专利名称：Mods－mof的干预治疗药物epo抗体epo受体与制造方法及动物模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体与制造方法及动物模型。它涉及生命科学领域、及医药领域。
背景技术：
多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF，是防治极其困难、死亡率极高的人类疾病。目前现代科学还没有能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物。
发明内容
本发明公开了一种能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体与制造方法，揭示多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，揭示能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的分子生物调控机制的动物模型及实验方法。
本发明的目的是，提供一种干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体，能够通过创造揭示多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，与创造揭示能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，证实能够干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的干预治疗作用机制，与揭示EPO抗体、EPO受体相应的干预治疗分子生物调控机制。和提供一种制造促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的方法。
促红细胞生成素EPO，是包括人类在内的哺乳类动物的多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子；特别是它在啮齿类动物生命机体缺氧应激表达有12~24小时持续升高增加表达峰值期、在人类生命机体缺氧应激表达有48小时持续升高增加表达峰值期；特别是它在包括人类在内的哺乳类动物的MODS-MOF的发生器官脑组织存在旁分泌表达细胞、有脑神经组织细胞能够表达针对它的特异受体，“近年来已证实在脑组织中也存在EPO受体，星状胶质细胞可能生成EPO，脑组织中的EPO可保护因低氧或缺血造成的脑损伤并可促进神经原对抗古氨酸盐的毒性作用”；特别是它在包括人类在内的哺乳类动物的MODS-MOF的发生器官肾组织和肝组织存在分泌表达细胞；特别是它受体EPO受体EPO-R的PLCγ1信号传导通路，可以使PLCγ1的酪氨酸残基磷酸化，可和机质网上的受体结合，而导致机质网贮存钙的释放，使细胞内钙离子浓度明显升高，是能够造成缺氧细胞累积损伤的机制；特别是它受体EPO受体EPO-R的P13K信号传导通路，可刺激细胞的增殖和存活、也抑制细胞的凋亡，“新近有资料表明，EPO-R的激活效应主要是抑制细胞的凋亡(具体机制尚不清楚)”。作者可以为协作相关MODS-MOF动物模型实验的科学研究单位提供促红细胞生成素EPO。促红细胞生成素EPO，是针对包括人类在内的哺乳类动物的伤害自我保护“应激”MODS-MOF的触发启动机制，与同时伴生的伤害自我保护“应激”有害机制累积构成，促使“MODS-MOF发生系统”从混沌变化走向有序变化、从低级有序变化走向高级有序变化、以及从有序变化又转化为混沌的具体机理和共同发生规律，导致动物机体和人体发生MODS-MOF的综合生物调控网络，对包括人类在内的哺乳类动物的MODS-MOF的发生器官组织能够造成微循环障碍，造成包括人类在内的哺乳类动物的MODS-MOF的发生器官功能丧失或部分功能丧失、与发生器官组织细胞损伤。创造相应的揭示多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，能够揭示多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制。创造相应的揭示干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，能够证实干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的干预治疗作用机制。提供制造促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的方法，使相关实验能够实施。
创造相应的揭示多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制的动物模型及实验方法把促红细胞生成素EPO注射到实验动物体内，对实验动物实施快速放血创造多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型；把促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体注射到实验动物体内，对实验动物实施快速放血创造多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型。
创造相应的揭示干预治疗多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的分子生物调控机制的动物模型及实验方法对多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型实施，注射促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体、与输入新鲜红细胞加吸氧加扩容等治疗方法相结合的综合治疗方法。
制造促红细胞生成素EPO抗体的方法把促红细胞生成素EPO注射到小鼠体内，通过免疫小鼠获得促红细胞生成素EPO抗体。
制造促红细胞生成素EPO受体的方法克隆促红细胞生成素EPO受体的表达基因，在原核或真核表达系统表达生产促红细胞生成素EPO受体EPO-R。
具体实施例方式
为达到上述目的，实施本发明采用的方案1、把促红细胞生成素EPO注射到实验动物兔体内，对实验动物实施快速放血创造多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型。
2、把促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体注射到实验动物兔体内，对实验动物实施快速放血创造多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型。
