专利名称：含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是一种药物和疫苗的传递系统。尤其是在药物或疫苗的传递系统中，提供一种含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法及其应用。
背景技术：
纳米技术是21世纪最具革命性的技术之一，是一门跨学科的边缘科学技术。是生物学、医学、材料学、化学、物理学等多门学科的结晶。纳米技术作为一种空间平台技术，其范围已涉及到许多学科和技术领域。尤其在医学领域、药剂学发展及生物工程和医学器材方面有革命性的突破，成为医学、生物医学及药学研究中的热点之一。
纳米技术在医学研究中涉及到医学材料、医学设备、药剂学的研制技术的发展。纳米粒子的制备和应用则是药剂学中具有希望的突破点并具有极大的市场和应用价值。纳米粒子在药剂学研究中通常是指大小在100nm-1000nm范围内的粒子(平其能“纳米药物和纳米载体系统”。中国新药杂志2002年地11卷第1期，编号1003-3734(2002)01-0042-05)。
在生物医学领域中利用纳米或微米粒子作为诊断工具，结合计算机技术提高诊断的敏感性和正确性，从而达到早期、快速和精确诊断。为肿瘤疾病的治愈提供帮助(Borm PJ，Kreyling W.J Nanosci Nanotechnol.2004 May；4(5)521-31.Toxicological hazards of inhaled nanoparticles--potential implications for drugdelivery)。同时，由于纳米制备的诊断试剂盒便于储存和运输，从而减少了诊断费用。尤其适合于大规模现场流行病学的普查和边远地区的医院使用。
在药物学和药剂学中纳米粒子作为药物传递系统具有以下优势1、纳米粒子因其尺寸、理化特性和表面特性特别适合作为各种类型的药物载体，并通过不同的结合方式形成药物的传递系统。由于其尺寸属于亚细胞、亚微米范围，在体内被细胞摄取的效率比微米粒子大15-250倍并且可以穿过亚粘膜层，而微米只停留在粘膜表层。纳米粒子还可以有效地穿过血脑屏障，从而传输药物进入脑部，增加药物在脑部的浓度，有效的治疗脑部疾病。例如脑瘤，就是由于药物不能很好的通过血脑屏障而得不到有效的治疗(Lisa Brannon-Peppas and James O.Blanchette.Adv Drug DelivRev.2004 Sep 22；56(11)1649-59.Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy.以及Kreuter J.J Nanosci Nanotechnol.2004 May；4(5)484-8.Influence of thesurface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.)。
2、有些纳米粒子是可以生物降解的。当纳米携带药物进入体内，随着纳米粒子的降解，药物持续释放从而保证了药物的浓度，提高了药物的作用时间，减少了用药量，减轻了药物的毒副作用，减少了病人因服药而引起的不适反应。
3、纳米粒子可以定向输送药物，尤其是可以定向输送抗肿瘤药物，在静脉注射纳米抗肿瘤药物后，发现药物聚集在肿瘤周围，提高了药物抗肿瘤特性，减少了用药量，能够明显降低病人对药物的毒副作用的反应。纳米粒子这种靶向输送药物的功能，提高了药物局部浓度，增加了药物的疗效，尤其适合于脑部和眼部疾病的治疗(Lockman PR，Mumper RJ，Khan MA，Allen DD.Drug Dev Ind Pharm.2002 Jan；28(1)1-13.Nanoparticle technology for drugdelivery across the blood-brain barrier.)。
