专利名称：防治水产养殖动物疾病的复合菌苗及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治水产养殖疾病的复合菌苗。
背景技术：
细菌性疾病是对虾、鱼类、海参等海水养殖中的常见的疾病，如对虾红腿病(红肢病)病原有副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌；烂眼病病原有非01群霍乱弧菌；烂鳃病病原有弧菌属、假单胞菌属、气单胞菌属；褐斑病病原有弧菌、假单胞菌、螺菌、黄杆菌；气单胞菌病病原有气单胞菌；对虾幼体的弧菌病病原有鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌；而这些细菌也可以导致鱼类、海参等养殖疾病的发生，如海水养殖鱼类的溃疡病、烂鳃病等；海参的皮肤烂边、溃疡等。这些细菌性疾病往往导致海水养殖中的大面积死亡，给水产养殖带来重大的损失。鱼虾养殖过程中，鱼虾疾病一旦出现明显症状，即已经是病程后期，难以治疗。因此对于鱼虾疾病主要是以预防为主，而目前使用的消毒剂和抗生素存在着药物残留、产生抗药性、污染养殖环境等很多弊端。
因此，免疫学方法成为控制水产养殖动物暴发性流行病最佳选择。
在现有的技术中，对于鱼虾疾病的防治还有不足之处，如《弧菌疫苗对斑节对虾和日本对虾免疫预防的作用》水产学报.2000.024(006).-564-569。尝试使用免疫学的方法来防治对虾弧菌病。将病原副溶血弧菌制成福尔马林灭活疫苗，在实验条件下分别以浸泡、口服和注射等方式接种于斑节对虾和日本对虾，结果发现，在一定的范围内，对虾的免疫保护率随疫苗浓度的增加而升高。但是存在着只能防治对虾弧菌病，防治疾病种类单一的缺欠。2001年9月5日公开了申请号为00114083.3的专利《一种抗水产养殖动物弧菌病的混合疫苗及其制备方法》。该混合疫苗由创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、细小弧菌、河弧菌、哈弧菌和鳗弧菌等二种获二种以上混合而成，能防治多种弧菌的侵袭。但是对其他致病菌感染的防御作用较差，而海水养殖实践中细菌性疾病相对复杂，如弧菌病、气单胞菌病等，所以其实际应用受到限制。公开的申请号为02110261.9《一种水产养殖动物的细菌疫苗制备方法》虽然涉及了多种病原细菌，但是其主要应用于鱼或海豚等哺乳动物，对于对虾等低等动物的疾病的防御效果没有做出说明。《海水鱼类病原弧菌对对虾的致病力及其疫苗的免疫预防》热带海洋学报.2001.020(004).-68-73。鱼类致病弧菌(溶藻弧菌，创伤弧菌，河弧菌生物I型，鳗弧菌和副溶血弧菌)同样可使斑节对虾Penaeus monodon患病，仅对斑节对虾的致病性和免疫保护力作了研究。通过肌肉注射感染实验，发现5种弧菌对斑节对虾均有不同的致病作用。从5种弧菌中筛选出强毒株，以其制成福尔马林灭活疫苗。通过注射、浸浴和投喂等3种方式接种的斑节对虾，除投喂效果不明显外，注射和浸浴接种均有一定的免疫保护力。在注射接种组中，随着疫苗浓度的提高，其免疫力有升高的趋势。说明在鱼虾的弧菌病中，疫苗能起到共同的防御效果，为商用鱼虾疫苗的生产提供了可能。虽然注射和浸浴接种有一定的免疫保护力，但是对于水产养殖来说，将患病鱼虾捉出来进行注射和浸浴接种，几乎是不可能的事情。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫多种水产养殖动物，防御多种致病菌感染的复合菌苗，以克服目前疫苗所存在的问题。
本发明是将常见的海水养殖中的致病菌制成复合菌苗防治水产养殖疾病，其特征在于主要由下列细菌中的一种或一种以上弧菌和一种或一种以上的除弧菌外的其他细菌混合而成，所述的弧菌菌种包括溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)；所述除弧菌外的其他细菌菌种包括嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、类志贺氏类志贺氏邻单胞菌(P.shigelloides)。复合菌苗中各成分菌苗含量为溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均为10～50％；副溶血弧菌、鳗弧菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌均为0～50％，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
根据以上原则，经过优选复合菌苗中的配比可以分别为1、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌含量均为10～20％。
2、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌各为50％。
3、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌均为10～50％。
4、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌分别占10～50％。
具体来说，以下配方的复合菌苗防治效果相当优异1、溶藻弧菌10％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌10％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌20％、类志贺氏邻单胞菌20％组成的混合菌苗，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
2、溶藻弧菌15％、副溶血弧菌15％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌10％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌20％组成的混合菌苗，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
3、溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％组成的混合菌苗，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
