专利名称：汉黄芩素在制备治疗白血病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，涉及汉黄芩素在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术：
白血病是起源造血系统的、以骨髓或其他造血组织中产生和积聚大量幼稚和异常白细胞为特点的恶性疾病。从形式看白血病细胞大多数是未成熟和形态异常的白细胞；在功能上，白血病细胞有着与肿瘤细胞相同的特点白血病细胞呈肿瘤性增殖，无法控制，常导致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出现贫血、中性粒细胞和血小板减少，白血病细胞可浸润全身各种组织与脏器，使各个脏器的功能受损，如脾、肝、淋巴结、脑膜、皮肤等，产生肝、脾、淋巴结肿大、头痛、颈强直等临床症状和体征；也可表现为局部的肿瘤，例如浸润骨膜下时，可聚集成淡绿色肿块，俗称绿色瘤，如乳突绿色瘤、硬脑膜绿色瘤、脊椎绿色瘤、骨盆绿色瘤等，并可早于白血病前出现于临床。由于白血病细胞源于血液系统，又具有肿瘤细胞的上述特点，所以人们习惯上称它是血癌。白血病的分布是世界性的，占癌症总发病数的5％左右，发病以儿童和青年居多。我国白血病患者约为3-4人/10万人口，男性多于女性。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中白血病占第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下的人群中则占第1位。白血病按白细胞发育成熟的程度区分，可分为急性、慢性两种；按白细胞的不同类型来区分，可分为淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型、浆细胞型、巨核细胞型白血病，有时也可由两种细胞混合而成，如粒一单细胞性白血病。
目前白血病的治疗主要依靠化疗，治疗白血病的药物也比较多，中药西药均有，常见的西药有甲氨蝶呤、环磷酰胺、长春新碱、三尖杉酯碱、干扰素等，中成药有珍香胶囊、复方斑蝥胶囊等，这些药物通过不同的机制对白血病进行治疗，其中有细胞毒性药物、诱导分化药物等。细胞毒性药物虽然可以杀伤大量的白血病细胞，减少体内的白血病负荷，但副作用较多，如杀伤、抑制正常造血细胞，导致贫血、出血；抑制正常免疫功能，机体免疫力下降，容易合并感染；损伤胃肠道粘膜，导致厌食恶心、呕吐；还会影响心肝肾功能，而且还可使第二肿瘤发生率增加。此外，这些药物剂量再大，也不可能完全杀灭体内的白血病细胞，而残留的白血病细胞是疾病复发的根源。诱导分化治疗是指应用能够促进白血病细胞分化成熟或能够调节白血病细胞表型以增强其对药物敏感性的诱导分化剂。目前应用最有效的是用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(M3)，ATRA已成为M3型白血病诱导缓解的首选药物。
干扰素是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。分为α、β及γ3种。自80年代以来，许多研究显示，干扰素(尤其α-干扰素及γ-干扰素)除具有抗病毒、免疫凋节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。目前干扰素已被用于治疗多种白血病。干扰素的治疗主要显示对慢粒(慢性期)、毛细胞白血病，慢淋等慢性白血病是有帮助的。由于干扰素治疗费用昂贵、大剂量时副作用多(如行动能力降低、智力减退等)，目前国内应用尚不普遍。
上述药物有的具有较强的毒性，在治疗白血病的同时对正常细胞也有杀伤作用，有的效果不明显，有的效果虽好但价格昂贵。中药在白血病治疗上已表现出一定的效果，并且由于中药毒性低、副作用少而越来越受到关注。汉黄芩素是唇形科(Labiatase)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)及同属多种植物的根中所含的黄酮类化合物，具有式(1)的结构。
式(1)研究表明汉黄芩素有多种药理作用，包括抗氧化作用，抗凝血作用，抗肿瘤作用，解痉作用，此外还有抗菌、抗病毒作用以及利尿作用等。最新研究表明汉黄芩素还可以抑制肿瘤细胞增殖。有文章报道，汉黄芩素可以通过抑制端粒酶活性，抑制过氧化物家族或促进凋亡而抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞和人T-淋巴性白血病细胞CEM细胞的增殖。
