一种含有西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素的新的药物组合物的制作方法

专利名称：一种含有西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素的新的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种含有西洋参提取物、水蛭提取物、红花黄色素的新的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
我国是心血管疾病的高发区，每年全国死于心脑血管疾病者约300万人，平均每天7000人，即每12秒钟就有一个生命被夺去。1000万人因心脑血管疾病致残。我国现有心脑血管患者约7300万人(此数字未含潜在患者)。此外，心血管疾病发病率和死亡率还有逐年上升的趋势。心脑血管疾病急性发作致死率极高，存活者经常会留下不同程度的后遗症，如偏瘫、失语、口眼歪斜等，或者频发心绞痛、心率失常，使生活质量降低，给病人及家属带来沉重的身心和经济负担。心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超载、自由基损伤等多种变化。采用复方制剂多靶点逆转或改善这些变化，提高综合疗效是药物治疗的重要目标。
红花为菊科植物红花(Cacthamus tinctonus.L)的干燥花，研究证明红花的主要有效成分存在于其水溶性部分，红花黄色素是含有多种查耳酮类的水溶性混合物，药理实验证明其是红花的主要有效活性成分，具有扩张冠状动脉、改善心肌血供，降低血压、扩张血管、改善器官供血，抗凝血，抑制血栓形成，耐缺氧、抗炎等多种药理作用。红花黄色素中羟基红花黄色素A含量较高，具有药理效应代表性。红花黄色素和注射用红花黄色素均有上市，批准文号国药准字Z20050145、Z20050146，制剂规格每瓶装50mg(含羟基红花黄色素A 35mg)，生产厂家浙江永宁制药厂。注射用红花黄色素临床主要用于治疗心绞痛、心肌梗塞及其它类型的冠心病、高血脂症等心脑血管疾病。与红花黄色素相关的专利有CN1085674、CN1368503，涉及红花黄色素的制备方法、制剂及用途等。
本品为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whit-mania acranulata Whitman的干燥体。具有破血，逐瘀，通经的功效。药理研究表明，水蛭提取物能阻止凝血酶对纤维蛋白的作用，阻碍血液凝固，具有强抗凝血酶作用；水蛭提取物对ADP诱导的大鼠血小板聚集性有显著的抑制作用，也能明显抑制正常人血小板的聚集，有抗血栓形成作用；水蛭在人体外对纤维蛋白发生较强的纤溶作用，在家兔体内也具有纤溶活性，能使蛋白溶解时间显著缩短，故水蛭可活化纤维系统，溶解血栓；水蛭水提取液能降低大鼠的全血比粘度和血浆比粘度。缩短红细胞电泳时间；水蛭可增加心肌营养性血流量，对人体组织缺血缺氧有保护作用；水蛭能抗垂体后叶素引起的家兔冠状动脉痉挛、对心肌缺血有抑制和治疗作用；水蛭可增加家兔的脑动脉血流量，并促进血肿吸收，缓解颅内高压，改善局部血液循环，保护脑组织免遭破坏，有利于神经功能恢复；另外水蛭还有降血压和改善微循环的作用。目前水蛭注射液已有医院制剂在临床中应用。

