专利名称：一种水蛭多肽冻干粉针制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药制药技术领域，具体涉及一种水蛭多肽冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术：
水蛭(学名)又名蚂蟥，是一种生长于沼泽、湖泊或水田中的环节动物，以吸食人畜的血液为生。水蛭是较强的活血化瘀药物，据《神农本草经》记载“水蛭味咸平，主逐恶血，月闭，破血瘕集聚，无子，利水道。”欧洲的JohnHaycraft博士在1884年发现欧洲医用水蛭会分泌出某种阻止血液凝结的物质以利于水蛭吸食血液消化。在20世纪初人们发现这种物质是一种蛋白质，并命名为水蛭素(Chirudin)。它能阻止凝血酶对血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而释放，从而延缓或阻止血液的凝固。
当今世界正步入老年社会，仅我国50岁以上的人口就有3亿之多。血栓病是老年人的常见病，全世界有血栓栓塞性病人约1500万所需溶栓剂的潜在市场约20亿美元。目前在临床上还没有治疗血栓栓塞的特效药，早期的抗(溶)血栓药物有纤维蛋白原溶解酶、尿激酶、链激酶等，但它们的临床应用有几个显著的缺点，如凝血酶会高比例再生等。而小的合成抑制因子如三肽d-Phe-Pro-Arg虽然具有高选择的抗凝血酶活性，但其半衰期仅有几分钟。
重组水蛭素已经在临床应用，国内已有多家获新药证书。但是，重组水蛭素与天然水蛭素相比，却存在着天生性的缺陷。第一，由于重组水蛭素的二级结构与凝血酶不具有互补性，其作用效果远不及天然水蛭素理想；第二，由于受发酵提取环节的的影响，批与批之间产品不一致，导致质量、效果都难以保证；第三，重组水蛭素的抗凝血作用时间短，推测机制可能是由于重组水蛭素与凝血酶结合不完全，不能完全阻碍凝血酶活性中心。
天然水蛭素尽管目前研究不少，但至今为止还没有天然水蛭素药品应用于临床。其原因在于第一，天然水蛭素提取十分困难，而且受天然水蛭来源影响，提取过程中的工序复杂，提取过程中导致水蛭素失效等因素，导致获得纯化的水蛭素非常困难，不仅价格昂贵，而且没有产品，甚至连标准品都没有购到。这种情况不仅在国内如此，国外亦是如此。第二，目前文献中所称的天然水蛭素实际上绝大部分为水蛭多肽。第三，天然水蛭多肽纯化后还有不稳定现象。
申请号为95117701的专利公开了采用亲合色谱法纯化水蛭素，但在实际应用过程中，只适用于实验室，不能进一步中试放大和生产，不利于产业化推广。专利申请号为03113566的专利公开了提取纯化水蛭素的方法，但该方法在实际操作过程中因为运用有机溶剂使得环境要求特别高，并且只应用了阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF层析(凝胶过滤柱层析只是分子筛的作用)进行纯化，杂质没有分离完全，水蛭素的纯度不高，也未见该专利关于水蛭素纯度的报道。申请专利号200410037695.7的专利公开了一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法，其特征在于从鲜水蛭提取水蛭素，纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭素冻干粉针制剂，此专利所述的水蛭素冻干粉针制剂实际上也是指水蛭多肽，该制备方法得到的水蛭多肽凝血酶比活为1∶16，影响凝血酶比活的原因可能是纯化过程中使用的凝胶柱并没有达到理想的分离纯化效果，或者没有找到真正适合该多肽提取纯化的凝胶柱，所以提取纯度的原因直接影响了药理活性。
发明内容
基于上述原因，本发明在原有制备方法的基础上，纯化过程中经过多次实验对阳、阴离子凝胶色谱柱的型号及其填料进行筛选，最终优选使用两组分离纯化效果最佳的阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱C-25、C-50和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF、A-25。该制备方法简单，提取过程不使用任何有机试剂；操作过程无环境污染，省时节源，采用该纯化方法得到的水蛭多肽不但分离纯化效果好，同时收率也得到提高。采用该制备纯化方法所得到的水蛭多肽的凝血酶比活为1∶32，比原制备方法作用效果大大加强。
一、工艺制法(1)水蛭多肽冻干粉针制剂的处方组成为处方1水蛭多肽2-4重量份。
处方2水蛭多肽2-4重量份，赋形剂为96-98重量份。
(2)提取物的制备1>称取水蛭，加入纯水，洗去杂质，用电动绞肉机充分搅碎使成粗制匀浆。将粗制匀浆经胶体磨匀浆，待匀浆呈粘稠状态且无明显可见粒状物时，即停止研磨，将全部匀浆立即分装于经煮沸消毒的离心瓶中，于-20±5℃冰柜冻结24-36小时，再用水温为25±5℃的振荡水浴中解冻，反复冻、融5-7次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，收集上清液；2>将上清液用截留分子量为8000-12000的中空纤维膜进行超滤，压力为0.1MPa，双向流TWT式，外压式分离，当分离至截留液体积基本达到原溶液体积的1/4-1/3时，加入1/3截留液体积的注射用水，继续超滤，直至超滤液体积基本达到上清液量时停止超滤，超滤结束后，将超滤液分装到离心瓶中，冻存于-20±5℃冰柜中。
3>将超滤液用缓冲液调pH值为5.0-7.0后，分别经过阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱C-25、C-50和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF、A-25进行分离纯化阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱C-25、C-50的流动相用缓冲液调pH至6.0-7.0进行洗脱，阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF、A-25的流动相用缓冲液调pH至7.0-8.0进行梯度洗脱；在紫外检测下，自动收集具有抗凝血酶活性部分的洗脱液，至紫外检测器检测不到吸收为止；将各个单一组分分别进行抗凝血酶活性检测，将有活性的单一组分合并后除菌过滤，滤液用反渗透膜机浓缩脱盐，或用凝胶柱脱盐并进一步纯化，并留样检测，得到水蛭多肽半成品。
(3)冻干粉针剂的制备将上述水蛭多肽半成品与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂。
