木豆叶及其提取物用于制备治疗骨性关节炎药物的用途的制作方法

专利名称：木豆叶及其提取物用于制备治疗骨性关节炎药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药制药领域，具体而言，本发明涉及中药植物木豆叶及其提取物用于制备治疗骨性关节炎药物的用途。
背景技术：
骨性关节炎是世界上最常见的关节病，随年龄增大，患病率迅速上升；大于65岁人群中50％以上有骨性关节炎的X线片证据，但是有25％会有症状。75岁以上人群80％会出现症状。在美国50岁以上男性中，骨性关节炎是仅次于缺血性心脏病导致工作能力丧失的第二位原因，可使劳动力丧失达53％。骨性关节炎是老年人疼痛和致残的主要原因。
世界卫生组织(WHO)统计，骨性关节炎在女性患病率中占第四位，在男性患病率中占第八位。在中国，老年人口约在1亿以上，约有8000万人口会有骨性关节炎的X线表现，约有4000万人有症状。随着人口的老龄化，中国也进入了老龄化国家，这种疾病会不断地增加。治疗这种疾病还将会耗费巨大的医疗保健资源。
木豆叶是豆科植物木豆(Cajanus canjan(L.)Millsp.)的干燥叶及嫩枝，分布于亚洲南部，我国海南、云南、四川、江苏、广东和广西等省区有栽培，资源丰富。《中药大辞典》和《原色中国本草图鉴》载木豆叶“性平，味淡，解痘小毒，消炎肿。治小儿水痘，痈肿；”木豆种子“甘微酸，性温。清热解毒，补中益气，利水消食，止血止痢。”木豆嫩叶嚼烂用于治疗口疮，压汁内服可消黄疸，捣烂的浆汁对外伤和疮毒有祛腐生肌作用，叶的煎剂对咳嗽、腹泻等有效。袁浩用木豆叶提取物治疗股骨头坏死已获得国家专利授权(专利号ZL97108820.9)，另外还发现木豆叶提取物可用于治疗骨折、骨质疏松、脑梗塞等疾病。但目前尚未有运用木豆叶治疗骨性关节炎的研究。
研究表明，骨性关节炎与股骨头坏死不同，股骨头坏死系由股骨头血运受限，引起股骨头部骨质缺血，形成骨的有活力的成分(包括骨细胞、骨髓、造血细胞及脂肪细胞)的死亡。股骨头坏死的发病原因很多，有些尚未查清，已知的可分为两大类。损伤性股骨头坏死主要病因有股骨颈骨折、髋关节脱位、髋关节损伤等。其中股骨颈骨折导致股骨头坏死最多。股骨颈骨折愈合后仍可继发股骨头坏死。非损伤性股骨头坏死主要病因有长期服用激素、慢性酒精中毒、血红蛋白病、减压病、血友病、高血脂症、动脉硬化、糖尿病及扁平髋等。其中激素、酒精中毒导致股骨头坏死较多。如激素使毛细血管通透性升高造成渗血、静脉阻塞造成回流障碍等等均引起骨内压增高。升高的骨内压又增大了血流的阻力，从而进一步导致缺血，形成恶性循环，尤其是患肢继续负重。股骨头坏死后，缺血的股骨头受压，会加快股骨头的磨损、塌陷。股骨头坏死的临床表现为(1)疼痛股骨头缺血坏死早期可以没有临床症状，而是在拍摄x线片时发现的。最早出现的症状是髋关节或膝关节疼痛。疼痛可为持续性或间歇性。逐渐或突然出现髋部或膝部疼痛、钝痛或酸胀不适等，常向腹股沟区或臀后侧或外侧，或膝内侧放射，该区有麻木感。疼痛性质在早期多不严重，但逐渐加重，也可受到外伤后突然加重。经过保守治疗后可以暂时缓解，但经过一段时间会再度发作。原发疾病距离疼痛出现的时间相差很大；(2)关节僵硬与活动受限早期患者髋关节活动正常或轻微丧失，表现为向某一方向活动障碍，特别是内旋。应在平卧位伸髋及屈膝屈髋90′位进行屈、伸、内收、外展及内旋检查，双侧对比，才能发现。随病情发展活动范围逐渐缩小，晚期由于关节囊肥厚挛缩，髋关节向各方向活动严重受限，髋关节融合，出现髋关节僵直；(3)跛行早期患者由于股骨头内压增高，可有间歇性跛行，休息后好转，晚期患者由于股骨头塌陷及髋关节半脱位可有持续性跛行。股骨头坏死的主要治疗方法是手术治疗和药物治疗。手术治疗包括骨髓内减压与钻孔术、血管移植术、游离植骨术、异体软骨移植术、人工关节置换术；药物治疗包括西药目前尚未有一种药物可以治疗股骨头坏死。中成药主要有通络生骨胶囊、健骨生、仙灵骨葆胶囊以及马氏骨片等。主要是通过活血化瘀、补肾健骨达到修复骨坏死的作用。