发明内容
为了满足临床需要，解决上述问题，本发明提供了主要由西洋参、水蛭和红花黄色素组成的新的药物组合物及其制备方法和用途。西洋参、水蛭和红花黄色素三药合用，协同发挥扩张血管、改善心肌血供、抗凝血、抗血栓、抗缺氧、降血脂等药理作用，可用于冠心病、心绞痛、脑梗阻、脑血栓等疾病。
本发明提供的的药物组合物，其特征在于所述的西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素按照如下重量配比组成西洋参提取物10～200份 水蛭提取物5～100份 红花黄色素10～200份优选为西洋参提取物25～100份 水蛭提取物10～50份 红花黄色素25～100份最优为西洋参提取物50份 水蛭提取物25份 红花黄色素50份以上组成，若以克为单位，可以制成100～1000次用量的制剂，如作为注射剂，可制成1000支，每次用量1～10支。如作为片剂，可制成1000片，每次服用1～10片。
以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减小，如大规模生产可以以千克为原料，或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间重量配比的比例不变。
以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％本发明提供的任一药物组合物，其特征在于该组合物可制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。该组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体，以口服或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油悬浮剂等，如水针、冻干粉针、无菌粉针、输液等。优选的形式是注射剂。
本发明的药物可采用现有制药领域中的常规方法生产，需要的时候可以添加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明的药效学试验表明西洋参、水蛭、红花黄色素三药合用，可协同发挥改善血瘀模型大鼠的血液流变学指标、抗血小板聚集、抗动脉血栓形成、保护脑缺血再灌注损伤、抗心肌缺血的作用，其疗效均优于红花黄色素注射液单用组，表明三药联合应用，有协同作用。
本发明的优点在于红花黄色素中有效成分明确，以西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素三者直接投料用药，制备工艺简便，杂质含量少。三药配伍，通补兼用，经药理学试验证明，配伍后疗效显著提高，因此有着广泛的应用前景。
本发明提供的药物组合物中，西洋参提取物的优选制备工艺如下取西洋参，加12倍量常水，常温浸泡8小时，滤出浸泡液，继加8倍量常水，煎煮1小时，共二次，合并浸提液，减压浓缩至密度为1.19～1.25(60)，喷雾干燥，得水浸膏粉。依次加8、5、5、3倍量正丁醇，沸水浴搅拌提取1h，共4次，合并提取液，减压回收正丁醇，真空干燥即得。
通过上述工艺制备的西洋参提取物，总皂苷含量不低于50％，人参皂苷Rg1(C42H72O14)、Rb1(C54H92O18)、Re(C48H82O18)的总含量不低于5.2％。
本发明提供的组合物中，西洋参提取物还可以通过下列工艺制备，但不应将此理解为上述药物组合物中西洋参提取物仅限于下列制备工艺。
工艺一取西洋参，加水煎煮三次，每次2小时，加水量为12倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.26(60)，滤过，滤液减压浓缩、真空干燥，得水提浸膏粉。依次加8、5、5、3倍量正丁醇，沸水浴搅拌提取1h，共4次，合并提取液，减压回收正丁醇，真空干燥即得。通过本工艺制备的西洋参样品，总皂苷含量为28％，人参皂苷Rg1(C42H72O14)、Rb1(C54H92O18)、Re(C48H82O18)总含量0.65％。
工艺二取西洋参，加水煎煮三次，每次2小时，加水量为12倍量，合并煎液，滤过，滤液上大孔树脂，采用D101型大孔树脂，树脂与生药比例为1∶0.68，用两倍量80％乙醇洗脱。收集洗脱液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.21～1.27(60℃)，真空干燥(60℃)，即得。通过本工艺制备的西洋参样品，总皂苷含量为47％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re总含量0.97％。
工艺三取西洋参，加水煎煮2次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含乙醇量为75％，第二次为85％，每次均冷藏放置，滤过，滤液减压浓缩、真空干燥，即得。通过本工艺制备的西洋参样品，总皂苷含量为35％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re总含量0.67％。
工艺四取西洋参粉碎，干法装柱，用80％乙醇溶液渗漉，收集8倍量的渗漉液，渗漉液回收乙醇浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，喷雾干燥，即得。通过本工艺制备的西洋参样品，总皂苷含量为40.2％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re总含量0.71％。
工艺五取西洋参，用70％乙醇提取两次，每次1.5小时，加醇量分别为10、8倍量，合并提取液，滤过，滤液上回收乙醇，浓缩至相对密度为1.21～1.27(60℃)，喷雾干燥(60℃)，即得。通过本工艺制备的西洋参样品，总皂苷含量为40.2％，人参皂苷Rg1、Rb1、Re总含量0.71％。
本发明提供的药物组合物中，水蛭提取物的优选制备工艺如下
取水蛭，切碎，用水浸泡4小时，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二、三次各加水8倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，加入乙醇使含醇量达70％，充分搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，清膏减压浓缩至相对密度为1.25～1.28(70℃)，80℃真空干燥，干浸膏粉碎即得。