用于本发明提取水蛭多肽的水蛭品种为蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)、亚洲水牛蛭(菲牛蛭)、日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)、柳叶蚂蝗(Wh.acranulatc Whitman)、欧洲医用水蛭、印度水蛭、宽体金线蛭中的任何一种。
二、检测分析采用高效液相色谱法对水蛭多肽进行检测。
1.实验仪器waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器；色谱柱日本TOSOH TSK2000SW 7.5×300；色谱条件工作站millennium chromatograph；波长260nm；流动相0.01mol/L、pH值6.68的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准委员会编，化学工业出版社，P13-14配制)。
2.实验药物水蛭多肽样品为本发明工艺制备的水蛭多肽(广州天之骄药物开发有限公司)。
3.样品制备取样品，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。
4.上样取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。
5.结果对五批样品进行测定，采用归一化法计算水蛭多肽的纯度为98.4％-99.9％。
三、药理实施例实施例一水蛭多肽比活性的检测1.实验原理天然水蛭多肽的活性检测国家尚未公布标准的检测方法，根据凝血酶活性的检测方法(中国生物制品规程2000年版附录1)，依据水蛭多肽与凝血酶是1∶1的比例结合，消耗一个凝血酶单位，相等于一个抗凝血单位(ATU)的原则，采用试管法(连续稀释法)检测水蛭多肽的抗凝血单位的效价。
2.实验材料5g/L纤维蛋白原的生理盐水溶液，注射用生理盐水(广州天之骄药物开发有限公司)冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所购买，每瓶含量为500IU，用时用生理盐水稀释至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待测样品水蛭多肽样品为本发明工艺制备的水蛭多肽(广州天之骄药物开发有限公司提供)4.检测方法取10×80mm试管8支，在每支试管中加入生理盐水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待测样品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混匀后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，将多余的0.2ml混合液废弃，此时各试管都为0.2ml，其浓度稀释比例依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素，作为试验对照，加样结束后，放到37℃水浴使样品与凝血酶作用5-10min，再于各试管中加入5g/l纤维蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，观察记录1-24小时结果，并进行计算。计算方法为发生凝固或沉淀的试管为无抗凝血酶活性(阴性)，不凝固或无沉淀产生的试管为具有抗凝血酶活性。
5.结果经过计算本发明的水蛭多肽的效价比为1∶32。
6.说明
(1)由于目前文献报导中对于水蛭多肽的效价大部分应用检测仪器进行检测，以5分钟为判定终点。我们的研究发现，5分钟测定有抗凝活性，但30分钟至4小时仍可能发生凝固，至24小时仍能保持抗凝血酶活性。因此本发明的检测结果是以37℃、24小时结果为准。
(2)研究表明24小时的检测结果1IU/mg相当于仪器检测5分钟检测结果80IU/mg。
实施例二水蛭多肽制剂对小鼠凝血时间的影响。
1.实验药物水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)；本发明水蛭多肽冻干粉针剂(广州天之骄药物开发有限公司提供)2.实验动物昆明种小鼠，体重18～22g，动物雌雄兼用，随机分为4组。
3.实验方法实验用小鼠30只，动物雌雄兼用，随机分为3组；生理盐水作为空白对照组，水蛭注射液作为阳性对照组。于末次给药后1h用玻璃毛细管插入小鼠眼内球后静脉丛，深约4～5mm轻轻转动再缩回，自血液流入管内开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌面上，每隔30s折断两端毛细管约0.5cm，并缓慢向左右拉开。观察折断处是否有血凝丝，至血凝丝出现为止，所历时间即为血凝时间，毛细管两端数据的平均值即为该鼠的血凝时间，结果见表1。
表1 水蛭多肽冻干粉针剂对小鼠凝血时间的影响(x±s)
注与空白对照组比较*P＜005，与阳性对照组比较**P＜001；结论本实验结果表明，水蛭多肽制剂可延长小鼠凝血酶时间，并且明显优于水蛭注射液阳性对照组。提示水蛭多肽制剂具有较好抗凝血的作用，为其治疗血栓性疾病提供了可靠的实验依据。
实施例三水蛭多肽制剂对大鼠静脉血栓的影响1.实验药物水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)；本发明水蛭多肽冻干粉针剂(广州天之骄药物开发有限公司提供)2.实验动物Wistar大鼠，体重200～300g，动物雌雄兼用。
3.实验方法取大鼠30只，随机分为3组，生理盐水作为空白对照组，水蛭注射液为阳性对照组。实验组与对照组连续ig给药3d，于末次给药后，立即麻醉大鼠，开腹分离下腔静脉，在左肾静脉下方用线结扎，2h后，于结扎处2cm处结扎血管，阻断血流，取出血栓，称湿重，结果见表2。
表2 水蛭多肽冻干粉针剂对大鼠静脉曲栓的影响(x±s)
注与空白对照组比较*P＜005，与阳性对照组比较**P＜001；结论通过以上药理实验表明，本发明的水蛭多肽制剂可抑制大鼠静脉血栓形成，具有很好的溶栓作用，对血栓具有较强溶解作用，与市售同类品种比较具有更强的药理作用。
实施例四水蛭多肽制剂对家兔体外血栓长度、干重的影响1.实验药物水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)；本发明水蛭多肽冻干粉针剂(广州天之骄药物开发有限公司提供)2.实验仪器DS-87BChandler氏体外血栓形成仪(镇江美达生物仪器有限公司产品)3.实验动物大耳白兔，雄性，2.0～2.5kg(广州天之骄实验动物中心提供)4.实验方法雄性大耳白兔10只，随机均分组给药组和阳性对照组(水蛭注射液)。家兔自耳缘静脉注射给药(0.5mg/kg)，给药前及给药后5、15、30、60及120min分别自心脏取血1.5mL，不加抗凝剂，弃去初始几滴，迅速将1mL血注入已预温(37℃)的塑料管中，管连成环状，置Chandler氏体外血栓形成仪转盘上，立即启动转盘，以12r/min旋转10min，仪器自动停转，立即取出塑料环，小心取出血栓，用滤纸吸去残血，测量血栓长度，64℃烘干30min后称量其干重。以药前为基准，计算给药后各时间点的栓长和血栓干重的抑制百分率(％)，结果见表3，表4。