4、改善大分子药物的稳定性。尤其是肽类和蛋白质类药物。把这类药物合成到纳米粒子内，可保护药物在口服时不被胃肠道的低PH值环境所破坏并保护药物不被酶降解(Gavini E，Chetoni P，Cossu M，Alvarez MG，SaettoneMF，Giunchedi P.Eur J Pharm Biopharm.2004 Mar；57(2)207-12.PLGA microspheres forthe ocular delivery of a peptide drug，vancomycin using emulsification/spray-drying as thepreparation methodin vitro/in vivo studies.以及Morishita M，Takayama K.NipponRinsho.2002 Sep；60 Suppl 9516-21.The design of oral insulin delivery systemsbased on smart hydrogels)。
5、最近研究发现用纳米作为载体的药物不仅可以靶向传输药物到特定的组织和细胞还可以传递药物到特定的细胞器，更进一步提高药物的生物利用度(Takeuchi H，Yamamoto H，Kawashima Y.Adv Drug Deliv Rev.2001 Mar23；47(1)39-54.Mucoadhesive nanoparticulate systems for peptide drugdelivery.)。
纳米粒子在药物传递和药剂学的研制和发展中占据越来越重要的地位，不久将成为最具有潜力的药物携带系统。尤其是随着生物药品的需求和市场比重的增加，纳米药物传递系统的需求必将随之提高。
目前在药物传递系统中最常见研究的纳米粒子有由脂肪酸、脂肪醇及磷脂组成的固体脂质纳米粒子；由聚乳酸、聚丙胶脂、聚壳糖、明胶等生物高分子材料制备的纳米球或纳米束；由聚乳酸和聚乙二醇的共聚物或者是聚壳糖及其衍生物组成的纳米粒子。其合成方法有聚合法；超临界技术；凝聚分散法；高压匀质法；熔融分散法；溶剂蒸发法和乳化/溶剂扩散法。目前在我国最常研究的纳米粒子有脂质纳米、纳米囊、纳米球及纳米胶囊。其中脂质体纳米粒子是国内外研究最广泛的一种(平其能，“纳米药物制剂的现状与未来”2002-09-03，中国医药报；以及Maitra，et al.United State Patent 6,555,376.July 24，2002；以及Bell，etal.United State Patent 635，5271.March，2002；以及Fulton et al.United StatePatent 5,266,205.Nov，1993)。
虽然纳米技术合成的药物和疫苗传递系统在近年来有很大的进展，但仍然存在一些重要的障碍，使得纳米粒子作为药物传递系统在产业化方面停滞不前。目前存在的问题有(Rao GC，Kumar MS，Mathivanan N，Rao ME.Pharmazie.2004 Jan；59(1)5-9.Nanosuspensions as the most promising approach innanoparticulate drug delivery systems.)首先，大多数纳米粒子的原材料是有机化合物或其衍生物，合成过程复杂。与大分子药物结合的制备过程中会改变大分子药物的结构，从而降低其活性。例如，PLGA在与蛋白质药物结合的过程中会失去大约30％的蛋白质活性。
其次，一些纳米粒子在体内不能生物降解，从而影响所携带药物的缓释和控释作用，并且由于粒子的在体内的聚集，有可能产生一定的副作用。
第三，大部分纳米粒子合成过程复杂，原材料又多为一些有机大分子物质，因而每一批产品之间的重复性差，粒子的尺寸、表面物化特性及浓度在不同批品之间有很大的差异，很难控制纳米粒子的工业化生产，给纳米粒子的产业化带来很大的障碍。脂质体纳米是最常见的。
第四，有些粒子载体系统有一定的副作用，其产生的副作用的机制尚不清楚。例如，用脂质体作为流感疫苗的载体，临床报道出现面瘫高发率，目前已在欧洲市场禁用。
第五，多聚物纳米粒子在多次服用后，因其生物降解速度慢，可能诱发全身性毒性反应，并在降解过程中可能产生毒性代谢物。
第六，高分子有机物的纳米粒子无法进行高压消毒，只能用伽马射线消毒。这也影响到纳米粒子在人体的应用。
第七，目前尚没有发现一种方法可以大规模的生产脂质纳米粒子并有效的控制成本。
第八，固体脂质纳米粒子与药物结合后稳定性差，药物极易从纳米粒子上分解，从而影响药物的包封率。
