专利名称：重组人那希力肽的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性多肽的制备方法，特别涉及一种利用基因重组技术制备那希力肽的生物活性多肽的方法。
背景技术：
那希力肽(Nesiritide)又称脑钠素(Brain Natreuritic Peptide，BNP)，是由脑组织和心脏合成和分泌的生物活性物质。Sudoh等首先从猪脑中分离出那希力肽，随后发现其他动物和人心脏中也有那希力肽的分布，脑细胞中合成的那希力肽作为神经递质发挥生理功能；心肌细胞合成并分泌至血液循环中的那希力肽则作为心脏的内分泌物，对调节心血管功能和水盐代谢起重要作用。心力衰竭时血浆BNP含量增加，静脉滴注外源性BNP可以进一步改善心力衰竭时的心肾功能。因此，重组人那希力肽在临床上具有重要的使用价值。
根据文献报道，人那希力肽(hBNP)由32个氨基酸残基所组成，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His，其中第10位和第26位Cys残基内的巯基形成分子内的二硫键。
中国专利99120613.4公布了一种制备人那希力肽的方法，该方法采用的是串联表达技术，既将BNP串联成十聚体直接克隆到表达载体pET22a上。表达产物经柱层析纯化后，串联的BNP融合蛋白用色氨酸裂解试剂裂解为单个BNP，经柱层析纯化后，再将BNP单体中二硫键氧化生成二硫键，最后用梭肽酶Y去掉BNP C末端多余的色氨酸得到与天然人序列完全一致的BNP。该工艺步骤极其繁杂，且容易在BNP二硫键生成时形成分子间的聚合体或异构体，得率极低。本发明大大简化了工艺，大大提高了那希利肽产量，从而可大规模工业化生产人那希力肽。
发明内容
本发明提供一种制备人那希力肽的方法，该方法包括以下步骤
a.人工合成人编码那希力肽氨基酸序列的基因DNA片段；b.步骤a得到的基因片段与适宜的表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因3′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；c.将含有步骤b.得到克隆的融合蛋白编码基因的表达载体重组质粒DNA转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；d.该基因工程菌经发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出人那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白；e.步骤d得到的融合蛋白经肠激酶或者凝血酶切割后，分离，纯化，获得重组人那希力肽。
步骤d.中的融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过肠激酶酶切识别位点-(Asp)n-Lys-连接，结构为X-(Asp)n-Lys-hBNP，其中X为硫氧还蛋白，Asp为天冬氨酸(简写为D)，Lys为赖氨酸(简写为K)，hBNP为人那希力肽，n为2、3或者4，即表示n个Asp串联在一起Asp。
或融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过凝血酶酶切识别位点X-P2-P3-Pro-P1.连接，结构为X-P2-P3-Pro-P1_hBNP，其中X为硫氧还蛋白，P1为Arg或Lys，P2、P3为疏水性氨基酸选自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp，这里P2可以优选但不限于Leu，P3可以优选但不限于Val，X-P2-P3-Pro-P1_hBNP代表的优选的氨基酸序列可以但不限于为X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP。
所述人那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白的编码DNA和氨基酸序列见序列表序列表1为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDDY)的编码DNA序列。
序列表2为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDDY)的氨基酸序列。
序列表3为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDY)的编码DNA序列。
序列表4为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDDY)的氨基酸序列。
序列表5为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDY)的编码DNA序列。
序列表6为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列为DDY)的氨基酸序列。
序列表7为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(凝血酶识别序列)的编码DNA序列。
序列表8为那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(凝血酶识别序列)的氨基酸序列。
本发明的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将合格的重组人那希力肽基因工程菌接种到发酵罐中培养，其中加入IPTG诱导融合蛋白的表达。
本发明的制备方法，其中所述提取层析纯化，对于肠激酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清的步骤，将收集的上清上Zn2+-Sepharose F.F.金属离子螯和柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的咪唑洗脱那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白，将洗脱的那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白用透析或超滤除去咪唑，用高纯度的Enterkinase做酶切处理，将酶切的融合蛋白上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧还蛋白，将得到的那希力肽上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，得到纯度95％以上的纯那希力肽。
