专利名称：吲哚丙烯酸衍生物及其用于制备免疫抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或可药用盐或水合物，它们的制备方法，含有所述化合物的药物组合物。本发明还涉及所述化合物用于制备抗器官移植排斥反应以及预防和/或治疗某些自身免疫疾病如类风湿、牛皮癣、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等疾病的药物的用途。
背景技术：
近来的研究表明，CD4在免疫排斥反应以及一些自身免疫疾病如风湿、类风湿、牛皮癣、多发性硬化症中扮演着非常重要的角色。CD4为单链跨膜糖蛋白，表达于Th细胞之上。人CD4分子量为55kDa，由435个氨基酸残基组成，胞膜外、跨膜区、胞浆内分别有374、21和40个氨基酸残基。胞膜外区结构属IgSF成员，两个N-连接糖基化位点，共有四个IgSF结构域(D1～D4)(White，R.A.H.，Mason，D.W.，1978，J.Exp.Med.148，664-673)，其中D1和D3为V样区，D3无二硫键，D2和D4为C2样区，D2的二硫键是在β片层中形成的，还有特征性疏水穿膜功能区和一短的伴有潜在丝氨酸磷酸化部位的胞浆功能区。胞浆区的三个丝氨酸(Ser408，ser415，se431)可能是PKC底物，胞浆区CxcpJI基序是与P561ck结合的位点。CD4分子作为CD4+细胞表面的糖蛋白随着CD4+T细胞的分布而分布，在各种器官中有所差异，在外周血和淋巴器官中，CD4+T细胞为辅助性T细胞(Th)，包括Th0，Th1和Th2亚群。在胸腺中，CD4阳性细胞包括CD4单阳性细胞(Th)以及CD4 CD8双阳性的不成熟T细胞。此外，CD4还表达于某些B细胞、EBV转化的B细胞以及脑细胞等。
在同种异基因移植排斥反应中，CD4+T细胞参与了不同类型的排斥反应(Abbas AK et al，ed.Cellular and Molecular Immunology，3rd ed.，P 362-381，1997.)，其在各类排斥反应中的角色也有所不同(Janeway C，et al.P 115-162 Immunobiology，4th ed.)在急性体液排斥反应中，以抗MHC分子的抗体和抗内皮细胞表面分子抗体结合相应的抗原激活补体系统导致血管损害为主，同时在炎症CD4+T细胞的效应机制参与下，导致血管炎；在急性细胞性排斥反应中，炎症性CD4+T细胞/巨嗜细胞的效应机制的参与导致间质细胞损害；在慢性排斥反应中，主要是炎症性CD4+T细胞/巨嗜细胞相关的慢性炎症，导致间质纤维化，移植物内血管硬化。可见，在各种类型的免疫排斥反应中都有CD4+T细胞的参与。而CD4二聚化或齐聚化后与MHC-II类分子的结合是CD4+T细胞活化参与免疫排斥反应的关键条件之一(Gould DS and Auchincloss H.，Immunology Today，1999(20)77-82.)。因此，抑制CD4二聚化或齐聚化这一活性形式的形成或阻断CD4与MHC-II类分子的结合可以预防或抑制同种异基因移植排斥反应。
自身免疫疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态(Zhu Y，Bao L，Zhu S，Chen Z，et al Exp Neurol 2002Sep；177(1)314-20)，由自身抗体和(或)自身应答性T淋巴细胞介导的对自身抗原发生免疫应答引起。而T细胞的活化需要双信号刺激，其中，TCR与抗原肽-MHC分子复合物的形成是关键的信号之一。在该复合物的形成过程中，CD4分子与MHC-II类分子的结合是其稳定的一个重要条件。CD4抑制剂可以选择性地抑制CD4分子活性形式的形成或阻断CD4与MHC-II类分子的结合，从而不能形成稳定的TCR与抗原肽-MHC分子复合物，导致T细胞活化所需要的双信号刺激中的一个关键信号无能，因而自身抗体和(或)自身应答性T淋巴细胞介导的对自身抗原发生免疫应答不能发生，故CD4抑制剂可以应用于自身免疫疾病如类风湿，牛皮癣，多发性硬化症，系统性红斑狼疮等的预防和治疗。由于上述环节是自身抗原和外来抗原引发的免疫反应的一个共同环节，故CD4抑制剂对移植排斥反应和自身性免疫疾病皆有作用。
发明内容
本发明的目的在于寻找并开发能够选择性地抑制CD4分子活性形式的形成或阻断CD4分子与MHC-II类分子结合从而实现免疫抑制作用的化合物。
本发明人经过研究发现，下列通式I所表示的化合物可作用于CD4分子因而具有免疫抑制作用，其可用于器官移植中的抗免疫排斥反应以及预防和/或治疗某些自身免疫疾病如类风湿、牛皮癣、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等。
因此，本发明的一方面涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子，C1-C7烷基，C1-C7烷酰基，C1-C7烷氧酰基，苄基；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7的烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包括至少一种通式I化合物或其几何异构体或其可药用盐或水合物以及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明的再一方面涉及式I化合物、其几何异构体或其药用盐或水合物的制备方法，其包括使取代或未取代的3-吲哚丙烯酸与相应的芳胺、杂芳胺在合适的溶剂中进行反应。
本发明的另一方面涉及至少一种式I化合物、或其几何异构体或其可药用盐或水合物用于制备预防和/或治疗器官移植中的排斥反应或自身免疫疾病的药物的用途。