但对于汉黄芩素在制备治疗白血病药物中的应用方面，特别是对于汉黄芩素在制备诱导白血病细胞定向分化药物的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供汉黄芩素在制备治疗白血病的药物中的应用。
本发明的理论基础是根据成熟的白细胞由造血于细胞分化而来。粒细胞一般按照原始粒细胞——早幼粒细胞——中幼粒细胞——晚幼粒细胞——杆状核及分叶核细胞逐渐分化成熟。一般认为白血病的发生与细胞分化受阻有关，细胞停止在原始粒或早幼粒阶段而产生异常增殖的白血病细胞。但在分化诱导剂的诱导下造血干细胞可沿粒系方向逐渐分化为趋于成熟的细胞。
本发明的技术方案是汉黄芩素在制备治疗白血病的药物中的应用，特别是在制备诱导白血病细胞向粒系定向分化的药物中的应用。
本发明中汉黄芩素可以和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以和其他与汉黄芩素不发生拮抗作用的治疗白血病药物组成复方制剂。这些制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、膜剂、胶囊剂、脂质体等。汉黄芩素的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度等变化，其日剂量可以是80-3600mg，可以一次或多次施用。
本发明的优点本发明提供了汉黄芩素在制备治疗白血病的药物中的应用，特别是在制备诱导白血病细胞定向分化的药物中的应用，根据本发明制备的抗白血病药物在诱导白血病细胞向粒系分化方面具有较好的效果，为白血病药物治疗提供了更多选择，并且为特定类型白血病的治疗提供了有针对性的药物。同时汉黄芩素对细胞的毒性作用较小，有利于临床应用。
图1为NB4细胞对照组Giemsa(姬氏染液)染色照片。
图2为NB4细胞汉黄芩素高剂量(50μM)组Giemsa染色照片。
图3为NB4细胞汉黄芩素中剂量(12.5μM)组Giemsa染色照片。
图4为NB4细胞汉黄芩素低剂量(3.13μM)组Giemsa染色照片。
图5为NB4细胞NBT(硝基四氮唑蓝)实验结果。
图6为U937细胞对照组Giemsa染色照片。
图7为U937细胞汉黄芩素高剂量(50μM)组Giemsa染色照片。
图8为U937细胞汉黄芩素中剂量(12.5μM)组Giemsa染色照片。
图9为U937细胞汉黄芩素低剂量(3.13μM)组Giemsa染色照片。
图10为U937细胞NBT实验结果。
图11为HL60细胞对照组Giemsa染色照片。
图12为HL60细胞汉黄芩素高剂量(50μM)组Giemsa染色照片。
图13为HL60细胞汉黄芩素中剂量(12.5μM)组Giemsa染色照片。
图14为HL60细胞汉黄芩素低剂量(3.13μM)组Giemsa染色照片。
图15为HL60细胞NBT实验结果。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
效果实施例1汉黄芩素对人原幼粒白血病细胞株NB4细胞的体外分化诱导作用1)细胞形态学检测方法分别用50μM，12.5μM和3.13μM浓度的汉黄芩素与NB4细胞共培养5天，之后，将各组NB4细胞悬液离心，弃上清，加入PBS或Hanks液洗涤1～2次，取细胞沉淀涂片，迅速风干；用Giemsa染液染色10～20分钟，蒸馏水漂洗，风干；于油镜下每片观察200个细胞，按其分化成熟程度分类细胞分类各类细胞的形态特点如下①早幼粒细胞胞浆少，呈淡蓝色或灰蓝色，有非特异性嗜天青颗粒。核圆形或椭圆形，染色质细，核仁大而明显，1～3个不等。
②中幼粒细胞胞浆较多，出现细小的粉红色特异颗粒。核呈圆形或椭圆形，有时偏向一侧，核染色质粗糙，核仁减少或消失。
③晚幼粒细胞胞体较小，胞浆淡红色，特异颗粒增多，核呈肾形、豆形或黄瓜形。
④杆状核细胞胞浆量多，呈淡红色，布满细小嗜中性颗粒。核弯曲，呈带状、S形、U形或W形。
⑤分叶核细胞胞浆量多，胞核分2-5叶。
结果见图1-图4与空白对照组相比，分别采用50μM，12.5μM和3.13μM浓度的汉黄芩素共培养5天后的NB4细胞，其分化率分别达到了86％，63％，38％(中幼粒以上都算分化)。
结果表明，汉黄芩素对人白血病细胞NB4细胞株具有良好的分化诱导作用，可诱导NB4细胞可沿粒系方向逐渐分化为趋于成熟的细胞。由图1至图4的照片中可观察到随汉黄芩素剂量的增加，NB4细胞的分化程度也在增加，汉黄芩素所诱导的NB4细胞的分化与汉黄芩素的剂量成正相关。
2)功能学检测NBT还原能力测定方法无菌条件下，收集对数增殖期NB4细胞，接种于96孔板(同时做两块平行板)，于5％CO2，37℃条件下培养5天。将两块板离心，弃上清，一块板加入100μl的1640培养基(含有2mg/ml的NBT和500μg/ml的PMA(佛波脂))，置于37℃，5％CO2条件下孵育2小时，加DMSO溶解沉淀，于570nm处测定吸光度值。同时另一块平行板加入20μl MTT(四氮唑蓝)(5mg/ml)溶液，相同条件下孵育4小时后，加DMSO溶解甲臜沉淀，于570nm处测定吸光度值。最后以NBT/MTT的比值表示分化率。