通过上述工艺制备的水蛭提取物，总氨基酸含量不低于50％，抗凝血酶活性不低于8U。
本发明提供的组合物中，水蛭提取物还可以通过下列工艺制备，但不应将此理解为上述药物组合物中水蛭提取物仅限于下列制备工艺。
工艺一取水蛭，切碎，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二、三次各加水8倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，加入乙醇使含醇量达70％，充分搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，清膏减压浓缩至相对密度为1.25～1.28(70℃)，80℃真空干燥，干浸膏粉碎即得。通过本工艺制备的水蛭样品，总氨基酸含量为28％，抗凝血酶活性为3U。
工艺二取水蛭，切碎，用水浸泡2小时，加水煎煮两次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水8倍量，煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，加入乙醇使含醇量达70％，充分搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，清膏减压浓缩至相对密度为1.25～1.28(70℃)，80℃真空干燥，干浸膏粉碎即得。通过本工艺制备的水蛭样品，总氨基酸含量为33％，抗凝血酶活性为4U。
工艺三取水蛭，切碎，用水浸泡4小时，加水煎煮一次，加水26倍量，煎煮3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，加入乙醇使含醇量达70％，充分搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，清膏减压浓缩至相对密度为1.25～1.28(70℃)，80℃真空干燥，干浸膏粉碎即得。通过本工艺制备的水蛭样品，总氨基酸含量为36％，抗凝血酶活性为3U。
工艺四取水蛭，切碎，用水浸泡4小时，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二、三次各加水8倍量，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，加入乙醇使含醇量达85％，充分搅拌，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，清膏减压浓缩至相对密度为1.25～1.28(70℃)，80℃真空干燥，干浸膏粉碎即得。通过本工艺制备的水蛭样品，总氨基酸含量为45％，抗凝血酶活性为5U。
本发明提供的药物组合物中，红花黄色素以羟基红花黄色素A计，其含量为不低于70％。
本发明提供的药物组合物中的红花黄色素，可以购买上市的原料或通过以下制备工艺获得，但不应将此理解为上述药物组合物中红花黄色素仅限于下列制备工艺。
工艺一将红花用水冷浸24小时或煎煮回流提取50-90分钟，然后过滤，把滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25；将浓缩液中加入乙醇至含醇量80％，并不断搅拌，在4℃沉淀24小时，过滤除去沉淀，取上清液，挥净乙醇并浓缩至相对密度为1.15-1.20；向浓缩液中加入5-10倍的水，在4℃沉淀12-24小时，离心除去沉淀；将上述离心液经大孔吸附树脂柱层析，先用去离子水洗脱至Molish反应和茚三酮反应呈阴性，然后继续用去离子水洗脱4-6个柱体积并收集洗脱液；将上述洗脱液经聚酰胺吸附，极性溶剂洗脱，收集洗脱液，在60℃减压浓缩除去洗脱溶剂，把剩余水溶液冷冻干燥或喷雾干燥，得到桔黄色无定形粉末，即红花黄色素。通过本工艺制备的红花黄色素含羟基红花黄色素A为80.1％工艺二取红花生药药粉，每次加5倍量水室温浸48小时，其间不时搅拌，共提取两次，合并两次水提液，过滤除去药渣，50-90度减压浓缩至相对密度1.10-1.25得红花水提浓缩液。取上述红花水提浓缩液，上柱床体积为15倍浓缩液体积的聚酰胺柱，以蒸馏水洗脱Molish反应和茚三酮反应呈阴性，以95重量百分比乙醇洗脱聚酰胺柱上吸附的红花黄色素至洗脱液无色即可。上述洗脱液回收乙醇，50-90度减压浓缩，干燥即得红花黄色素。通过本工艺制备的红花红花黄色素含羟基红花黄色素A为59％工艺三取干燥红花药材粗粉，于70℃温度用PH为3的10倍的酸水温浸提取2至4次，每次均为1000ml，每次1.5小时。合并提取液，滤过，收集滤液，放冷，调PH值至中性，减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加乙醇至醇浓度为70％，冷藏(10℃以下)放置24小时，滤过得沉淀。将沉淀用水溶解，加于已处理好的大孔吸附树脂HPD100柱色谱(药材与树脂比例为1∶10(W/V))，先用去离子水以1-2.5ml/cm2/min的流速洗脱两个柱床体积，然后用60％的乙醇以1-2.5ml/cm2/min的流速洗脱五个柱床体积。60％醇洗脱部分，减压浓缩至密度为1.10左右，然后在70℃左右减压真空干燥或减压旋转蒸发后冷冻干燥，即得红花黄色素。通过本工艺制备的红花黄色素含羟基红花黄色素为71.2％上述方法所得的红花黄色素原料均以以下方法进行鉴别和含量测定。
红花黄色素的鉴别以羟基红花黄色素A为对照品，鉴别红花黄色素。
分别精密称定羟基红花黄色素A和红花黄色素1.0mg至1ml的量瓶中，用水溶解并定容至刻度。分别吸取上述两种溶液，点于薄层硅胶GF254板，以丙酮∶甲醇∶水(10∶2.5∶1.5)为展开剂，在紫外灯下254nm处观察可看到相应荧光斑点。
经鉴别，市售样品及根据三种工艺所制得的样品均为红花黄色素。
红花黄色素的含量测定系统适应性试验采用Diamonsil C18-ODS(150×46mm)柱，以甲醇-乙腈-2％醋酸水溶液(26∶2∶72)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。
供试品溶液的制备精密称取所得红花黄色素1.5mg，至50ml量瓶中，水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
下列试验例进一步说明本发明。
试验例1 西洋参提取物的制备工艺筛选试验1.水提工艺筛选试验加水量、提取时间和提取次数对提取结果的影响较大，因此以总皂苷含量和浸膏得率为指标，用正交试验法考察三种因素对提取结果的影响。因素及水平设计见表1。
表1 西洋参水提工艺考察因素水平表

