专利名称：大肠杆菌在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌的医疗用途，具体地说涉及大肠杆菌在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，传统的肿瘤治疗模式如手术切除，放、化疗等，具有肿瘤靶向性差、对病人正常组织损坏大、易复发、副反应大等缺点。目前迫切需要一种新的技术或方法，能正确的区分肿瘤组织与正常组织，达到特异的识别和杀伤肿瘤细胞的目的。随着对细菌的深入认识及现代分子生物学的进展，人们发现，很多细菌如梭状芽胞杆菌、双岐杆菌、霍乱弧菌、利斯特菌、沙门菌及大肠杆菌等具有特异的聚集于肿瘤组织，并可在肿瘤组织中生长繁殖的特性，有些细菌还具有抑制肿瘤生长的作用(Pawelek J.M，Low K.B，Bermudes D.Bacteria as tumor-targeting vectors.LancetOncol，2003，4548-556.)。利用这一特性，掀起了一场关于细菌在肿瘤靶向治疗中应用的重大变革。细菌应用于肿瘤的靶向治疗具有不可比拟的优势1.在肿瘤组织内，细菌主要聚集于肿瘤细胞外，对抗生素较为敏感，可以较快地清除，较为安全。
2.细菌的基因组很大，可以快速表达具有肿瘤治疗作用的目的基因，使其在特定部位发挥更特异、更强的抗肿瘤作用，同时肿瘤部位的细菌可以生长繁殖，使得效应基因能在肿瘤部位持续表达，从而发挥更大、更持久的抑瘤效果。
3.某些细菌无论是在同种基因的肿瘤模型还是异种肿瘤移植物模型，均有较好的肿瘤定位效果，且其在肿瘤组织积聚的量大，即较少的细菌定位于肿瘤组织便可在此生长繁殖。
4.很多细菌经过遗传改造后，如某些细菌的减毒株、携带某些肿瘤治疗基因的细菌等均未改变其肿瘤靶向性，且也未改变其对抗生素的敏感性，为将细菌应用于肿瘤治疗提供了更为广阔的前景。
5.细菌用于肿瘤治疗有多种注菌方式，如静脉注射、腹腔内注射、瘤内注射等，为今后细菌应用于肿瘤治疗提供更多的选择。
6.细菌不仅能定位于原发肿瘤部位，也可定位于肿瘤的转移灶，故细菌不仅能作为肿瘤治疗的载体，也可用于肿瘤的早期发现及诊断。
目前，用于肿瘤治疗主要有两大类细菌，一类是厌氧菌属的芽胞杆菌和双岐杆菌，另一类是兼性厌氧菌的沙门氏菌。芽胞杆菌是发现较早，且研究也较多的细菌，芽胞杆菌的亲肿瘤性与肿瘤大小有一定的关系，即只有肿瘤长到一定大小后，芽胞杆菌才能定位于肿瘤内，且大多数病人的肿瘤没有减小的迹象。芽胞杆菌的毒性及缺乏临床效果影响了其在抗肿瘤方面的应用。直到上世纪90年代，利用芽胞杆菌的亲肿瘤性，将其作为抗肿瘤效应基因治疗的载体取得了良好的成效，但其毒性作用仍然是其应用于临床治疗的主要障碍(Liu SC，Minton NP，Giaccia AJ，et al.Anticancer efficacy of systemically deliveredanaerobic bacteria as gene therapy vectors targeting tumor hypoxia/necrosis.Gene Ther，2002，9291-296.)。
双岐杆菌属革兰阳性厌氧菌，是一类无毒且安全的细菌。研究者们发现，将双岐杆菌以静脉注射的方式注入荷瘤小鼠体内时，可发现肿瘤组织内有细菌聚集，且其在肿瘤组织与在正常组织中量之比＞1000∶1，但未发现有肿瘤减小或消退的现象，且其只能在直径1.5cm或更大的肿瘤组织内聚集，而在小肿瘤内同样剂量的细菌则无法聚集，提示双岐杆菌用于肿瘤治疗也依赖于肿瘤大小，有一定局限性。但其作为肿瘤治疗的载体仍然吸引着众多研究者的注意并取得了良好的实验结果(Geng-Feng Fu，Xi Li，Ya-Yi Hou，et al.Bifidobacteriumlongum as an oral delivery system of endostatin for gene therapy on solid liver cancer.CancerGene Therapy，2005，12133-140.)。