目前为止尚无一种纳米传递系统正式应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于针对目前在药物学和药剂学中采用的纳米粒子多为固体脂质纳米粒子以及纳米囊、纳米球及纳米胶囊在制备和作为药物传递系统应用中存在的一系列问题，提供一种在体内能生物降解并含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的一种含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法，其特征在于首先制备包含生物活性物质的无机盐纳米粒子，具体过程是将0.01～1.0摩尔的盐溶液、生物活性物质溶液、0.01～1.0摩尔的磷酸溶液按1∶1∶1混合后，在4℃下搅拌48小时，超声处理15分钟，在4℃下，8500rpm离心15分钟，去除含有游离生物活性物质溶液的上清液，用去离子水悬浮粒子，在5mg/ml的浓度形成含有生物活性物质的无机盐纳米粒子，其大小尺寸为100nm～800nm；然后包封中药的活性物质和生物活性物质，具体过程是室温下，将含有生物活性物质的无机盐粒子、中药的活性物质和生物活性物质按1∶10∶10混合后，按10mg/ml的浓度悬浮在PH值7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液中，4℃下在摇床上摇动2小时，4℃，8500rpm离心三次，每次15分钟，获得含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子。
获得的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子应该贮存于4℃或冷冻干燥后备用。
所述的盐溶液是用去离子水制备的0.01～1.0摩尔的氯化锰，或氯化镁，或氯化钙溶液；所述的中药的活性物质是中药的单体多糖或复合体的活性物质；所述的生物活性物质溶液是含有蛋白质，或脂溶性的小分子药物，或水溶性的小分子药物，或抗体类药物，或多肽类药物的溶液，或基因遗传活性物液体。
所述的中药的单体多糖活性物质是虫草多糖，或茯苓多糖，或黄芪多糖，或甘草酸，或枸杞多糖；所述的中药的复合体活性物质是虫草，或茯苓，或黄芪，或甘草，或枸杞的粗提物。
一种含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的应用，其特征在于作为载体传递生物活性物质治疗疾病，或作为疫苗佐剂。
所述的生物活性物质是指蛋白质，或脂溶性的小分子药物，或水溶性的小分子药物，或多肽类药物，所述的疫苗是指蛋白质或多肽类物质抗体或基因遗传活性物。
传递生物活性物质的方式包括黏膜传递或通过系统给药。
所述的黏膜给药是指鼻黏膜给药，或阴道给药，或口腔给药；所述的系统给药是指腹腔注射，或静脉注射，或肌肉注射。
本发明的优点在于由于在制备过程中形成的磷酸钙、或磷酸镁、或磷酸锰等无机盐纳米粒子易于相互粘连，分散率差，表面物理化学特性需要改进，采用中药的活性物质包裹后形成的无机盐纳米粒子不仅可以改变离子的表面电极，提高它们的分散率，而且提高了生物活性物质对无机盐纳米粒子的包封率；中药中的有效成分(多糖、皂苷等成分)本身具有一定的生理功能，一旦与无机盐纳米粒子结合后，可以使纳米粒子从纯粹的携带体变为具有一定生物功能的纳米携带体；同时，形成的纳米粒子可以在体内生物降解。
本发明的优点还在于不仅制备含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的工艺简单，而且产品的稳定性高，不同批次的批间的差异极小，易于产业化。
图1含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的模型图；图2含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法的工艺流程；图3含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子扫描电镜照片；图4含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的大小分布；图5含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子携带人体生长激素体外释放试验；图6含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子携带人体生长激素经鼻腔给药后在血浆中的含量；图7人体简单病毒II型抗原(HSV-2)在体外从纳米粒子释放试验。