试验方法 称取西洋参100g，共18份，按表2各列号的要求提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩并定容至500ml，备用。
总皂苷的含量测定 对照品溶液 精密称取西洋参总皂甙对照品4mg，置2ml量瓶中、加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每1ml含西洋参总皂苷2mg)。
供试品溶液 精密吸取溶液25ml，加甲醇提取4次(50、40、40、40ml)，每次提取30min。合并提取液，减压回收至干。加蒸馏水溶解并转移至50ml量瓶中，用蒸馏水分数次洗涤容器，洗液与水溶液合并，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取水溶液20m]置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取4次(20、15、15、15ml)，萃取液用正丁醇饱和的水20ml洗涤后，置水浴上减压回收至干。残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用甲醇多次洗涤容器，洗液并人量瓶，加甲醇至刻度摇匀，即得。
标准曲线 精密量取对照品溶液20、40、60、80、100ul，分别置10ml具塞试管中置水浴中挥干溶剂，立即取出精密加5％香草醛一冰醋酸液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15min。取出。立即以流动水冷却2min，精密加冰醋酸5ml。摇匀。以相应的试剂为空白，于550nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，西洋参总皂甙的ug数为横座标绘制标准曲线，计算回归方程。
测定法 分别精密吸取供试品溶液20ul，置10ml具塞试管中。在水浴中挥干溶剂。其余步骤同标准曲线的制备。在550nm波长处测得吸收度，由回归方程计算出总皂苷的量。结果见表2。
表2 西洋参提取工艺考察正交试验表

