专利名称：甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物化学技术领域。具体涉及甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用。
背景技术：
甾醇类化合物，特别是植物中的甾醇类化合物，主要包括谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、以及甾醇糖苷、甾醇酯和酰化甾醇糖苷等。很多植物中都含有甾醇类化合物，在植物中主要以混合物形式存在。
有关甾醇类化合物的生物活性也有大量报道。例如，甾醇糖苷具有补体活化和抗炎活性；包括β-谷甾醇葡萄糖苷和其它β-谷甾醇糖苷的甾醇糖苷混合物具有免疫调节作用；体内试验表明，他们对Hashimoto氏甲状腺炎、遗传性过敏症的exzema、牛皮癣、哮喘和肿瘤都有作用。甾醇可降低胆固醇。但甾醇类成分对抑郁、焦虑等中枢神经系统的作用未见报道。
抑郁症(depression)是情感性精神障碍(mood disorders)的主要类型，是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合征，其主要表现有情绪低落，言语减少，精神、运动迟缓，常自责自罪，甚至企图自杀等。随着社会经济的快速发展，生活节奏日益加快，生活工作压力不断加大，抑郁症已成为现代社会的常见病、高发病，其发病率正在迅速攀升。据世界卫生组织报告，全世界抑郁症患者已经达到2亿多。世界上大型流行病学研究显示，“抑郁”目前在世界致残性疾病中排名第四，至少有3％～5％的终身患病率，到2020年将排名第二，仅次于缺血性心脏病。
目前用于治疗抑郁症的化学合成药物主要有三环类抗抑郁剂、单胺氧化酶抑制剂和5-羟色胺重吸收抑制剂，但均有不同程度的不良反应，在长期服用后会出现严重的毒副作用，大大影响了患者的生存质量。因此，迫切需要寻找高效、安全的抗抑郁药物。
从中草药中寻找和研制具有良好抗抑郁作用的药物，具有疗效好、副作用小、适合长期服用及安全可靠等许多优点，已愈来愈引起人们的重视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计天然植物中疗效好、副作用小、适合长期服用及安全可靠的抗抑郁药物。
本发明以天然植物或中药材为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法或二氧化碳超临界萃取等工艺中的一种或多种工艺，并结合浓缩干燥、减压干燥或冷冻干燥等常用干燥方法，利用包括吸附树脂柱层析、真空液相柱层析、硅胶柱层析、Sephadex凝胶柱层析、中低压柱层析以及高压液相(HPLC)柱层析，和沉淀、结晶等方法获得甾醇类化合物或总甾醇提取物。
上述的天然植物或中药包括百合、白芍、大枣、大豆(或大豆油脱臭馏出物)、牛膝、油菜籽、小麦(或小麦麸)等。
在采用溶剂提取法中，所用溶剂可选用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚或石油醚等有机溶剂或两种或多种互溶的混合溶剂，在室温下浸渍提取或用超声提取或加热状态下的回流提取，提取次数可为一次，也可为多次。
在采用溶剂萃取法中，可将上述得到的提取物悬浮于水中用合适的溶剂丁醇、戊醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚或石油醚等直接进行萃取，萃取次数可为一次，也可为多次。
上述的树脂法为大孔吸附树脂法，水、醇或含水醇提取物可用大孔吸附树脂进行处理，弃去水洗脱部分，全部或部分收集醇洗脱部分即得。
所采用的二氧化碳超临界萃取法可根据情况加入适当的夹带剂，如环己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或乙醇等。
本发明所述甾醇类化合物包括甾醇、甾醇衍生物、甾醇酯、甾醇糖苷、酰化甾醇糖苷以及它们的衍生物。
所述总甾醇提取物是指由天然植物或中药中通过上述提取分离方法得到的含有上述一种或一种以上甾醇类化合物的提取物，其总甾醇含量在50～90％。
