaaggccagt 300ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360ttgagcagaa taaaccactt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat 420catgaagcct catcaggggt gagcgcggca tgtccatacc atgggaagcc ctcctttttc 480agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac 540aataacacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgca 600gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tctccgttgg aacatcaaca 660ttaaaccaga gattggtccc aaaaatagct actagatcca gagtaaacgg gcaaagtgga 720agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccataaattt cgagagtaat 780gggaatttca ttgctccaga atacgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actagactca gaaatacccc tcaaagagag 1020agaaggagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtggatac 1140gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260aggaggatag aaaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgattcaaat 1380gtcaagaacc tttacaacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440aatggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaaaaaac 1500gggacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagac taaacagaga ggaaataaat 1560ggagtaaaat tggaatcaat gggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680tcgttacaat gcagaatttg catttaaHPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因DNA序列为agcaaaagca ggagttcaaa atgaatccaa atcaaaagat aataaccacc ggatcaatct 60gtatggtaatt ggaatggtta gcttgatgtt gcaaattgg gaacataatc tcaatatggg 120ttagtcattc aattcagaca gggactcaac accgagctga accatgcaat cgaagcatta 180ttaattatga aaacaacacc tgggtaaatc agacatatgt caaaatcagc aacaccaatt 240ttcttactga gaaagctgtg gcttcagtaa gattagtggg caattcatct ctttgcccca 300tgtttgttat aagagagccg ttcatctcat gctcccactt ggaatgccga accttctttt 360tgactcaggg agccttgctg aatgataagc actccaatgg gaccgtcaaa gacagaagcc 420cttacagaac attgatgagc tgtcctgtgg gtgaggcccc ctccccatat aactcgaggt 480ttgagtctgt tgcttggtcg gcaagtgctt gtcatgatgg cactagttgg ttgacaattg 540gaatttctgg cccagacaat ggggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag 600acactatcaa gagttggagg aacaacatac tgagagctca agagtctgaa tgtgcatgtg 660taaatggctc ttgctttact gtaatgactg acggaccaag taatgggcag gcttcatata 720agatcttcaa aatagaaaaa gggaaagtag ttaaatcagt cgaattgaat gcccctaatt 780atcactatga ggagtgctcc tgttatcctg atgctggcga aatcacatgt gtgtgcaggg 840ataattggca tggctcaaat cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtaccaaa 900taggatatat atgcagtgga gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggca 960gttgtggtcc ggtgtcccct aacggggcat atggagtaaa agggttttca tttaaatacg 1020gcaatggtgt ttggatcggg agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga 1080tttgggatcc aaatgggtgg actggaacgg acagtaattt ttcggtgaag caagatatcg 1140tagctataac tgattggtca ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag 1200gattagattg cataagacct tgtttctggg ttgagctaat cagagggcgg cccaaagaga 1260gcacaatttg gactagtggg agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg 1320gttggtcttg gccagacggt gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag tttgttcaaa 1380aaactccttg tttctact。
2.一种禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6的构建方法，其特征在于将MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS和HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因和致弱的HA基因进行重配，构建成禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6。
3.根据权利要求2所述禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤1)扩增MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS，扩增引物序列如下Bm-PB2-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC-3’Bm-PB2-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3’；Bm-PB1-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA-3’；Bm-PB1-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3’；Bm-PA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGAT-3’；Bm-PA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTT-3’；Bm-NP-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATC-3’；Bm-NP-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTC-3’；Bm-M-15’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG-3’；Bm-M-25’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3’；Bm-NS-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG-3’；Bm-NS-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；2)分别扩增HPAIV株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的HA基因和NA基因，扩增HA和NA基因的引物序列如下Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’；Bm-HA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；Bm-NA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3’；Bm-NA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’；3)修饰H5N1亚型HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的HA基因将HA基因的裂解位点PQRERRRKKR↓GL突变为非致病性流感病毒A/Teal/Hong Kong/W312/97(H6N1)株HA的裂解位点PQIETR↓GL；4)将修饰后的H5N1亚型HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的HA基因cDNA经3分子连接法克隆至pHW2000，构建HPAIVA/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株致弱的HA基因的转录/表达质粒pHW504-HA；5)构建6个内部基因的转录/表达质粒在8质粒转录/表达载体pHW2000中，分别插入MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)cDNA，形成6个转录/表达质粒，即pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS；6)构建HPAIV A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的NA基因的转录/表达质粒在8质粒转录/表达载体pHW2000中插入HPAIVA/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的NA基因形成pHW506-NA；7)6+2基因重配将来自F株的6个质粒pHW201-PB2、pHW202-PB1、pHW203-PA、pHW205-NP、pHW207-M、pHW208-NS和来自A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)株的2个质粒pHW504-HA、pHW506-NA，按1∶1的比例混合，将混合的质粒和转染试剂加入COS-1细胞中，置含5％CO2、37℃培养箱中，培养24h后转接种10日龄SPF鸡胚，即获得禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6。
4.根据权利要求3所述禽流感病毒基因重配株D3/F-R2/6的构建方法，其特征在于步骤4)中通过两对突变引物分别扩增HA1(1.05kb)和HA2(0.65kb)两个片段，凝胶电泳回收的HA1和HA2经BsmBI酶切、回收，与同样经BsmBI酶切的转录/表达载体pHW2000进行3分子连接反应，16℃作用12h；两对突变引物分别是Bm-HA-1 5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGG-3’；Bm-HA-2 5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’；P-MG4-1 5’-ACATCGTCTCACTAGAGGATTATTTGGAGCTAT-3’；P-MG4-2 5’-AGATCGTCTCTTCAATTTGAGGGCTTTTTCTGAGTCC-3’。
全文摘要
一种禽流感病毒基因重配株D3/F－R2/6及其构建方法，涉及应用反向遗传技术。将MPAIV鸡胚高度适应株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)的6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS和HPAIV流行株A/Duck/Huadong/D3/00(H5N1)的NA基因和致弱的HA基因进行重配，构建成禽流感病毒基因重配株D3/F－R2/6。可用于制造禽流感疫苗，以避免采用人流感病毒的内部基因和AIV的表面基因重配成新的A型流感病毒制备禽流感疫苗时，对公共卫生构成威胁。
文档编号A61K39/12GK1733912SQ20051004097
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月8日 优先权日2005年7月8日
发明者刘秀梵, 石火英, 卢建红, 张小荣 申请人:扬州大学