在图1、图2中1、无机盐纳米粒子，2、中药的活性物质，3、生物活性物质，4、盐溶液，5、磷酸溶液，6、含有生物活性物质的无机盐纳米粒子，7、搅拌器，8、高速离心机，9、超声波破碎仪，10、摇床，11、冷冻干燥机。
具体实施例方式
实施例1含有中药黄酮和皂苷成分的用人体生长激素(hGH)包封的无机盐纳米粒子的制备方法及其应用制备前的准备盐溶液用去离子水制备0.01～1.0摩尔的氯化锰(或氯化镁，或氯化钙溶液)。
磷酸溶液用去离子水制备0.01～1.0摩尔的磷酸溶液。
生物活性物质溶液按每100ml磷酸缓冲液+10mg人体生长激素的比例制备10％的人体生长激素溶液。
中药的活性物质溶液按每100ml生理盐水+10mg黄酮和皂苷的制备成中药的复合体活性物质溶液。
PH值为7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液可以外购。
图1是含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的模型图，由图1可见，模型的中的无机盐纳米粒子1内部为生物活性物质3，在含有生物活性物质3的无机盐纳米粒子1的外围包封有中药的活性物质2，最后再包封生物活性物质3。本实施例反映的是含有人体生长激素和包封中药成分黄酮和皂苷的无机盐纳米粒子，在无机盐纳米粒子1选择的是人体生长激素，外围选择的都是黄酮和皂苷，最外层包封的还是人体生长激素。
图2是含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法涉及的工艺流程，由图2可见，制备过程如下a)制备包含生物活性物质的无机盐纳米粒子将0.01～1.0摩尔的盐溶液4、生物活性物质3溶液、0.01～1.0摩尔的磷酸溶液5按1∶1∶1混合置于搅拌器7后，在4℃下搅拌48小时，再通过超声波破碎仪9超声处理15分钟，然后在4℃下，经过高速离心机8在转速为8500rpm离心15分钟，去除含有游离生物活性物质溶液的上清液，用去离子水悬浮粒子，在5mg/ml的浓度形成含有生物活性物质的无机盐粒子6，其大小尺寸为100nm～800nm；b)包封中药的活性物质和生物活性物质室温下，将含有生物活性物质的无机盐纳米粒子6、中药的活性物质2(本实施例为中药复合体的活性物质)和生物活性物质3按1∶10∶10混合后，按10mg/ml的浓度悬浮在PH值7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液中，4℃下在摇床10上摇动2小时，然后在4℃下，经过高速离心机8在转速为8500rpm离心三次，每次15分钟，获得含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子。
获得的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子应该贮存于4℃或通过冷冻干燥机11冷冻干燥后备用。
在具体制备过程中，所述的盐溶液4可以选用去离子水制备的0.01～1.0摩尔的氯化锰，或氯化镁，或氯化钙溶液；所述的中药的活性物质2可以选用中药的单体或复合体的活性物质，它们包括虫草多糖，或茯苓多糖，或黄芪多糖，或甘草酸，或枸杞多糖以及包括虫草，或茯苓，或黄芪，或甘草，或枸杞的粗提物；所述的生物活性物质3溶液可以选用含有蛋白质，或脂溶性的小分子药物，或水溶性的小分子药物，或抗体类药物，或多肽类药物的溶液，或基因遗传活性物液体。