对于凝血酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液沉淀(Thioredoxin-BNP融合蛋白主要在离心沉淀中)。将收集的沉淀清用8M的脲素溶解，然后用透析的方法去掉脲素，将透析液直接用凝血酶(Thrombin)酶切，将酶切的溶液直接上SP-Sepharose F.F.离子交换柱，rhBNP被吸附在柱上，其它大部分杂质则直接穿透；将洗脱的含rhBNP的溶液上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，可得到纯度95％以上的纯品。用适宜的方法去掉乙氰和三氟乙酸，并换成适宜的缓冲液，如柠檬酸盐缓或磷酸盐缓冲液。
本发明还提供人那希力肽药物组合物，其配方组成如下那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg
柠檬酸(一水) 2.1mg柠檬钠(二水) 2.94mg或那希力肽 0.5mg甘露醇 5～20mg磷酸二氢钠 0.93mg磷酸氢二钠 1.73mg氯化钠 10mg本发明是根据已经发表的人那希力肽一级结构的氨基酸编码序列(该序列可按照遗传密码的通用性、简并性和大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则进行改变)，人工合成该双链DNA全序列。本发明的主要特点在于，分别将该编码基因片段克隆入适宜表达载体，(优选的如pET32a或pTDa，为常规的表达载体，均可在市场上买到，内含硫氧还蛋白基因片段)中构建形成重组质粒，然后将重组质粒转化适宜的大肠杆菌，经过筛选，优选的为BL21(λDE3)或HB101菌株(为常规菌株，均可在市场上买到)。该基因工程菌以硫氧还蛋白(Thioredoxin)为融合伴侣，融合表达hBNP，即形成那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白，所表达的融合蛋白经过适宜的步骤分离纯化后，用适宜的具有特异序列识别能力的蛋白酶如用肠激酶(Enterkinase)或凝血酶(Thrombin)将hBNP从融合蛋白上切割下来，经过高度分离纯化，得到hBNP纯品。经过N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定、等电点测定、肽图分析以及生物活性检测等分析，结果表明我们所表达的人那希力肽与天然的那希力肽各指标完全一致，而表达效率为全菌蛋白的30％以上，高于现有技术报道的串联法生产那希力肽。
本发明使用的分子克隆方法的基本原理，以及操作步骤中所使用的原料，溶剂，工具属于现有技术领域，如DNA的合成方法，酶切位点的选择等，本发明使用的基因表达载体，基因工程菌等都可以在市场上买到。
以上方法的具体操作步骤可以见本发明的实施例。
本发明的优点主要表现在(1)、本发明中那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白以可溶的形式存在(以肠激酶Enterkinase识别序列连接)，或者以包涵体的形式存在(以凝血酶Thrombin识别序列连接)在8M脲素溶解后透析复性，其BNP10位和26位上的cys的形成完全正确的二硫键，避免融合蛋白酶切纯化后必须进行复性处理，从而大大简化生产工艺和大大提高生产效率；(2)、通过上述工艺得到的rhBNP，其结构等理化特性和生物学活性与文献报道的结构完全一致，无任何二聚体或者异构体的存在，同时还避免通常重组蛋白质药物N端前面多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而可降低其免疫原性；(3)、表达率高。
本发明组合物的优点表现在(1)稳定性好，室温下放置18个月，其各项指标仍能达到注射用生物制品的各项要求。
图1pET-32a质粒图谱图2pET-32a多克隆位点及序列图3pET32a-BNP重组质粒的构建示意4那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(肠激酶识别序列)融合蛋白表达图5肠激酶处理后纯化的那希力肽电泳图谱图6pTDa表达载体图7pTDa-BNP重组质粒DNA的构建示意8那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白(凝血酶识别序列)的表达(1、2为实例1所得到的rhBNP、3、4为实例2所得到的rhBNP)图9两种方式纯化的那希力肽电泳图谱
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例11.表达载体的选择选用Novagen公司的pET系列表达载体pET32a作为表达载体，The pET-32a是用于高效融合表达蛋白和多肽的大肠杆菌表达载体系统，目的蛋白或多肽以109个氨基酸残基的硫氧还蛋白(Trx·TagTM)作为融合伴侣。(图谱见附图1、图2)。
2.基因的设计和合成根据文献报道的人那希力肽DNA编码序列(序列可根据遗传密码的通用性、简并性原则改变，但不改变氨基酸组成和排列)设计编码成熟人BNP序列，如5’_AGC CCT AAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGTATC AGC TCT TCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA_3’。同时在该序列的5’-端加上Kpn识别序列GGTACC和肠激酶(Enterokinase)酶切位点编码序列GACGACGACGACAAG(即编码-DDDDK-)；在3’_端加上Xho I的识别序列CTCGAG从而形成如下的设计序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAAATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCCAGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
或在该序列的5’-端加上Kpn识别序列GGTACC和肠激酶(Enterokinase)酶切位点编码序列GACGACGACAAG(即编码-DDDK-)；在3’_端加上Xho I的识别序列CTCGAG从而形成如下的设计序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAAATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCCAGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