3、对多器官功能障碍综合征MODS-多器官功能衰竭MOF的动物模型实施，注射促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体、与输入新鲜红细胞加吸氧加扩容等治疗方法相结合的综合治疗方法。
4、分别在0、14天给小鼠静脉或腹腔或皮下免疫接种100ug的促红细胞生成素EPO加等量免疫佐剂，28、42天给小鼠免疫接种50ug的促红细胞生成素EPO；1～2周后，从被促红细胞生成素EPO免疫的小鼠心脏取血，从获取的血液——血清中提取抗促红细胞生成素EPO的特异性多克隆IgG抗体。从被促红细胞生成素EPO免疫的小鼠脾脏中分离致敏B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞相融合，分离出能够表达促红细胞生成素EPO的特异IgG抗体制的杂交瘤细胞克隆，建立杂交瘤细胞株；将106个杂交瘤细胞植入小鼠腹腔，7～10天后收集腹水，从收集的腹水中提取抗促红细胞生成素EPO的特异单克隆IgG抗体。应用上述方法，用人的促红细胞生成素EPO免疫小鼠，从杂交瘤细胞的基因组中分离鉴别出鼠抗人的促红细胞生成素EPO单克隆抗体的功能性的VL与VH基因，分别与人的抗体轻、重链恒定区基因相连接，构建人-鼠嵌合的抗体重链和轻链基因，然后把构建的人-鼠嵌合的抗体重链和轻链基因转染骨髓瘤细胞，使之表达DNA基因重组的人-鼠嵌合的抗人的促红细胞生成素EPO抗体；或把构建的人-鼠嵌合的抗体重链和轻链基因，在原核或真核表达系统表达生产DNA基因重组的人-鼠嵌合的抗人的促红细胞生成素EPO抗体；这种嵌合有人的重链和轻链的抗人的促红细胞生成素EPO抗体、包含有人的重链和轻链的抗人的促红细胞生成素EPO抗体，与鼠抗人的促红细胞生成素EPO抗体相比具有可在一定程度上减轻临床治疗中在人体内诱导的抗异种蛋白反应。
5、克隆在鼠的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因或DNA基因，在原核或真核表达系统表达生产DNA基因重组的鼠的促红细胞生成素EPO受体EPO-R。
6、克隆在人类的染色体19P上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因或DNA基因，在原核或真核表达系统表达生产DNA基因重组的人源促红细胞生成素EPO受体EPO-R。这种人源促红细胞生成素EPO受体EPO-R具有可减有效轻临床治疗中在人体内诱导的抗异种蛋白反应。
不同物种动物的MODS-MOF模型1.1 实验动物及分组选用清洁级健康日本大耳白兔或新西兰兔60只，体重2.5kg。实验前3～5天转入动物实验室喂养以适应实验环境。随机分为以下7组。
1.1.1MODS-MOF动物模型I(SDDI组，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水3～5ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持30分钟，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水3～5ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDI组计数)1.1.2MODS-MOF动物模型II(SDD II组，n＝12)术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水3～5ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持30分钟，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水3～5ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDII组计数)
1.1.3MODS-MOF动物模型对照动物组I(CONI组，n＝8) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水3～5ml，在与MODS-MOF动物模型组I的相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组I的1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水3～5ml。
1.1.4MODS-MOF动物模型对照动物组II(CONII组，n＝8) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水3～5ml，在与MODS-MOF动物模型组II的相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组II的1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水3～5ml。
1.1.5MODS-MOF动物模型对照动物组III(CONIII，n＝8)术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射生理盐水3～5ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持30分钟，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射生理盐水3～5ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。
1.1.6正常动物组手术损伤I(AI组，n＝8)术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射生理盐水3～5ml，生理盐水3～5ml，在与MODS-MOF动物模型组相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射生理盐水3～5ml。
1.1.7正常动物手术损伤组II(AII组，n＝4) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，在与MODS-MOF动物模型组相同时间内结扎缝合手术切口。12小时后再通过耳静脉注射生理盐水3～5ml。
1.2观察指标及方法1.2.1针对以上各组动物各器官功能指标观察经颈动脉插管测量血压，并采血作血气分析、肝肾功、血常规、和电解质检查。
