专利名称：带有单链polyA尾巴的siRNA分子制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及带有polyA尾巴的siRNA分子的制备方法，包括polyA掺入方向，空间结构以及polyA长度和序列；涉及带有发明中长度和序列polyA尾巴的siRNA分子在生物医学领域中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是双链RNA介导的特异性基因沉默现象。自从最初在线虫发现该现象后，RNAi已经在多个生物种类观察到，包括果蝇、植物、真菌、哺乳动物等。双链的dsRNA在DICER家族核酸酶作用下，产生21-25bp的siRNA(short interference RNA)。siRNA分子随后解链，以单链形式与其他核酸酶和相关蛋白分子形成RISC(RNA-induced scilencing complex，RNA诱导的沉默复合体)，再进一步诱导与单链siRNA序列互补的靶mRNA的降解，达到“基因沉默”的效果。在哺乳动物中，由于大于30bp的dsRNA(double-stranded RNA，双链RNA)会诱发抗病毒的干扰素效应，而使RNAi的应用受到限制，直到Elbashir等人成功应用人工合成的21bp-22bp的siRNA在哺乳动物细胞内有效的特异抑制相关基因表达而不诱导干扰素效应。作为一种新的“基因沉默”技术，RNAi技术在随后随后几年迅速发展，主要集中于基因功能研究和病毒抑制等。
RNAi技术在哺乳动物中的应用关键是siRNA的制备与有效性。但是针对同一靶mRNA设计的不同siRNA所产生的沉默效应具有很大差异，这为siRNA设计和应用带来困难。常常为寻找有效的siRNA，浪费大量时间与资金。产生这种差异性的重要因素包括mRNA本身的高级结构影响和siRNA的可能具有的不完全匹配机制。
我们根据国内外研究进展以及自身工作基础，模拟mRNA翻译起始时的解旋机制，在siRNA上掺入一定长度单链polyA尾巴，可以有效提高siRNA对靶基因的沉默效应。
该发明可以在医药学中得到广泛应用。
发明内容
本发明目的在于提出带有单链polyA尾巴的siRNA分子的设计和制备方法，并提出该结构siRNA分子在基因沉默中的应用。
本发明通过以下技术方案实现首先设计带有T7转录启动子的siRNA的DNA转录模版，具体又分为两种方案一、T7启动子+22bp正义链，T7启动子+22bp反义链+polyA；二、T7启动子+22bp正义链+polyA，T7启动子+22bp链反义链。在体外T7RNA聚合酶的作用下分别生成正义链RNA和反义链RNA，纯化后将相等摩尔质量的正反义链退火生成具有单链polyA尾巴的siRNA分子。
本发明中应用的polyA为10-100个连续的A。
本发明中采用脂质体(lipofectamineTM2000)包裹的方法将siRNA转染入细胞。转染48小时后，检测目的基因表达情况。
本发明优点1)本发明并非从siRNA初始设计着手，而直接从任意siRNA本身结构改造入手，优化siRNA的沉默效应。
2)本发明研究了siRNA加上单链10-100个连续A尾巴的分子在RNAi中的应用，发现了随着polyA长度增加而沉默效应增强的科学结果。带有polyA尾巴的siRNA分子在生物医学中具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
图1本发明制备的siRNA和siRNA-polyA分子电泳图1、controlsiRNA 2、EGFPsiRNA 3、EGFPsiRNA-18A 4、EGFPsiRNA-36A5、EGFPsiRNA-60A图2siRNA和siRNA-polyA分子在针对GFP沉默应用中荧光观察结果图3siRNA和siRNA-polyA分子在针对GFP沉默应用中GFP的RT-PCR电泳1、EGFPsiRNA 2、EGFPsiRNA-18A 3、EGFPsiRNA-36A 4、EGFPsiRNA-60A 5、对照siRNA
具体实施例方式下面通过以GFP(绿色荧光蛋白)mRNA为靶标设计的带单链polyA尾巴的siRNA分子的具体应用来进一步描述本发明。
1.针对GFPmRNA的siRNA分子和control siRNA分子转录模版和的设计EGFPsiRNA模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCG3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTGAAGTCCCAGTCGAACGGC5′
EGFPsiRNA-18A模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGaaaaaaaaaaaaaaaaaa3′3’CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTGAAGTCCCAGTCGAACGGCtttttttttttttttttt5′EGFPsiRNA-36A模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3′3’CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTGAAGTCCCAGTCGAACGGCtttttttttttttttttttttttttttttttttttt5′EGFPsiRNA-60A模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCG-60A-3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTGAAGTCCCAGTCGAACGGC-60T-5′EGFPsiRNA-100A模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCAI3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCG-100A-3′
3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTGAAGTCCCAGTCGAACGGC-100T-5′control siRNA模板正义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCAAGAGGCTTGCACAGTGCAAA5′反义链5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGACGTGACACG TTCGGAGAATT3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTGCACTGTGCAAGCCTCTTAA5′将上述相互匹配的单链DNA(1ug/ul)于20ul体系中95℃加热5分钟，37℃放置30分钟退火形成双链DNA。