4、溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％组成的混合菌苗，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
复合菌苗的制造方法1、分别制备弧菌和其他细菌的单一成分菌苗(1)将弧菌和其他细菌菌种接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，物理或化学灭菌。
(3)3000～5000转/分钟离心，除去杂质。
(4)用生理盐水配制成所需浓度，即得单一成分菌苗。
2、将制得的单一成分菌苗按配方比例的浓度相混合即得所述的复合菌苗。
3、将上述复合菌苗加入适当的防腐剂保存备用。
与现有技术相比，本发明的复合菌苗在应用于水产养殖动物过程中可以更为广泛地防治常见的细菌性疾病，特别是对海水养殖的虾、鱼、海参等的细菌性疾病防治，取得较满意的效果。
下面结合实施例说明本发明。
具体实施例方式
实施例一溶藻弧菌和嗜水气单胞菌各占50％组成的混合菌苗的制取。
1.分别制备溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌和嗜水气单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方各占50％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例二溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌分别占25％组成的混合菌苗的制取。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方分别占25％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例三溶藻弧菌和嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌分别占20％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌和嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌和嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方分别占20％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例四溶藻弧菌10％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌10％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌20％、类志贺氏邻单胞菌20％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方溶藻弧菌10％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌10％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌20％、类志贺氏邻单胞菌20％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例五溶藻弧菌15％、副溶血弧菌15％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌10％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌20％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方溶藻弧菌15％、副溶血弧菌15％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌10％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌20％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例六溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例七溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，1～5％甲醛溶液灭活。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去残存的甲醛溶液。
(4)用生理盐水溶解最后离心所得的沉淀物，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
实施例八溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％组成的混合菌苗。
1.分别制备溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的单一成分菌苗(1)将溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌菌种分别接种于培养基，25～37℃培养24～48小时。
(2)生理盐水洗涤培养物，56℃～65℃水浴灭活60～120分钟。
(3)将灭活的培养物3000～5000转/分钟离心后用生理盐水溶解，再离心，反复多次以除去杂质。
(4)用生理盐水溶解配制成所需浓度，即得单一成分菌苗。
2.将制得的单一成分菌苗按配方溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％的比例浓度相混合，细菌总量为1×107～1×1010个/ml，即得所述的混合菌苗。
3.将上述复合菌苗加入1％苯甲醇作为防腐剂保存备用。
本复合菌苗主要应用于防治水产养殖疾病，特别是对虾、鱼类等海水养殖中的常见细菌性疾病。这些细菌性疾病往往导致海水养殖中的大面积死亡，应用本复合菌苗后取得了较满意的效果，举例如下1、于1997年9月27日，从普兰店养殖海区取回平均5cm长的对虾16只，喂养于实验室玻璃缸内。取回的对虾均患有不同程度的褐斑病，经每天投喂实施例五菌苗2～3次，除两只于当年11月自然死亡外，其余14只经多次褪皮，存活至1998年8月，虾体长16cm左右。