1.2.2以上各组动物出现动物在24小时后死亡时，要迅速解剖动物取出内脏各个器官；当其中有一组动物死亡到第4只动物时，乙醚麻醉处死各组的所有动物，要迅速解剖动物取出内脏各个器官。把迅速解剖动物取出的内脏各个器官切为1cm×1cm×0.4cm小块，置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6小时后，用PBS液漂洗5次，每次20分钟后；置于1％~2％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定4~6小时后，用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1小时；做脱水处理。对每一个固定好的动物器官组织做扫描电镜、或透射电镜连续断层切片。
1.2.3应用扫描电镜、或透射电镜对比分析观察在各组动物内脏各个器官发生存在的，组织形态学、细胞形态学、亚细胞细胞器形态学的MODS-MOF生理/病理发生状况。(1)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO相关的细胞损伤、或抑制细胞凋亡保护的生物机制；(2)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体相关的细胞损伤、或造成细胞凋亡的生物机制。
其它不同物种的非灵长类哺乳实验动物如豚鼠、小鼠、大鼠、狗、猪、羊等与灵长类哺乳实验动物如猕猴、狒狒等的MODS-MOF模型，参照与上法相同的方法予以实施。
相关实验MODS-MOF动物模型简化方案11.1实验动物及分组与实验检测对比分析方法，参考上述“不同物种动物的MODS-MOF模型”实施。
1.1.1MODS-MOF动物模型I(SDDI组，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，腹部备皮后，用电刀切开腹部分离肝的、或肾的、或脾的、或小肠的动脉和静脉血管。首先经动脉(肝的门静脉)注射含有10~15U促红细胞生成素EPO的生理盐水3～5ml后，立刻用无损伤止血钳关闭该器官的动脉和静脉血管20~30分钟后开放血管，再缓慢注射含有15~20U/促红细胞生成素EPO的生理盐水5～10ml约50～100分钟后止血，缝合手术切口。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDI组计数)1.1.2MODS-MOF动物模型II(SDDII组，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，用电刀切开腹部分离肝的、或肾的、或脾的、或小肠的动脉和静脉血管。首先经动脉(肝的门静脉)注射含有能够中和10~15U促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水3～5ml后，立刻用无损伤止血钳关闭该器官的动脉和静脉血管20~30分钟后开放血管，再缓慢注射含有能够中和15~20U/促红细胞生成素EPO或EPO受体的生理盐水5～10ml约50～100分钟后止血，缝合手术切口。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDII组计数)1.1.3MODS-MOF动物模型对照动物组I(CONI组，n＝8) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，用电刀切开腹部分离肝的、或肾的、或脾的、或小肠的动脉和静脉血管。首先经动脉(肝的门静脉)注射生理盐水3～5ml后，立刻用无损伤止血钳关闭该器官的动脉和静脉血管20~30分钟后开放血管，再缓慢注射生理盐水5～10ml约50～100分钟后止血，缝合手术切口。
1.1.4MODS-MOF动物模型对照动物组II(CONII组，n＝8) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，用电刀切开腹部分离肝的、或肾的、或脾的、或小肠的动脉和静脉血管。在与MODS-MOF动物模型相同时间内缝合手术切口。
1.2观察指标及方法
1.2.1针对以上各组动物各器官功能指标观察、尤其是在实施手术的那个器官功能指标观察 经颈动脉插管测量血压，并采血作血气分析、肝肾功、血常规、和电解质检查。
1.2.2以上各组动物出现动物在24小时后死亡时，要迅速解剖动物取出内脏各个器官；当其中有一组动物死亡到第4只动物时，乙醚麻醉处死各组的所有动物，要迅速解剖动物取出内脏各个器官。把迅速解剖动物取出的内脏各个器官切为1cm×1cm×0.4cm小块，置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6小时后，用PBS液漂洗5次，每次20分钟后；置于1％~2％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定4~6小时后，用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1小时；做脱水处理。对每一个固定好的动物器官组织做扫描电镜、或透射电镜连续断层切片。
1.2.3应用扫描电镜、或透射电镜对比分析观察在各组动物内脏各个器官发生存在的、尤其是在实施手术的那个器官发生存在的，组织形态学、细胞形态学、亚细胞细胞器形态学的MODS-MOF生理/病理发生状况。(1)、揭示MODS-MOF发生器官尤其是在实施手术的那个器官的功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO相关的细胞损伤、或抑制细胞凋亡保护的生物机制；(2)、揭示MODS-MOF发生器官尤其是在实施手术的那个器官的功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体相关的细胞损伤、或造成细胞凋亡的生物机制。
其它不同物种的非灵长类哺乳实验动物如豚鼠、小鼠、大鼠、狗、猪、羊等与灵长类哺乳实验动物如猕猴、狒狒等的MODS-MOF模型，参照与上法相同的方法予以实施。
相关实验MODS-MOF动物模型简化方案21.1实验动物应用体重350g~400g的不同个体之间体重相差尽可能小的近交系大鼠，其分组与实验检测对比分析方法，参考上述“不同物种动物的MODS-MOF模型”实施。