在本发明的一个实施方式中涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子，C1-C7烷基，C1-C7烷酰基，C1-C7烷氧酰基，苄基；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7的烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N。
本发明的一个优选实施方式涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N。
本发明的另一个优选实施方式涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子；R2是氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；R3是氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N。
本发明另一个优选的实施方式涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N。
本发明更进一步的优选实施方式涉及式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子。
R2是氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；R3是氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH。
更优选地，本发明式I化合物为选自以下的化合物或其药用盐或水合物(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-甲氨基-5-硝基苯基)丙烯酰胺； (E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺；
(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-吡啶基)丙烯酰胺； (E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(3-硝基苯基)丙烯酰胺； (E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲基苯基)丙烯酰胺 本发明式I化合物可通过下面的反应路线制备
具体而言，使式II化合物与式III化合物在氯化亚砜或N，N二环己基碳二亚胺(DDC)存在条件下，于0-150℃进行反应0.5-20小时得到。
反应中所用到的原料式II化合物和式III化合物均为商购(例如Acros公司)可得。
根据本发明，本发明化合物的可药用盐包括其与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，或与碱金属或碱土金属形成的无机碱盐以及与有机碱性化合物或碱性氨基酸形成的有机碱盐。所述的酸加成盐包括但不限于盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐；无机碱盐包括但不限于铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，有机碱盐如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺盐以及精氨酸盐和赖氨酸盐等。
如上所述，本发明化合物可以用于治疗包括但不限于以下的疾病或病症器官移植中的抗异体排斥反应以及某些自身性免疫疾病如多发性硬化症、类风湿，系统性红斑狼疮等。
根据本发明，本发明化合物的药用组合物可以以下面的任意方式施用口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，阴道用药，局部用药，非肠道用药如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内用药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂，胶囊，水溶液或水悬浮液。其中，片剂一般使用的载体包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂一般使用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂，芳香剂或着色剂。
当直肠用药时，本发明化合物一般可制成栓剂的形式，其通过将药物与一种适宜的非刺激性赋形剂混合而制得。该赋形剂在室温下呈现固体状态，而在直肠温度下熔化释出药物。这类赋形剂包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛，皮肤或下肠道神经性疾病时，本发明化合物可根据不同的患面或器官制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。此外对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏，洗剂或霜剂制剂形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。这里软膏制剂可使用的载体包括但不限于矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。
当下肠道局部施用时，本发明化合物可制成如上所述的直肠栓剂制剂或适宜的灌肠制剂形式，另外也可使用局部透皮贴剂。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液，或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01-100mg/kg体重/天。
图1显示了本发明实施例1化合物在CD4与MHC-II结合阻断试验中的免疫抑制作用。
具体实施例方式
下面的实施例意在说明本发明，对本发明不构成任何限制。
