杂交酵母流感疫苗的制作方法

专利名称：杂交酵母流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明是一种治疗和/或预防传染性疾病流感的方法及其组成成份。该发明由至少两个基因表达单位经杂交形成一个基因表达载体；其中一个基因表达单位表达细胞因子和/或淋巴因子，另一个基因表达单位表达单个、融合和/或多个流感病毒抗原基因；该发明主要是应用这个基因表达单位形成杂交载体疫苗治疗和预防流感。
背景技术：
在疾病防治历史上，疫苗一直是最有效、价廉和实用的方法。没有任何一种措施包括抗生素在内曾经如此有效地降低人口的死亡率，疫苗对人类健康的影响之大是难以用语言做评价的。疫苗曾在世界上许多国家成功地控制了以下九种疾病天花、白喉、破伤风、猩红热、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹。天花是在世界范围内得到最有效控制的疾病。一个疫苗的有效性是取决于它能诱导机体产生保护性免疫反应的能力。
脊椎动物尤其是鸟类和哺乳动物战胜微生物感染的机制是一个复杂的过程。病原体侵入宿主后会激活机体多系统多种保护性反应，如果病原体或其毒素成功地攻破机体的外层防线而进入血循环，淋巴器官如脾、肝和骨髓将会分解和清除进入血循环中的病原体或其毒素。淋巴组织是由一系列相互交织的细胞和纤维组成，这些细胞包括白细胞即淋巴细胞和处于不同分化阶段的其它细胞，如浆细胞、淋巴纤维细胞、单核-巨噬细胞、嗜酸细胞和肥大细胞。淋巴细胞主要分为T和B淋巴细胞，它们在机体的抗原特异性免疫反应中起不同作用但又互补。
免疫系统通过识别外源性病原体而成为保持机体内环境稳定的重要防线。机体对外源性病原体的初步反应称为“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其它白细胞首先对病原体产生应答，这些细胞通过吞噬、消化、裂解或分泌淋巴因子在短时间内消灭病原体。先天性免疫是抗原非特异性的，它是机体产生“获得性免疫”应答之前的第一道抵御病原体的防线。T和B淋巴细胞是参于获得性免疫反应的主要细胞，获得性免疫反应的特征是B细胞识别抗原后被激活从而分泌抗原特异性抗体、T细胞的激活和抗原提呈。
B细胞识别抗原是指抗原与B细胞表面的免疫球蛋白受体结合，这些抗原包括细菌细胞壁、细菌毒素或病毒表面糖蛋白，该结合促使信号传导到B细胞内，此过程称为“第一信号”，在某些情况下，仅需要一个信号就能激活B细胞，这些无需辅助性T细胞就能激活B细胞的抗原称为“不依赖T细胞抗原”(或不依赖胸腺抗原)；某些情况下，B细胞的激活需要“第二信号”，第二信号通常由辅助性T细胞提供，这类细胞抗原称为“T细胞依赖性抗原”(或胸腺依赖性抗原)；结合到B细胞表面的抗原通过内吞进入B细胞并被消化为小片段，这些片段又与B细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”，该复合物提供T细胞依赖性抗原激活B细胞所需的第二信号。激活B细胞的另一种方式是B细胞与淋巴结和脾脏生发中心的树突状细胞(DentriticCells，DC)结合。
获得性免疫的一个重要机制是T细胞的激活，激活T细胞需要抗原提呈细胞如巨噬细胞和DC细胞与T细胞结合，巨噬细胞表面有多个识别病原体抗原的受体，如甘露糖和清道夫受体，巨噬细胞吞噬这些病原体后在内体和溶酶体的作用下将其消化裂解为多肽片段，这些多肽片段与巨噬细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”，当T细胞与该复合物结合后被激活。DC细胞是既能形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”又能形成“抗原多肽-MHC I分子复合物”的抗原提呈细胞。
当B细胞与抗原结合后通过“同型转换”使分泌普通IgM抗体的B细胞转化为分泌特异性的IgG抗体，这些细胞分为两类一类不断分裂称为克隆扩增，这类细胞成熟后每秒钟可释放2000个同样的抗体，约2-3天后死亡；另一类细胞此时不分泌抗体而成为记忆细胞，这些记忆细胞可存活数月到数年，当再次遇到同样抗原时这类记忆细胞会迅速产生大量抗体，这种免疫反应称为次级免疫反应。研发疫苗的目标就是要诱导这种较初级免疫反应更快更强的次级免疫反应。