或在该序列的5’-端加上Kpn识别序列GGTACC和肠激酶(Enterokinase)酶切位点编码序列GACGACAAG(即编码-DDK-)；在3’_端加上Xho I的识别序列CTCGAG从而形成如下的设计序列5’_GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG CCT AAA ATG GTACAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCT TCC AGC GGTCTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA CTC GAG_3’。
合成方法参见《分子克隆手册》冷泉港第二版3.将上述合成的核酸片段插入到PET32a的Kpn和Xho I位点形成重组质粒，转化大肠杆菌BL21，经筛选即得高效表达基因工程菌。有关操作方法参见《分子克隆手册》冷泉港第二版构建图谱见附图34.将细菌接种到LB或其它适宜的培养基中，当工程菌长到适宜浓度时如对数中期，加入适宜浓度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可见明显的融合蛋白表达条带，见附图45.将培养过夜的种子液，接种到发酵罐适宜的培养基(如LB、TB或其它适宜培养基中)中培养，细菌培养至适宜的程度时，加IPTG诱导培养一定时间(如3-4小时)。离心收菌，将菌体悬浮在适宜的缓冲液中(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液等)，超生波或高压匀浆破菌。将破碎的菌液离心，收集上清液，弃沉淀。
将收集的上清(或再经过滤处理)上Zn2+-Sepharose F.F.金属离子螯和柱(chelating-Sepharose F.F.经适宜浓度如100mM的Zn2+SO4或者Zn2+Cl2处理)，用平衡缓冲液(如20-50mM磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液等)洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的100mM咪唑洗脱那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白。
将洗脱的那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白用透析或超滤除去咪唑，用高纯度的Enterkinase(如Invitrogen公司的EKmax)处理，条件可参照文献或Invitrogen公司的Enterkinase酶使用推荐条件。
将酶切的融合蛋白上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧还蛋白(条件同第一步纯化)，将得到的rhBNP上反相柱层析(填料可选取C4、c8、Resource等反相填料)，用含一定浓度水的Acetonitrile(含一定浓度如0.1％的三氟乙酸)梯度洗脱，可得到纯度95％以上的纯品。用适宜的方法(如真空泵抽调或者用离子交换的方法)去掉乙氰和三氟乙酸，并换成适宜的缓冲液，如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
纯化后得到的rhBNP电泳附图5实施例21、表达载体的选择选用本实验室的pTDa作为表达载体(见附图6)2、基因的设计和合成根据大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则设计了编码成熟人那希力肽序列5’_AGC CCT AAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GACCGT ATC AGC TCT TCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA(序列可根据遗传密码的通用性、简并性原则改变，但不改变氨基酸组成和排列)。同时在该序列的5’-端加上EcoRI识别序列GAA TTC和凝血酶(Thrombin)酶切位点(-LVPR-X)编码序列CTG GTG CCT CGT；在3’_端加上Sal I的识别序列GTC GAC从而形成如下的最终设计序列5’_GAA TTC CTG GTG CCT CGT AGC CCTAAA ATG GTA CAG GGT TCT GGT TGC TTC GGT CGT AAA ATG GAC CGT ATC AGC TCTTCC AGC GGT CTG GGT TGC AAA GTA CTG CGT CGT CAC TAA GTC GAC_3’。合成方法参见《分子克隆手册》冷泉港第二版2、上述合成的核酸片段插入到pTDa的EcoRI和Sal I位点形成重组质粒，转化大肠杆菌HB101，经筛选即得到高效表达基因工程菌。有关操作方法参见《分子克隆手册》冷泉港第二版(重组质粒DNA的构建示意图见附图7)3、将细菌接种到LB或其它适宜的培养基中，当工程菌长到适宜浓度时如对数中期，加入适宜浓度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可见明显的融合蛋白表达条带，见附图84、过夜的种子液，接种到发酵罐适宜的培养基(如LB、TB或其它适宜培养基中)中培养，细菌培养至适宜的程度时，加IPTG诱导培养一定时间(如3-4小时)。离心收菌，将菌体悬浮在适宜的缓冲液中(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液等)，超生波或高压匀浆破菌。将破碎的菌液离心，收集沉淀，弃上清液。
5、沉淀用8M脲溶解，稀释复性，用Thrombin进行酶切(参照酶的使用说明)。
6、酶切后用SP-FF柱层析进行纯化。
将得到的rhBNP上反相柱层析(填料可选取C4、C8、Resource等反相填料)，用含一定浓度水的乙氰(含一定浓度如0.1％的三氟乙酸)梯度洗脱，可得到纯度95％以上的纯品。用适宜的方法(如真空泵抽调或者用离子交换的方法)去掉乙氰和三氟乙酸，并换成适宜的缓冲液，如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
6、纯化后得到的rhBNP电泳附图9实施例3根据实施例1或2所得的rhBNP的理化性质测定1、N-末端15个氨基酸序列测定将上述两种方法得到的重组人那希力肽，进行N-末端测定，Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met2、分子量质谱测定采用FAB方法测定，两种方法得到的重组人那希力肽的分子量为3462，与理论预测一致。
3、生物学活性测定利用Phenylephrine与其在血管上的受体结合，产生缩血管效应，将血管的静止张力提高，并稳定维持在一定水平，然后利用rhBNP与其在血管上的利钠肽受体结合，产生对家兔胸主动脉条的扩血管效应，通过血管张力的变化，测定rhBNP的生物活性。所得到的rhBNP表现出明显的扩血管效应。