而骨性关节炎是一种慢性关节疾病，它的主要改变是关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生。多发生于中年以后，发病部位多在负重关节。也可继发于关节畸形、损伤和炎症之后，故又称增生性关节炎、肥大性关节炎、退行性关节炎、老年性关节炎、畸形性关节炎、创伤性关节炎等等。骨性关节炎的病因病理主要由损伤、关节面不对称、血循不足、炎症以及原发性因素导致。主要改变是在关节软骨及其下面的骨质，软骨逐渐磨损，压力最大部位首先软骨消失，软骨下骨质硬化，关节边缘增大，形成骨刺。早期软骨变黄、粗糙、失去光泽，继之软骨深层发生裂隙、软化或剥脱，骨质暴露。以后软骨周围组织增生，形成骨赘，即一般所谓骨刺。有时骨赘可能很大，以致影响关节的活动。在承受应力和磨损最大的中央部位，软骨下骨质致密硬化，而外围部位承受应力最小，软骨下骨发生萎缩，表现为骨质疏松。在负重关节，如髋关节可出现囊腔病变，并与关节相通，内含有滑液。在关节囊和滑膜内并无原发性病变，但由于对这些组织的反复劳损，促使其轻度增厚及纤维化，关节活动受到限制由于关节周围肌肉因疼痛而产生保护性痉挛，屈肌挛缩，使关节逐步发生畸形，这将增加局部受压部位的退行性变，其结果是关节的纤维性强直，但很少发生骨性强直。骨性关节炎的临床表现主要是关节疼痛和活动不灵活，发病缓慢，病人常感到在静止时疼痛，即关节处于一定的位置过久或清晨，病人感到关节疼痛，稍加活动后疼痛可缓解。但如果活动过多又产生疼痛，天阴雨时疼痛加剧。
骨性关节炎的治疗药物分为改善症状和改变病情的两类药物。常用药物包括以下几种(1)抗炎止痛药如乙酰氨基酚；(2)非甾体类抗炎药(NSAIDs)具有抗炎、止痛和解热作用，是治疗骨性关节炎最常用的药物。如阿司匹林、水杨酸、保泰松、吲哚美辛和萘普生、双氯芬酸、美洛昔康、萘丁美酮、依托度酸、舒林酸和阿西美辛等；(3)阿片类是作为治疗的最后选择；(4)氨基葡萄糖也称为软骨保护剂，可阻止膝关节骨性关节炎的发展；(5)双醋瑞因可以抑制金属蛋白酶的活性及稳定溶酶体膜而发挥抗炎及对关节软骨的保护作用，从而改善骨性关节炎的病程；(6)关节腔注射药物一种是激素类药物，可以暂时减轻疼痛。另一类是透明透明质酸制剂。
目前国内上市的专门用于治疗骨性关节炎的中成药品种并不多，而且常常都是来源于治疗腰腿痛类药。可分为外用和内服两大类，外用包括酒汀剂如风湿痛药酒、史国公药酒、壮骨药酒等等；膏剂如伤湿止痛膏、东方活血膏、天和追风膏、祖师麻关节止痛膏等等，这类外用药主要起到消肿止痛，暂时缓解局部症状的作用；内服药主要品种有壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊、尪痹冲剂、痹祺胶囊等等，这类药主要通过补肾、活血、通络、行气，使得局部气血经脉运行畅通，达到止痛的效果。从现代药理研究来看，目前有关这些内服药对关节软骨损伤修复的报道并不多见，从严格意义上来说，这些药尚不能使骨性关节炎的病程逆转或停止。