1.1.1MODS-MOF动物模型I(SDDI组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水1～2ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约10~15ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水1～2ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDI组计数)1.1.2MODS-MOF动物模型II(SDDII组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水1～2ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约10~15ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水1～2ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDII组计数)1.1.3MODS-MOF动物模型对照动物组I(CONI组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水1～2ml，在与MODS-MOF动物模型组I的相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组I的1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射含有150~200U/kg促红细胞生成素EPO的生理盐水1～2ml。
1.1.4MODS-MOF动物模型对照动物组II(CONII组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水1～2ml，在与MODS-MOF动物模型组II的相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组II的1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水1～2ml。
1.1.5MODS-MOF动物模型对照动物组III(CONIII，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射生理盐水1～2ml，5～10分钟后放血相当全身血总容量40％~60％约10~15ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射生理盐水1～2ml。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。
1.1.6正常动物组手术损伤I(AI组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉注射生理盐水1～2ml，在与MODS-MOF动物模型组相同时间内输入相当MODS-MOF动物模型组1倍失血量的林格平衡液，而后结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射生理盐水1～2ml。
1.1.7正常动物手术损伤组II(AII组，n＝24) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，在与MODS-MOF动物模型组相同时间内结扎缝合手术切口。12小时后再通过尾静脉注射生理盐水1～2ml。
1.2观察指标及方法1.2.1针对以上各组动物分别在开始实施手术后的15分钟、30分钟、60分钟、2小时、8小时、24小时、72小时各自抽取3只动物的各器官功能指标观察经颈动脉插管测量血压，并采血作血气分析、肝肾功、血常规、和电解质检查。并应用大鼠生物芯片对采血，分别检测各组实验动物模型血液成分，在不同时间发生进程各种分子物质发生的上调变化或下调变化；分析揭示促红细胞生成素EPO、EPO抗体或EPO受体在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的分子生物调控机制，分析揭示促红细胞生成素EPO、或EPO受体在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的分子生物表达机制，分析揭示在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的各个分子生物调控机制。乙醚麻醉处死各自抽取的3只动物，要迅速解剖动物取出内脏各个器官。把迅速解剖动物取出的内脏各个器官切为1cm×1cm×0.4cm小块，置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6小时后，用PBS液漂洗5次，每次20分钟后；置于1％~2％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定4~6小时后，用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1小时；做脱水处理。对每一个固定好的动物器官组织做扫描电镜、或透射电镜连续断层切片。
1.2.2对动物器官组织做的扫描电镜、或透射电镜连续断层切片分为3组。分别应用抗大鼠的红细胞生成素EPO抗体、抗大鼠的红细胞生成素EPO受体的抗体、抗大鼠的红细胞生成素EPO受体mRNA的抗体，分别做能够检测组织细胞的大鼠的红细胞生成素EPO生物表达、大鼠的红细胞生成素EPO受体生物表达、大鼠的红细胞生成素EPO受体mRNA生物表达组织切片的免疫组织化学处理。
1.2.3应用扫描电镜、或透射电镜对比分析观察在各组动物内脏各个器官发生存在的，组织形态学、细胞形态学、亚细胞细胞器形态学的MODS-MOF生理/病理发生状况。(1)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO相关的细胞损伤、或抑制细胞凋亡保护的生物机制；(2)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体相关的细胞损伤、或造成细胞凋亡的生物机制。
相关实验MODS-MOF动物模型简化方案31.1实验动物应用体重250g的不同个体之间体重相差尽可能小的近交系大鼠，或应用体重25g的不同个体之间体重相差尽可能小的近交系小鼠，其分组与实验检测对比分析方法，参考上述“不同物种动物的MODS-MOF模型”实施。