表3 水蛭多肽冻干粉针剂对家兔体外血栓长度的影响(x±s，n＝5)
注与阳性对照组比较*p＜0.05结论本实验结果表明，本发明的水蛭多肽制剂可抑制家兔静脉血栓形成，具有很好的溶栓作用，与水蛭注射液比较有显著性差异，对血栓具有较强溶解作用。
表4 水蛭多肽冻干粉针剂对家兔体外血栓干重的影响(x±s，n＝5)
注与阳性对照组比较*p＜0.05结论本实验结果表明，本发明的水蛭多肽制剂可抑制家兔静脉血栓形成，具有很好的溶栓作用，与水蛭注射液比较有显著性差异，对血栓具有较强溶解作用。
四、制备实施例实施例1(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)5.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-25℃冰柜冻结30小时，再用水温为30℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-25，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为372克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例2(1)取日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-20℃冰柜冻结24小时，再用水温为25℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，反复冻、融6次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为8000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.10(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-50，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为712克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例3(1)取柳叶蚂蝗(Wh.acranulatc Whitman)6.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-22℃冰柜冻结28小时，再用水温为28℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为11000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.06(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-25，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱A-25，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为410克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例4(1)取欧洲医用水蛭6.5公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-25℃冰柜冻结24小时，再用水温为30℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.06(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-50，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱A-25，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为410克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例5
(1)取印度水蛭7.5公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-25℃冰柜冻结24小时，再用水温为25℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.0(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-25，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用凝胶柱脱盐并进一步纯化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为486克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例6(1)取亚洲水牛蛭(菲牛蛭)10.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结30小时，再用水温为25℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-25，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用凝胶柱脱盐并进一步纯化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为726克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例7(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-25℃冰柜冻结32小时，再用水温为20℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为12000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.0(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-50，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱FF，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用凝胶柱脱盐并进一步纯化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为712克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