表3 西洋参提取工艺方差分析表

F0.05(2，6)＝5.14 F0.05(2，6)＝10.92由表2、表3结果可以看出，对西洋参提取效果影响因素由大到小依次为A＞C＞D＞B，结合工业生产的实际情况，确定水蛭提取工艺为A2B2C2D2.，即西洋参，加12倍量常水，常温浸泡8小时，滤出浸泡液，继加8倍量常水，煎煮1小时，共二次。
试验例2 西洋参提取物鉴别试验取本品粉末0.5g，加甲醇25ml，加热回流1小时，方冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水层用饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取西洋参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取拟人身皂苷F11对照品，人参皂苷Rb1对照品，人身皂苷Re对照品，人身皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述六种溶液各5ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及子紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。
试验例3 西洋参提取物含量测定试验总皂苷的含量测定对照品溶液 精密称取西洋参总皂甙对照品4mg，置2ml量瓶中、加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每1ml含西洋参总皂苷2mg)。
供试品溶液 精密吸取溶液25ml，加甲醇提取4次(50、40、40、40ml)，每次提取30min。合并提取液，减压回收至干。加蒸馏水溶解并转移至50ml量瓶中，用蒸馏水分数次洗涤容器，洗液与水溶液合并，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取水溶液20m]置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取4次(20、15、15、15ml)，萃取液用正丁醇饱和的水20ml洗涤后，置水浴上减压回收至干。残渣加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用甲醇多次洗涤容器，洗液并人量瓶，加甲醇至刻度摇匀，即得。照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)标准曲线 精密量取对照品溶液20、40、60、80、100ul，分别置10ml具塞试管中置水浴中挥干溶剂，立即取出精密加5％香草醛一冰醋酸液0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15min。取出。立即以流动水冷却2min，精密加冰醋酸5ml。摇匀。以相应的试剂为空白，于550nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，西洋参总皂甙的ug数为横座标绘制标准曲线，计算回归方程。
测定法 分别精密吸取供试品溶液20ul，置10ml具塞试管中。在水浴中挥干溶剂。其余步骤同标准曲线的制备。在550nm波长处测得吸收度，由回归方程计算出总皂苷的量。
人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VID)色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙睛为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温40℃。理论板数按人参Rb1峰计算不低于4000。
表4 梯度洗脱流动相配比表

对照品溶液得制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参Rb1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1对照品0.1mg、人参皂苷Re对照品0.4mg、人参皂苷Rb11mg，供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，称定重量，置水浴中加热回流提取1.5小时，放冷，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
三批西洋参提取物中总皂苷、人参皂苷Rg1、Rb1、Re的总含量测定结果见表6。
表5 西洋参提取物的总含量测定结果和得率

试验例4 水蛭提取工艺筛选试验1.水提工艺筛选试验浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数对提取结果的影响较大，因此以总氨基酸含量和浸膏得率为指标，用正交试验法考察四种因素对提取结果的影响。因素及水平设计见表6。
表6 水蛭水提工艺考察因素水平表

试验方法 称取水蛭100g，共18份，按表2各列号的要求提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩并定容至500ml，备用。
总氨基酸的含量测定供试品溶液的制备 精密称取样品液按氨基酸水解法制备。
测定法 使用氨基酸自动分析仪测定，结果见表7。
表7 水蛭提取工艺考察正交试验表

表8 水蛭提取工艺方差分析表

F0.05(2，6)＝5.14 F0.05(2，6)＝10.92由表7、表8结果可以看出，对水蛭提取效果影响因素由大到小依次为A＞C＞D＞B，结合工业生产的实际情况，确定水蛭提取工艺为A2B1C3D3.，即取水蛭，切碎，用水浸泡4小时，加水煎煮三次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二、三次各加水8倍量，每次1.5小时。
2.醇沉工艺的考察醇沉浓度的考察试验方法 称取水蛭200g，共3份，分别取水蛭，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(70℃)，分别缓缓加入乙醇使其含醇量为60％、70％、80％，充分搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，并定容至1000ml。精密量取25ml，照1项下含量测定与浸膏得率测定方法，测定总氨基酸的含量。试验结果见表9。
表9 醇沉浓度考察试验结果