1.1.1MODS-MOF动物模型(SDD组，n＝36) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离两侧颈动脉一侧股动脉。首先经股动放血相当全身血总容量40％~60％约5.5~9.6ml或约0.8~1.2ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg后结扎两侧颈动脉维持8分钟后开放，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持8分钟，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。每天行密切观察，必要时给予支持治疗。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDD组计数)1.1.2MODS-MOF动物模型对照动物组I(CONI组，n＝36) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉，分离两侧颈动脉一侧股动脉。维持10分钟后缝合手术切口。
1.1.3MODS-MOF动物模型对照动物组II(CONII组，n＝36) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥45mg/kg腹腔内麻醉。
1.2观察指标及方法1.2.1针对以上各组动物分别在MODS-MOF动物模型开始实施结扎两侧颈动脉手术后的3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、45分钟、2小时、5小时、12小时、24小时、48小时各自抽取3只动物的各器官功能指标观察经颈动脉插管测量血压，并采血作血气分析、肝肾功、血常规、和电解质检查。并应用大鼠或小鼠生物芯片对采血分别检测各组实验动物模型血液成分，在不同时间发生进程各种分子物质发生的上调变化或下调变化；分析揭示促红细胞生成素EPO、或EPO受体在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的分子生物调控机制，分析揭示促红细胞生成素EPO、或EPO受体在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的表达机制，分析揭示在MODS-MOF综合体液分子生物调控网络的各个分子生物调控机制。断头处死各自抽取的3只动物，要迅速把断头置于液氮中冷冻处理后，剥离取出脑组织切为1cm×1cm×0.4cm小块，要迅速解剖动物取出内脏各个器官切为1cm×1cm×0.4cm小块。置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6小时后，用PBS液漂洗5次，每次20分钟后；置于1％~2％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定4~6小时后，用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1小时；做脱水处理。对每一个固定好的动物器官组织做扫描电镜、或透射电镜连续断层切片。
1.2.2对动物器官组织做的扫描电镜、或透射电镜连续断层切片分为3组。分别应用抗大鼠或抗小鼠的红细胞生成素EPO抗体、抗大鼠或抗小鼠的红细胞生成素EPO受体的抗体、抗大鼠或抗小鼠的红细胞生成素EPO受体mRNA的抗体，分别做能够检测组织细胞的大鼠或小鼠的红细胞生成素EPO生物表达、大鼠或小鼠的红细胞生成素EPO受体生物表达、大鼠或小鼠的红细胞生成素EPO受体mRNA生物表达组织切片的免疫组织化学处理。
1.2.3应用扫描电镜、或透射电镜对比分析观察在各组动物内脏各个器官发生存在的、尤其是在实施手术的脑组织器官发生存在的，组织形态学、细胞形态学、亚细胞细胞器形态学的MODS-MOF生理/病理发生状况。(1)、揭示MODS-MOF发生器官尤其是在实施手术的脑组织器官的功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO相关的细胞损伤、或抑制细胞凋亡保护的生物机制；(2)、揭示MODS-MOF发生器官尤其是在实施手术的脑组织器官的功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO受体相关的细胞损伤、或造成细胞凋亡的生物机制。
相关实验MODS-MOF动物模型简化方案41.1实验动物及分组选用清洁级健康日本大耳白兔或新西兰兔36只，体重2.5kg。实验前3～5天转入动物实验室喂养以适应实验环境。随机分为以下3组。
1.1.1MODS-MOF动物模型I(SDDI组，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDI组计数)静脉输入动物全身血容量20％～30％新鲜红细胞加吸氧加扩容，静脉或腹腔注射含有能够中和10~20U/kg促红细胞生成素EPO抗体或EPO受体的生理盐水5～10ml，每日2次。
1.1.2MODS-MOF动物模型II(SDD II组，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDII组计数)静脉输入动物全身血容量20％～30％新鲜红细胞加吸氧加扩容，静脉或腹腔注射生理盐水3～5ml，每日2次。
1.1.3MODS-MOF动物模型III(SDDIII，n＝12) 术前禁食12小时。称重后给予乙醚轻度麻醉或戊巴比妥30mg/kg腹腔内麻醉，颈部及腹部备皮后，分离一侧颈动脉和股动脉。颈动脉插管测量血压，股动脉插管备用。首先经股动脉放血相当全身血总容量40％~60％约60~80ml、使血压下降至平均动脉压MAP＝5.33 kPa＝40mmHg，在放血中加入50U/ml肝素抗凝，造成失血性休克维持2小时，然后回输加入肝素抗凝的失血和相当1倍失血量的林格平衡液复苏，而后结扎缝合手术切口。(不能复苏或在24小时内死亡的动物不在SDDIII计数)静脉或腹腔注射生理盐水3～5ml，每日2次。
1.2观察指标及方法
1.2.1针对以上各组动物各器官功能指标观察经颈动脉插管测量血压，并采血作血气分析、肝肾功、血常规、和电解质检查。
1.2.2以上各组动物出现动物在24小时后死亡时，要迅速解剖动物取出内脏各个器官；当其中有一组动物死亡到第4只动物时，乙醚麻醉处死各组的所有动物，要迅速解剖动物取出内脏各个器官。把迅速解剖动物取出的内脏各个器官切为1cm×1cm×0.4cm小块，置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、O.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6小时后，用PBS液漂洗5次，每次20分钟后；置于1％~2％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定4~6小时后，用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1小时；做脱水处理。对每一个固定好的动物器官组织做扫描电镜、或透射电镜连续断层切片。