沙门氏菌属革兰阴性杆菌，是近十年内新发现的具有肿瘤靶向性的一类兼性厌氧菌，其同样具有肿瘤定位能力，但由于其强毒性作用，故人们积极探索寻求其减毒株或弱毒株，使其更好地用于肿瘤治疗。VNP20009是一类敲除了msbB和purI基因的沙门氏菌，其毒性大为减弱，且保留了其肿瘤靶向性。Zhao Ming等研制了一种营养缺陷型沙门氏菌，该种弱毒株保留了肿瘤靶向性，当瘤内注射沙门氏菌时，小鼠的肿瘤组织完全消退，表明了减毒性沙门氏菌在抗肿瘤方面的应用前景(Zhao Ming，Yang Meng，Li Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonellatyphimurium，PNAS，2005，102755-760.)。减毒性沙门氏菌作为某些效应基因如肿瘤坏死因子、血管生成抑制素、自杀基因等的载体用于肿瘤靶向治疗已有不少报道，且在动物实验取得了喜人成果(Ivan King，David Bermudes，Stanley Lin，et al.Tumor-targeted salmonella expressing cytosine deaminase as an anticancer agent.Human GeneTherapy，2002，223261-3266；)，但减毒了的沙门氏菌并非完全无毒，其应用于临床还有一定的限制。
从以上可以看出，芽胞杆菌、双岐杆菌和沙门氏菌用于肿瘤治疗各有其本身的不足，所以目前迫切需要寻找一类即无毒又不受肿瘤大小限制，同时又具有良好肿瘤靶向性的细菌用于肿瘤治疗。
大肠杆菌属革兰阴性杆菌，是寄生于人类和动物体内的正常菌群。目前人工改造的大肠杆菌工程菌主要有DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等，它们的基因组稳定，遗传背景清楚，更重要的是其无毒，广泛用于基因工程的各个方面，如作为克隆载体或是某些效应基因的表达载体等。
大肠杆菌也像其它细菌一样，具有肿瘤靶向性，当静脉注射细菌于荷瘤小鼠体内时，在注菌的第二天，即可在肿瘤组织中发现有细菌的存在，研究者观察到该现象，并未公布有关大肠杆菌的详细数据。(Yong A Yu，ShahrokhShabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visulization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.Nature Biotechnology2004；22313-21)。目前也尚无关于利用大肠杆菌的肿瘤靶向性发挥抗肿瘤作用，以及大肠杆菌是否具有抑制肿瘤生长作用的报道。
发明内容
为了解决目前存在的缺少适合用于肿瘤诊断或治疗的细菌问题，本发明公开了大肠杆菌在制备肿瘤诊断或治疗药物的用途。
本发明通过实验发现大肠杆菌可以特异地集聚于动物肿瘤组织，还发现多次注射大肠杆菌可以抑制肿瘤生长。
本发明中大肠杆菌可以为大肠埃希菌属的各个种及其在此基础上经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌如DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等。
本发明中肿瘤可以为各种实体瘤，如鼠黑色素肿瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纤维肉瘤细胞HT1080、鼠膀胱肉瘤细胞MB-49及鼠神经胶质瘤C6。
本发明用途中肿瘤诊断是通过大肠杆菌聚集于肿瘤组织实现的，所述肿瘤组织可以为肿瘤原发灶，也可为肿瘤转移灶。本发明用途中的肿瘤治疗是通过大肠杆菌聚集于肿瘤组织，并抑制肿瘤组织的生长实现。
本发明用途中用于肿瘤治疗大肠杆菌的剂量是5×109cfu/次/kg体重，每周一次，连续三次，用于肿瘤诊断大肠杆菌的剂量是5×108cfu/kg体重。本发明用途中肿瘤诊断或治疗药物给药途径为静脉给药。
本发明的用途通过以下实验验证一、动物肿瘤模型及转移瘤模型的建立首先进行肿瘤细胞培养，其中肿瘤细胞包括B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49、HT1080、C6神经胶质瘤、BEL7405及SMMC7721等各种实体瘤细胞。培养后进行细胞计数，制备成一定浓度细胞悬液。
然后进行肿瘤模型及转移瘤模型的建立，将制备的肿瘤细胞悬液接种动物，其中肿瘤模型的动物可以为BALB/C小鼠及裸鼠等，接种方式为右后腿皮下注射，肿瘤转移模型动物可以为裸鼠等，接种方式为尾静脉注射。
