专利名称:守宫多糖及制备方法和其医药应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及中药提取技术领域,具体的说,是涉及一种动物中药中的单一的、有很高药用价值的活性成分、制备该活性成分的方法和该活性成分的应用。
背景技术:
中医是我国的国粹,中药材是中医药理论的物质宝库,中药材分为植物中药材、动物中药材和矿物中药材;传统中医的理论、临床与现代研究均表明动物药材治疗恶性肿瘤是中医的一大特色,如在斑蝥中提取斑蝥素、斑蝥酸盐应用于治疗恶性肿瘤取得一定效果,并且还具有一定的抗病毒的作用。如ZL90106365.7 ZL91110970.6、CN1076111A、ZL93110157.3、CN1374310A等专利和申请。
一般来说,多数动物中药对人体都具有一定的毒性,限制了这类药物在治疗时的用药量,使得治疗效果受到较大的影响。如何在保持药用活性的同时降低其对人体的不良影响,是药学家们研究的热点。同时,明确药物的活性成分以及其作用机理是天然药开发的首要任务。在有抗癌作用的动物中药中提取有抗癌作用的活性物质则是我国乃至世界各国的药学家、研发机构的工作重心。
守宫是传统的中药材,为壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonis Gūenther或其它几种壁虎[多疣壁虎Gekko japonicus(Duméril &Bibron);无疣壁虎Gekko subpalmatus Güenther;蹼趾壁虎Gekko chinensis Gray]的全体,是中医传统的咸寒软坚药。中医长期以来使用守宫治疗瘰疬癌肿(《青囊杂篡》、《得配本草》、《四川中药志》),国内较多医家使用守宫治疗恶性肿瘤也取得了很好的疗效。体外研究发现守宫水溶液可抑制人肝癌细胞的呼吸,并已明确守宫含有与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质、脂肪油、多种氨基酸、微量元素和维生素,但上述成分均不足以解释守宫的抗肿瘤作用,国内外至今未能从守宫里分离出其抗肿瘤、抗病毒与免疫调节的活性成分。
传统中医认为守宫咸寒有小毒,研究发现守宫含有与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质,使传统的中医理论得到了验证。而守宫的毒性限制了其临床大剂量应用,故守宫的日用量一般仅1.5~4.5g,极大的限制了守宫的医疗应用和医疗效果。
公知的应用守宫方式,除了作为中医药的原料药使用外,云南曾将守宫制备成肌肉注射液,六十年代曾远销东南亚各地。其工艺为醇提水沉,活性碳吸附除杂。其存在的问题主要为①提取液含多种成分曾检测出粗蛋白、脂肪、粗纤维、维生素、微量元素等;②有效成分不明上述物质均不能很好的解释守宫的抗肿瘤作用;③醇提中需将药材在乙醇中浸泡20天,这种方法存在的问题是I长时间浸泡,乙醇挥发,浓度降低;II浸泡时间越长,则提取物含杂质越多;III浸泡时间太长,药材容易变质;IV浸泡时间太长,给生产带来不便,且增加生产成本。该注射液由于其工艺为醇提水沉,故不可能含有守宫多糖,事实上从该注射液中也未能检测出守宫多糖。
多糖是一类天然大分子物质,广泛存在于动物、植物和微生物细胞中,是构成生命的四大基本物质之一。大量研究表明,多糖具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。一般情况下,多糖是良好的免疫调节剂。多糖可以活化巨噬细胞,促进淋巴细胞有丝分裂,增强NK细胞(自然杀伤细胞)与LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)活性,增强TD细胞(迟发性超敏反应T细胞)功能,诱生白细胞介素(尤其是IL-1、IL-2)、IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)等细胞因子,活化补体,增强红细胞免疫,调节神经-内分泌-免疫网络。
