专利名称：重组人白细胞介素－15在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用以及一种免疫治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种重组蛋白的医药用途，即涉及肿瘤免疫治疗中含有重组人白细胞介素-15(recombinant human interleukin-15，rhIL-15)的药物。本发明还涉及包含所述重组蛋白的药物组合物以及具体的注射用粉针剂。
背景技术：
白细胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子，成熟蛋白由114个氨基酸残基组成，分子量为14～15kD(Grabstein KH，et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the βchainof the interleukin-2 receptor.Science，1994；264965-68.)。随着对其研究的不断深入，人们对IL-15的结构、功能等有了更新的认识。IL-15的体外活性类似于IL-2，促进T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞的增殖分化，增强细胞毒T淋巴细胞(CTL)/NK细胞毒活性等，在机体的免疫应答中发挥着重要作用。但是，它对T细胞的作用又不完全同于IL-2，有时甚至作用相反。IL-2促进T细胞活化和增殖，但也可能通过IL-2受体诱导活化淋巴细胞凋亡和/或功能抑制，IL-15却有助于维持记忆性CD8+T细胞存活。IL-15是一个多效能细胞因子，低剂量的外源IL-15能诱导NK细胞、NK-T细胞和记忆性CD8+T细胞的发育、增殖及活化，提高机体CD8+T细胞的抗肿瘤或抗病原体功能，而不产生明显的毒副作用。由于IL-15作用的多样性，可在天然免疫和获得性免疫反应中产生交叉的调节作用，因而可将其看作天然免疫和获得性免疫系统间的桥梁。
在IL-15的功能研究中，其抗肿瘤作用受到重视(Munger W，Dejoy SQ，Jeyaseelan R，Torley LW，Grabstein KH，Eisenmann J，Paxton R，Cox T，Wick MM，Kerwar SS.Studies evaluating the antitumor activity and toxicity of interleukin-15.anew T cell growth factorcomparison with interleukin-2.Cellular Immunology.1995.165289-293.)。在大鼠结肠癌模型中发现，IL-15能显著降低化疗引起的胃肠道毒性，增加药物的最大耐受剂量。并且，低浓度IL-15(10ng/ml)不刺激外周血单核细胞产生一定程度的增殖，却增强它们的抗肿瘤细胞毒作用，因为在限定剂量范围内，IL-15在发挥抗肿瘤细胞毒作用同时，仅诱导最低程度的淋巴细胞增殖，从而降低了炎性细胞因子的释放和毒副作用的产生(Jong JL，Farner NL，JavorskyBR，Lindstrom MJ，Hank JA，Sondel PM.Differential quantitative effects of IL-2 andIL-15 on cytotoxic activity and proliferation by lymphocytes from patients receiving invivo IL-2therapy.Clin Cancer Res.1998.4(5)1287-1296.)。
发明人通过对IL-15的深入研究发现，IL-15基因修饰的小鼠肺腺癌细胞LA795A的致瘤性明显降低，有明显的抑制肿瘤生长作用；IL-15基因修饰的人肺鳞癌细胞PG1在裸鼠体内能够产生抗肿瘤肺转移作用，其抗瘤作用的产生至少为NK和T细胞依赖的；IL-15裸质粒DNA对小鼠肺腺癌LA795模型小鼠有明显的早期局部治疗作用，可提高小鼠的存活率，延长存活期，并对防止肿瘤发生有一定的保护作用。为将IL-15的这些作用应用到工业制药方面，应用发明人先前的专利申请200310115197.5中的技术，制备了重组人白细胞介素-15(rhIL-15)，它比人自身的白细胞介素-15多一个氨基酸，即多出氨基端的第一个氨基酸——蛋氨酸，该重组蛋白是否具有和IL-15同样的作用，以及是否可以应用到工业制药方面有待进一步研究。
目前临床上可用于肿瘤免疫治疗的药物有重组人白细胞介素-2(rhIL-2)，但是，IL-2的某些副作用使它不可能成为最佳的免疫治疗性T细胞生长/活化因子。这些副作用表现为活化-诱导T细胞凋亡(Van Parijs，L.，Refaeli，Y.，Lord，J.D.，Nelson，B.H.，Abbas，A.K.and Baltimore，D.Uncoupling IL-2 signals that regulate T cellproliferation，survival，and Fas-mediated activation-induced cell death.Immunity；1999，11281-286.Refaeli Y，Van Parijs L，London C A，et al.Biochemical mechanisms ofIL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis.Immunity，1998，8(5)615～623.Lenardo，M.J.Fas and the art of lymphocyte maintenance.J.Exp.Med.1996 183721-724.)，抑制记忆性CD8+T细胞的增殖和存活(Ku CC，Murakami M，Sakamoto A，Kappler J，Marrack P.Control of homeostasis of CD8+memory T cells by opposing cytokines.Science.2000 Apr 28；288(5466)675-8.X.Zhang，S.Sun，and I.Hwang.Potent andselective stimulation of memory-phenotype CD8+T cells in vivo by IL-15.Immunity1998.8591-599.)，以及高剂量IL-2还会引起剂量限制性毒性等(S.A.Rosenberg，J.C.Yang，and S.L.Topalian，et al.Treatment of 283 consecutive patients withmetastatic melanoma or renal cell cancer using high dose bolus interleukin 2[comment]JAMA 1994.271907-913.)。并且，发明人还发现，rhIL-2的抗肿瘤转移和预防肿瘤复发的效果还不够理想。
发明内容
