专利名称：RanBPM在神经系统中的重要作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鼠源性基因RanBPM(微管中心与Ran结合的蛋白)能够与神经营养素受体TrkA、p75NTR相互作用，并将这两种受体偶联，而且也能够与一种参与神经递质释放的蛋白snapin相互作用，利用该发现可以对神经性疾病的分子机制进行研究，并且开发出治疗神经性疾病的方法和药物。
背景技术：
虽然目前人类对于科研的探索已获得了突飞猛进的发展，但是对于一些疾病尤其是神经系统疾病的致病分子机制仍不甚了解。帕金森症、阿尔茨海默症(老年痴呆症)及抑郁症都是与神经递质释放紊乱有关的疾病，为了进一步了解上述疾病的发病机制，从而找到治疗这种疾病的方法或药物，我们研究了与神经递质释放有关的受体及其相关蛋白。
Trks和p75NTR是神经元细胞上的两类膜受体，具有调节突触的功能。对交感神经元和心肌细胞间突触传递的研究表明，在这一系统中，单个的神经元细胞会合成释放去甲肾上腺素和乙酰胆碱，两者使肌细胞产生截然相反的效应。NGF可以提高去甲肾上腺素的释放水平，这一效应依赖TrkA的存在，因此传统上具有使用神经营养素治疗阿尔茨海默症的愿望，但是由于其太多的副作用尔使该治疗方案的使用受到很大的限制。p75NTR通常在发育阶段中高度表达，到了成年期，则仅在某些病理条件下，神经元细胞会重新表达p75NTR，例如机械损伤、病灶部位的局部缺血、轴突切开、中风、癫痫等，表达量与发育阶段相当。另外，在阿尔茨海默症(AD)病人的大脑皮层中观察到p75NTR的重新表达，通过p75NTR所激活的神经酰胺途径可以加速阿尔茨海默症的进程。
RanBPM是一种广泛表达而又高度保守的蛋白，它最初是以蛋白Ran的一种结合性蛋白发现并参与微管的成核现象而命名。利用SMART(Simple ModularArchitecture Resaerch Tool)蛋白-结构域查询软件发现，RanBPM含有三个已被公认的保守性结构域，它们分别是SPRY，LisH，CTLH。LisH-CTLH结构域参与微管的动态变化、细胞的迁移、核运动以及染色体的分离；因此含有多种保守结构域的RanBPM可能会与多种蛋白相互作用。
神经递质的释放是神经元调节其它组织行使其功能的主要方式。该过程涉及一系列突触囊泡与突触前膜的相互作用以及Ca2+依赖性的膜融合的过程。然而通过什么机制使Ca2+引发膜的融合目前还不太清楚，在众多参与神经递质释放的信号分子中，研究最多的还是SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattached protein receptors)核心复合物以及突触结合膜蛋白(Synaptotagmin)。SNARE对于囊泡的运输及融合过程来讲是必需的，该复合物中含有多种突触囊泡相关蛋白如小突触泡蛋白(synaptobrevin)/VAMP及胞膜相关蛋白突触融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25(突触小体相关蛋白synaptosome-associated protein-25)。Snapin是一种广泛存在于脑组织(包括皮层、小脑、海马、及脊索等)分子量约为15Kda的囊泡相关性的膜蛋白。该蛋白氨基端含有疏水性的跨膜区及羧基端含有一个coiled-coil结构，提示可能参与蛋白-蛋白之间的相互作用。突触结合蛋白是突触囊泡膜上的Ca2+结合蛋白，也是神经递质释放过程中公认的Ca2+感受器，它与SNARE复合物的相互作用可以引发囊泡在神经递质的释放过程中最后的膜融合过程。最初认为Snapin能够通过与SNAP-25相互作用而阻止SNARE复合物与突触结合蛋白的结合，从而影响神经递质的释放。
在研究神经递质释放的过程中，受体可以将外界信号传入，而受体在胞内的运输以及突触囊泡的运输都离不开RanBPM的作用，从而为神经系统疾病的研究提供了靶位点。
发明内容
本发明涉及一种鼠源性的蛋白RanBPM能够与神经营养素受体TrkA、p75NTR相互作用，同时也能够与snapin相互作用，为研究神经递质释放紊乱有关的疾病的治疗方法或开发药物提供了靶点。
图1RanBPM能够与TrkA相互作用图2RanBPM能够将TrkA与p75NTR偶联图3TrkA与snapin相互作用具体实施方式
本发明的一方面提供了一种在RanBPM作用下的受体TrkA、p75NTR信息交流的支架，首先是RanBPM能够与TrkA胞内区相互作用，该结果已被酵母双杂交、GST pul-down及Co-IP和荧光共振能力转移所验证，然后通过免疫共沉淀技术证明RanBPM能够将TrkA、p75NTR连接成三聚体复合物，为研究受体信号传导、疾病的分子机制提供了有利的平台。
同时上述三种蛋白可以同时与调节神经递质释放的蛋白snapin相互作用，为研究与神经递质释放紊乱的神经性疾病如阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的分子机制提供了明确的方向，也为这些疾病的治疗方法的研究或药物的开发提供了靶点。