目前国内外从天然原料药里分离得到的绝大多是植物多糖和微生物多糖。由于多糖多是中药或食物的水溶性成分,一般中药或食物均可通过煎煮服用,其水溶液含有大量多糖。然而国内外已分离的多糖大多是从没有显著抗癌作用(多数甚至是没有抗癌作用)的植物中分离,因而其得到的多糖用于动物或人体,其抗癌作用非常有限。
同样基于上述原因,多数多糖对肿瘤细胞无直接作用。大多数有关多糖抗肿瘤作用的研究均系体内研究,然而体内的研究常系多糖增强机体抗肿瘤免疫进而间接起到抗肿瘤作用。事实上人体的免疫系统仅能清除小于106-109个肿瘤细胞(小于1cm3),上述肿瘤属极早期肿瘤,不但临床很难发现,即便确诊,也多采取手术治疗并得以根治。大多数肿瘤患者一经发现即属晚期,远远超过机体免疫系统的清除能力。寻找对肿瘤细胞具有直接的抑制作用的药物显得尤为重要。
新近的研究表明含硫酸根的多糖具有抗HIV的作用,因而硫酸多糖已成为国内外研究的热点。由于天然的硫酸多糖很难获得,研究者常常采取人工合成或硫酸酯化的方法得到硫酸多糖。目前除人工合成与化学修饰得到的硫酸多糖外,仅从植物中分离得到少数几种天然硫酸多糖,均有一定的抗HIV感染的作用。
多糖具有独特而复杂的化学结构,因而其化学结构研究和构效关系的研究相当复杂和困难,虽然近年在这些方面的研究取得一定的进展,但是多糖高级结构研究和构效关系研究仍有很多问题有待阐明,这也使得我们对多糖的化学修饰存在众多因素的影响,通常难以严格控制其条件并准确阐明其结构与机理,不利于新药的研发。例如人工修饰得到硫酸酯化茯苓多糖,不仅其工艺复杂,条件难以准确控制,其得到的茯苓多糖硫酸酯,在2.5mg/ml肿瘤细胞的抑制率最高才16.2%。
综上所述,临床上对守宫的使用提出了更高的要求,第一是降低其毒副作用,以提高其使用量,增加其对多种病患的疗效;第二是从现代医药发展的观点来看,获取、弄清楚中药的有效成份对于继承和宏扬祖国传统医学、参与国际竞争具有十分重要的作用,同时也是时代赋于我们的历史使命;第三是公知的药物中对癌症的治疗效果不是很理想,在中药中筛选治疗癌症的有效成份是我国的药物学家研究的热点;同时筛选能治疗HIV感染的有效成分并用于临床具有十分重大的科学价值、医疗价值和经济价值。
发明人通过对现有技术的研究,认为,公知的从中药中提取有效成份的方法是水煮醇沉,保留水溶液去掉沉淀,是一种技术上的偏见,起码是技术路线上的偏差;并重新设计出一套提取方法,进而完成、实现了本发明的多个发明目的。
技术内容本发明的发明目的是旨在克服上述现有技术缺限,提供一种源自动物中药守宫的守宫多糖;该守宫多糖对多种恶性肿瘤特别是肝癌细胞有很强的抑制作用,抑癌率高达70.8%,并且可诱导肝癌细胞分化,同时由于该守宫多糖含有硫酸根对HIV等病毒性疾病有明显的抗病毒作用,守宫多糖也是一具有广泛免疫调节作用的生物治疗剂;本发明的另一发明目的是提供制备该守宫多糖的方法及守宫多糖在医药领域的应用。
本发明所述的守宫多糖来源于守宫的水煮醇沉物,外观灰白色至棕色粉末;PH6-7;显色反应Molish反应阳性、Fehling反应阳性;
所述的守宫多糖含有硫酸根;硫酸根定性试验呈阳性。
上述守宫多糖的制备方法包括以下按顺序进行的工艺步骤备料---粉碎---守宫粗粉---脱脂---水浸提---逐步醇沉---守宫多糖。
在上述工艺步骤中,脱脂是必须的、非常重要的步骤,由于守宫是一种动物,含有大量的脂溶性物质,因此,脱脂对于产品的收得率和纯度有重要的作用;即在守宫的水浸提前用甲醇抽提出脂溶性物质。
水提按守宫量的1-8倍加入水,在60-120℃条件下浸提1-3小时,并可对同一守宫粗粉进行多次水浸提,将所得水浸提液合并使用。
醇沉水提液分次加入乙醇至15%-80%浓度,分别收集沉淀,将沉淀溶解于水,滤除不溶物,滤液再加乙醇沉淀,沉淀即为标的物守宫多糖。