我们对木豆叶进行了深入研究，在兔的骨性关节炎动物模型上，发现该药能改善软骨含水率，提高软骨糖醛酸含量，提高酸性磷酸酶，降低碱性磷酸酶，防止软骨细胞破坏，阻止软骨细胞基质的降解，促进软骨细胞基质的合成，促进关节软骨的修复，消除滑膜充血肿胀，促进关节炎症的吸收，对兔的骨性关节炎动物模型具有较好的治疗作用。另外，采用软骨细胞体外培养，通过木豆叶提取物含药血清的作用来观察对软骨细胞增殖和蛋白质合成的影响。结果证实木豆叶提取物的含药血清能够(1)促进软骨细胞的增殖；(2)促进软骨细胞内蛋白和细胞总蛋白的合成。由此，完成了木豆叶提取物在用于治疗骨性关节炎用途的发明。

发明内容
本发明的目的是提供一种木豆叶的新用途，即木豆叶用于制备治疗骨性关节炎的药物的用途；本发明的另一目的是提供木豆叶提取物用于制备治疗骨性关节炎的药物的用途。
本发明的目的通过下列实施方案实现。
本发明的木豆叶是指木豆叶干燥叶及其嫩枝。本发明的目的可以通过将木豆叶经过传统的煎煮或者粉碎压片使用实现，用于治疗骨性关节炎。本发明的目的更理想的是通过制备木豆叶提取物实现。
木豆叶提取物可以通过下面的方法制备得到(1)木豆叶水提取物取木豆叶，加药材重量的10倍水浸泡约1小时，加热煎煮，提取三次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05-1.10，过滤，滤液经干燥，得到的干浸膏粉即为“木豆叶水提取物”。
(2)木豆叶醇提取物取木豆叶，用4倍重量的20％-80％(v/v体积比)乙醇回流，提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压回收乙醇后，调节相对密度为1.10，干燥，得到的干粉即为“木豆叶醇提取物”。
具体而言，本发明的木豆叶水提物和醇提物可以通过下面的方法制备得到。
(1)木豆叶水提取物取木豆叶，净选除杂质，置多功能提取罐中，加药材量的10倍水浸泡约1小时，加热煎煮，提取三次，每次1.5小时，过滤(用80目尼纶布)，合并滤液，置真空浓缩器(真空度为-0.08Mpa，温度60℃)中，浓缩至相对密度为1.05-1.10(60℃热测)过滤(用80目尼纶布)，滤液采用连续式离心过滤(转速15000r.p.m，流量为50L/小时)，滤液经喷雾干燥器(进风口180℃×4秒，出风口为80℃)干燥，获得的干浸膏粉即为“木豆叶水提取物”。
(2)木豆叶醇提取物取木豆叶，净选除杂质，分别用4倍量的不同浓度的乙醇(20％、40％、60％、80％)回流，提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压回收乙醇(80℃，0.08MPa)后，调节相对密度为1.10，进行喷雾干燥，获得干粉即为“木豆叶醇提取物”。
本发明研究证明采用软骨细胞体外培养方法，通过含药血清的作用来观察该药对软骨细胞增殖和蛋白质合成的影响。试验证明木豆叶水提取物和醇提物的含药血清均能够(1)促进软骨细胞的增殖；(2)促进软骨细胞内蛋白和细胞总蛋白的合成。另外，将木豆叶水提取物用于治疗兔骨性关节炎动物模型，具有良好的治疗效果。我们进行了木豆叶治疗骨性关节炎的主要药效学研究，建立了木瓜蛋白酶致骨性关节炎的动物模型，并设木豆叶水提取物高、中、低剂量组、对照药(壮骨关节丸)组、模型组和正常对照组，经药物治疗4周后进行大体检查、软骨病理切片、软骨生化测定(含水率、糖醛酸、羟脯氨酸)和血液生化测定(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、钙、磷)，结果显示木豆叶水提取物组能改善软骨含水率，提高软骨糖醛酸含量，提高酸性磷酸酶，降低碱性磷酸酶，防止软骨细胞的破坏，阻止软骨细胞基质的降解，促进软骨细胞基质的合成，促进关节软骨的修复，消除滑膜充血肿胀，促进关节炎症的吸收，对兔骨性关节炎动物模型具有较好的治疗作用。通过主要药效学研究，证明了木豆叶水提取物能够促进兔的骨性关节炎动物模型的软骨修复、促进软骨的增殖。因此可用于治疗骨性关节炎药物的制备。