经典的主动疫苗分为亚单位和完整病原体疫苗，亚单位疫苗是完整病原体的一部分，其目的是避免应用有致病性的完整病原体或避免应用完整病原体的有毒组份。B型副流感病毒的脂多糖做为脑膜炎疫苗就是应用抗原组份的一个亚单位疫苗例子；完整病原体疫苗通常是灭活或减毒的病原体，如灭活的百日咳疫苗。由于灭活或减毒过程有时会损害一些诱导免疫反应所必需的抗原决定基，因此这类疫苗常需添加免疫增强剂。
传统的预防性疫苗是通过接种疫苗后使机体在再次遇到相同病原体时能产生保护性免疫反应，这种理论适用于病毒或细菌传染性疾病，因病毒或细菌仅有有限数量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必须能够根除已经存在的癌细胞，这样就使我们必须更好地明白肿瘤抗原和宿主免疫的作用机制，当代的疫苗理论是要诱导细胞免疫反应。
因流感的变异快、血清型众多，容易发生突变，致使迄今没有成功的流感疫苗，还没有疫苗能够诱导足够强的细胞免疫反应和体液免疫反应来消灭已被流感病毒感染的细胞和不断释放新病毒颗粒的被感染细胞。流感的迅速蔓延和传播，使疫苗免疫接种成为预防控制流感最有效的一种手段。
本发明是一种杂交酵母流感疫苗，它能诱导与MHC I和II分子偶联的强效、持久的保护性CTL免疫反应和产生流感病毒特异性抗体的体液免疫，也就是说是能达到理想免疫效果的疫苗。

发明内容
本发明第一部分是一个基因载体系统。该载体由两个DNA质粒组成，一个编码协同刺激信号，由启动子操作的T细胞生长因子；另一个DNA质粒编码由启动子操作的至少一个或多个流感病毒抗原基因。
本发明第二部分是一种诱导流感特异性的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应(CTL)和产生流感特异性抗体的体液免疫对抗流感病毒及其它病原微生物的方法。
本发明第三部分是一种基因表达系统，该系统由独立启动子分别表达细胞生长因子如IL-2和流感病毒的抗原基因。
本发明第四部分是一种诱导脊椎动物免疫反应的方法，所需免疫反应通过该流感疫苗载体及疫苗载体所携带的病毒抗原基因或细胞生长因子来体现。


以下

是对本发明以图表示时的一些部分的具体描述，同时也是对本发明原理的辅助性解释。
图1.本发明操作原理的图解。
图2.本发明疫苗载体系统图解。
图3.应用本发明所表达的IL-2水平的线图示。
具体实施例方式
本发明的流感疫苗载体系统是一种诱导强效、持久的CTL免疫反应的方法，它通过激活依赖MHC I和II的途径来产生保护性免疫反应。图1是对本发明操作原理的图解，图中的酵母质粒α和a分别表达抗原基因和一个协同刺激信号，该协同刺激信号通常是促使抗原基因刺激最有效免疫反应的相应细胞生长因子，而且很可能若没有同时将此细胞因子导入，其免疫反应将不能达到其最佳状态。这些抗原分子有如下所列但并不限于这些，如病毒、细菌、寄生虫和肿瘤细胞组份、百喉毒素C片断、霍乱毒素B亚单位、B型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原、志贺氏杆菌脂多糖(LPS)等以及单个、多个或不同排列组合的抗原。另一些抗原可以是真菌、原虫、蛔虫和癌细胞抗原；流感的病毒蛋白抗原有如下所列但并不限于这些，如HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等；细胞因子有如下所列但并不限于这些，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、TNF-β和IFN-γ等。
本发明的疫苗载体系统首先是由两个分离的质粒通过真核生物基因交配的方法形成。该真核生物包括如下所列但并不限于这些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，这个载体系统也可由原核细胞组成，如大肠杆菌和病毒质粒等但并不限于这些。因此，无论是真核或原核细胞所形成的最后产品是由一个启动子控制表达细胞因子，另一个多克隆位点供插入各种各样的抗原基因，另有复制子、转录、翻译元件的DNA序列、筛选标记等通过连接子将其连成完整质粒，真核细胞表达载体的筛选标记有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，该疫苗载体被用于需要治疗的机体。