由表9结果可以看出，当醇沉浓度为70％时，既能保证总氨基酸的含量，又能达到除杂的目的，因此选择醇沉浓度为70％。
试验例5 水蛭提取物鉴别试验取本品0.3g，加乙醇10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点紫外光灯(365nm)下显相同的橙红色荧光斑点。
试验例6 水蛭提取物含量测定试验总氨基酸的含量测定供试品溶液的制备 精密称取样品液按氨基酸水解法制备。
测定法 使用氨基酸自动分析仪测定。
抗凝血酶活性测定精密称取本品0.4g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100ul，置试管(10mm×100mm)中，加入含0.5％(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100ml，调节pH值至7.4)200ul，摇匀，置水浴(37℃±0.5℃)中缓缓滴加每1ml中含40单位的凝血酶溶液(每分钟5ul，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算。
U＝C1V1/C2V2W式中U——每1g含凝血酶活性单位，U/g；C1——凝血酶溶液的浓度，u/mlC2——供试品溶液的浓度，g/mlV1——消耗凝血酶溶液的体积，ul；V2——供试品溶液的加入量，ul；
W——取样量。
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。三批水蛭样品中总氨基酸、抗凝血酶活性的量见表10。
表10 水蛭提取物的含量测定结果和得率

为便于理解本发明组合物在治疗和预防心脑血管疾病的药用价值，下面提供本发明组合物的部分药理实验结果。
实验例7 本发明组合物对大鼠血液流变学的影响试验供试品氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；红花黄色素注射液，自制，2ml∶50mg；组合物注射液，西洋参提取物∶水蛭提取物∶红花黄色素为50∶25∶50，自制；取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只。分别为(1)生理盐水对照组、(2)血瘀模型组、(3)红花黄色素注射液组、(4)组合物注射液低剂量组、(5)组合物注射液中剂量组、(6)组合物注射液高剂量组。每日1次，连续腹腔注射给药7d，末次给药后30min，除对照组用0.9％NS外，其余各组均皮下注射0.1％肾上腺素(0.9mg/kg)，30min后将大鼠放入冰水中冷浴8min，间隔2h后再注射等量肾上腺素，制备血淤模型。腹主动脉取血5ml，肝素抗凝，测定10S-1、40S-1、200S-1全血粘度、血浆比粘度、红细胞压积。实验室温度控制在(20±1)℃。结果见表11。
表11 对急性血淤模型大鼠血液流变学的影响

注#与生理盐水组比较P＜0.01；*与模型组比较P＜0.05结论与生理盐水组比较，血瘀模型组低、中、高切率的全血粘度、血浆比粘度、纤维蛋白原、红细胞压积均明显升高，说明模型可靠。与模型组比较，红花黄色素注射液组、组合物注射液组均能明显改善血液流变学指标，组合物注射液组疗效优于红花黄色素注射液组，且组合物中、高剂量组疗效显著。
实验例8 本发明组合物的抗血小板聚集作用供试品氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；红花黄色素注射液，自制，2ml∶50mg；组合物注射液，西洋参提取物∶水蛭提取物∶红花黄色素为50∶25∶50，自制；Wister大鼠，雄性，体重225.6±20.7g，50只，每组10只，随机分为5组，分别为(1)生理盐水对照组、(2)红花黄色素注射液组、(3)组合物注射液低剂量组、(4)组合物注射液中剂量组、(5)组合物注射液高剂量组。各组动物腹腔注射给药，每日一次，连续给药7天，末次给药后1小时，动物麻醉后自腹主动脉取血，抗凝剂采用3.28％枸橼酸钠，与血液以1∶9比例混合。将抗凝全血在20℃条件下1500r.min-1离心5min获得富血小板血浆(PPR)。留取定量PPR后，将剩余PPR再次以3000r.min-1离心10min，获得自身对照贫富血小板血浆(PPP)。以PPP调节PPR浓度，使各PPR浓度相同。将PPR在37℃的恒温孔中预热后，加入ADP(终浓度为3μmol.L-1)引起血小板聚集，记录最大聚集率。结果见表12。
表12 抗血小板聚集作用

注与生理盐水组比较*P＜0.05，**P＜0.01结论与生理盐水组比较，组合物注射液和红花黄色素注射液均能使试验大鼠的血小板最大聚集率降低，表明组合物注射液和红花黄色素注射液均有抗血小板聚集作用，其中组合物注射液疗效优于红花黄色素注射液，且组合物注射液中、高剂量组疗效显著。
实验例9 本发明组合物对大鼠实验性动脉血栓形成的影响试验供试品氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；红花黄色素注射液，自制，2ml∶50mg；组合物注射液，西洋参提取物∶水蛭提取物∶红花黄色素为50∶25∶50，自制；取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只，分别为(1)生理盐水对照组、(2)红花黄色素注射液组、(3)组合物注射液低剂量组、(4)组合物注射液中剂量组、(5)组合物注射液高剂量组。空白对照组给予等容积生理盐水，给药20分钟后开始试验。动物用2.5％戊巴比妥钠(25mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定，分离右侧颈总动脉，采用电流损伤颈动脉内膜法，用BT87-3实验性体内血栓形成仪测定不同组别动物颈动脉血栓形成时间。将电极置放在颈动脉上对其进行电刺激(2mA，7min)，以感应电极连续测量动脉远端表面温度，观察动脉温度突降时间。记录电刺激开始至主动脉温度突降的时间，该时间定为颈动脉血栓形成时间(超过3000秒者以3000秒计)。实验结果见表13。
表13 对大鼠颈动脉内血栓形成的影响