发明的木豆叶提取物可以单独使用也可以与其它药物配伍，被制成药物组合物，用于治疗骨性关节炎。这种药物组合物可以是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、注射剂、缓控释制剂等形式。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1本发明木豆叶水提取物的制备木豆叶水提物的制备取木豆叶，净选除杂质，置多功能提取罐中，加药材量的10倍水浸泡约1小时，加热煎煮，提取三次，每次1.5小时，过滤(用80目尼纶布)，合并滤液，置真空浓缩器(真空度为约0.08Mpa，温度60℃)中，浓缩至相对密度为1.05-1.10(60℃热测)，过滤(用80目尼纶布)，滤液采用连续式离心过滤(转速15000r.p.m，流量为50L/小时)，滤液经喷雾干燥器(进风口180℃×4秒，出风口为80℃)干燥备用。
实施例2本发明木豆叶醇提取物的制备木豆叶醇提取物的制备取木豆叶，净选除杂质，分别用4倍量的不同浓度的乙醇(20％、40％、60％、80％)回流，提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压回收乙醇(80℃，0.08MPa)后，调节相对密度为1.10，进行喷雾干燥，备用。
实施例3本发明木豆叶水提取物对兔骨性关节炎动物模型的治疗作用1.材料1.1药物木豆叶水提取物根据本发明实施例1的方法制备得到；壮骨关节丸由三九医药股份有限公司生产，批号0404281，规格60g/瓶；木瓜蛋白酶(Sigma)由上海生工生物工程有限公司提供；葡萄糖醛酸(Sigma)、羟脯氨酸(Fluka)由北京舒伯尔公司提供；其余试剂均为AR级以上的产品。
1.2动物新西兰大白兔，普通级，10～12月龄，体重2.0～2.5kg，雌雄各半，由广州中医大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK(粤)2003-0001。动物饲料广州中医药大学实验动物中心提供标准饲料。
1.3仪器UV-754分光光度计，广州中医药大学内科实验室提供；电子全自动称重仪，广州中医药大学骨科实验室提供；日立7060全自动生化分析仪，日本日立公司生产，广州中医药大学实验动物中心提供；Leica SM2000R型平推切片机，德国莱卡仪器有限公司生产，广州中医药大学科技园提供。
2.方法2.1建立木瓜蛋白酶致骨性关节炎的动物模型健康新西兰兔60只，左膝关节周围剃毛，酒精消毒，用30mg/kg的戊巴比妥钠进行耳缘静脉注射麻醉。麻醉后经膝关节正中进针，通过髌上韧带注射4％木瓜蛋白酶蒸馏水0.3ml入关节腔，隔3天1次，分别于第1、4、7日进行注射，一周后完成造模。
2.2药物治疗造模后，进行相应的药物治疗，本试验共设木豆叶水提取物高、中、低剂量组，壮骨关节丸组，模型组和正常组，见下表1。
表1 各药物剂量设置

按上表不同剂量设置，用蒸馏水配制相应浓度的药物混悬液，通过灌胃给药，每只兔给药容积为10ml，正常组和模型组分别给予等量的蒸馏水，每天一次，连续灌胃4周。
2.3疗效检测给药4周后全部耳缘静注空气处死动物，分别作下述检查。
(1)大体检查断离左侧膝关节，肉眼对软骨、滑膜进行大体观察。
(2)关节软骨病理切片检查用冰冻蒸馏水冲洗关节腔，切取内侧胫骨平台中央条状关节面(包括软骨下骨)及内侧作病理切片，关节软骨标本用10％甲醛固定，脱钙后石蜡包埋、切片、HE染色后用光镜观察。