本发明疫苗载体的结构原理如图1所示，首先，构建二个功能性的多核苷酸序列组成的DNA表达质粒；这两个质粒的具体应用本发明疫苗如图2所示。其中的启动子是真核生物启动子但并不限于此，如酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。启动子可以是诱导性的或组成性的，诱导性启动子可以被调介，如营养成份(carbonsouces，nitrogen souces和其它)、药物(抗药性等)、与感染过程有关的特殊试剂(血清等)和温度(热休克和冷休克等)。将所得到的两个质粒分别转化为真核微生物如单倍体酵母，转化DNA的方法可以是多种多样的，包括钙磷沉淀法、显微注射法、脂质体法、电穿孔法和病毒载体法等，这里也包括各种各样的含有载体的宿主细胞。
本发明用酵母作为宿主微生物，酵母质粒被成功地转化为酵母时，可用氨基酸缺陷培养基筛选转化子，然后通过单倍体酵母基因交配而形成双倍体杂交酵母，此时再用双氨基酸缺陷培养基筛选双倍体杂交转化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics&Molecular Biology，Methods in Enzymology，1943-231(1999)]，在这个过程中，非转化子被自然淘汰。
本发明中的DNA质粒的启动子可以是原核细胞启动子，在这种情况下，宿主可以是原核细胞表达质粒，其目的也是诱导所需的免疫反应，可用多种方法将此原核细胞表达质粒转化为真核微生物，如转导、偶联、转化、电穿孔法和转染等。
本发明流感疫苗载体用于流感的治疗和预防。
应用该疫苗的另一个方法是从流感患病机体分离巨噬细胞或DC细胞，然后将该流感疫苗导入被分离出的巨噬细胞或DC细胞，在体外培养这种细胞并加入一些淋巴因子，然后将该细胞输回入患者。
为构建流感疫苗，将细胞生长因子IL-2、IL-4、IL-6等克隆到在组成性酵母启动子控制下的酵母质粒α上，将流感病毒抗原HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等克隆到酵母质粒a，将所得到的两个单倍体酵母质粒α和a分别转化到宿主酵母W303α和a上，将所得到的转化子交配形成双倍体，通过leu2/ura3氨基酸缺陷培养基筛选终末疫苗产品。
本发明中的疫苗通常通过注射，如皮下、皮内、肌内、腹腔使用，也可通过胃肠道使用等；也可通过鼻腔滴入、喷雾吸入和口服；本发明也包括该流感疫苗的其它配方，如栓剂或应用纳米技术；使用疫苗的途经可根据个体情况选择以达到最佳临床效果；本疫苗可通过计算活性单位来定量，可以是无菌胃肠道型和非胃肠道型的，也可以是普通胃肠道型和非胃肠道型的；可以是油水或水油乳剂；使用该疫苗的疗程可以是2-3周内2次或视具体情况决定。
以下举例说明本发明的具体实施例，当然本发明的应用并不局限于此，另外，用同样方式同样性质组分但又作些修改仍显而易见属于本发明之范畴。
例1.构建酵母表达质粒表达IL-2和构建表达流感病毒抗原基因的广谱质粒载体图2中的质粒pcDNA3.IL-2，将该质粒中的IL-2用限制性内切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位点区(MCS)smalI/NotI，将质粒pYEX-BX(Clontech)的MCS区域修饰即增加多个限制性内切酶位点使其容易克隆，由此构建成表达抗原基因的广谱质粒载体pYEX.UIG。所得到的质粒pYEX.UIG可用于克隆表达流感病毒抗原基因，在此实施例中为血凝素基因(HA基因)，用EcoRI/XhoI内切酶将其抗原基因克隆到pYEX.UIG载体。
例2.杂交酵母流感疫苗载体的构建如图2所示，将例1中所得质粒pYES3/CT.IL-2用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将例1中所得质粒pYEX.UIG HA用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将所得两个转化子IGV.IL-2(α)和IGV.HA通过基因配型杂交生成终末疫苗产品，该疫苗具有表达细胞生长因子IL-2和血凝素蛋白(HA)的能力。
例3.IL-2的测定向5周龄的无免疫SPF鸡和Balh/c小鼠注射1ml矿物油，24小时后用无血清的PBS液清洗出腹腔渗出液，收集渗出液中的巨噬细胞，将1-6×106个巨噬细胞分为二组并分别与IGV.IL-2和IGV.HA共同孵育，在不同时间时，取出200μl培养上清液储存于-70C°待作IL-2定量测定，用IL-2测定试剂盒(DuoSet Kit)(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)定量测定IL-2。如图3所示，接种表达IL-2和HA基因的疫苗比接种有HA基因但无IL-2的疫苗的IL-2水平明显提高，该结果表明用本发明所生产的疫苗能有效地激活机体APC细胞分泌足够量的淋巴因子，它有利于进一步激活CTL免疫反应。