守宫多糖在医药领域的应用;应用守宫多糖制成符合药剂学要求的口服剂型;应用守宫多糖制成符合药剂学要求的注射剂型;守宫多糖在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
守宫多糖在制备治疗肝癌的药物中的应用。
守宫多糖在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。
守宫多糖在制备治疗HIV感染的药物中的应用。
守宫多糖在制备免疫调节药物中的应用。
与现有的多糖相比,守宫多糖的科学价值和应用的意义在于1、申请人在世界上首次得到守宫多糖,并得到科学验证。2、守宫多糖对恶性肿瘤有较高的疗效例如原发性肝癌俗称“癌王”,为我国常见恶性肿瘤之一,我国每年约有11万人死于肝癌,占全球肝癌死亡数的45%,早期肝癌(<3cm),肝移植有较好疗效,然而不但费用十分昂贵(约需25-30万元,且每年尚有数万元的维持药费),且全球供肝来源不足,致使许多患者无法行肝移植术;大多数肝癌一经发现即属晚期,而中晚期患者无论是手术、放疗、化疗、介入治疗疗效均不理想。目前仅少数几种化疗药如阿霉素、顺铂、替加氟对肝癌有明确的疗效,但因其抑癌率较低而毒性反应较大,用于全身化疗多无确切疗效。守宫多糖在浓度为1mg/ml时对原发性肝癌细胞株抑癌率就高达70.8%,IC50<10μg/ml,显示了极高的抑癌活性,并且可诱导肝癌细胞分化,疗效优于众多化疗药物,可单独用于恶性肿瘤的治疗,也可用于肿瘤手术、放疗、化疗与介入治疗。3、传统中医认为守宫咸寒有小毒,现代研究发现守宫含与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质,使传统的中医理论得到了验证;守宫的毒性限制了其临床大剂量应用,故守宫的日用量一般仅1.5~4.5g,我们从守宫里分离提取了对恶性肿瘤和HIV感染有较高治疗效果的有效成分守宫多糖,起到了很好的减毒增效作用。4、由于含有硫酸根,守宫多糖在艾滋病等病毒感染性疾病的防治上具有广阔的应用前景。5、多糖是良好的免疫调节剂,临床使用守宫治疗免疫低下也有很好的治疗效果,守宫多糖可作为一种新的免疫调节剂,用于恶性肿瘤、慢性感染等疾病的治疗。
图1是制备守宫多糖的工艺流程图;图2是守宫多糖作用后肝癌Bel-7402细胞的生长曲线;图3是守宫多糖对肝癌Bel-7402细胞的抑癌率(%);图4是守宫多糖作用后肝癌Bel-7402细胞的存活率;图5是肝癌细胞株Bel-7402阴性对照组细胞的形态图;图6是肝癌细胞株Bel-7402 ATRA阳性对照组细胞的形态改变图;图7是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖低剂量组细胞的形态改变图;
图8是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖中剂量组细胞的形态改变图;图9是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖高剂量组细胞的形态改变图;具体实施方法实施例1守宫多糖的制备无蹼壁虎Gekko swinhonis Gūenther 1Kg,粉碎为粗末,过1号筛,4000ml甲醇60℃水浴浸提3小时、2小时各1次,均4层纱布过滤,榨尽药汁,药渣以8000ml蒸馏水90-100℃水浴提取3小时、2小时各1次,6000ml蒸馏水90-100℃水浴提取1小时1次,均4层纱布过滤,榨尽药汁,合并3次水提药液,2000转20分钟离心除去沉淀,浓缩至1500-2000ml,缓缓加乙醇至30%浓度,边加边搅拌,静置去沉淀,药液再缓缓加乙醇至80%浓度,边加边搅拌,收获沉淀,沉淀用蒸馏水400ml溶解,滤除不溶物,缓缓加乙醇至80%浓度,边加边搅拌,收获沉淀,沉淀用无水乙醇洗涤3次,真空干燥,碾细即得;得率约3.8-4.2%。