(3)关节软骨生化指标的测定含水率测定取关节软骨后，用滤纸吸干软骨表面水分，精确称取湿重后置于丙酮中脱水24小时，然后在室温下真空干燥1周至恒得重，精确称取干重，计算含水率。含水率＝(湿重-干重)/湿重×100％糖醛酸的测定精确称取软骨标本，置5ml安瓿中，加入1ml2N HCL，100℃水解2小时。倒出冷却后按Bitter等的卡巴唑法测定糖醛酸的含量。
羟脯氨酸的测定干燥后的软骨，每份样品称取30mg，置10ml带盖试管中，加入0.3mol/L三氯醋酸溶液3ml，置90℃恒温箱内3小时，冷却后离心(3500r/min)5分钟，上清液置20ml洁净试管中；沉淀中再加入0.3mol/L三氯醋酸溶液2ml，依上法再提取1次，合并上清。将盛有提取液的试管置烘箱中120℃蒸干。在蒸干后的试管中加入6mol/L HCL溶液2ml，溶解全部剩余物后，移入5ml洁净安瓶，封闭，120℃水解10小时。取水解液20μl，加蒸馏水6000μl，振荡后配成待测样品。取待测样品1ml加入0.05mol/L CuSO4及10％NaOH溶液各0.50ML，再加入6％H2O2溶液0.50ml，置30℃水浴10分钟。放置期间振荡3次。加入无水乙醇0.50ml，再放置20分钟，其间振荡3次；加入6mol/L HCl 1ml，再加5％对二甲氨基苯甲醛1ml摇匀，于60度水浴15分钟，自然冷却后，测540nm的吸光值。另取2mg羟脯氨酸标准品，溶于50ml容量瓶中，配成储备液，实验时，按0、2、4、6、8、10、12、14、16μg/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值，计算样品中羟脯氨酸的含量。
(4)血液生化指标在兔耳中动脉取3ml血，2500转/分离心10-15分钟，取血清测定血清酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、钙及磷。
(5)数据处理及统计学分析所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析(ANOVA)。显著性检验水准取α＝0.05，P＜0.05则为有显著性差异。
3结果3.1大体标本观察正常组见关节软骨表面光滑，滑膜未见有充血水肿，关节液量适中；模型组见关节软骨变黄，表面见有裂隙，关节滑膜有充血水肿，关节液量增多；木豆叶水提物高剂量组关节软骨表面光滑未见裂隙，关节滑膜未见明显炎症反应，关节液量适中；木豆叶水提物中、低剂量组及壮骨关节丸组可见有部分软骨变黄，部分软骨表面有小裂隙，滑膜未见有明显充血水肿，关节液无明显增多。
3.2关节软骨生化检测
3.2.1软骨含水率的测定木豆叶水提取物对骨性关节炎动物模型软骨含水率的影响见表2。
表2 木豆叶水提取物对软骨含水率的影响(x±s)

注与正常组比*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比#P＜0.05 ##P＜0.01模型组的含水率明显高于正常组(P＜0.01)，木豆叶水提物高、中、低剂量组及壮骨关节丸组的含水率与正常组比差异无显著性意义，与模型组比有明显下降(P＜0.01)，提示含水率有改善的趋向。
3.2.2软骨糖醛酸含量测定木豆叶水提物对骨性关节炎模型软骨糖醛酸含量的影响见表3。
表3 木豆叶水提物对软骨糖醛酸含量的影响(x±s)

注与正常组比*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比#P＜0.05 ##P＜0.01模型组及各给药组糖醛酸含量与正常组相比，含量明显下降，并差异有显著性意义(P＜0.01)；木豆叶水提物高、中、低剂量组及壮骨关节丸组与模型组相比，糖醛酸含量升高，且差异有显著性意义(p＜0.01)。说明木豆叶水提物能有效提高骨性关节炎动物模型软骨糖醛酸含量，提示该药是通过提高软骨基质蛋白多糖的含量，从而促进软骨基质的合成。