2.制备siRNA2.1单链RNA的体外转录5×转录缓冲液400mM HEPES-kOH，120mM Mgcl2，10mM spermidine，200mM DTT，rNTP25mM each，T7RNA聚合酶(10u/ul)，RNAase抑制剂(50u/ul)1)按照下述转录体系进行反应5×转录缓冲液8ulrNTP8ulT7RNA聚合酶3ulDNA模板6ulRNAase抑制剂1ulDEPCH2O14ul37℃，4小时加入4u无RNAase的DNAase，37℃消化30分钟。
2)加入1/5体积10M的醋酸铵，2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃沉淀1小时。4℃离心回收沉淀，70％乙醇清洗沉淀。
3)重复步骤2)一次，用DEPCH2O溶解沉淀，测定A260/A280，定量2.2双链siRNA的制备5×退火缓冲液100mM KCl，30mM HEPES-KOH pH 7.5，1mM MgCl2将纯化后的正义链和反义链RNA等摩尔质量混合，70℃加热5分钟，然后37℃静置30分钟，退火形成双链结构。2％琼脂糖胶电泳鉴定(图1)。
3.带单链polyA尾巴的siRNA对GFP的RNAi应用
3.1细胞培养将生长在DMEM中状态良好的MCF-7细胞用胰酶消化后重新种植于24孔板中，每孔细胞数为1×105个，500ul体积。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
3.2siRNA的转染每种siRNA的用量均为30pmol/孔，用酵母tRNA补充每孔RNA总量为1ug。与RNA共转染的GFP表达载体pEGFP-N2用量为100ng/孔。脂质体lipofectamineTM2000(invitrogen)用量为2ul/孔。
将需转染核酸用50ul无血清DMEM稀释混匀，同时也将2ul脂质体用50ul无血清DMEM稀释，再将两者合并混匀，室温静置20分钟后，加入24孔板中。细胞继续培养6小时后，更换新鲜DMEM(10％FBS)培养基。
3.3转染48小时后，在荧光显微镜(奥林巴斯IX71)下观察GFP表达状况(图2)。
3.4RT-PCR分析GFP mRNA水平3.4.1300ul TRIzol(invitrogen)直接加入24孔板中提取每孔细胞RNA。
3.4.2按照如下体系进行反转录反应总RNA500ngOligodT18(500ng/ul)1ul5×buffer4ulM-MLV反转录酶(100u/ul)；0.5ulRNAase抑制剂1ul加DEPCH2O至20ul42℃，1小时。95℃，加热10分钟灭活反转录酶。
3.4.3PCRGFP引物forward5’-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC；reverse5’-TCACCTTGATGCCGTTCTTCTGβ-actin引物forward5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′；reverse5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA5′按照如下体系进行PCR反应；10×PCR缓冲液2uldNTP(2.5mM each)1.6ul引物(mix)0.4ulTaq酶(25u/ul)0.4ul
cDNA模板2ulH2O13.6H2O95℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟2％琼脂糖电泳鉴定结果(图3)实验结果带单链polyA尾巴的siRNA分子增强了对GFP的沉默效应由图2可以得到结论随着polyA长度的增加，GFP蛋白表达水平越低。
由图3可以得出结论随着polyA长度的增加，GFP的mRNA水平越低。
总之，随着polyA长度的增加，siRNA增强了对靶基因的沉默效应。
序列表<110>军事医学科学院医学基础所<120>带有单链polyA尾巴的siRNA分子制备方法和应用<130>
<160>24<210>1<211>47<212>DNA<213>
<400>1GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCAT47<210>2<211>47<212>DNA<213>
<400>2ATGAACTTCA GGGTCAGCTT GCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC47<210>3<211>47<212>DNA<213>
<400>3GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAACT TCAGGGTCAG CTTGCCG47<210>4<211>47<212>DNA<213>
<400>4CGGCAAGCTG ACCCTGAAGT TCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC47<210>5<211>47<212>DNA<213>
<400>5GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCAT47<210>6<211>47<212>DNA<213>
<400>6ATGAACTTCA GGGTCAGCTT GCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC47
<210>7<211>65<212>DNA<213>
<400>7GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAACT TCAGGGTCAG CTTGCCGAAA50AAAAAAAAAA AAAAA 65<210>8<211>65<212>DNA<213>
<400>8TTTTTTTTTT TTTTTTTTCG GCAAGCTGAC CCTGAAGTTC CCTATAGTGA50GTCGTATTAG CATGC 65<210>9<211>47<212>DNA<213>
<400>9GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCAT 47