2、1999年7月5日，发现4只雌性对虾附肢变红色，游动缓慢，不愿进食。遂调整使用实施例二菌苗每天2次为3～4次，经4天治疗，病态消失，存活至2000年1月自然死亡，体长达18cm。
3、1999年6月开始，在普兰店市某虾场一个100亩的虾池进行本产品的田间应用试验。从6月底发现部分虾患病后，开始使用实施例七菌苗按每周2次用药，一直用至9月末对虾出池，未再发病。而临近对照池的虾则发病不断，产量为110斤/百亩。因1999年对虾病害严重，当年试验池产量70～80斤/亩，且虾体健壮。无论从对虾个体身长、重量、还是亩产量，经使用菌苗后，疗效均优于对照组。
4、本试验于2003年5月至2003年9月在辽宁省普兰店市石河镇长店铺村沿海虾场进行，该处共有12个虾池，选取愿意应用实施例八复合菌苗的4个虾池作为试验组，其余8个虾池为对照组。投苗前虾池用茶籽饼消毒处理。投放日本对虾虾苗，入池虾苗规格为0.9～1.0cm，养殖面积50～100亩，投放虾苗40～80万尾。试验组对虾外壳整洁、光亮，平均存活102天，比对照组多生长40.75天，对虾更加成熟，因此，试验组对虾平均身长比对照组长4.0cm。
5、2003～2004年先后多次使用近100只观赏用金鱼研究鱼类抗感染能力，近50天不换水，使养殖环境恶化，达到有金鱼死亡，然后换水，同时使用实施例六复合菌苗，经过抢救，有86只金鱼生存下来。
6、鱼类养殖实验购买患溃疡病鲫鱼15只，经过使用实施例三复合菌苗，有12只溃疡病痊愈。
7、海参的实验室养殖实验组与对照组各100只稚参，使用实施例二菌苗经过一年养殖，实验组成活76只，而对照组仅成活36只。对海参的溃疡也显示出了一定的防治效果。
权利要求
1.一种防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于主要由一种或一种以上弧菌和一种或一种以上的除弧菌外的其他细菌混合而成，所述的弧菌菌种包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌；所述除弧菌以外的其他细菌菌种包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌；复合菌苗中各成分菌苗含量为溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均为10～50％；副溶血弧菌、鳗弧菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌均为0～50％，细菌总量为1×107～1×1010个/ml。
2.根据权利要求1所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述复合菌苗中溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌的含量均为10～20％。
3.根据权利要求1所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中溶藻弧菌和嗜水气单胞菌各占50％。
4.根据权利要求1所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌分别占10～50％。
5.根据权利要求1所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中溶藻弧菌和嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌分别占10～50％。
6.根据权利要求2所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中各菌苗含量分别为溶藻弧菌10％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌10％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌20％、类志贺氏邻单胞菌20％。
7.根据权利要求2所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中各菌苗含量分别为溶藻弧菌15％、副溶血弧菌15％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌10％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌20％。
8.根据权利要求2所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中各菌苗含量分别为溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌20％、温和气单胞菌10％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％。
9.根据权利要求2所述防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其特征在于所述的复合菌苗中各菌苗含量分别为溶藻弧菌15％、副溶血弧菌10％、鳗弧菌15％、嗜水气单胞菌15％、温和气单胞菌15％、铜绿假单胞菌15％、类志贺氏邻单胞菌15％。
10.一种防治水产养殖动物疾病的复合菌苗的制法，其特征在于工艺步骤为(1)各菌种进行单一菌种经接种，25～37℃、24～48小时培养、生理盐水洗涤、灭活、离心、生理盐水配制而成单一菌苗；(2)根据需要按配方比例将各单一菌苗混合进行复配而成复合菌苗；(3)加入防腐剂保存。
全文摘要
一种防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，其主要由溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌、类志贺氏邻单胞菌组成。复合菌苗中各菌种含量为溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均为10～50％，其他菌种均为0～50，细菌总量为1×10
文档编号A61P31/04GK1762387SQ20051009581
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者刘为国 申请人:大连大学