本发明的目的在于提供重组人白细胞介素-15(rhIL-15)在制备可用于抗肿瘤转移和预防肿瘤复发的药物中的应用。
在所述药物应用中，rhIL-15可以是重组DNA分子在原核细胞中的表达产物，也可以是在真核细胞如酵母中的表达产物。
具体地说，本发明还提供了以该重组人白细胞介素-15作为药用成分的药物组合物，可用于抗肿瘤转移和预防肿瘤复发。所述组合物为药学上可接受的剂型。
更具体地说，本发明提供了一种重组人白细胞介素-15注射用粉针剂，可用于提高机体免疫力，增强肿瘤免疫治疗。该粉针剂是将50mg/100ml的重组人白细胞介素-15和0.1～5g/100ml甘露醇冻干而成。该注射用粉针剂以重组人白细胞介素-15(0.5mg/ml)为药效成分，并佐以1％(g/100ml)甘露醇作为赋型剂，使用时以0.9％生理盐水为溶媒。适用于多种给药途径，包括皮内、皮下、肌内、腹腔、局部或静脉内给药。
本发明将重组人白细胞介素-15(rhIL-15)制备成可用于抗肿瘤转移和预防肿瘤复发的药物，并首次成功地在小鼠肺腺癌LA795移植瘤模型和小鼠黑色素瘤B16移植瘤模型上证明了rhIL-15的抗肿瘤作用，结果表明rhIL-15能有效抑制或延缓荷瘤小鼠肿瘤结节的形成，明显抑制肿瘤生长，甚至完全清除肿瘤细胞，防止肿瘤复发，延长荷瘤小鼠的存活时间，提高存活率。此外，rhIL-15还能有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤转移。因此，将rhIL-15开发成抗肿瘤转移和预防肿瘤复发的创新药物并用于临床肿瘤治疗具有很好的前景。
图1-1为不同剂量rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的抑瘤作用实验的给药过程示意图；图1-2为经过图1-1治疗后荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；图1-3为经过图1-1治疗后荷瘤小鼠存活率曲线；图2-1为相同生物活性剂量的rhIL-15和rhIL-2对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用实验的给药过程示意图；图2-2为经过图2-1治疗后荷瘤小鼠的肿瘤大小比较图片；图2-3为经过图2-1治疗后荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；图2-4为经过图2-1治疗后荷瘤小鼠存活率曲线；图2-5为经过图2-1治疗后小鼠肿瘤肺转移图片，其中A为生理盐水组，B为rhIL-2治疗组，C为rhIL-15治疗组；图2-6为经过图2-1治疗后小鼠肿瘤肝转移图片，其中A为生理盐水组，B为rhIL-2治疗组，C为rhIL-15治疗组；图3-1为不同细胞接种量的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型抑瘤作用实验的给药过程示意图；
图3-2为肿瘤接种量为5×104/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠肿瘤结节形成情况分析曲线；图3-3为肿瘤接种量为1×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠肿瘤结节形成情况分析曲线；图3-4为肿瘤接种量为5×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠肿瘤结节形成情况分析曲线；图3-5为肿瘤接种量为5×104/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲线；图3-6为肿瘤接种量为1×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲线；图3-7为肿瘤接种量为5×105/只的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率分析曲线；图4-1为rhIL-15对不同细胞接种数量的小鼠肺腺癌LA795静脉播散模型的抗肿瘤转移作用实验给药过程示意图；图4-2为rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795静脉播散模型小鼠的肺肿瘤灶数量和大小的影响图片；图5-1为不同剂量rhIL-15对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型的抑瘤作用实验给药过程示意图；图5-2为不同剂量rhIL-15治疗对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型小鼠的肿瘤生长的抑制曲线；图5-3为不同剂量rhIL-15治疗对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型小鼠存活率的影响曲线；图6-1为rhIL-15治疗对不同细胞接种量的小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型的抗肿瘤转移作用实验给药过程示意图；图6-2为rhIL-15治疗后小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型小鼠的存活时间图；图7-1为rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的CTL/NK活性的影响实验给药过程示意图；图7-2为rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠脾细胞的CTL细胞毒活性的影响曲线。
图7-3为rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠脾细胞的NK杀伤活性的影响曲线。
具体实施例方式
本发明的重组人细胞介素-15或以该重组人白细胞介素-15为药性成分的药物可以用于手术后肿瘤治疗，或/和协同化疗和放疗，清除残余的肿瘤细胞，增强机体抗肿瘤免疫，抗肿瘤转移和预防肿瘤复发。
本发明中，所使用的术语定义如下术语“荷瘤小鼠”是指接种LA795肿瘤细胞的T739小鼠或接种B16肿瘤细胞的C57小鼠。
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。
实施例1重组人白细胞介素-15的制备制备重组人白细胞介素-15，可采用发明人先前申请的专利中介绍的方法(中国专利申请号200310115197.5，发明名称可用于生产人重组白细胞介素-15的原核表达工程菌及纯化方法)。在此不赘述。
实施例2重组人白细胞介素-15的比活性测定用对数生长期的CTLL-2细胞以3H-TdR掺入法测量上述实施例1的重组人白细胞介素-15的促细胞增殖活性，以IL-2标准品对照，计算出重组人白细胞介素-15的单位质量活性。具体步骤如下1)1000×g离心8min收集对数生长期CTLL-2细胞，用含10％FCS的1640培养基洗涤细胞2次，每次1000×g离心8min，除去原培养基中的IL-2。