制备结束后，可以计算纳米粒子中生物活性物质的浓度，具体方法是用去离子水悬浮粒子，检测游离的生物活性物质的浓度，计算纳米粒子中生物活性物质的浓度，用Backman Counter N5 Plus检测粒子的尺寸和分布。含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子扫描电镜照片参见图3，含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的大小分布参见图4。
由于在本实施例中采用的盐溶液是氯化钙，采用的中药的活性物质溶液是中药黄酮和皂苷溶液，采用的生物活性物质溶液是10％的人体生长激素溶液，其制备的是一种含有中药黄酮和皂苷的人体生长激素包封的无机盐纳米粒子.获得一种含有中药黄酮和皂苷成分的人体生长激素(hGH)包封的无机盐纳米粒子。
应用中分别进行了含有人体生长激素和包封中药成分的无机盐纳米粒子携带人体生长激素体外释放的实验以及通过含有人体生长激素和包封中药成分的无机盐纳米粒子携带人体生长激素体经鼻腔实施黏膜给药后，人体生长激素在血浆中的含量。其中，人体生长激素体外释放的实验数据参见图5；给药后在血浆中的含量的实验选择老鼠，给药后在血浆中的含量参见图6。
实施例2本实施例按照实施例1的方法和步骤制备含有中药黄芪粗提物的HSV-2无机盐纳米粒子疫苗，它与实施例1的区别仅在于选择的中药复合体的活性物质为中药黄芪粗提物，选择的生物活性物质为HSV-2蛋白质。
宿主对很多性疾病病毒的抵抗力主要依赖与局部的免疫功能，尤其是女性阴道的免疫系统，对性疾病病原体的入侵起到主要的抵抗功能。因此，在性疾病的免疫和治疗中，阴道免疫途径和阴道给药途径成为研究重点。我们将无机盐纳米粒子与中药黄芪的粗提物的复合体按照实施例1的方法合成后作为HSV-2疫苗的传递系统，实现药物和疫苗从阴道直接给药。实验中，首先进行了人体简单病毒II型抗原(HSV-2)在体外从纳米粒子释放试验，实验结果参见图7，然后，我们选择了老鼠，分成5组，采用下列成分的药物1、空白；2、中药黄芪粗提物；3、HSV-2制备成疫苗；4、中药黄芪中的粗提物和HSV-2蛋白质制备成疫苗；5、本发明制备的含有中药黄芪粗提物的无机盐纳米粒子为传递系统的HSV-2疫苗。分组分别从阴道直接给药，进行抗HSV-2特异型抗体水平实验(参见表3)和宿主免疫保护试验(参见表4)。通过实验可以看出本发明能够提高药物的局部浓度，从而增加药效；同时，提高生殖系统局部免疫力，从而清除入侵的病毒；避免了肝脏对药物的代谢作用。通过阴道给药也可达到有效地全身治疗效果。
表3抗体浓度(ug/ml)
表4临床症状
实施例3、含有中药黄芪多糖的无机盐纳米粒子作为阴道衣原体蛋白质抗原肌肉注射免疫的比较实验本实施例按照实施例1的方法和步骤制备含有中药黄芪多糖活性物质的阴道衣原体无机盐纳米粒子疫苗，它与实施例1的区别仅在于选择的中药的单体活性物质为中药黄芪多糖活性物质，选择的生物活性物质为阴道衣原体蛋白质(MOMP)。
我们临床采用选择25名阴道衣原体患者，分成5组，采用下列药物成分的药物1、空白；2、中药黄芪多糖；3、阴道衣原体蛋白质(MOMP)制备成疫苗；4、中药黄芪多糖和阴道衣原体蛋白质(MOMP)蛋白质制备成疫苗；5、本发明制备的含有中药黄芪多糖的无机盐纳米粒子为传递系统的阴道衣原体蛋白质(MOMP)疫苗，分别从肌肉注射给药。阴道衣原体蛋白质特异型干扰素浓度水平实验(参见表5)和阴道衣原体蛋白质特异型抗体浓度水平实验(参见表6)。通过实验可以看出本发明能够提高阴道衣原体蛋白质的抗原性，从而增加阴道衣原体患者全身免疫力；同时，提高生殖系统局部免疫力，从而清除入侵的细菌(参见表7)。通过肌肉注射给药含有中药黄芪多糖的无机盐纳米粒子阴道衣原体蛋白质(MOMP)疫苗也可达到有效地局部治疗效果。
表5gamma干扰素浓度(pg/ml)
表6抗体浓度(ug/ml)
表7衣原体浓度(IFU/ml)
本案提供的上述实施例并非对本发明进行一种唯一的限制，在实际应用中，尤其是作为载体传递生物活性物质治疗疾病，或作为疫苗佐剂时，生物活性物质应该包括蛋白质，或脂溶性或水溶性小分子药物，或多肽类药物，所述的疫苗是指蛋白质或多肽类物质，或抗体，或基因遗传活性物。它们的传递方式应该包括黏膜给药或通过系统给药。所述的黏膜给药是指鼻黏膜给药，或阴道给药，或口腔给药；所述的系统给药是指腹腔注射，或静脉注射，或肌肉注射。
权利要求