实施例8(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)5.9公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-24℃冰柜冻结36小时，再用水温为30℃的振荡水浴中解冻，再次冻结，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为9000的中空纤维膜进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.06(20℃)的溶液；将浓缩的透过液磷酸盐缓冲液调pH值6.8，离子强度为0.01mol/l，以10ml/min通过阳离子葡聚糖凝胶色谱柱C-25，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调pH值7.4，以10ml/min通过阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱A-25，分别用PH值为7.2、7.0、7.0的缓冲液进行梯度洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用凝胶柱脱盐并进一步纯化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽为398克)；(2)冻干粉针剂的制备将提取物与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂1000支。
权利要求
1.一种水蛭多肽冻干粉针制剂，其特征在于该制剂是以水蛭多肽2-4重量份为活性成分的注射制剂；其特征还在于水蛭多肽的凝血酶比活为1∶32。
2.权利要求1所述的水蛭多肽冻干粉针制剂，其特征在于提取过程不使用任何有机溶剂，纯化过程中应用的凝胶柱阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱。
3.一种水蛭多肽冻干粉针制剂的制备方法，其特征包括以下步骤(1)提取物的制备1>称取水蛭，加入纯水，洗去杂质，用电动绞肉机充分搅碎使成粗制匀浆。将粗制匀浆经胶体磨匀浆，待匀浆呈粘稠状态且无明显可见粒状物时，即停止研磨，将全部匀浆立即分装于经煮沸消毒的离心瓶中，于-25±5℃冰柜冻结24-36小时，再用水温为25±5℃的振荡水浴中解冻，反复冻、融5-7次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，收集上清液；2>将上清液用截留分子量为8000-12000的中空纤维膜进行超滤，压力为0.1MPa，双向流TWT式，外压式分离，当分离至截留液体积基本达到原溶液体积的1/4-1/3时，加入1/3截留液体积的注射用水，继续超滤，直至超滤液体积基本达到上清液量时停止超滤，超滤结束后，将超滤液分装到离心瓶中，冻存于-20±5℃冰柜中；3>将超滤液用缓冲液调pH值为5.0-7.0后，分别经过阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱进行分离纯化阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱的流动相用缓冲液调pH至6.0-7.0进行洗脱，阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱的流动相用缓冲液调pH至7.0-8.0进行梯度洗脱；在紫外检测下，自动收集具有抗凝血酶活性部分的洗脱液，至紫外检测器检测不到吸收为止；将各个单一组分分别进行抗凝血酶活性检测，将有活性的单一组分合并后除菌过滤，滤液用反渗透膜机浓缩脱盐，或用凝胶柱脱盐并进一步纯化，并留样检测，得到水蛭多肽半成品。(2)冻干粉针剂的制备将水蛭多肽半成品与酪氨酸混匀，用注射用水溶解，调pH值，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，冷冻干燥，得到冻干粉针剂。
4.根据权利要求1、2或3所述的水蛭多肽，其中水蛭品种为选自蚂蝗、亚洲水牛蛭、日本医蛭、柳叶蚂蝗、欧洲医用水蛭、印度水蛭、宽体金线蛭中的任何一种。
5.根据权利要求3的一种水蛭多肽冻干粉针制剂的制备方法，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的一种。
6.权利要求3的一种水蛭多肽冻干粉针制剂的制备方法，所述的阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱是sephadexC-25、sephadexC-50中的一种。
7.权利要求3的一种水蛭多肽冻干粉针制剂的制备方法，所述的阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱是sepharoseF.F、sepharoseA-25中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种水蛭多肽注射制剂及其制备方法，其特征在于水蛭多肽提取过程采用水为溶剂，纯化过程单独使用两组效果最佳的阳离子交换葡聚糖凝胶色谱柱和阴离子交换琼脂糖凝胶色谱柱。纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭多肽注射制剂；其特征还在于提取过程不使用任何有机试剂；该制备方法简单，操作过程无环境污染，省时节源并且使水蛭多肽的纯度大大提高，同时抗凝血活性得到了显著的提高，采用该纯化方法得到的水蛭多肽的凝血酶比活为1∶32。
文档编号A61K38/17GK1891234SQ20051008031
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月1日 优先权日2005年7月1日
发明者张晴龙 申请人:张晴龙