2)调整细胞浓度至1～2×105/ml。
3)96孔培养板，加100μl/孔CTLL-2细胞悬液(1～2×104/孔)。
4)加入100μl/孔不同稀释浓度的标准品IL-2(终浓度最好在200U/ml以内)或待测样品，设3个重复孔。
5)37℃，5％CO2孵箱培养24～48h，待对照孔细胞死亡超过90％时，每孔加入3H-TdR 0.5μCi/50μl，继续培养4～6h。
6)用细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维纸上。
7)干燥后移入液闪瓶，每瓶加入5ml闪烁液，用液闪仪测β射线的cpm值。
计算视最大放射活性孔为100％掺入孔，其他各孔测得的cpm值与之相除即为掺入百分数。将不同稀释度的IL-2标准品或待测样品所对应的掺入百分数作图，纵轴为概率坐标，横轴为稀释倍数取log2后的值。自掺入百分数50％处画一横线，与IL-2标准品掺入百分数和待测样品掺入百分数斜线的交点，即可得到样品和标准品的稀释倍数，由以下公式计算出待测样品的活性单位。
结果显示该重组人白细胞介素-15的体外比生物活性为6.7×106U/mg。
实施例3rhIL-15体内药效学实验-对小鼠肺腺癌LA795移植瘤模型的治疗作用。
该实验中，试验药物为重组人白细胞介素-15注射用粉针剂。使用甘露醇作为赋型剂，溶液中甘露醇含量为1％，重组人白细胞介素-15含量为0.5mg/ml，将其分装成每支含2mg rhIL-15于安瓿内冻干。使用时，将冻干物溶于0.9％生理盐水备用。
1.不同剂量rhIL-15对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用T739近交系小鼠，6～8周龄，雌、雄各半，每组10只，共50只。新鲜传代培养的LA795细胞，用胰酶消化，RPMI-1640培养液洗涤2次，重悬，离心，计数并制成1×107/ml的细胞悬液，小鼠左后肢腋窝(腹股沟)靠外侧皮下接种0.1ml(即1×106/只)。
分组1)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
2)rhIL-2治疗组40kU/天(市售rhIL-2，欧耐特，北京瑞得合通药业有限公司)。
3)低剂量rhIL-15治疗组10kU/天(自制rhIL-15)。(1kU相当于0.15μg)4)中剂量rhIL-15治疗组20kU/天(自制rhIL-15)。
5)高剂量rhIL-15治疗组40kU/天(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤(D0)后第7天(D7)开始腹腔注射给药，每周连续给药5天，停药2天，连续给药4周，共给药20天，第33天(D33)开始停药。给药过程参见图1-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察每天观察一次各治疗组小鼠肿瘤生长及存活情况。每三天测量一次肿瘤的长径和短径，并计算出肿瘤结节大小(肿瘤大小＝0.4×长径×短径2)，结束给药后继续观察4周。解剖实验结束前死亡或最终处死的小鼠，取肺、肝、脾、肾、淋巴结和肿瘤组织进行病理检查。镜下观察肺、肝、淋巴结和肿瘤组织中淋巴细胞和中性粒细胞浸润情况以及肿瘤转移情况。
结果1)抑瘤效果接种肿瘤后7～10天，各组小鼠开始有肿瘤结节形成，随着时间推移，肿瘤结节不断长大。接种肿瘤后第7天开始给药治疗，共治疗4周。给药后肿瘤仍见生长，但是相对生理盐水治疗组，rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组肿瘤生长受到抑制，并且所有3个剂量的rhIL-15治疗组的小鼠肿瘤结节均比rhIL-2治疗组生长慢。第65天时，不同剂量rhIL-15治疗组间，肿瘤大小有随给药剂量增加而递减的趋势，即不同剂量rhIL-15治疗组的肿瘤大小有简单的量效关系趋势，详见图1-2。图1-2为不同剂量rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的肿瘤生长的抑制作用。
2)对荷瘤小鼠存活率影响图1-3示出rhIL-15治疗可以提高荷瘤小鼠存活率，从图中可以看出，接种肿瘤后第24天，小鼠开始死亡，但rhIL-2治疗组和所有rhIL-15治疗组小鼠同期存活率均高于生理盐水组。第60天时，高剂量rhIL-15治疗组和中剂量rhIL-15治疗组的小鼠存活率分别为100％和91％，均显著高于生理盐水组的30％(均为p＜0.01)。低剂量rhIL-15治疗组小鼠存活率为60％，高于生理盐水组小鼠存活率，但无显著性差异。rhIL-2治疗组小鼠存活率为81％，显著高于生理盐水组(p＜0.05)。由此可知，rhIL-2和rhIL-15能有效延长小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的存活期。
高剂量rhIL-15治疗组和中剂量rhIL-15治疗组的小鼠存活率高于rhIL-2治疗组，但差异均无显著性。此外，不同剂量rhIL-15治疗组间小鼠存活率也有随给药剂量增加而递增的趋势，呈现出简单的剂量-效应关系。图1-3为不同剂量rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠存活率的影响(*p＜0.05，**p＜0.01)。
2.相同生物活性剂量的rhIL-15和rhIL-2对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的抑瘤作用T739近交系小鼠，雄性，12周龄，生理盐水组10只，rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组各12只，共34只。新鲜传代培养的LA795细胞，胰酶消化，RPMI-1640培养液洗涤2次，重悬，离心，计数并制成1×107/ml的细胞悬液。小鼠左后肢腋窝(腹股沟)靠外侧皮下接种0.1ml LA795细胞，即1×106/只。
分组生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2治疗组40kU/天(市售rhIL-2)。
rhIL-15治疗组40kU/天(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤(D0)后第3天(D3)开始腹腔注射给药，每天1次，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，连续给药4周，共给药20天，第30天(D30)开始停药。给药过程参见图2-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察每天观察一次各治疗组小鼠肿瘤生长及存活情况。每三天测量一次肿瘤的长径和短径，并计算出肿瘤结节大小，结束给药后继续观察4周。解剖实验结束前死亡或最终处死的小鼠，取肺、肝、脾、肾、淋巴结和肿瘤组织进行病理检查。镜下观察肺、肝、淋巴结和肿瘤组织中淋巴细胞和中性粒细胞浸润情况以及肿瘤转移情况。