结果NBT/MTT比值表示在剩余活细胞中分化细胞所占的比率。细胞对照组(未加药)的NBT阳性率为5.05％。以汉黄芩素50μM，12.5μM和3.13μM处理细胞5天后，NB4细胞株的NBT反应阳性率(即分化率——NBT/MTT比值)分别为60％，25％，15％。
结果表明汉黄芩素可以诱导NB4细胞向终末(粒系)分化，且成剂量正相关(见图5)。
效果实施例2汉黄芩素对人淋巴细胞白血病细胞株U937的体外分化诱导作用除细胞株改为人淋巴细胞白血病细胞株U937外，所做实验及实验方法均同1。
结果见图6-10。
结果表明，汉黄芩素对U937细胞有良好的分化诱导作用，且可诱导U937细胞向粒系方向分化。
效果实施例3汉黄芩素对人早幼粒白血病细胞株HL60的体外分化诱导作用除细胞株改为人白血病细胞株HL60外，所做实验及实验方法均同1。
结果见图11-15。
结果表明，汉黄芩素对HL60细胞有良好的分化诱导作用，且可诱导HL60细胞向粒系方向分化。
效果实施例4汉黄芩素对白血病细胞体内诱导分化作用方法采用SCID鼠作体内试验。
取SCID小鼠随机分为四组，每组8只，空白对照组给予生理盐水(NS)20ml/kg。汉黄芩素高剂量组浓度是28mg/kg，中剂量组浓度是14mg/kg，阳性对照组给予维甲酸15mg/kg。分别将NB4细胞(1×106)100μl腹腔注射接种于SCID小鼠，第二天开始给药，各组分别给药两周，观察小鼠存活天数，结果见表1。
表1汉黄芩素对SCID小鼠生命延长的影响
(*p＜0.05，**p＜0.01，vs.对照组)实验结果表明，与空白对照组相比，汉黄芩素高、中剂量可以显著延长SCID小鼠存活时间。
制剂实施例1取汉黄芩素10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗白血病药注射剂。
制剂实施例2取汉黄芩素10g，加入片剂(包括缓控释片，骨架片，包衣片，分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片，骨架片，包衣片，分散片等)工艺制备成抗白血病药片剂。
制剂实施例3取汉黄芩素10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗白血病药胶囊剂。
制剂实施例4取汉黄芩素10g，加入乳剂(包括微乳，纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳，纳米乳等)工艺制备成抗白血病药乳剂。
制剂实施例5取汉黄芩素10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成抗白血病药颗粒剂。
制剂实施例6取汉黄芩素10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制备成抗白血病药缓释控释剂。
制剂实施例7取汉黄芩素10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗白血病药口服液。
制剂实施例8取汉黄芩素10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成抗白血病药脂质体剂型。
权利要求
1.汉黄芩素在制备治疗白血病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的治疗白血病药物是诱导白血病细胞分化的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的诱导白血病细胞分化的药物是指诱导白血病细胞向粒系分化的药物。
全文摘要
本发明属于制药领域，涉及汉黄芩素在制备治疗白血病药物中的应用。本发明提供了汉黄芩素在制备治疗白血病的药物中的应用，特别是在制备诱导白血病细胞向粒系定向分化的药物中的应用。按本发明制备的药物对白血病细胞具有良好的分化诱导作用，为治疗特定类型白血病提供了更好的选择。
文档编号A61P35/00GK1785175SQ20051009534
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月9日 优先权日2005年11月9日
发明者郭青龙, 张坤, 俞军, 尤启冬, 王伟, 张海伟, 顾红燕, 赵丽, 胡扬 申请人:中国药科大学