注与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01结论与空白对照组比较，组合物注射液和红花黄色素注射液均能使实验大鼠的血栓形成时间延长，表明组合物注射液和红花黄色素注射液均有抗血栓作用，其中组合物注射液疗效优于红花黄色素注射液，且组合物注射液中、高剂量组疗效显著。
实验例10 本发明组合物对兔脑缺血再灌注损伤的保护作用试验供试品氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；红花黄色素注射液，自制，2ml∶50mg；组合物注射液，西洋参提取物∶水蛭提取物∶红花黄色素为50∶25∶50，自制；受试动物 家兔，60只，体重2.2～2.5kg，随机分为10组，每组6只。
试验方法 将兔随机分为缺血再灌注组(I/R组)、组合物注射液治疗组、红花黄色素注射液治疗组和假手术对照组(SOC组)。(1)缺血再灌注组(I/R组)18只，用25％的氨基甲酸乙脂溶液1g/kg体重耳缘静脉麻醉，颈部正中切口分离气管插入气管套管，暴露两侧颈总动脉，以动脉夹两侧夹闭20min，造成脑缺血，松夹分别再灌注1h、6h和12h，三个时间点各6只。分别在松夹10min后，耳缘静脉推注生理盐水5ml/kg体重。(2)组合物注射液治疗组18只，手术方法同I/R组，三个时间点各6只，分别在松夹10min后，耳缘静脉推注组合物注射液10mg/kg。(3)红花黄色素注射液治疗组18只，手术方法同I/R组，三个时间点各6只，分别在松夹10min后，耳缘静脉推注红花黄色素注射液供试液10mg/kg。(4)假手术对照组(SOC组)；6只，动物仅行麻醉和动脉分离术而不夹闭，1h后处死。上述各组实验结束后即断头，在冰浴中剥出大脑，冰盘上解剖出双侧海马区组织，用锡纸包裹放在4℃冰箱中储存，备用。应用pH酸度计检测海马组织PLA2的活性；采用干湿重法、TTC染色法测定皮层脑组织含水量、梗死面积；光镜下观察脑组织病理变化。
试验结果(1)对海马组织PLA2活性的影响I/R组再灌注1h、6h和12h后，海马组织PLA2活性较SOC明显增高(p＜0.01)，且随灌注时间延长，PLA2活性呈递减趋势，但各时间点间比较差异不显著(p＞0.05)组合物注射液治疗组(1h、6h、12h)PLA2活性明显降低，与SOC组和I/R各相应时间点比较具有显著性差异(p＜0.01，p＜0.001)，且随再灌时间延长，PLA2活性逐渐向正常水平恢复；红花黄色素注射液治疗组(1h、6h、12h)PLA2活性降低，与SOC组和I/R各相应时间点比较具有明显差异(p＜0.05，p＜0.01)。(2)对皮层组织含水量(％)和梗死面积(％)的影响I/R组各时间点脑含水量均增高；组合物注射液治疗组各时间点脑水含量与I/R组相比明显减轻(p＜0.001)，脑梗死面积与I/R组相比明显缩小(p＜0.01)；红花黄色素注射液治疗组各时间点脑水含量与I/R组相比均减轻(p＜0.01)，脑梗死面积与I/R组相比均缩小(p＜0.05，p＜0.01)。(3)脑组织病理改变SOC组无梗死灶，神经元结构形态正常，无间质水肿；I/R组有梗死灶，梗死灶周神经元肿胀，细胞轮廓不清，间质水肿明显；组合物注射液治疗组、红花黄色素注射液治疗组梗死灶面积均缩小，梗死灶周神经元肿胀不明显，间质水肿明显减轻；组合物注射液治疗组作用更明显。
结论上述试验结果表明，组合物注射液、红花黄色素注射液均可通过降低PLA2活性，改善脑循环，减轻脑缺血再灌注损伤，而发挥脑保护作用。组合物注射液治疗组在各项指标中均高于红花黄色素注射液单独用药的效果，提时西洋参、水蛭、红花黄色素三药具有协同增效作用。
实验例11 本发明组合物对结扎大鼠冠状动脉所致心肌缺血的影响试验供试品氯化钠注射液，山东华信制药有限公司；红花黄色素注射液，自制，2ml∶50mg；组合物注射液，西洋参提取物∶水蛭提取物∶红花黄色素为50∶25∶50，自制；取Wistar大鼠50只，雌雄兼用，按体重随机分为5组，每组10只。(1)生理盐水对照组、(2)红花黄色素注射液组、(3)组合物注射液低剂量组、(4)组合物注射液中剂量组、(5)组合物注射液高剂量组。尾静脉注射给药。大鼠用乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉，背位固定，记录心电，接人工呼吸机进行人工呼吸，打开胸腔，剪开心包，各组动物按各自药物静脉注射给药15mg/kg，3min后结扎左侧冠状动脉前降枝，全程记录心电30min，结扎后1h取血，检测磷酸肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)。取出大鼠心脏，沿结扎线将心室肌均匀横切4片，0.5％氯化硝基四氮唑兰染色，用求积仪测每片心肌两面的缺血面积，计算心肌缺血面积占心室面积的百分比。实验结果见表14。
表14 对结扎大鼠冠状动脉所致心肌缺血的影响(n＝10)