结果1)抑制肿瘤生长效果接种肿瘤后第10天，生理盐水组的所有10只小鼠全部长出肿瘤结节，而rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组分别只有11只(共12只)和5只(共12只)长出肿瘤结节。rhIL-15治疗组，直至接种肿瘤后第27天，最后一只小鼠才长出肿瘤结节。随着时间推移，各组小鼠的肿瘤结节均不断长大。接种肿瘤后第3天开始给药治疗，共治疗4周，治疗后肿瘤仍见生长，但是rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组肿瘤生长受到抑制(参见图2-2，图中，从左到右依次为生理盐水组、rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组)，同期肿瘤大小依次为生理盐水组＞rhIL-2治疗组＞rhIL-15治疗组。图2-2为rhIL-15治疗或rhIL-2治疗后荷瘤小鼠的肿瘤大小的比较方差分析结果显示，自第11天起，直至研究结束，rhIL-15治疗组小鼠的肿瘤大小均明显小于生理盐水组(p＜0.001)，rhIL-2治疗组小鼠自第14天起，肿瘤大小明显小于生理盐水组(p＜0.05)。此外，在第14-49天，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤大小也明显小于rhIL-2治疗组(p＜0.05)。此研究结果表明，rhIL-2或rhIL-15治疗均能有效抑制LA795小鼠肺腺癌肿瘤生长，并且相同生物活性剂量的rhIL-2和rhIL-15的比较显示，rhIL-15抑制LA795小鼠肺腺癌肿瘤生长的能力更强(参见图2-3)。图2-3中，rhIL-15治疗抑制小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的肿瘤生长(*p＜0.05，***p＜0.001)。
2)提高荷瘤小鼠存活率，延长荷瘤小鼠存活时间如图2-4所示，接种肿瘤后第32天，小鼠开始陆续死亡。终止治疗给药(第30天)4周后，第59天rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组小鼠存活率分别为67％和100％，生理盐水组为60％。数据统计分析表明，终止治疗给药4周后，rhIL-15治疗组小鼠存活率显著高于生理盐水组和rhIL-2治疗组(均为p＜0.05)。但是，由于第30天荷瘤小鼠开始停止给药治疗，肿瘤生长不受抑制，因此自接种肿瘤后第60天，rhIL-2治疗组小鼠存活率开始接近生并自此开始低于生理盐水组。rhIL-15治疗组小鼠也开始快速死亡，但是荷瘤小鼠最大存活期还是长于生理盐水组。此研究结果表明，rhIL-15能明显提高荷瘤小鼠的存活率，延长荷瘤小鼠存活时间，并且rhIL-15比rhIL-2更为有效。图2-4为rhIL-15治疗对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠的存活率的影响(*p＜0.05)。
3)抑制小鼠肿瘤转移效果解剖所有实验结束前死亡小鼠，进行大体病理学检查，取肺、肝、淋巴结和肿瘤组织进行组织病理学检查。肺、肝和淋巴结组织石蜡切片H.E.染色结果显示，生理盐水组有7只小鼠(7/10只)发生肿瘤的肺、肝或淋巴结转移，而rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组分别为8只(8/11只)和7只(7/12只)，数据统计分析表明，发生肿瘤转移的小鼠数量没有显著性差异。但是，各组小鼠肿瘤转移程度有差别，生理盐水组小鼠肿瘤肺转移和肝转移相对严重，基本上为III级和IV级，而rhIL-15治疗组肿瘤转移相对较轻，基本上为I级和II级，rhIL-2治疗组居中(参见图2-5小鼠肿瘤肺转移和图2-6小鼠肿瘤肝转移)。肿瘤淋巴结转移较少发生，发生淋巴结转移的小鼠也都是存活时间较长的荷瘤小鼠，转移程度也往往较严重。表1示出小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型小鼠肿瘤肺、肝、淋巴结转移情况分析。
如表1所示，生理盐水组肿瘤肺转移III级或III级以上为4只(4/10只)，而rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组分别为2只(2/11只)和无(0/12只)。生理盐水组肿瘤肝转移III级或III级以上为6只(6/9只)，而rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组分别为7只(7/10只)和无(0/12只)。生理盐水组肿瘤淋巴结转移III级或III级以上为1只(1/10只)，而rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组也分别为1只(1/11只)和1只(1/12只)。数据统计分析表明，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肺III级或III级以上转移明显少于生理盐水组(p＜0.05)，rhIL-2治疗组也少于生理盐水组，但无显著性差异。rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肝III级或III级以上转移也明显少于生理盐水组和rhIL-2治疗组(均为p＜0.01)，rhIL-2治疗组与生理盐水组间无明显差别。肿瘤淋巴结转移在三组间均无明显差别。此研究结果提示，rhIL-15具有良好的抗LA795小鼠肺腺癌肿瘤转移作用，并且其抗肿瘤转移作用强于rhIL-2。
表1
注N为此治疗组组织病理学鉴定为有肿瘤转移的小鼠只数，n为此治疗组组织病理学鉴定例数。肿瘤转移程度分级I级——个别或少数散在较小的肿瘤细胞团(全肺5个以下)。II级——较多散在的小肿瘤细胞灶(全肺5个以上)。III级——较大的转移肿瘤团块(不计数量)。IV级——布满一个肺叶或肝叶的转移瘤(*p＜0.05，**p＜0.01)。
3.rhIL-15对不同细胞接种数的小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的早期治疗作用T739近交系小鼠，雌性，7周龄，生理盐水组8只，rhIL-2治疗组和rhIL-15治疗组每组各9只，共78只。新鲜传代培养的LA795细胞，胰酶消化，RPMI-1640培养液洗涤2次，重悬，离心，计数并制成5×105/ml、1×106/ml和5×106/ml的细胞悬液，分别于小鼠右后侧背部皮下接种0.1ml，即分别接种5×104/只、1×105/只或5×105/只的LA795细胞。