3.2.3软骨羟脯氨酸含量木豆叶水提物对骨性关节炎动物模型软骨羟脯氨酸含量的影响见表4。
表4 木豆叶水提物对软骨羟脯氨酸含量的影响(x±s)

注各组间统计学上无显著性差别(p＞0.05)木豆叶水提物高、中、低剂量组、壮骨关节丸组、模型组及正常组之间软骨羟脯氨酸含量差异无显著性意义(P＞0.05)，说明木豆叶水提物对骨性关节炎动物模型软骨羟脯氨酸含量无影响，提示该药对关节软骨的胶原合成无明显作用。
3.3血生化检查表5 木豆叶水提物对血清酸、碱性磷酸酶、钙、磷含量的影响(x±s)

注 与正常组比*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比#P＜0.05 ##P＜0.01模型组与正常组比较，血清酸性磷酸酶明显下降，差异有显著性意义(P＜0.01)；木豆叶水提物高、中、低剂量组和壮骨关节丸组血清酸性磷酸酶与模型组相比有明显升高，差异有显著性意义(P＜0.01)。
模型组与正常组比较，血清碱性磷酸酶明显升高，差异有显著性意义(P＜0.01)；木豆叶水提物高、中、低剂量组和壮骨关节丸组血清碱性磷酸酶与模型组相比有明显下降，差异有显著性意义(P＜0.01)。
血清钙、磷的含量各组间无明显差异。
表明木豆叶水提物能有效改善骨性关节炎动物模型血清酸性磷酸酶和血清碱性磷酸的活性。但对血清钙、磷含量无影响。
3.4病理学检查正常组软骨表面光滑，由浅入深可分为表浅层、移行层、放射层和钙化层。表浅层较薄，软骨细胞呈扁平状，其长轴与关节表面平行；移行层软骨细胞较小，核明显，未见软骨细胞簇；放射层软骨细胞纵行排列成柱状；其下为钙化层，与软骨下骨相连，潮标线完整。
模型组软骨表面不平滑，出现许多裂隙，部分软骨剥脱，形成缺损区，表层细胞消失，移行层细胞大部分消失，有个别细胞存在可见软骨细胞簇，放射层细胞呈柱状排列，有细胞簇集现象；潮标不完整。
壮骨关节丸组软骨表面有表浅裂隙，表浅层细胞部分消失；移行层见有软骨细胞簇；放射层细胞排列呈柱状，有细胞簇集，潮标完整。
木豆叶水提物低剂量组软骨表面有表浅裂隙，表浅层细胞部分消失；移行层见软骨细胞簇；放射层细胞排列呈柱状，有细胞簇，潮标不完整。
木豆叶水提物中剂量组软骨表面有表浅裂隙，表浅层细胞部分消失；移行层见软骨细胞簇；放射层细胞排列呈柱状，细胞排列整齐，潮标完整。
木豆叶水提物高剂量组软骨表面光滑，表浅层细胞部分消失；移行层见有软骨细胞簇；放射层细胞排列呈柱状，排列整齐，潮标完整。
病理切片提示木豆叶水提物能有效防止关节软骨的破坏，促进关节软骨的修复，抑制关节炎症、促进炎症的吸收。高剂量组可见关节面光滑，软骨细胞排列整齐，潮标完整，关节软骨破较少，接近正常组，明显优于模型组；中、低剂量组和壮骨关节丸组仍可见有部分关节软骨的破坏，但与模型组相比仍有明显的改善。
本实验研究表明木豆叶水提物能防止软骨细胞的破坏，阻止软骨细胞基质的降解，促进软骨细胞基质的合成，明显改善软骨蛋白多糖和水的含量，促进关节软骨的修复，消除滑膜充血肿胀，促进关节炎症的吸收，显著改善血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。但对软骨胶原和血清中钙、磷的含量无明显的影响。
实施例4本发明木豆叶水提物和醇提物对体外培养软骨细胞增殖和蛋白质合成的作用1材料1.1药品 同“实施例3”，另外，木豆叶醇提取物根据实施例2的方法制备得到。
1.2动物 同“实施例3”。