所述甾醇是谷甾醇(Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、菜油甾醇(Campesterol)菜籽甾醇(brassicasterol)、胆甾醇(cholesterol)、菠菜甾醇(spinasterol)、岩藻甾醇(fucosterol)、羊毛甾醇(lanosterol)、燕麦甾醇(avenasterol)、禾本甾醇(gramisterol)、多孔甾醇(poriferasterol)、菌甾醇(fungisterol)、扶桑甾醇(rosasterol)、苋菜甾醇(amasterol)、粪甾醇(epicoprosterol)、刺松藻甾醇(codisterol)、钝叶甾醇(obtusifoliol)、蚬甾醇(corbisterol)、粉苞苣甾醇(chondrilla sterol)、链甾醇(desmosterol)、]桐甾醇(clerosterol)、大戟甾醇(euphorbosterol)等来源于植物的甾醇。
所述甾醇衍生物是指甾醇中部分或全部双键加氢氢化或7-位去氢或氧化等的衍生物所述甾醇酯是甾醇与不饱和脂肪酸或阿魏酸形成的甾醇酯。其不饱和脂肪酸具有16～22个碳原子和一个或一个以上不饱和碳碳双键。
所述甾醇糖苷是甾醇与天然五碳糖或六碳糖等一个或一个以上的单糖结合形成的甾醇糖苷。所述单糖是D-葡萄糖(D-glucose)、D-甘露糖(D-mannose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-阿洛糖(D-allose)、L-阿拉伯糖 (L-arabinose)、D-来苏糖(D-lyxose)、D-木糖(D-xylose)、D-核糖(D-ribose)、D-果糖(D-fructose)、 L-山梨糖(sorbose)、L-鼠李糖(rhamnose)或L-夫糖(L-fucose)等。
所述酰化甾醇糖苷是上述任一甾醇糖苷和不饱和脂肪酸形成的酰化甾醇糖苷。其不饱和脂肪酸具有16～22个碳原子和一个或一个以上不饱和碳碳双键。
本发明所述甾醇类化合物及总甾醇提取物进行了下列动物药效实验1、甾醇类化合物抗抑郁作用试验甾醇类化合物选择β-谷甾醇(I)、β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和亚油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)为代表，采用小鼠强迫游泳试验、拮抗利血平实验和自发性活动实验进行抗抑郁作用检测和验证。
①小鼠强迫性游泳实验(FST)用经典的小鼠强迫性游泳抑郁模型，观察了小鼠1次性口服或腹腔注射不同剂量甾醇类化合物后对其强迫性游泳不动时间的影响，以评价该化合物的抗抑郁活性。取雄性ICR小鼠，体重24-28g。给药1小时后进行实验，将小鼠置于盛有25℃水的玻璃缸(直径10cm，高20cm)内，水深10cm，使小鼠游泳6分钟，前2分钟不计，记录后4分钟内动物累计的不动时间。实验结果表明，口服90mg/ml或腹腔注射30mg/kg的β-谷甾醇(I)、30mg/ml的β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和30mg/ml的亚油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)均能显著减少小鼠强迫游泳不动时间(P＜0.05)(见表2、3、4)。
表2.β-谷甾醇对小鼠游泳不动时间的影响
**P＜0.01，*P＜0.05vs control group表3.β-谷甾醇葡萄糖苷对小鼠游泳不动时间的影响
**p＜0.01，*p＜0.05表4.亚油酰葡萄糖基β-谷甾醇对小鼠游泳不动时间的影响
**p＜0.01，*p＜0.05②拮抗利血平在小鼠引起的眼睑下垂实验用经典的利血平在小鼠引起的眼睑下垂模型，观察了小鼠1次性腹腔注射给予不同剂量甾醇类化合物-β-谷甾醇后对利血平引起的眼睑下垂的影响，以评价该化合物的抗抑郁活性。取雄性ICR小鼠，体重24-28g。腹腔注射给予不同剂量的β-谷甾醇，并同时皮下注射给予2.5mg/kg的利血平，1小时后测定眼睑下垂。实验结果表明腹腔注射30mg/kg的β-谷甾醇能显著拮抗利血平在小鼠引起的眼睑下垂(见表5)。
表5.β-谷甾醇对利血平在小鼠引起眼睑下垂的影响