治疗分组(1)5×104/只(接种细胞数)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只(接种细胞数)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只(接种细胞数)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤(D0)前3天(D-3)开始预防性给药，每天1次，连续给药3天，接种肿瘤后第1天(D1)开始治疗性给药，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，共连续给药12周(第82天停药，D82)。停药8周后仍未长出肿瘤结节的小鼠，再次(第138天，D138)在第一次接种部位的对侧皮下接种5×104/只的LA795细胞进行攻击，继续观察60天(至第198天，D198)，看能否长出肿瘤结节。给药过程参见图3-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察肿瘤结节的长出率、长出时间和肿瘤大小，荷瘤小鼠的存活时间。每天观察1次，每3天测量一次肿瘤大小。
结果1)抑制小鼠肿瘤结节的形成如图3-2所示，在肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠中，生理盐水组小鼠在接种肿瘤后第14天开始长出肿瘤结节，至第24天时，所有小鼠均长出肿瘤结节(8/8只，100％)。rhIL-2治疗组小鼠在第19天开始长出肿瘤结节，至第35天最后一只小鼠长出肿瘤结节，累计共有3只(3/9只，33％)小鼠长出肿瘤结节。而直到第138天时，rhIL-2治疗组另外6只小鼠(6/9只)和rhIL-15治疗组的全部小鼠均未长出肿瘤结节(0/9只，0％)。统计学分析结果显示，第35天起，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤结节长出率显著低于生理盐水组(p＜0.001)，rhIL-2治疗组小鼠肿瘤结节长出率也显著低于生理盐水组(p＜0.01)。此外，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤结节长出率低于rhIL-2治疗组，但差异无显著性。此研究结果初步表明，rhIL-15和rhIL-2均能显著延缓和抑制肿瘤结节的形成，并且相对于rhIL-2，rhIL-15可能更为有效。
图3-3显示另一组实验结果，在肿瘤细胞接种量为I×105/只小鼠中，生理盐水组和rhIL-2治疗组小鼠在接种肿瘤后第14天开始长出肿瘤结节，至第24天时此两组所有小鼠均长出肿瘤结节(分别为8/8只和9/9只，均为100％)，第24天前，生理盐水组小鼠肿瘤结节长出率一直高于rhIL-2治疗组，但只在第16天差异有统计学显著性(p＜0.05)。而rhIL-15治疗组小鼠直到第138天时均未长出肿瘤结节(0/9只，0％)。统计学分析结果显示，自第24天起，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤结节长出率均显著低于生理盐水组和rhIL-2治疗组(均为p＜0.001)。此实验结果再次表明，rhIL-15能显著延缓和抑制肿瘤结节的形成，并且rhIL-15相对rhIL-2更为有效。
图3-4显示肿瘤细胞接种量为5×105/只小鼠的实验结果，接种肿瘤后第10天开始长出肿瘤结节，第14天时，生理盐水组和rhIL-2治疗组分别有8只(8/8只)和6只(6/9只)小鼠长出肿瘤结节，而rhIL-15治疗组无小鼠长出肿瘤结节。接种肿瘤后第24天，生理盐水组和rhIL-2治疗组小鼠均全部长出肿瘤结节，即长出率均为100％，而rhIL-15治疗组仅有1只小鼠长出肿瘤结节。至第50天时，rhIL-15治疗组最后一只小鼠长出肿瘤结节，至此，rhIL-15治疗组累计共有5只(5/9只，56％)小鼠长出肿瘤结节，其他4只(4/9只，44％)直至第138天也未长出肿瘤结节。数据统计分析表明，接种肿瘤后，第50天前，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤结节长出率一直显著低于rhIL-2治疗组和生理盐水组(均为p＜0.05)。因此，此实验结果进一步表明，rhIL-15能显著抑制肿瘤结节的形成，并且作用比rhIL-2强。
至接种肿瘤后第138天，此研究的所有小鼠，有4组共28只没有长出肿瘤结节，这些小鼠分别为细胞接种量5×104/只组和1×105/只组的rhIL-15治疗组的全部18只小鼠、5×104/只组的rhIL-2治疗组的6只和5×105/只组的rhIL-15治疗组的4只小鼠。第138天，即停止治疗给药(第82天停药)8周后，所有未长出肿瘤结节的小鼠，再次在第一次接种肿瘤部位的对侧背部皮下接种5×104/只的小鼠肺腺癌LA795细胞进行攻击，两个月后(即至第198天)均未长出肿瘤结节。此研究结果表明，这些小鼠已经完全治愈，并且已经有对小鼠肺腺癌LA795细胞的记忆免疫。
综上所述，可以得出结论，rhIL-15和rhIL-2均能显著延缓和抑制肿瘤结节的形成，并且rhIL-15相对rhIL-2更为有效。
2)提高荷瘤小鼠存活率，延长荷瘤小鼠存活期如图3-5所示，在肿瘤细胞接种量为5×104/只小鼠中，生理盐水组小鼠自接种肿瘤后第69天开始死亡，至第101天，生理盐水组所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理盐水组小鼠最大存活期为101天，第138天存活率为0％。rhIL-2治疗组小鼠自接种肿瘤后第77天开始死亡，至第105天最后一只荷瘤小鼠死亡，累计共死亡3只(3/9只)，直至第138天，仍有6只小鼠(6/9只)存活，因此，第138天存活率为67％。rhIL-15治疗组小鼠因均未长出肿瘤结节(0/9只)，所以直至第138天，9只小鼠(9/9只)均存活，存活率为100％。数据统计分析表明，rhIL-15治疗组(p＜0.001)和rhIL-2治疗组(p＜0.01)小鼠第138天存活率均显著高于生理盐水组。rhIL-15治疗组小鼠第138天存活率也高于rhIL-2治疗组，但差异无统计学显著性。rhIL-15治疗组和rhIL-2治疗组存活小鼠再次肿瘤攻击60天后(第198天)，仍未长出肿瘤结节，并且存活，因此，认为这些荷瘤小鼠已经治愈，并对LA795小鼠肺腺癌细胞有记忆免疫。此外，各组小鼠存活时间的方差分析结果显示，rhIL-15治疗组小鼠的存活时间显著长于生理盐水组(p＜0.001)，rhIL-2治疗组小鼠的存活时间也显著长于生理盐水组(p＜0.01)。此研究结果表明，rhIL-15治疗和rhIL-2治疗均能显著提高荷瘤小鼠存活率，延长荷瘤小鼠存活期，并且rhIL-15相对rhIL-2可能更为有效。