序列表<110>成都西玛生物科技有限公司<120>重组人那希力肽的生产方法<160>8<210>1<211>579<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagagccct480aaaatggtac agggttctgg ttgcttcggt cgtaaaatgg accgtatcag ctcttccagc540ggtctgggtt gcaaagtact gcgtcgtcac taactcgag 579<210>2<211>190<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Set Pro Lys Met Val Gln Gly155 160 165Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser170 175 180Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 190
<210>3<211>576<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>3atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacaa gagccctaaa480atggtacagg gttctggttg cttcggtcgt aaaatggacc gtatcagctc ttccagcggt540ctgggttgca aagtactgcg tcgtcactaa ctcgag 576<210>4<211>189<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>4Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thrl 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Asp Lys Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser155 160 165Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly170 175 180Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 189<210>5<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>5atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa420ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacaagag ccctaaaatg480gtacagggtt ctggttgctt cggtcgtaaa atggaccgta tcagctcttc cagcggtctg540ggttgcaaag tactgcgtcg tcactaactc gag 573<210>6<211>188<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>6Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His110 115 120His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu125 130 135Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp140 145 150Leu Gly Thr Asp Asp Lys Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly155 160 165Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu170 175 180Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His185 188<210>7<211>507<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>7atgtctgata aaattattca tctgactgat gattcttttg atactgatgt acttaaggca60gatggtgcaa tcctggttga tttctgggca cactggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgct120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac180atcgatcaca acccgggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggc tctggatccg gtgatgacga tgacaaggta360cctatgcatg agctcgagat cttcgaattc ctggtgcctc gtagccctaa aatggtacag420ggttctggtt gcttcggtcg taaaatggac cgtatcagct cttccagcgg tctgggttgc480aaagtactgc gtcgtcacta agtcgac 507<210>8<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
<400>8Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala20 25 30Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu35 40 45Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn50 55 60Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly65 70 75Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr80 85 90Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp95 100 105Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val110 115 120Pro Met His Glu Leu Glu Ile Phe Glu Phe Leu Val Pro Arg Ser125 130 135Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp140 145 150Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg155 160 165His16权利要求