二、发光细菌的构建及检测首先制备发光细菌按常规方法制备感受态大肠杆菌，将质粒pXen-1(luxABCDE)(FDrancis KP，Joh D，Bellinger-kawahara C，et al.Monitoring bioluminescentstrphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct.InfectImmun；2000，68(6)3594～3600.)转化到大肠杆菌，涂板后应用IVIS成像系统观察克隆的发光情况及效率。将发光效率较高的单克隆菌于带有抗性的培养基中培养，收集细菌，并制成一定浓度的细菌悬液，注菌于正常及荷瘤动物，可以采用尾静脉注射等。
三、细菌在动物体内分布特征及肿瘤定位特性细菌在正常小鼠中的分布特点。静脉注射细菌于正常小鼠，可见细菌先分布于肺，然后渐向肝脏聚集，最终定位于肝脏。动物尸检结果也显示细菌进入动物体内短时间主要聚集于肺脏与肝脏，随着时间延长，细菌只分布于肝脏。
细菌在荷瘤小鼠中的分布特点。静脉注射细菌于荷瘤小鼠，注菌之初，细菌在荷瘤小鼠体内的分布与在正常小鼠中的分布类似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的肿瘤部位即有光的存在。解剖小鼠结果提示细菌全部分布在肿瘤部位。对于较大的肿瘤，细菌主要分布于肿瘤组织的周边，说明大肠杆菌主要聚集于氧份比较丰富的肿瘤区域，且较少的细菌也可在肿瘤中定位。
四、细菌对肿瘤生长的作用通过一次注菌及多次注菌于荷瘤动物，观察大肠杆菌本身对肿瘤生长的作用。结果显示动物肿瘤体积的增长变化在一次注菌组与对照组间无明显差别，但在多次注菌组与一次注菌组间或是与对照组间则差别明显。说明多次注菌可以抑制肿瘤的生长。
五、细菌在转移瘤发现中的应用按上述方法构建动物转移瘤模型，动物可以采用裸鼠等，肿瘤可以为黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等，通过腹腔注射底物，活体成像，判断转移瘤模型是否构建成功。然后在构建成功的动物模型中尾静脉注射大肠杆菌，观察到大肠杆菌具有定位于转移瘤的能力。
大肠杆菌应用于肿瘤的诊断及治疗，除具有细菌本身的优势外，还有其独有的特点首先，大肠杆菌属胞外菌，比胞内菌更易被抗生素清除；其次，非致病性大肠杆菌是无毒的细菌，不须先对细菌进行减毒或弱毒改造即可应用；再次，对大肠杆菌的基因组了解比较全面，改造起来更容易；最后，大肠杆菌是兼性厌氧菌，即可在肿瘤的坏死区域聚集，也可在氧性丰富的部位聚集，在肿瘤的选择方面不受肿瘤大小及肿瘤内是否缺氧的限制。本发明通过实验首次证明了大肠杆菌在有肿瘤生长的动物体内，对肿瘤组织，包括转移瘤具有特异性定位特点，并能抑制肿瘤的生长。可以利用大肠杆菌对肿瘤的靶向性及其对肿瘤生长的抑制作用，加上药学上可接受的辅料，以保持大肠杆菌的活性及稳定性，用来制备用于肿瘤诊断或治疗的药物，具有非常广阔的市场前景。
图1为发光细菌在正常小鼠中的分布特点。其中A图是尾静脉注射E.coliDH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分钟后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的双肺，B图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的肝脏，其他大肠杆菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情况与此相类似。
图2为发光细菌在荷瘤小鼠中的分布特点。其中A图是尾静脉注射E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天时的成像情况，B图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天时的成像情况，圈中所示的是小鼠肿瘤接种的部位，即肿瘤接种于小鼠右后腿皮下，发光的区域是发光细菌聚集于肿瘤组织，其他大肠杆菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他实体瘤小鼠中的分布情况与此相类似。