如图3-6所示，在肿瘤细胞接种量为1×105/只小鼠中，生理盐水组小鼠自接种肿瘤后第69天开始死亡，至第96天，所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理盐水组小鼠最大存活期为96天，第138天存活率为0％。rhIL-2治疗组小鼠自接种肿瘤后第69天开始死亡，至第86天最后一只荷瘤小鼠死亡，累计共死亡9只(9/9只)，因此，rhIL-2治疗组小鼠最大存活期为86天，第138天存活率为0％。rhIL-15治疗组小鼠因均未长出肿瘤结节(0/9只)，所以直到第138天，9只小鼠(9/9只)均存活，存活率为100％。数据统计分析表明，rhIL-15治疗组第138天存活率均显著高于生理盐水组和rhIL-2治疗组(p＜0.001)。rhIL-15治疗组小鼠再次肿瘤攻击60天后(第198天)，仍未长出肿瘤结节，并且存活，因此，认为这些荷瘤小鼠已经治愈，并对LA795小鼠肺腺癌细胞有记忆免疫。此外，各组小鼠存活时间的方差分析结果显示，rhIL-15治疗组小鼠存活期明显长于生理盐水组和rhIL-2治疗组(p＜0.001)。此研究结果进一步证明，rhIL-15能显著提高荷瘤小鼠存活率，延长荷瘤小鼠存活时间，并且比rhIL-2更为有效。
如图3-7所示，肿瘤细胞接种量为5×105/只的小鼠，其中生理盐水组小鼠自接种肿瘤后第57天开始死亡，至第65天时，生理盐水组所有小鼠死亡(8/8只)，因此，生理盐水组小鼠最大存活期为65天，第138天存活率为0％。rhIL-2治疗组小鼠自接种肿瘤后第44天开始死亡，至第94天最后1只荷瘤小鼠死亡，累计9只(9/9只)小鼠全部死亡，因此，rhIL-2治疗组小鼠最大存活期为94天，第138天存活率为0％。rhIL-15治疗组小鼠自接种肿瘤后第90天开始死亡，至第130天最后1只荷瘤小鼠死亡，累计共死亡5只(5/9只)，直至第138天，尚有4只小鼠(4/9只)存活，即第138天存活率为44％，并且认为此4只小鼠为治愈。数据统计分析表明，rhIL-15治疗组荷瘤小鼠的存活率，自第61天起显著高于生理盐水组(p＜0.01)，自第66天起显著高于rhIL-2治疗组(p＜0.05)。rhIL-2治疗组小鼠存活率，自第61天起就高于生理盐水组，但由于动物数少，至第65天才开始有显著性差异(p＜0.05)。rhIL-15治疗组存活的4只小鼠再次肿瘤攻击60天后(至第198天)，仍未长出肿瘤结节，并且存活，因此，认为这些荷瘤小鼠已经治愈，并对LA795小鼠肺腺癌细胞有记忆免疫。此外，各组小鼠存活时间的方差分析结果显示，rhIL-15治疗组小鼠存活时间明显长于生理盐水组和rhIL-2治疗组(p＜0.001)。此研究结果进一步证明，rhIL-15治疗能显著延长荷瘤小鼠的存活时间，提高荷瘤小鼠存活率，并且rhIL-15比rhIL-2治疗更为有效。
第138天，即停止治疗(第82天停药)8周后，所有未长出肿瘤结节并存活的小鼠，再次皮下接种5×104/只的小鼠肺腺癌LA795细胞进行肿瘤攻击，2个月后(即至第198天)均未长出肿瘤结节，因此，认为这些小鼠为完全治愈，并且已经有对小鼠肺腺癌LA795细胞的记忆免疫。
综上所述，可以得出结论，rhIL-15和rhIL-2均能显著提高荷瘤小鼠的存活率，延长荷瘤小鼠的存活期，并且rhIL-15相对rhIL-2更为有效。
4.rhIL-15对不同细胞接种数的小鼠肺腺癌LA795静脉播散模型的抗肿瘤转移作用T739近交系小鼠，雄性或雌性，8周龄，每组9只，共81只。新鲜传代培养的LA795细胞，用胰酶消化，RPMI-1640培养液洗涤2次，重悬，离心，计数并制成5×105/ml，1×106/ml，5×106/ml的细胞悬液，每只小鼠分别经尾静脉注射接种0.1ml，即分别接种5×104/只、1×105/只或5×105/只的LA795细胞。
治疗分组(1)5×104/只(雄性小鼠)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只(雄性小鼠)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只(雌性小鼠)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤细胞(D0)前6天(D-6)开始预防给药，每天1次，连续给药3天，停药1天，然后连续给药2天，第0天(D0)接种肿瘤，第1天(D1)开始治疗给药，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，共连续给药6周，即给药直至第40天(D0)。给药过程参见图4-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察和处理每天观察一次小鼠存活状态。肿瘤细胞接种量为1×105/只和5×105/只的小鼠，第41天(D41)摘眼球放血处死。肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠，给药6周后即停止治疗，直到第106天(D106)尚未死亡的小鼠，摘眼球放血处死。取心、肝、肺、淋巴结和肿瘤组织进行病理学检查，肺经气管充墨汁染色，计数肺表面的肿瘤灶个数，其余各脏器常规石腊切片，镜下观察肿瘤转移情况。
结果表2给出小鼠肺腺癌LA795静脉播散模型细胞数梯度实验肿瘤转移情况分析。
表2
注N为此治疗组病理学鉴定为有肿瘤转移的小鼠例数，n为此治疗组病理学鉴定的小鼠例数。(*p＜0.05，2-sided Fisher’s Exact Test，双侧费歇尔精确概率法)
如表2所示，在所有肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠中，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肺转移为2只(2/9只)，低于生理盐水组的5只(5/9只)和rhIL-2治疗组的3只(4/9只)。rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肝转移或其他器官转移分别为0和1只(1/9只)，均低于生理盐水组的3只(3/9只)和5只(5/9只)，也低于rhIL-2治疗组的2只(2/9只)和2只(2/9只)。rhIL-15治疗组发生肿瘤转移的小鼠为2只(2/9只)，少于生理盐水组的6只(6/9只)和rhIL-2治疗组的5只(5/9只)。
在肿瘤细胞接种量为1×105/只的小鼠中，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肺转移为4只(4/9只)(p＜0.05)，rhIL-2治疗组为5只(5/9只)(p＜0.05)，均低于生理盐水组的9只(9/9只)。rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肝转移或其他器官转移均为0，即没有发生，显著低于生理盐水组的4只(4/9只)和4只(4/9只)(均为p＜0.05)，也低于rhIL-2治疗组的1只(1/9只)和1只(1/9只)。rhIL-15治疗组发生肿瘤转移的小鼠为4只(4/9只)，少于生理盐水组的9只(9/9只)(p＜0.05)和rhIL-2治疗组的6只(6/9只)。