1.一种人那希力肽的制备办法，包括以下步骤a.人工合成人那希力肽氨基酸编码区相对应的基因；b.步骤a得到的基因与表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因3′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；c.将含有步骤b的克隆有融合蛋白编码基因的表达载体重组质粒DNA转化大肠杆菌获得基因工程菌；d.该基因工程菌发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白；e.步骤d的融合蛋白，经肠激酶或者凝血酶切割后，经分离，纯化，得人那希力肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d.中的融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过肠激酶酶切识别位点-(Asp)n-Lys-连接，结构为X-(Asp)n-Lys-hBNP，其中X为硫氧还蛋白，Asp为天冬氨酸，Lys为赖氨酸，hBNP为人那希力肽，n为2、3或者4；或步骤d.中的融合蛋白中硫氧还蛋白和人那希力肽之间通过凝血酶酶切识别位点X-P2-P3-Pro-P1.连接，结构为X-P2-P3-Pro-P1-hBNP，其中X为硫氧还蛋白，P1为Arg或Lys，P2、P3为疏水性氨基酸选自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中所述结构为X-P2-P3-Pro-P1-hBNP的融合蛋白为X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP，其中X为硫氧还蛋白，其氨基酸序列见序列表8。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中所述结构为X-(Asp)n-Lys-hBNP的融合蛋白为X-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP、氨基酸序列见序列表2X-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP、氨基酸序列见序列表4或X-Asp-Asp-Lys-hBNP，氨基酸序列见序列表6其中X为硫氧还蛋白。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述结构为X-Leu-Val-Pro-Arg-hBNP的融合蛋白，其编码DNA序列见序列表7。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述结构为X-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸序列，其编码DNA序列见序列表1，X-Asp-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸，其编码DNA序列见序列表3，或X-Asp-Asp-Lys-hBNP的氨基酸序列，其编码DNA序列见序列表5，其中X为硫氧还蛋白。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述表达载体为pET32a或pTDa。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述大肠杆菌为BL21或HB101菌株。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将合格的重组人那希力肽基因工程菌接种到发酵罐中培养，采用IPTG诱导融合蛋白的表达；其中所述提取，层析，纯化步骤，对于肠激酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清的步骤，将收集的上清上Zn2+-Sepharose F.F.金属离子螯和柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的咪唑缓冲液洗脱那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白，将洗脱的那希力肽-硫氧还蛋白融合蛋白用透析或超滤除去咪唑，用高纯度的Enterkinase做酶切处理，酶切完毕后溶液上Zn2+-Sepharose F.F.柱去掉硫氧还蛋白，将得到的含那希力肽溶液上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，得那希力肽；对于凝血酶识别位点的融合蛋白包括的步骤为离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液沉淀，将收集的沉淀清用8M的脲素溶解，然后用透析的方法完全去掉脲素，将透析液直接用凝血酶酶切，将酶切后的溶液直接上SP-Sepharose F.F.离子交换柱，rhBNP被吸附在柱上，其它大部分杂质则直接穿透；将洗脱的含rhBNP的溶液上反相柱层析，用含TFA的Acetonitrile梯度洗脱，得那希力肽。
10.一种那希力肽药物组合物，其配方组成如下那希力肽0.5mg甘露醇 5～20mg柠檬酸(一水)2.1mg柠檬钠(二水)2.94mg或那希力肽0.5mg甘露醇 5～20mg磷酸二氢钠 0.93mg磷酸氢二钠 1.73mg氯化钠 10mg
全文摘要
本发明涉及一种生物活性多肽重组人那希力肽的生产方法，该方法包括以下步骤a.人工合成人那希力肽氨基酸编码区相对应的基因；b.步骤a得到的基因与适宜的表达载体上的细菌硫氧还蛋白基因3′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；c.将含有步骤b得到的融合蛋白编码基因的表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；d.该基因工程菌经发酵后，经提取，层析，纯化步骤，制备出人那希力肽－硫氧还蛋白融合蛋白；e.步骤d得到的融合蛋白经肠激酶或者凝血酶切割后，分离，纯化，获得重组人那希力肽。
文档编号A61K38/16GK1769456SQ20051007112
公开日2006年5月10日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者周裕程, 赵斌, 彭宏卫, 杨伟, 彭辉 申请人:成都西玛生物科技有限公司