例4.疫苗诱导的CTL活性的测定将4-6周龄Balh/c小鼠分为4组，每组10只，向小鼠皮下注射1×106稳定转染流感病毒HA基因的疫苗产品(IGV.Factor)和对照疫苗IGV.HA，接种剂量为2mg/200μl/次，对照组注射200μl PBS，30天时用CO2安乐死法杀死小鼠，取出脾脏，以51Cr标记的B16.gag细胞为靶细胞，以取出的脾脏细胞为功能性T细胞，按照40∶1的E∶T比例测定CTL活性，百分裂解率(lysis％)实验CPM减去自发CPM的百分比。实验正在进行中。
例5.疫苗诱导的流感特异性HI抗体的检测试验通过间接ELISA方法测定杂交酵母流感疫苗免疫无免疫的SPF鸡后HI特异性抗体的出现时间和HI特异性抗体的滴度。试验在鸡群进行相应免疫后一周开始监测相应抗体，以后间隔一周的时间进行一次连续监测8次，定量鸡群流感特异性HI抗体水平，评价杂交酵母流感疫苗的抗原性和诱导的体液免疫反应的能力，该实验正在进行。
例6.流感疫苗保护性免疫反应通过中和试验和攻击试验进行保护性免疫反应作用的研究。试验用活病毒进行细胞中和试验、鸡胚试验和Balb/c小鼠的中和试验，评价流感疫苗的免疫保护作用；分别使用同型病株和不同年代的同型病株的活病毒进行Balb/c小鼠和鸡胚的攻击试验，观察流感疫苗诱导的保护性的免疫作用，并通过不同年代的同型病株攻击试验进行交互免疫作用的研究，此类实验正在进行中。
新一代的流感重组蛋白疫苗和DNA疫苗直接将编码病毒抗原基因置于适当的真核细胞启动子下，直接导入动物细胞体内使其表达，通过MHC-I和MHC-II直接递呈给机体的免疫系统，可诱导强效、持久的体液和细胞双重保护性免疫反应，安全性好且比传统的疫苗免疫原性弱。因流感血清型众多和变异速度快，传统的疫苗不能诱导患病机体产生特异性免疫反应且免疫反应维持时间短，急需具有可维持持久免疫佐剂作用的流感疫苗和疫苗载体系统，当今以诱导细胞免疫为主的疫苗通常缺乏有效的导入刺激T细胞活性的协同刺激淋巴因子的方法，本发明为最有效地刺激机体的免疫反应提供了一个理想的方法，该理论可延伸到基因治疗的所有领域，因为最有效地刺激机体的免疫反应常需要合适的协同因子的配合。
本发明是一个创新性的疫苗平台技术，不仅仅可用于流感的治疗和预防，可用于研发多种以诱导细胞免疫为主的治疗性和预防性疫苗。
权利要求
1.刺激机体产生流感特异性CTL细胞免疫反应和特异性抗体免疫反应的疫苗，该疫苗由一个DNA酵母质粒通过启动子控制表达细胞生长因子和第二个DNA酵母质粒通过启动子控制表达多个流感病毒抗原基因组成，这两个质粒都由一个宿主微生物作为载体
2.1中所说的CTL细胞免疫反应是CD8+杀伤性T细胞免疫反应。
3.1中所说的流感特异性抗体是指流感病毒血凝抑制(HI)抗体但不限于此。
4.1中所说的细胞因子包括如下IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和细胞内细胞因子IFN-γ和TNF-β等。
5.1中所说的流感病毒抗原为来源于流感病毒的蛋白。
6.1中所说的患病机体是指流感病毒感染的个体。
7.1中所说的宿主微生物载体是指真核细胞但不限于此。
8.6中所说的真核细胞是酵母细胞但不限于此。
9.将1中所说的疫苗配以赋形剂或与其它药物联合应用。
10.5中所说的流感病毒抗原是指HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA等流感病毒蛋白。
全文摘要
该杂交酵母流感疫苗由基因重组杂交酵母组成。流感疫苗由两个分别表达不同目的基因的酵母质粒组成，其中一个酵母质粒表达细胞因子，另一个酵母质粒表达流感病毒抗原基因；经这两个质粒分别转化为单倍体酵母，通过酵母杂交技术将这两个单倍体酵母转化为含有分别表达不同目的基因的杂交酵母，由此产生的重组杂交酵母流感疫苗是一种具有治疗和预防流感作用的疫苗。
文档编号A61K39/145GK1923288SQ20051009779
公开日2007年3月7日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者孙娟 申请人:孙娟