在肿瘤细胞接种量为5×105/只的小鼠中，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肺转移为6只(6/9只)，低于生理盐水组的9只(9/9只)，也低于rhIL-2治疗组的8只(8/9只)。rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肝转移或其他器官转移均为1只(1/9只)和0，低于生理盐水组的1只(1/9只)和2只(2/9只)，rhIL-2治疗组分别为0和1只(1/9只)。rhIL-15治疗组发生肿瘤转移的小鼠为6只(6/9只)，低于生理盐水组的9只(9/9只)和rhIL-2治疗组的8只(8/9只)。
因此，从肿瘤肺转移、肝转移、其他器官转移以及转移小鼠的例数上看，均可以得出结论rhIL-15治疗可以减少小鼠肺腺癌LA795静脉播散模型肿瘤转移的发生，并且作用有比rhIL-2强的趋势。
实验结果还显示，肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠，生理盐水组1只、rhIL-2治疗组2只及rhIL-15治疗组1只小鼠肿瘤肺转移严重，程度相差不大。此4只小鼠均在停止治疗之后研究结束之前死亡，死亡时间依次为生理盐水组Day 61、rhIL-2治疗组Day 72和Day 101、rhIL-15治疗组Day 83。其他肉眼检查不能判定的肿瘤肺转移者均为组织病理学鉴定结果，转移程度均在I～II级。
实验结果还显示，肿瘤细胞接种量为1×105/只和5×105/只的小鼠，发生肿瘤肺转移的例数比较多，而且多数肺表面可见肿瘤灶。如图4-2所示，在此两组不同肿瘤细胞接种量的小鼠中，rhIL-15治疗组小鼠肺肿瘤转移灶个数少，而且小，一般只有1个或者没有肉眼可见的肿瘤灶。rhIL-2治疗组小鼠肺肿瘤转移灶一般为1～3个，甚至更多，肿瘤转移灶也较大。生理盐水组小鼠的肺肿瘤转移灶一般都在5个以上，整个肺叶几乎都长满肿瘤转移灶，组织结构完全被破坏。不同治疗组间，肺肿瘤灶数目及大小依次为生理盐水组＞rhIL-2治疗组＞rhIL-15治疗组，肿瘤肺转移严重程度也依次为生理盐水组＞rhIL-2治疗组＞rhIL-15治疗组。因此，从肿瘤转移的严重程度上看，得出结论，rhIL-15治疗能有效抑制肺肿瘤转移灶的形成，并且作用比rhIL-2强。
综上所述，rhIL-15有良好的抗肿瘤转移作用，并且作用比rhIL-2强。
实施例4rhIL-15体内药效学实验-对小鼠黑色素瘤B16移植瘤模型的治疗作用。
该实验中，试验药物为重组人白细胞介素-15注射用粉针剂。使用1％(g/100ml)甘露醇作为赋型剂，重组人白细胞介素-15含量为0.5mg/ml，将其分装成每支含2mg rhIL-15于安瓿内冻干。使用时，将冻干物溶于0.9％生理盐水备用。
1.不同剂量rhIL-15对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型的抑瘤作用C57BL/6小鼠，雌性，7周龄，每组12只，6组共72只。新鲜传代培养的小鼠黑色素瘤B16细胞，用RPMI-1640培养液洗涤，重悬，离心，计数并制成5×106/ml的细胞悬液。每只小鼠于左后肢腋窝(腹股沟)皮下接种0.1ml，即5×105/只。
分组1)生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
2)rhIL-2治疗组40kU/次(市售rhIL-2)。
3)rhIL-15(高剂量)治疗组80kU/次(自制rhIL-15)。
4)rhIL-15(中剂量)治疗组40kU/次(自制rhIL-15)。
5)rhIL-15(低剂量)治疗组10kU/次(自制rhIL-15)。
6)IL-2+rhIL-15联合治疗组rhIL-15(自制)和rhIL-2(市售)各20kU/次。
给药方案接种肿瘤(D0)后第3天(D3)开始给药，每天1次，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，连续给药数周，直至其中某一组超过半数小鼠死亡，停药当天处死。给药过程参见图5-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察观察并记录肿瘤结节的长出时间和肿瘤大小，荷瘤小鼠的存活时间。每天观察1次，每3天测量一次肿瘤大小。
结果
肿瘤接种后第3天开始治疗给药，并以生理盐水作为治疗对照。如图5-2所示，接种肿瘤后4～7天，各组小鼠肿瘤结节形成，随着时间推移，肿瘤结节不断长大。治疗给药后，肿瘤仍见生长，但是相对生理盐水组，各治疗组小鼠肿瘤生长受到不同程度的抑制。数据统计分析表明，除rhIL-2治疗组小鼠在第18天肿瘤大小与生理盐水组有显著性差异外(p＜0.05)，其他治疗组均无显著性差异。
如图5-3所示，接种肿瘤后第14天，小鼠开始死亡。至接种肿瘤后第23天，生理盐水组已死亡8只，存活4只，存活率为33％。rhIL-2(40kU/次)治疗组死亡6只，存活6只，存活率为50％。rhIL-15(80kU/次)治疗组死亡5只，存活7只，存活率为58％。rhIL-15(40kU/次)治疗组死亡4只，存活8只，存活率为67％。rhIL-15(10kU/次)治疗组死亡5只，存活7只，存活率为58％。rhIL-2+rhIL-15联合治疗组(各20kU/次)死亡1只，存活11只，存活率92％。由此可见，各治疗组第23天的小鼠存活率均高于生理盐水组，但是，数据的统计分析结果表明，除rhIL-2+rhIL-15联合治疗组与生理盐水组有显著性差异(p＜0.01)外，其他各治疗组与生理盐水组间均无显著性差异。高剂量和低剂量rhIL-15治疗组的小鼠存活率一致，均低于中剂量rhIL-15治疗组，却均高于rhIL-2治疗组，但差异无显著性。此外，rhIL-2+rhIL-15联合治疗组小鼠第23天的存活率同rhIL-2治疗组相比有显著性差异(p＜0.05)。此研究结果表明，rhIL-2或rhIL-15治疗能够有效提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率，此外，rhIL-2+rhIL-15联合应用比rhIL-2或rhIL-15单独应用更能有效提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率。
2.rhIL-15对不同细胞接种量的小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型的抗肿瘤转移作用C57BL/6近交系小鼠，雌性，5周龄，每组2～3只，共15只。新鲜传代培养的小鼠黑色素瘤B16细胞，用RPMI-1640培养液洗涤，重悬，离心，计数并制成5×105/ml、1×106/ml和5×106/ml的细胞悬液，每只小鼠分别尾静脉注射接种0.1ml，即分别接种5×104/只、1×105/只或5×105/只的小鼠黑色素瘤B16细胞。
实验分组(1)5×104/只生理盐水组(2只)生理盐水0.1ml/天。
rhIL-15组(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
(2)1×105/只生理盐水组(2只)生理盐水0.1ml/天。
rhIL-15组(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
(3)5×105/只生理盐水组(2只)生理盐水0.1ml/天。