实施例2守宫多糖的制备多疣壁虎Gekko japonicus(Duméril &Bibron)1Kg,粉碎,甲醇脱脂,药渣以4-8倍蒸馏水60-80℃提取2-3次,15%-80%乙醇分步沉淀,收获沉淀,水溶,再用乙醇沉淀,沉淀用无水乙醇洗涤3次,干燥,碾细即得。
验证鉴定例1守宫多糖的鉴定壁虎按上述实施例1、2的方法提取的物质外观颜色呈灰白色至棕色粉末;溶于水,不溶于乙醇等有机溶剂;Molish反应呈阳性取该物质0.1g溶于10ml蒸馏水,取1ml水溶液加5%α萘酚乙醇溶液3滴,摇匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸,在药液与浓硫酸液面间有紫色环产生;盐酸水解试验取该物质水溶液1ml,加稀盐酸10滴,酒精灯上加热水解15分钟后立即观察,溶液澄清,无明显的沉淀产生;Fehling反应呈阳性取该物质水溶液1ml,加稀盐酸10滴,酒精灯上加热水解15分钟后,加Fehling试剂1ml,酒精灯上加热10分钟,静置数小时后观察,有砖红色沉淀产生(Fehling试剂A液3.45gCuSO4·5H2O溶于500ml蒸馏水中,加50μl浓H2SO4,混匀,储存;B液6.25gNaOH和6.85g酒石酸钾钠溶于蒸馏水,储存;临用前将A液与B液等体积混匀即可)。
通过上述反应可证明该物质为多糖,因其来源于守宫,即为守宫多糖。
验证鉴定例2守宫多糖硫酸根的鉴定守宫多糖硫酸根定性试验呈阳性取守宫多糖水溶液1ml,加稀盐酸10滴,酒精灯上加热水解15分钟后,滴加氯化贝溶液,产生白色沉淀。
证明该天然守宫多糖含有硫酸根。
实验实施例1守宫多糖抗肿瘤药理研究(1)将肝癌细胞株Bel-7402培养于含10%新生小牛血清(56℃灭活30min)的RPMI1640培养基中,0.25×104/ml接种于12孔板,于37℃、体积为5%CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养。接种24小时后分别用含守宫多糖1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml与等体积NS的PRMI1640培养基培养7天。加药后30分钟、1-6天分别收集细胞,台盼蓝染色,分别计数活细胞与死细胞,作生长曲线、细胞存活率与抑癌率计算。统计方法采用多重比较,全部统计由统计软件包SPSS(version11.0,Chicago,USA)完成(紧接下页)。
1、守宫多糖对肝癌细胞株Bel-7402的生长抑制作用表1守宫多糖对肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用(×104/ml,N=3)
注△与对照组比较P<0.05;与高剂量组比较P<0.05;◇与对照组比较P<0.01;◆与高剂量组比较P<0.01;□与对照组比较P<0.001;■与高剂量组比较P<0.001;○与中剂量组比较P<0.05;◎与中剂量组比较P<0.01。
图1是守宫多糖作用后肝癌Bel-7402细胞的生长曲线;表2守宫多糖对肝癌Bel-7402细胞的抑癌率(%)
图2是守宫多糖对肝癌Bel-7402细胞的抑癌率(%)研究结果表明守宫多糖高、中、低剂量组在加药后24小时就可显著抑制肝癌Bel-7402细胞的生长,抑癌率最高达70.8%,疗效以中剂量组为最佳。守宫多糖对肝癌Bel-7402细胞增殖抑制的IC50<10μg/ml。
2、守宫多糖对肝癌细胞存活率的影响表3守宫多糖对肝癌细胞Bel-7402细胞存活率的影响(n=3)
注△与空白对照组比较P<0.05;与高剂量组比较P<0.05;◇与空白对照组比较P<0.01图3是守宫多糖作用后肝癌Bel-7402细胞的存活率;研究结果表明守宫多糖高、中、低剂量组对肝癌Bel-7402细胞存活率均有影响,表明守宫多糖对肝癌Bel-7402细胞有一定的细胞毒作用。