注与空白对照组相比，*P＜0.05，与红花黄色素注射液相比**P＜0.01结论结果表明，结扎后对照组大鼠心电的QRS波均突然异常增高、加宽，心肌大范围缺血，生化检测表现为CK和LDH均异常增高。组合物注射液组和红花黄色素注射液组均能减少因结扎冠状动脉所致的心电和生化指标的异常改变，减小心肌缺血范围。组合物注射液组，效果显著，优于红花注射液单独给药组的效果，提示西洋参、水蛭、红花黄色素合并用药有协同增效作用。且组合物注射液中、高剂量组疗效最好。
具体实施例方式
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。
本实施例中所用的供试品红花黄色素，市购，羟基红花黄色素含量为72％；水蛭提取物，自制，总氨基酸含量为52％，抗凝血酶活性为9U；西洋参提取物，自制，总皂苷含量54％，人参皂苷Rg1(C42H72O14)、Rb1(C54H92O18)、Re(C48H82O18)的总含量为5.5％。
实施例1水针的制备处方西洋参提取物25.0g水蛭提取物 12.5g红花黄色素 25.0g聚山梨酯80 10g注射用水加至1000ml共制备 500支制备工艺1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将水蛭提取物和红花黄色素加入配液量20％的注射用水中加热搅拌溶解完全。西洋参提取物加入聚山梨酯80制成的水溶液中加热搅拌溶解完全。
3)合并上述两溶液，补加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的PH值。
6)经0.45um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)将溶液熔封于玻璃安瓿中。
9)100℃流通蒸汽灭菌30分钟。
10)趁热将样品放入0.01％的亚甲蓝溶液中检漏。
11)灯检，成品全检，包装入库。
实施例2粉针的制备处方2西洋参提取物 25.0g水蛭提取物12.5g红花黄色素25.0g聚山梨酯8010g甘露醇300g无菌注射用水 加至1500ml共制备500支制备工艺首先将配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，胶塞等进行无菌处理。
1)按照处方量称取原辅料。
2)将红花黄色素和水蛭提取物加入配液量30％无菌注射用水中加热溶解完全。甘露醇加配液量30％的无菌注射用水加热搅拌溶解完全，聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入西洋参提取物加热溶解，合并上述溶液，补加无菌注射用水至全量。
3)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
4)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的PH值。
5)经0.22um的微孔滤膜精滤。
6)检查溶液的澄明度，半成品化验。
7)分装于抗生素玻璃瓶中，半压塞。将样品放入冻干机中冷冻干燥。预冻-45℃5小时，低温真空干燥-45℃～0℃20小时，然后升温至25℃真空干燥3小时。
8)冻干结束，压塞，轧盖。
9)成品全检，包装入库。
实施例3氯化钠输液的制备处方西洋参提取物 100.0g水蛭提取物50.0g红花黄色素100.00g聚山梨酯8010g氯化钠900g注射用水 加至100000ml共制备1000瓶制备工艺1)前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将红花黄色素、水蛭提取物加入配液量20％注射用水加热搅拌溶解完全，将氯化钠用配液量20％的注射用水溶解完全。聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入西洋参提取物加热溶解。
3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的PH值。
6)经0.45um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)灌装于100ml的输液瓶中。
9)115℃热压灭菌30分钟。
10)灯检，成品全检，包装入库。
实施例4葡萄糖输液的制备处方西洋参提取物100.0g水蛭提取物 50.0g红花黄色素 100.00g聚山梨酯80 10g葡萄糖 5000g注射用水加至100000ml共制备 1000瓶制备工艺1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将红花黄色素、水蛭提取物加入配液量20％注射用水中加热搅拌溶解完全，将葡萄糖用配液量20％的注射用水溶解完全，加热煮沸15分钟。聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入西洋参提取物加热溶解。
3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的PH值。
6)经0.45um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)灌装于100ml的输液瓶中。
9)115℃热压灭菌30分钟。
10)灯检，成品全检，包装入库。
实施例5片的制备处方西洋参提取物50.0g水蛭提取物 25.0g红花黄色素 50.0g淀粉40.0g微晶纤维素 40.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁6.0g羧甲淀粉钠 12.0g共制备 1000片制备工艺1)将西洋参提取物、红花黄色素和水蛭提取物粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
4)将红花黄色素、水蛭提取物、西洋参提取物、淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
5)过20目筛制颗粒。
6)颗粒在60℃的条件下烘干。
7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁和羧甲淀粉钠，过18目筛整粒，混合均匀。
8)取样，半成品化验。
9)按照化验确定的片重压片。
10)成品全检，包装入库。
实施例6胶囊的制备处方西洋参提取物50.0g水蛭提取物 25.0g红花黄色素 50.0g淀粉20.0g微晶纤维素 60.0g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁6.0g共制备 1000粒制备工艺1)将西洋参提取物、红花黄色素和水蛭提取物粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
4)将红花黄色素、水蛭提取物、西洋参提取物、淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
5)过20目筛制颗粒。
6)颗粒在60℃的条件下烘干。
7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁，过18目筛整粒，混合均匀。
8)取样，半成品化验。
9)按照化验确定的装量装入胶囊。
10)成品全检，包装入库。
实施例7颗粒的制备处方西洋参提取物50.0g水蛭提取物 25.0g红花黄色素 50.0g糖粉870.0g2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备 1000包制备工艺1)将蔗糖粉碎过100目筛备用。将西洋参提取物、红花黄色素和水蛭提取物粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将西洋参提取物、红花黄色素、水蛭提取物与糖粉以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材，4)过20目筛制颗粒。
5)颗粒在60℃的条件下烘干。
6)干颗粒过18目筛整粒。
7)取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量。
8)包装，成品全检，包装入库。
实施例8滴丸的制备处方西洋参提取物50.0g水蛭提取物 25.0g红花黄色素 50.0g聚乙二醇60001000g制备工艺
将西洋参提取物、红花黄色素和水蛭提取物粉碎过100目筛后备用。将聚乙二醇6000在水浴中加热熔融，待全部熔融后加入西洋参提取物、红花黄色素和水蛭提取物，搅拌溶解，60目筛过滤，保持60℃滴入冷至10℃以下的液体石蜡中制成丸。
实施例9软胶囊的制备处方西洋参提取物 50.0g水蛭提取物25.0g红花黄色素50.0g大豆油400.0g大豆磷脂 40g蜂蜡 20g共制备1000粒制备工艺将处方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蜡加热熔融，混匀，放冷，加入红花黄色素、水蛭提取物、西洋参提取物研匀，压制成软胶囊即可。
实施例10口服液的制备处方西洋参提取物 50.0g水蛭提取物25.0g红花黄色素50.0g丙二醇2000ml苯甲酸钠 15g甜菊甙10g纯化水加至10000ml共制备1000支制备工艺1)将红花黄色素、水蛭提取物加入配液量50％的纯化水中加热搅拌溶解完全。西洋参提取物加入丙二醇加热搅拌溶解完全。
2)将苯甲酸钠和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全。
3)合并上述溶液，补加纯化水水至全量。
4)过0.8um的微孔滤膜过滤。
5)半成品化验。
6)灌装。成品全检，包装入库。
权利要求
1.一种新的药物组合物，其特征在于它主要由西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素组成。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素按照如下重量配比组成西洋参提取物10～200份 水蛭提取物5～100份 红花黄色素10～200份
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素按照如下重量配比组成西洋参提取物25～100份 水蛭提取物10～50份 红花黄色素25～100份
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素按照如下重量配比组成西洋参提取物50份 水蛭提取物25份 红花黄色素50份
5.如权利要求1～4所述的任一药物组合物，在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。
6.如权利要求1～4所述的任一药物组合物，其特征在于该组合物可制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的组合物的剂型为注射剂。
8.如权利要求1～4所述的任一药物组合物，其特征在于其中的西洋参提取物中总皂苷的含量不低于50％，人参皂苷Rg1(C42H72O14)、Rb1(C54H92O18)、Re(C48H82O18)的总含量不低于5.2％。
9.如权利要求1～4所述的任一药物组合物，其特征在于其中的水蛭提取物中总氨基酸的含量不低于50％，抗凝血酶活性不低于8U。
10.如权利要求1～4所述的任一药物组合物，其特征在于其中的红花黄色素中羟基红花黄色素A的含量不低于70％。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了一种药物组合物及其制备方法和用途，该组合物主要由西洋参提取物、水蛭提取物和红花黄色素组成，三者可以按如下配比组成西洋参提取物10～200份、水蛭提取物5～100份、红花黄色素10～200份；三者可以单独或与药用辅料组合，制成临床上或药学上可接受的剂型，如注射剂、口服常释剂型、缓释控释剂型、颗粒剂、丸剂、口服液体剂等；三药合用，可协同发挥扩张血管、改善心肌血供、抗凝血、抗血栓、抗缺氧、降血脂等药理作用，可用于冠心病、心绞痛、脑梗阻、脑血栓等疾病。
文档编号A61K35/56GK1923221SQ20051004453
公开日2007年3月7日 申请日期2005年8月31日 优先权日2005年8月31日
发明者蔡军 申请人:蔡军