1.3主要试剂和仪器培养用液及主要试剂D-Hanks平衡液(每升双蒸水含有NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O1.34g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，6％酚红液体5滴，正压过滤除菌，分瓶封装，置-4℃冰箱保存备用)；PBS液(每升双蒸水含有NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.14g，KH2PO40.2g，高压消毒)；胎牛血清(购于永兴公司，杭州四季青有限公司制造，使用前用56℃水浴30分钟)；DMEM培养液(DMEM干粉由GIBCO公司生产，HEPES由SIGMA公司生产，13.4gDMEM干粉，NaHCO33.7g，HEPES2.38g，Penicillin0.0625g，Streptomycin0.1g共溶于900ml双蒸水中，正压过滤除菌，分瓶封装置-4℃冰箱保存备用，使用前加10％的胎牛血清，调整pH值为7.4)；胰蛋白酶由SIGMA公司生产，使用前用PBS液配制成0.25％的浓度，过滤除菌分装，-20℃冰箱冷藏备用；胶原酶II由SIGMA公司生产，使用前用PBS液配制成0.2％的浓度，过滤除菌分装，-20℃冰箱冷藏备用；10％中性福尔马林缓冲液(含有0.4％的十六烷基三甲基溴化氨，用NaOH调整pH值为7.0)；4％台盼蓝母液(称取0.4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至10ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4％)；0.04％甲苯胺蓝染色液(用0.01M pH值为4.0醋酸缓冲液配制)；考马斯亮蓝液(100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％的乙醇中，加100ml 85％的磷酸，补充蒸馏水至1000m1)；牛血清白蛋白(威佳公司)。
主要仪器与材料培养箱(美国SL)、超净工作台(上海净化设备厂)、倒置显微镜(Leica)、水浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)、恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂)、冷冻高速离心机(北京医用离心机厂)、、酶标仪(Barad3300)、眼科手术器械、培养皿、培养瓶、培养板(丹麦Nunc)、计数器、18号和20号留置针。
2方法2.1含药血清的制备将木豆叶水提、醇提物按成人体重(60kg)折算动物的等效剂量(g/kg/天)，分别给予动物1倍、5倍和10倍剂量，用蒸馏水配成10ml/次溶液灌胃，正常兔血清以蒸馏水10ml/次灌胃。连续两次灌胃，中间间隔4小时，于末次灌胃1小时后戊巴比妥钠腹腔麻醉下腹主动脉采血，4℃冰箱过夜，离心(2500rpm)25min，抽取血清(有溶血的剔除)，56℃、30min灭活，经0.22μm滤膜抽滤除菌，分装，-20℃保存备用。
2.2制备生长曲线将软骨细胞以每孔2×104个细胞/cm2接种5块96孔板，10％的兔血清培养，连续观察11天，在5个时间点(分别是3、5、7、9、11天)以MTT法测定细胞增殖，绘制生长曲线，确定观察点。
2.3含药血清对体外软骨细胞增殖影响将传代细胞接种在96孔板中，接种密度为2×104个细胞/cm2，分别用5％、10％、15％的正常兔血清、木豆叶提取物血清、壮骨关节丸血清以及胎牛血清培养，隔天换液，第五天吸去培养液后加入100μl纯DMEM及5mg/ml的MTT20μl/孔，放置培养箱中4小时后吸去液体加入PBS100μl漂洗后吸去液体加入150μl二甲基亚酚(DMSO)，10min后在酶标仪上测OD值，波长为490nm。