图3为尾静脉注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠13天后小鼠的解剖情况。其中A图是不同器官的曝光情况1-肝脏，2-肺脏，3-心脏，4-肾脏，5-脾脏，6-胃及肠，曝光时间300s，所有器官未见有发光细菌的存在。B图是整个肿瘤的曝光情况，曝光时间30s，可见有大量发光细菌的存在。C图是一切为二的肿瘤曝光情况，曝光时间30s，从C图可以看出发光细菌主要存在于肿瘤的边缘区域，在肿瘤中间的坏死区域则存在的很少。其他大肠杆菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他实体瘤小鼠中的情况与此相类似。
图4为大肠杆菌DH5α对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。大肠杆菌DH5α对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与此相类似。
图5为大肠杆菌BL21对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。大肠杆菌BL21对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与此相类似。
图6为大肠杆菌JM109对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。大肠杆菌JM109对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与此相类似。
图7为E.coli DH5α定位于裸鼠黑色素瘤肺转移灶。其中A图是取自注菌四天后的黑色素瘤转移模型裸鼠的肺脏，可见肺上布满了大大小小的黑色肿瘤转移灶；B图是将左图的肺脏，曝光120s后，可见发光细菌定位于肺脏的肿瘤转移灶。
具体实施例方式
实施例一 动物肿瘤模型及转移瘤模型的建立一、实验材料1、细胞、细菌、质粒及培养基肿瘤细胞B16-F10-luc-G5、MCF-7-luc-F5、BEL7405-luc及SMMC7421-luc购于Xenogen公司，PC-3、C6、MB-49及HT1080购于ATCC公司。大肠杆菌DH5α、BL21、JM109等均为国际标准株，市购，本实验室保存。细胞培养基RPMI-1640、DMEM，胎牛血清为Sigma公司产品。细菌培养基LB中各成分蛋白胨、酵母提取物购于OXOID公司，氯化钠为国产分析纯。pXen-1(luxABCDE)质粒购于Xenogen公司。
2、实验动物BALB/C小鼠和nu/nuBALB/C裸鼠，5～6周龄，体重20±5g，均由军事医学科学院动物中心提供。
3、仪器设备IVIS成像系统(Xenogen公司)；UV-1601型紫外分光光度计(Bio Rad公司)；Steri-cycle CO2培养箱(Thermo ELECTRON公司)；低温超速离心机(Sigma公司)；OLYMPUS显微镜；PCR仪(Biometra公司)。
二、方法结果1、肿瘤细胞的培养及制备肿瘤细胞的培养基组成成分与比例为B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49及HT1080细胞DMEM 90％，FBS 10％。C6神经胶质瘤、BEL7405及SMMC7421细胞RPMI-164090％，FBS 10％。将肿瘤细胞置于37℃ 5％CO2培养箱中培养，根据细胞生长状态进行换液或传代。
常规方法消化、收集细胞，1200rpm离心10min，弃上清，并用生理盐水洗细胞三次，最后以血球计数板计数细胞。最终将细胞重悬于生理盐水中，使其终浓度为5×107cell/ml或5×106cell/ml。
2、肿瘤模型及转移瘤模型的建立BALB/C小鼠及裸鼠的肿瘤模型均采用右后腿皮下接种肿瘤细胞(5×106cell/100μl/鼠)，裸鼠的肿瘤转移模型均采用尾静脉注入肿瘤细胞的方式(5×105cell/100μl/鼠)。
3、结果BALB/C小鼠及裸鼠的肿瘤模型在接种肿瘤细胞的7～10天后即能形成可触及的肿瘤；裸鼠的转移瘤模型在静脉注入肿瘤的细胞的7～14天后形成，转移部位肺转移占80％以上，其他如肝、淋巴结、脂肪、骨等也可有转移灶。