化合物熔点由RY-1型熔点仪测定，温度计未经较正。1H NMR由ARX-400 NMR仪测定。质谱由VG-ZabSpec MS仪测定。所有反应用溶剂未注明都经标准化预处理。
实施例1(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-甲氨基-5-硝基苯基)丙烯酰胺方法一将3-吲哚丙烯酸溶于无水四氢呋喃，再向其中加入N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，2-甲氨基-5-硝基苯胺，室温反应24小时，过滤，滤液浓缩的橙色固体，柱层析得产物(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-甲氨基-5-硝基苯基)丙烯酰胺。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)11.7(s，1H)，9.28(s，1H)，8.36(d，1H)，8.01-7.98(m，2H)，7.87-7.86(d，1H)，7.81-7.77(d，1H)，7，47-7.49(m，1H)，7.21-7.24(m，2H)，6.89-6.85(d，1H)，6.67-6.74(m，2H)，2.89(s，3H)；MS(EI)m/z317(M+1)。
方法二将3-吲哚丙烯酸溶于三氯甲烷，加入氯化亚砜，回流3-5小时，减压除去溶剂，向残余物加入二氯甲烷，搅拌使溶解，再加入2-甲氨基-5-硝基苯胺和适量的吡啶，室温反应3-5小时，过滤，滤液减压除去溶剂，残余物经柱层析得(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-甲氨基-5-硝基苯基)丙烯酰胺。
实施例2(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺按实施例1方法一制备该化合物，采用3-吲哚丙烯酸与4-甲氧基基苯胺反应，得到标题化合物，收率60.94％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)11.5(s，1H)，9.82(s，1H)，7.94-7.96(m，1H)，7.79-7.80(d，1H)，7.72-7.76(d，1H)，7.61-7.63(d，2H)，7.46-7.48(dd，1H)，7.19-7.22(m，2H)，6.91-6.89(m，2H)，6.80-6.76(d，1H)，3.73(s，3H)；MS(EI)m/z293(M+1)。
实施例3(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-吡啶基)丙烯酰胺按实施例1方法一制备该化合物，采用3-吲哚丙烯酸与2-氨基吡啶反应，得到标题化合物，收率40.94％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)11.6(s，1H)，10.5(s，1H)，8.32-8.33(m，1H)，8.26-8.28(d，1H)，8.04-8.06(m，1H)，7.76-7.85(m，3H)，7.46-7.48(m，1H)，7.19-7.23(m，2H)，7.07-7.08(m，1H)，7.03(s，1H)；MS(EI)m/z264(M+1)。
实施例4(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(3-硝基苯基)丙烯酰胺按实施例1方法一制备该化合物，采用3-吲哚丙烯酸与3-硝基苯胺反应，得到标题化合物，收率30.94％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)10.1(s，1H)，9.30(s，1H)，8.57(s，1H)，8.00-8.10(m，3H)，7.55(d，1H)，7.50(m，1H)，7.10-7.22(m，4H)，6.84(d，1H)；MS(EI)m/z293(M+1)。
实施例5(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲基苯基)丙烯酰胺按实施例1方法一制备该化合物，采用3-吲哚丙烯酸与4-甲基苯胺反应，得到标题化合物，收率52.94％。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)11.5(s，1H)，9.80(s，1H)，7.84-7.86(m，1H)，7.69-7.60(d，1H)，7.52-7.56(d，1H)，7.46-7.48(dd，1H)，7.41-7.43(dd，2H)，7.10-7.12(dd，2H)，6.91-6.89(m，2H)，6.80-6.76(d，1H)，2.35(s，3H)；MS(EI)m/z277(M+1)。
实施例6细胞系(HPB-ALL细胞)混合淋巴细胞培养(MTT法)考察实施例1化合物的免疫抑制作用将正常传代的HPB-ALL细胞重悬于10％FCS的1640培养基(购于GIBCO公司)中，调整浓度为5×105/ml，接种于96孔平底板中，50μ1/孔；将正常传代的Daudi细胞重悬于10％FCS的1640培养基中，调整浓度为2×105/ml，用30Gy的60Coγ射线进行照射后，接种于上述同一96孔平底板中，50μl/孔；同时在各孔中加入梯度稀释(1μm，10μm和100μm)的待测定的本发明实施例1化合物，10μl/孔，设溶剂对照和阳性对照环孢菌素A(CsA)，于5％CO2，37℃细胞培养箱培养48小时，每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，震荡3～5分钟后，置5％CO2，37℃细胞培养箱继续培养4～6小时，每孔加入含0.01N盐酸的10％SDS100μl，震荡3～5分钟后，置于5％CO2，37℃细胞培养箱继续培养过夜，次日于酶联仪上测定570nm的光密度值。根据光密度值得到化合物对细胞增殖作用的抑制率。