实验实施例2守宫多糖抗肿瘤药理研究(2)将肝癌细胞株Bel-7402培养于含10%新生小牛血清(56℃灭活30min)的RPMI1640培养基中,1×105/ml接种于20ml培养瓶中,于37℃、体积为5%CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养。接种24小时后换液,分别用含守宫多糖1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、全反式维甲酸(ATRA)3μg/ml与等体积NS的PRMI1640培养基培养4天。观察细胞形态,检测碱性磷酸酶(ALP)与白蛋白(ALB)。见图5是肝癌细胞株Bel-7402阴性对照组细胞的形态图;图6是肝癌细胞株Bel-7402 ATRA阳性对照组细胞的形态改变图;图7是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖低剂量组细胞的形态改变图;图7是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖中剂量组细胞的形态改变图;
图8是肝癌细胞株Bel-7402守宫多糖高剂量组细胞的形态改变图;ATRA可诱导Bel-7402细胞分化为多边形细胞,而守宫多糖作用后的7402细胞形态明显改变,呈纺锤状,并可见细胞周围有大量分泌物存在。初步的研究证实,守宫多糖作用后的Bel-7402细胞ALP下降,ALB分泌上升,提示守宫多糖可诱导Bel-7402细胞往成熟的肝细胞方向分化。
应用实施例1含守宫多糖的注射液的制备守宫多糖,蒸馏水溶解,过滤,透析3次,调整浓度为10mg/ml,除菌,除热原、除游离蛋白,无菌分装为2ml/瓶。
应用实施例2守宫多糖胶囊守宫多糖,装入空心胶囊,每粒50mg,封口,除粉,装瓶。
应用实施例3守宫多糖片剂守宫多糖,加糊精2份,淀粉2份,糖粉1份,氢氧化凝胶达总量的3%,压片为50mg/片,装瓶。
权利要求
1.守宫多糖,来源于守宫的水煮醇沉物,其外观灰白色至棕色粉末;PH6-7;显色反应Molish反应阳性、Fehling反应阳性。
2.根据权利要求1所述守宫多糖,其特征在于该守宫多糖还含有硫酸根,其所述的守宫多糖硫酸根定性试验呈阳性。
3.根据权利要求1所述守宫多糖的制备方法,包括备料、粉碎等基础步骤,其特征在于还包括按下述顺序进行的以下步骤脱脂守宫在水浸提取前用甲醇抽提出脂溶性物质;水提将脱脂后的药渣按守宫量的1-8倍加水,在60-120℃条件下浸提1-3小时,并可对同一守宫粗粉进行多次水浸提,将所得水浸提液合并使用。醇沉水提液分次加入乙醇至15%-80%浓度,分别收集沉淀,将沉淀分别溶解于水,滤除不溶物,滤液再加乙醇沉淀,沉淀即为标的物守宫多糖。
4.根据权利要求1所述守宫多糖,其特征在于将其制成符合药剂学要求的注射剂型。
5.根据权利要求1所述守宫多糖,其特征在于将其制成符合药剂学要求的口服剂型。
6.守宫多糖在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
7.守宫多糖在制备治疗肝癌的药物中的应用。
8.守宫多糖在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。
9.守宫多糖在制备治疗HIV感染的药物中的应用。
10.守宫多糖在制备免疫调节剂中的应用。
全文摘要
本发明在世界上首次公开了一种源自动物中药守宫的守宫多糖、其制备方法和其医疗用途;其对恶性肿瘤有较高的疗效守宫多糖在浓度为1mg/ml时对人肝癌细胞株Bel-7402的抑癌率就高达70.8%,IC
文档编号A61K31/715GK1676533SQ200510065309
公开日2005年10月5日 申请日期2005年4月1日 优先权日2004年6月17日
发明者吴雄志, 陈丹 申请人:吴雄志