1.2.3应用扫描电镜、或透射电镜对比分析观察在各组动物内脏各个器官发生存在的，组织形态学、细胞形态学、亚细胞细胞器形态学的MODS-MOF生理/病理发生状况。(1)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO相关的细胞损伤、或抑制细胞凋亡保护的生物机制；(2)、揭示MODS-MOF发生器官功能障碍、和组织细胞损伤、和组织细胞凋亡的，与触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体相关的细胞损伤、或造成细胞凋亡的生物机制。
寻找出能够早期干预治疗MODS-MOF的最佳有效治疗机制方案，为临床有效珍疗MODS-MOF干预治疗机制、方法及药物提供相关科学依据。
其它不同物种的非灵长类哺乳实验动物如豚鼠、小鼠、大鼠、狗、猪、羊等与灵长类哺乳实验动物如猕猴、狒狒等的MODS-MOF模型，参照与上法相同的方法予以实施。
权利要求
1.一种MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于MODS-MOF的干预治疗药物为促红细胞生成素EPO抗体(1)。
2.一种MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于MODS-MOF的干预治疗药物为促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)。
3.一种MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于MODS-MOF的干预治疗药物为促红细胞生成素EPO抗体(1)，是包含有人的抗体重链和轻链的抗人的促红细胞生成素EPO抗体(3)。
4.一种MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于MODS-MOF的干预治疗药物为促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)，是人源促红细胞生成素EPO受体EPO-R(4)。
5.根据权利要求3中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于包含有人的抗体重链和轻链的抗人的促红细胞生成素EPO抗体(3)制造方法，是通过分离鉴别出鼠抗人的促红细胞生成素EPO单克隆抗体的功能性的VL与VH基因(5)，分别与人的抗体轻、重链恒定区基因相连接(6)，构建人-鼠嵌合的抗体重链和轻链基因(7)，然后把构建的人-鼠嵌合的抗体重链和轻链基因(7)转染骨髓瘤细胞(8)，使之表达DNA基因重组的包含有人的重链和轻链的抗人的促红细胞生成素EPO抗体(3)。
6.根据权利要求2中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)的制造方法，通过克隆在动物的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因(10)，在原核表达系统表达生产cDNA基因(10)重组的动物的促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)。
7.根据权利要求2中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)的制造方法，通过克隆在动物的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因(10)，在真核表达系统表达生产cDNA基因(10)重组的动物的促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)。
8.根据权利要求2中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)的制造方法，通过克隆在动物的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达DNA基因(11)，在原核表达系统表达生产DNA基因(11)重组的动物的促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)。
9.根据权利要求2、4、6、7中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)的制造方法，通过克隆在动物的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因(10)，是通过克隆在人类的染色体19P上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达cDNA基因(12)，达生产cDNA基因(12)重组的人源促红细胞生成素EPO受体EPO-R(4)。
10.根据权利要求2、4、8、9中所述的MODS-MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，其特征在于促红细胞生成素EPO受体EPO-R(2)的制造方法，通过克隆在动物的染色体上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达DNA基因(11)，是通过克隆在人类的染色体19P上的促红细胞生成素EPO受体EPO-R的表达DNA基因(13)，达生产DNA基因(13)重组的人源促红细胞生成素EPO受体EPO-R(4)。
全文摘要
本发明名称为MODS－MOF的干预治疗药物EPO抗体EPO受体与制造方法及动物模型，涉及生命科学领域、及医药领域。提供了一个干预治疗MODS－MOF的有效药物EPO抗体、EPO受体与制造方法及动物模型。提供了揭示多器官功能障碍综合征MODS－多器官功能衰竭MOF的触发启动细胞因子促红细胞生成素EPO的分子生物调控机制的、与干预治疗MODS－MOF的有效药物促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的分子生物调控机制的动物模型及实验方法，和制造促红细胞生成素EPO抗体、EPO受体的方法。
文档编号A61K39/395GK1686543SQ20051006804
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月9日 优先权日2005年5月9日
发明者叶新新 申请人:叶新新