1.一种含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法，其特征在于a)制备包含生物活性物质的无机盐纳米粒子将0.01～1.0摩尔的盐溶液、生物活性物质溶液、0.01～1.0摩尔的磷酸溶液按1∶1∶1混合后，在4℃下搅拌48小时，超声处理15分钟，在4℃下，8500rpm离心15分钟，去除含有游离生物活性物质溶液的上清液，用去离子水悬浮粒子，在5mg/ml的浓度形成含有生物活性物质的无机盐纳米粒子，其大小尺寸为100nm～800nm；b)包封中药的活性物质和生物活性物质室温下，将含有生物活性物质的无机盐粒子、中药的活性物质和生物活性物质按1∶10∶10混合后，按10mg/ml的浓度悬浮在PH值7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液中，4℃下在摇床上摇动2小时，4℃，8500rpm离心三次，每次15分钟，获得含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法，其特征在于获得的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子贮存于4℃或冷冻干燥后备用。
3.根据权利要求1所述的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的盐溶液是用去离子水制备的0.01～1.0摩尔的氯化锰，或氯化镁，或氯化钙溶液；所述的中药的活性物质是中药的单体多糖或复合体的活性物质；所述的生物活性物质溶液是含有蛋白质，或脂溶性的小分子药物，或水溶性的小分子药物，或抗体类药物，或多肽类药物的溶液，或基因遗传活性物液体。
4.根据权利要求3所述的含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的中药的单体多糖活性物质是虫草多糖，或茯苓多糖，或黄芪多糖，或甘草酸，或枸杞多糖；所述的中药的复合体活性物质是虫草，或茯苓，或黄芪，或甘草，或枸杞的粗提物。
5.权利要求1或2所述含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的应用，其特征在于作为载体传递生物活性物质治疗疾病，或作为疫苗佐剂。
6.根据权利要求5所述含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的应用，其特征在于所述的生物活性物质是指蛋白质，或脂溶性的小分子药物，或水溶性的小分子药物，或多肽类药物，所述的疫苗是指蛋白质，或多肽类物质，或抗体，或基因遗传活性物。
7.根据权利要求5所述含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的应用，其特征在于传递生物活性物质的方式包括黏膜传递或通过系统给药。
8.根据权利要求7所述含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的应用，其特征在于所述的黏膜给药是指鼻黏膜给药，或阴道给药，或口腔给药；所述的系统给药是指腹腔注射，或静脉注射，或肌肉注射。
全文摘要
本发明是一种含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子的制备方法及其应用。先制备包含生物活性物质的无机盐纳米粒子；再包封中药的活性物质和生物活性物质，获得含有生物活性物质和包封中药成分的无机盐纳米粒子。在治疗疾病中用它作为载体传递生物活性物质，或作为疫苗佐剂。优点在于由于无机盐纳米粒子易于粘连，分散率差，理化特性需要改进，采用中药的活性物质包裹后可以提高它们的分散率和生物活性物质的包封率；中药中的有效成分还可以使纳米粒子从纯粹的携带体变为具有一定生物功能的纳米携带体；同时，形成的纳米粒子可以在体内生物降解。本发明的制备的工艺简单，产品的稳定性高，不同批次的批间的差异极小，易于产业化。
文档编号A61K36/00GK1736366SQ20051004116
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月25日 优先权日2005年7月25日
发明者江桥, 河清 申请人:江桥, 河清