以下将参照以下实施例进一步描述本发明实施例1酵母双杂交实验验证TrkA与RanBPM的相互作用利用氯化锂转化方法，将pAS2-1-TrkAICD与pACT2-RanBPM两种载体转化酵母Y190，涂布于SD/-Trp-Leu-his+3-AT固体培养基上，10天后有阳性克隆出现，直径大于2mm，呈白色，茁壮生长。转接到同样培养基上，生长3-4天后，检测β-半乳糖苷酶活性为阳性，表明在酵母体内TrkAICD与RanBPM能够相互作用。
实施例2免疫共沉淀技术证明TrkA与RanBPM的相互作用并进行定位将共表达的细胞裂解上清中加入抗-TrkA(图1A)或抗myc(图1B)孵育后，protein A捕获免疫复合物，SDS-PAGE电泳后，Western检测，抗myc(图1A)或抗-TrkA(图1B)杂交，分别可以检测到RanBPM与TrkAICD的存在，而对照组则检测不到，证明TrkAICD可以与RanBPM存在同一个复合物中，由此而证明两者可以相互作用。
实施例3免疫共沉淀技术证明TrkA、p75NTR与RanBPM的相互作用经研究证明了RanBPM与TrkA可以相互作用，而且是通过SPRY结构域，前期的实验已证明RanBPM可以同p75NTR结合，但作用的位点不是SPRY区，为了了解RanBPM是否可以作为一种支架将两种受体偶联，将TrkAICD，RanBPM，p75ICD三种蛋白的真核表达载体共同转染293T细胞，分别用抗TrkA、p75ICD、c-myc三种抗体捕获已表达这三种蛋白的细胞上清，将用protein A捕获的免疫复合物SDS-PAGE分离后，Western-blot检测，结果发现(图2)抗TrkA免疫复合物中，有RanBPM，p75ICD两种蛋白的存在；而TrkAICD，RanBPM两种蛋白也存在于抗p75抗体的免疫复合物中，同时在抗c-myc的免疫复合物中也存在TrkAICD、p75ICD这两种蛋白。由此可证明TrkAICD，RanBPM，p75ICD三种蛋白可以形成三聚体复合物，即RanBPM可以将TrkA、p75这两种受体偶联在一起。
实施例4酵母双杂交证明TrkA、p75NTR及RanBPM能够与snapin相互作用将pAS2-1-p75ICD及pAS2-1-RanBPM分别与pACT2-snapin共同转化Y190，发现TrkAICD-snapin、p75ICD-snapin、RanBPM-snapin在SD/3-+3-AT培养基中生长，而且其半乳糖苷酶活性呈阳性，并且在随机的阳性克隆(pAS2-1-TrkAICD与pACT2-snapin)提取酵母质粒DNA，以基因设计引物，通过PCR的方法得到TrkAICD及snapin的基因片段，以同样的方法在转化其它基因的克隆中也扩增出p75ICD-snapin、RanBPM-snapin的基因片段，由此表明TrkA、p75、RanBPM与snapin在酵母体系中可以相互作用。
实施例5免疫共沉淀证明TrkA能够与snapin相互作用利用如上免疫共沉淀的方法，将共表达的细胞裂解上清用抗TrkA抗体捕获TrkAICD，随后通过Western-blot检测，在该免疫复合物中存在抗c-myc抗体杂交的蛋白，大小与input中snapin的大小一直，而在对照组中则没有该蛋白的存在(图3)，表明snapin能够与TrkAICD共同沉淀下来，也就是两者能够相互作用。
实施例6TrkA与RanBPM相互作用后可以激活NFκB途径转染pCDNA-TrkA与pCMV-MYC-RanBPM的293T细胞在没有NGF刺激时能够激活NFκB，但在有NGF刺激时，该途径受到抑制，说明该途径与细胞的增殖有关，与肿瘤的发生有密切关系。
权利要求
1.RanBPM与受体TrkA、p75所形成的信息平台在阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的研究。
2.RanBPM、TrkA、p75与snapin相互作用后在阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的研究。
3.以RanBPM、TrkA、p75与snapin为靶向的阿尔茨海默症、帕金森症治疗方法和药物的开发。
4.以RanBPM、TrkA、p75与snapin为靶向的肿瘤的治疗方法和药物。
全文摘要
本发明涉及鼠源性基因RanBPM(在微管中心与Ran结合的蛋白)能够与神经营养素受体TrkA、p75NTR相互作用，并将这两种受体偶联，而且也能够与一种参与神经递质释放的蛋白snapin相互作用，利用该发现可以对神经性疾病的分子机制进行研究，并且开发出治疗神经性疾病的方法和药物。
文档编号A61P25/00GK1899602SQ200510085219
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者苑玉和, 黄秉仁, 陈虹, 王欣 申请人:中国医学科学院基础医学研究所