化合物对细胞增殖作用的抑制率(％)＝(溶剂对照组平均OD-给药组平均OD值)/模型对照组平均OD值。结果见表1。结果显示，本发明化合物呈现较好的免疫抑制作用。
表1
实施例7.CD4与MHC-II结合阻断试验(玫瑰花环试验)考察本发明实施例1化合物的免疫抑制作用原理将CD4基因(已克隆到含绿色荧光蛋白的pEGFP/N1表达载体)转染入HEK293细胞(一种贴壁细胞)，再与经TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)红色荧光染料染色的表达MHC-II类分子的Daudi细胞反应，37℃，1h，在镜下观察玫瑰花结的形成，若加入药物后玫瑰花结的形成减少，则说明药物能够抑制两种分子之间的粘附作用。
方法将2×105/ml293/CD4细胞接种到24孔板，0.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养至85％融片(＞18h)。再将Daudi细胞用TRITC染料(终浓度25μg/ml)染色，37℃，5％CO2孵育1h。染色后，用10％FCS1640培养基洗涤Daudi细胞二次，调整细胞浓度为2×106/ml。然后将(3)中的细胞加入(1)中，0.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养1h，同时加入待测化合物。用含10％FCS的1640培养基轻轻洗去未粘附的Daudi细胞，重复两次，立即在荧光倒置显微镜下观察，拍照(见附图1)，计数。结构显示实施例1化合物在100μmol/L浓度下，抑制率为65.63％±4.26％。
权利要求
1.式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物 其中R1是氢原子，C1-C7烷基，C1-C7烷酰基，C1-C7烷氧酰基，苄基；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7的烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N原子。
2.权利要求1的式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物其中R1是氢原子；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N原子。
3.权利要求1或2的式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物其中R1是氢原于；R2是氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；R3是氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子，C1-C7的烷基；X是CH或N原子。
4.权利要求1或2的式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物其中R1是氢原子；R2和R3各自独立地为氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH或N原子。
5.权利要求1或2的式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物其中R1是氢原子。R2是氢原子，C1-C7烷基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；R3是氢原子，C1-C7烷基，硝基，羧基，-NR4R5，其中R4和R5各自独立地为氢原子或C1-C7的烷基；X是CH。
6.权利要求1或2的式I吲哚丙烯酸衍生物，其几何异构体或其可药用盐或水合物选自(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-甲氨基-5-硝基苯基)丙烯酰胺；(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺；(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(2-吡啶基)丙烯酰胺；(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(3-硝基苯基)丙烯酰胺；以及(E)-(1-氢吲哚-3-基)-N-(4-甲基苯基)丙烯酰胺。
7.权利要求1的式I化合物的制备方法，该方法包括使式II所示3-吲哚丙烯酸与式III所示的芳香胺或杂芳胺在氯化亚砜或N，N-二环己基碳二亚胺存在条件下，于0-150℃反应，得到式I化合物 其中，R1、R2、R3和X的定义同权利要求1。
8.权利要求1-6任一项所要求的化合物或其几何异构体或其可药用盐或水合物用于制备预防或治疗器官移植中的排异反应和/或自身免疫疾病的药物的用途。
9.权利要求8的用途，所述的自身免疫疾病为多发性硬化症、系统性红斑狼疮、牛皮癣或类风湿。
全文摘要
本发明涉及具有免疫抑制作用的式I吲哚丙烯酸类衍生物，其几何异构体或可药用盐或水合物，其中各基团的定义见权利要求书，它们的制备方法，含有所述化合物的药物组合物，本发明还涉及所述化合物用于制备抗器官移植排斥反应以及预防和/或治疗某些自身免疫疾病如类风湿、牛皮癣、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等疾病的药物的用途。
文档编号A61P17/00GK1939905SQ20051010582
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者李松, 何新华, 郑志兵, 黎燕, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所