③β-谷甾醇对小鼠自发性活动的影响(LMA)观测小鼠口服β-谷甾醇，在强迫游泳实验有效剂量范围内对自发活动的影响，以检验β-谷甾醇是否有中枢兴奋或抑制作用。
采用Auto Track运动解析仪(美国Columbus Instruments)观察小鼠自发性活动。取雄性ICR小鼠，体重24-28g。腹腔注射30mg/kg或口服90mg/kg的β-谷甾醇1小时后将小鼠放入解析仪的有机玻璃敞箱中，观察动物的箱内10分钟的自发活动，观察指标包括水平运动数、垂直运动数和总运动数。实验结果表明强迫游泳有效剂量范围内的β-谷甾醇对小鼠自发性活动没有明显影响(表6)。
表6.β-谷甾醇对小鼠自发活动的影响
以上实验表明，小鼠腹腔注射给予β-谷甾醇可拮抗利血平引起的眼睑下垂，小鼠灌胃给予甾醇类化合物可显著减少强迫游泳不动时间，并且此作用不是由于中枢兴奋作用产生的，说明甾醇类化合物如β-谷甾醇等有抗抑郁作用。
2、百合总甾醇提取物抗抑郁作用试验①小鼠强迫性游泳实验(FST)实验方法同上表7.不同剂量百合总甾醇提取物对小鼠游泳不动时间的影响
②小鼠悬尾实验雄性小鼠灌胃给药1h后，将小鼠尾端2cm的部位贴在离台面35cm高的一根水平棍上，使动物成倒挂状态。观察6min，比较各组小鼠在后4min内的累计不动时间。
表8.百合总甾醇提取物小鼠悬尾实验结果
③小鼠自发活动试验实验方法同上表9.百合总甾醇提取物对小鼠自发活动的影响
3、不同植物提取物抗抑郁作用试验实验方法同上。
表10.不同植物提取物对小鼠游泳不动时间的影响
表1.β-谷甾醇葡萄糖苷(II)和亚油酰葡萄糖基β-谷甾醇(III)的13C NMR数据
本发明中所述甾醇类化合物作为制备治疗抑郁、焦虑等中枢神经系统疾病药物的有效成份，可单独应用或者合用或与适宜的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服剂型或非口服剂型的治疗抑郁、焦虑等中枢神经系统疾病药物。
实施例实施例1甾醇类化合物酰化谷甾醇葡萄糖苷(Acylated sitosteryl glucoside)的提取分离。
取百合科植物百合的干燥鳞茎(叶)片1kg，用80％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用石油醚萃取，浓缩得石油醚提取物，石油醚提取物上硅胶柱层析，梯度洗脱，其中15～16#部分再经硅胶柱层析得到6’-O-亚油酰基3-O-葡萄糖基-β-谷甾醇(NMR数据见表1)。
实施例2甾醇类化合物β-谷甾醇葡萄糖苷的提取分离取百合科植物百合的干燥鳞茎(叶)片1kg，用80％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用乙酸乙酯萃取，浓缩得乙酸乙酯提取物，乙酸乙酯提取物上硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，再经SephadexLH20凝胶柱层析得到β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(NMR数据见表1)。
实施例3甾醇类化合物β-谷甾醇提取分离取百合科植物百合的干燥鳞茎(叶)片1kg，用80％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用石油醚萃取，浓缩得石油醚提取物，石油醚提取物上硅胶柱层析，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，氯仿甲醇溶液中结晶，得到β-谷甾醇。
实施例4大枣中甾醇类化合物的提取分离取干燥大枣用80％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用乙酸乙酯萃取，浓缩得乙酸乙酯提取物；将乙酸乙酯提取物混悬于5％氢氧化钠水溶液中，用乙酸乙酯萃取，萃取物上硅胶柱，正己烷-氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱馏分放置或甲醇重结晶，得到β-谷甾醇和β-谷甾醇葡萄糖苷。