<210>10<211>47<212>DNA<213>
<400>10ATGAACTTCA GGGTCAGCTT GCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC 47<210>11<211>83<212>DNA<213>
<400>11GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAACT TCAGGGTCAG CTTGCCGAAA 50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 83<210>12<211>83<212>DNA<213>
<400>12
TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTCGGC AAGCTGACCC50TGAAGTTCCC TATAGTGAGT CGTATTAGCA TGC 83<210>13<211>47<212>DNA<213>
<400>13GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCAT 47<210>14<211>47<212>DNA<213>
<400>14ATGAACTTCA GGGTCAGCTT GCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC 47<210>15<211>107<212>DNA<213>
<400>15
GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAACT TCAGGGTCAG CTTGCCGAAA50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA100AAAAAAA 107<210>16<211>107<212>DNA<213>
<400>16TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT50TTTTTTTTTT CGGCAAGCTG ACCCTGAAGT TCCCTATAGT GAGTCGTATT100AGCATGC 107<210>17<211>47<212>DNA<213>
<400>17GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCAT 47<210>18<211>47<212>DNA
<213>
<400>18ATGAACTTCA GGGTCAGCTT GCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC 47<210>19<211>147<212>DNA<213>
<400>19GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAACT TCAGGGTCAG CTTGCCGAAA 50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA100AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 147<210>20<211>147<212>DNA<213>
<400>20TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 50TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT100CGGCAAGCTG ACCCTGAAGT TCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC 147<210>21
<211>47<212>DNA<213>
<400>21GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGTTCT CCGAACGTGT CACGTTT47<210>22<211>47<212>DNA<213>
<400>22AAACGTGACA CGTTCGGAGA ACCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC47<210>23<211>47<212>DNA<213>
<400>23GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGACGT GACACGTTCG GAGAATT47<210>24<211>47<212>DNA<213>
<400>24AATTCTCCGA ACGTGTCACG TCCCTATAGT GAGTCGTATT AGCATGC4权利要求
1.一种siRNA的修饰改造制备方法，其特征在于siRNA的正义链或者反义链3’端加入10-100个连续的腺嘌呤核苷酸(A)，形成带单链polyA尾巴结构的杂和siRNA分子。
2.根据权利要求1中所述方法，其中单链polyA尾巴的siRNA分子结构可以是体外直接化学合成。
3.根据权利要求1中所述方法，其中单链polyA尾巴的siRNA分子结构可以设计DNA模板体外转录制备。
4.根据权利要求1中所述方法，其中单链polyA尾巴的siRNA分子结构可以利用载体或线性DNA模板在细胞内产生。
5.根据权利要求1中所述方法，其中加入的polyA长度包含10-100中的任一数目。
6.根据权利要求1中所述方法，其中polyA尾巴可以是化学直接合成的或利用相应模板体外转录产生的。
7.权利要求1所述结构的siRNA分子在RNA干扰及其医药研究领域中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及带有polyA尾巴的siRNA分子设计和制备方法以及在以RNAi为技术基础的基因沉默中的应用。本发明通过脂质体包裹RNA分子导入MCF－7细胞，以GFP为靶标的具体实例证明了带有polyA尾巴的siRNA分子相比siRNA分子具有更强的沉默效应。本发明在基因沉默领域具有广泛应用前景。
文档编号A61K48/00GK1876815SQ200510075160
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月10日 优先权日2005年6月10日
发明者邵宁生, 李洁, 杨光, 沈倍奋, 范明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所