实施例二 发光细菌的构建及检测一、实验材料同实施例一。
二、方法结果1、发光细菌的制备细菌培养基LB按常规配制，大肠杆菌DH5α，BL21，JM109等感受态细胞按常规制备。
按常规方法将pXen-1(luxABCDE)分别转化大肠杆菌DH5α，BL21，JM109，涂板后采用IVIS成像系统观察克隆的发光情况及效率。
2、实验前细菌的处理①在给小鼠注菌的前一天，挑取发光效率较高的单克隆菌落于带有抗性的LB中，37℃摇床中培养过夜，次日按1∶100转接该菌，继续摇至对数生长中后期即OD600＝0.6～1.0。
②按1OD＝8×108cfu/ml计算菌量，然后离心，去除LB，并用无菌生理盐水彻底洗三遍，最终稀释到1×109cfu/ml。
③从制备好的菌液中取100μl用于动物的尾静脉注射。
3、注菌于荷瘤小鼠当小鼠接种肿瘤7～10天后，以尾静脉注射的方式给小鼠注菌，注菌剂量是1×108cfu/100μl/鼠。
结果通过以上方法制备的发光细菌，发光效率较高，注入到动物体内后，可在活体情况下，观察细菌在动物体内的分布，从而追踪细菌的定位(见附图1～2)。
实施例三 细菌在动物体内的分布特征及肿瘤定位特性一、实验材料同实施例一。
二、方法结果1、细菌在正常小鼠中分布的特点静脉给予2×109cfu/100μl/鼠或1×109cfu/100μl/鼠于正常小鼠体内的10～20min内，可见细菌分布于肺，然后细菌渐向肝脏聚集，并定位于肝脏，见附图1，其中A图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分钟后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的双肺；B图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的肝脏；其他大肠杆菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情况与此相类似。大部分小鼠不能耐受大于1×109cfu/100μl/鼠剂量的细菌，多数小鼠于注菌的第二天死亡，尸检结果显示细菌主要聚集于小鼠的肺脏与肝脏，未死或数天后死亡的小鼠尸检结果则显示细菌只分布于肝脏。静脉注射1×108cfu/100μl/鼠细菌的小鼠则能全部存活，且细菌的分布最终也只分布于肝脏。
2、细菌在荷瘤小鼠中分布的特点静脉注射1×108cfu/100μl/鼠细菌于荷瘤小鼠，注菌之初，细菌在荷瘤小鼠体内的分布与在正常小鼠中的分布类似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的肿瘤部位即有光的存在，见附图2，其中A图是尾静脉注射的E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天时的成像情况，B图是尾静脉注射的E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天时的成像情况，圈中所示的是小鼠肿瘤接种的部位，即肿瘤接种于小鼠右后腿皮下，发光的区域是发光细菌聚集于肿瘤部位，其他大肠杆菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他实体瘤小鼠中的分布情况与此相类似。解剖小鼠，分别取正常组织与肿瘤组织，发现只有肿瘤部位有较强的光，而正常组织如肝、肺、心、肾及胃肠等则无光，提示细菌全部分布于肿瘤组织。而且我们也发现，对于较大的肿瘤，细菌主要分布于肿瘤组织的周边，在肿瘤中心的坏死区域，细菌则分布的较少，说明大肠杆菌主要聚集于氧份比较丰富的肿瘤区域，见附图3，其中A图是不同器官的曝光情况1-肝脏，2-肺脏，3-心脏，4-肾脏，5-脾脏，6-胃及肠，曝光时间300s，所有器官未见有发光细菌的存在；B图是整个肿瘤的曝光情况，曝光时间30s，可见有大量发光细菌的存在；C图是一切为二的肿瘤曝光情况，曝光时间30s，从C图可以看出发光细菌主要存在于肿瘤的边缘区域，在肿瘤中间的坏死区域则存在的很少。其他大肠杆菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他实体瘤小鼠中的情况与此相类似。本研究还发现，尾静脉注射1×107cfu/100μl/鼠细菌的荷瘤小鼠在注菌的第二天进行解剖后，肿瘤部位就有光的存在，而在正常组织则无光，提示较少的细菌也可在肿瘤中定位。