实施例5白芍中甾醇化合物的提取分离取白芍饮片，用85％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用石油醚萃取，浓缩得石油醚提取物，石油醚提取物上硅胶柱层析，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，氯仿甲醇溶液中结晶，得到β-谷甾醇。
实施例6百合中总甾醇提取物的提取分离取百合科植物百合的干燥鳞茎(叶)片，用80％乙醇回流提取，浓缩浸提液得乙醇提取物，提取物混悬于水中，用氯仿萃取，将氯仿萃取物溶液丙酮中，过滤，丙酮溶液浓缩干燥后，加甲醇热熔，放置一定时间后，过滤，收集沉淀物，干燥，得百合总甾醇提取物。
实施例7大豆中总甾醇提取物的提取分离将大豆脱臭馏出物溶于乙酸乙酯，用5％氢氧化钠萃取，水系，浓缩干燥后热熔于甲醇，放置，滤出沉淀既为总甾醇提取物。
实施例8牛膝中总甾醇提取物的提取分离取干燥牛膝，粉碎，用80％乙醇回流提取，提取物混悬于水中，以乙酸乙酯萃取，萃取液再用5％氢氧化钠洗涤后，用甲醇热熔放冷沉淀，反复多次的牛膝总甾醇提取物。
权利要求
1.一种甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用，其特征在于其中所述的甾醇类化合物为甾醇、甾醇衍生物、甾醇酯、甾醇糖苷和酰化甾醇糖苷。
3.根据权利要求1所述的一种甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用，其特征在于其中所述总甾醇提取物是从百合、白芍、大枣、大豆或大豆油脱臭馏出物、牛膝、油菜籽、小麦或小麦麸中提取得到的含有一种或多种甾醇类化合物的提取物，其总甾醇含量为50-90％。
4.根据权利要求2所述的一种甾醇类化合物，其特征在于其中所述甾醇为谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、胆甾醇、菠菜甾醇、岩藻甾醇、羊毛甾醇、燕麦甾醇、禾本甾醇、多孔甾醇、菌甾醇、扶桑甾醇、苋菜甾醇、粪甾醇、刺松藻甾醇、钝叶甾醇、蚬甾醇、粉苞苣甾醇、链甾醇、桐甾醇或大戟甾醇。
5.根据权利要求2所述的一种甾醇类化合物，其特征在于其中所述甾醇衍生物为甾醇中部分或全部双键加氢氢化或7-位去氢或氧化的衍生物。
6.根据权利要求2所述的一种甾醇类化合物，其特征在于其中所述甾醇酯为甾醇与不饱和脂肪酸或阿魏酸形成的甾醇酯，其不饱和脂肪酸具有16-22个碳原子和一个或一个以上不饱和碳碳双键。
7.根据权利要求2所述的一种甾醇类化合物，其特征在于其中所述甾醇糖苷为甾醇与天然五碳糖或六碳糖等一个或一个以上的单糖结合形成的甾醇糖苷；所述单糖是D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿洛糖、L-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木糖、D-核糖、D-果糖、L-山梨糖、L-鼠李糖或L-夫糖。
8.根据权利要求2所述的一种甾醇类化合物，其特征在于其中所述酰化甾醇糖苷为任一甾醇糖苷和不饱和脂肪酸形成的酰化甾醇糖苷，其不饱和脂肪酸具有16-22个碳原子和一个或一个以上不饱和碳碳双键。
9.根据权利要求1所述的一种甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用，其特征在于用甾醇类化合物或总甾醇提取物作为有效成份，它们可以单独应用或合用与药用赋形剂组合制备治疗抑郁或焦虑中枢神经系统疾病药物，该药物为口服或非口服剂型。
全文摘要
本发明公开了一种甾醇类化合物及总甾醇提取物在制备抗抑郁药物中的应用。本发明所述甾醇类化合物主要包括从植物或中药中提取的谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、甾醇糖苷、甾醇酯和酰化甾醇糖苷等。经动物实验表明上述物质对小鼠具有抗抑郁作用。
文档编号A61K36/899GK1977848SQ20051011126
公开日2007年6月13日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者崔溶文, 李光赫, 杨君, 马宁 申请人:爱思开生物医药科技(上海)有限公司, Sk株式会社