rhIL-15组(3只)40kU/次(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤(D0)前3天(D-3)开始预防给药，每天1次，连续给药3天，接种肿瘤后第1天(D1)开始治疗性给药，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，持续给药至全部小鼠死亡。给药过程参见图6-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
观察每天观察一次小鼠的存活状态。实验结束前死亡或最终处死的小鼠均取心、肝、肺和肾，肉眼观察肿瘤转移情况。
结果此项实验为小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型的研究，主要观察各组小鼠存活时间和实验结束前死亡时肿瘤肺转移程度。肿瘤细胞接种量为1×104/只的小鼠，生理盐水组自接种肿瘤后第24天开始死亡，最大存活时间为26天，平均存活时间25.0天。rhIL-15治疗组小鼠自第29天开始死亡，最大存活时间32天，平均存活时间30.0天。肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠中，生理盐水组小鼠自接种肿瘤后第22天开始死亡，最大存活时间为26天，平均存活时间24.0天。rhIL-15治疗组小鼠自第21天开始死亡，最大存活时间31天，平均存活时间24.7天。肿瘤细胞接种量为1×105/只的小鼠中，生理盐水组小鼠自接种肿瘤后第15天开始死亡，最大存活时间为17天，平均存活时间16.0天。rhIL-15治疗组小鼠自第19天开始死亡，最大存活时间21天，平均存活时间20.0天。由此可见，所有不同肿瘤细胞接种量的小鼠，rhIL-15治疗组的最大存活时间和平均存活时间均长于生理盐水组。如图6-2所示，数据统计分析表明，肿瘤细胞接种量1×104/只和1×105/只的小鼠，rhIL-15治疗组的平均存活时间均长于生理盐水组，且差异显著(p＜0.05)。肿瘤细胞接种量为5×104/只的小鼠，rhIL-15治疗组的平均存活时间与生理盐水组比较，无显著差异。因此，rhIL-15治疗可以有效延长小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型小鼠的存活期。
解剖各组实验结束前死亡小鼠，发现全部小鼠均有肿瘤肺转移，但是相同肿瘤细胞接种量的小鼠中，rhIL-15治疗组小鼠肿瘤肺转移总是比生理盐水组的轻，生理盐水组小鼠肺叶基本全部被肿瘤破坏，已经看不到肺叶结构，而rhIL-15治疗组小鼠多数还有完整的肺叶。由此可见，rhIL-15治疗可以有效延缓小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型小鼠肿瘤肺转移。
综上所述，rhIL-15治疗能有效延长小鼠黑色素瘤B16静脉播散模型小鼠存活期，并抑制小鼠黑色素瘤B16肺转移。
实施例5rhIL-15对小鼠肺腺癌LA795皮下移植瘤模型的CTL/-NK活性的影响该实验中，试验药物为重组人白细胞介素-15注射用粉针剂。甘露醇作为赋型剂，含量为0.1～5％(g/ml)，重组人白细胞介素-15含量为0.5mg/ml，将其分装成每支含2mg rhIL-15于安瓿内冻干。使用时，将冻干物溶于0.9％生理盐水备用。
T739近交系小鼠，雄性，8周龄，每组5只，共15只。新鲜传代培养的LA795细胞，用胰酶消化，RPMI-1640培养液洗涤，重悬，离心，计数并制成5×106/ml的细胞悬液。左后肢腹股沟靠外侧皮下接种0.1ml LA795细胞悬液，即5×105/只。分组生理盐水组生理盐水0.1ml/天。
rhIL-2组40kU/次(市售rhIL-2)。
rhIL-15组40kU/次(自制rhIL-15)。
给药方案接种肿瘤(D0)后第10天(D10)开始给药，每天1次，连续给药3天，停药1天，继续给药2天，再停药1天，每周给药5天，共连续给药2周。分别于给药前、给药后一周和给药后两周断尾取血，测定血清中IFN-γ和TNF-α的水平。最后一次给药24h后即第23天(D23)各组小鼠摘眼球放血处死，无菌条件下取脾脏，分别以LA795和YAC-1为靶细胞，3H-TdR掺入法测脾细胞CTL/NK活性。给药过程参见图7-1。
给药途径腹腔注射，每次给药体积为0.1ml，给药溶剂为生理盐水。
结果皮下接种肿瘤后第10天开始给药治疗，连续给药2周，最后一次给药24h后，各组小鼠摘眼球放血处死，无菌条件下取脾脏，分离出脾细胞，分别以LA795和YAC-1为靶细胞，3H-TdR掺入法测脾细胞的CTL活性和NK活性。
实验结果参见图7-2和图7-3，表明rhIL-15治疗组和rhIL-2治疗组小鼠脾细胞的CTL活性和NK杀伤活性均高于生理盐水组。效靶比20∶1之后，rhIL-2治疗组小鼠脾细胞的CTL活性略高于rhIL-15治疗组，而其NK杀伤活性略低于rhIL-15治疗组。方差分析结果显示，效靶比20∶1之后，rhIL-15治疗组和rhIL-2治疗组小鼠脾细胞CTL活性和NK杀伤活性均与生理盐水组有显著差异(p＜0.05)，但rhIL-15治疗组与rhIL-2治疗组之间差异不显著。
权利要求
1.重组人白细胞介素-15在制备免疫治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，为制备用于抗肿瘤转移和预防肿瘤复发的药物。
3.一种用于肿瘤免疫治疗的药物，以重组人白细胞介素-15作为药性成分。
4.一种用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其包含重组人白细胞介素-15，制成药学上可接受的剂型。
5.根据权利要求4所述用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其特征在于，为一种重组人白细胞介素-15注射用粉针剂，是将50mg/100ml的重组人白细胞介素-15和0.1～5g/100ml甘露醇冻干而成。
6.根据权利要求5所述用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其特征在于，所述甘露醇浓度为1g/100ml。
全文摘要
本发明涉及一种重组蛋白的用途。更具体地说，本发明包含重组人白细胞介素－15(recombinant human interleukin－15，rhIL－15)在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。本发明还涉及包含所述重组蛋白的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK1927387SQ20051009828
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月5日 优先权日2005年9月5日
发明者何维, 唐峰, 崔莲仙, 沈永泉, 薛莉, 巴德年 申请人:中国医学科学院基础医学研究所