实施例四 细菌对肿瘤生长的作用一、实验材料同实施例一。
二、方法结果取三组小鼠分别是对照组(生理盐水组)，一次注菌组及多次注菌组，观察大肠杆菌本身对肿瘤生长的作用。
在接种肿瘤的第7天，将15只小鼠随机分为三组，每组5只。一次注菌组及多次注菌组以尾静脉注射的方式注入1×108cfu/100μl/鼠细菌悬液，对照组注入相同体积的生理盐水，多次注菌组小鼠在第一次注菌后的7天、14天，再次注入相同体积及浓度的菌液。观测的指标是小鼠肿瘤体积的增长变化，肿瘤体积的计算公式为V＝L×W2×0.5(其中L为肿瘤的长轴，W为肿瘤的短轴)。统计方法采用单因素方差分析，进行样本均数的两两比较，方法采用的是Student-Newman-Keuls检验，即q检验。
结果显示小鼠肿瘤体积的增长变化在一次注菌组与对照组间无明显差别(P＞0.05)，但在多次注菌组与一次注菌组间或是与对照组间则差别明显(P＜0.05)，表现为多次注菌组的小鼠肿瘤体积增长缓慢，有的小鼠肿瘤有缩小之现象，提示多次注菌可以抑制肿瘤的生长，见附图4～6，分别显示大肠杆菌DH5α、BL21及JM109对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，此三种工程菌对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤的作用与此相类似。
实施例五 细菌在转移瘤发现中的应用一、实验材料同实施例一。
二、方法结果按上述方法构建裸鼠黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等转移瘤模型，1～2周后，按0.1ml/10g腹腔注射底物，活体成像后，可以判断转移瘤模型是否构建成功。
当模型构建成功后，按上述方法，尾静脉注菌，观察大肠杆菌是否具有定位于转移瘤的能力。
结果尾静脉注射黑色素瘤，肝癌及乳腺癌等肿瘤细胞于裸鼠体内，10天后活体成像可见肺脏转移瘤构建成功，尾静脉注入1×108cfu/100μl/鼠的大肠杆菌3～4天后，解剖小鼠可见肺脏布满了大小不同的转移灶，成像显示，在肺脏转移灶有发光细菌存在，说明大肠杆菌可定位于肿瘤的转移灶，见附图7，而在没有肿瘤转移灶的其他脏器，则未见有发光细菌的存在；其他大肠杆菌工程菌在转移瘤中的定位情况与此相类似。
权利要求
1.大肠杆菌在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中大肠杆菌为大肠埃希菌属的每个种或在此基础上经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中大肠杆菌为DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803。
4.根据权利要求1所述的用途，其中肿瘤为实体瘤。
5.根据权利要求4所述的用途，其中肿瘤为鼠黑色素肿瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纤维肉瘤细胞HT1080、鼠膀胱肉瘤细胞MB-49或鼠神经胶质瘤C6。
6.根据权利要求1所述用途，其中肿瘤诊断的大肠杆菌的剂量是5×108cfu/k体重。
7.根据权利要求1所述用途，其中肿瘤治疗的大肠杆菌的剂量是5×109cfu/次/kg体重，每周一次，连续三次。
8.根据权利要求1所述用途，其中肿瘤诊断或治疗药物的给药途径为静脉给药。
全文摘要
本发明公开了大肠杆菌在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。本发明通过实验证明了大肠杆菌可以定位于动物体内的肿瘤组织，并对肿瘤组织生长具有抑制作用，可以用来制备肿瘤诊断或治疗的药物，具有广阔的市场和应用前景。
文档编号A61K35/66GK1903374SQ20051008711
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者张学敏, 张海英, 王晨辉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心