同法对比不同灌胃量含药血清对软骨细胞增殖的影响。
2.4含药血清对体外软骨细胞蛋白质合成的影响取传一代的软骨细胞，用DMEM培养液(含10％胎牛血清)稀释成2×105/ml，24孔培养板中每孔1毫升，培养24小时细胞贴壁后，吸去上清液分别更换为含空白兔血清、木豆叶水提物含药血清、木豆叶醇提物含药血清的DMEM培养液，培养五天后采用考马斯亮蓝法测定细胞内蛋白及总蛋白。
蛋白测定方法将胰蛋白酶分别加入24孔培养板孔中(测定细胞内蛋白则倾去上清液进行操作)，收集各孔细胞于相应试管中，各加0.3mol/L NaOH0.5ml，置100℃水浴30分钟，使细胞裂解。取细胞裂解液100μI和1ml的考马斯亮蓝液混合，放置10分钟后将液体置于96孔板中，酶联免疫检测仪上以牛血清白蛋白(1-50μg)作为标准品，595nm波长测A值，根据标准曲线推算出样品中蛋白含量。
2.5数据处理及统计学分析所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析(ANOVA)。显著性检验水准取α＝0.05，P＜0.05则为有显著性差异。
3结果3.1生长曲线软骨细胞在体外培养，3～5天细胞快速增殖，5～7天细胞增殖达到高峰，以后逐渐平缓，略有下降的趋势；3～5天细胞增殖活跃，共倍增3.5倍，以后细胞倍增能力下降。因此观察点确定在第5～7天比较适合(本实验采用的软骨细胞观察点均为第5天)，见附

图1(水提物)。
附图1体外培养软骨细胞生长曲线横坐标天，纵坐标OD值。
3.2含药血清对体外软骨细胞增殖影响3.2.1不同浓度含药血清对软骨细胞增殖的影响通过不同浓度含药血清对软骨细胞增殖的预试验，寻找一个比较理想、合理的血清浓度作为药效观察浓度，以尽可能排除血清中其它细胞因子对药效试验的干扰。结果如下表6。
表6 不同浓度含药血清对软骨细胞增殖的影响(x±s)

注各组与兔血清组相比*P＜0.05；**P＜0.01。
从表6可以看出木豆叶水提取物组和醇提物组均优于空白兔血清组及胎牛血清组，尤以木豆叶水提物组更为明显；而兔血清和胎牛血清组间无差异。在5％、10％血清浓度时，含药血清均显现出促进软骨细胞增殖的作用；而15％高浓度血清组并没有显现出明显地促进软骨细胞增殖的作用，这可能是高浓度血清中的细胞因子等血清固有成分含量过高，相互干扰，影响或掩盖了药效作用所致。
从以上预试验可知(1)兔血清完全可以替代胎牛血清进行体外药效试验；(2)采用的血清浓度以10％较为合理。
3.2.2不同灌胃量的10％血清对软骨细胞增殖的影响表7 不同灌胃量的10％血清对软骨细胞增殖的影响(x±s)

注与兔血清组相比**P＜0.01；与醇提物组相比##P＜0.01。
从表7可以看出(1)木豆叶水提物和醇提物不同灌胃量的10％血清均能促进软骨细胞的增殖，与兔血清相比P＜0.01，差异有显著性意义；(2)不同的剂量表现出一定的量效关系；(3)木豆叶水取物各剂量组的OD值均比醇提物组高(P＜0.01)，差异有显著性意义，说明木豆叶水提物对软骨细胞增殖的影响优于醇提物。
3.3含药血清对体外软骨细胞内蛋白合成的影响表8 不同灌胃量的10％血清对软骨细胞内蛋白合成的影响(x±s)

注与兔血清组相比**P＜0.01；与醇提物组相比##P＜0.01。
从表8可以看出(1)木豆叶水提物和醇提物不同灌胃量的10％血清均能促进软骨细胞内蛋白的合成，与兔血清相比P＜0.01，差异有显著性意义；(2)不同的剂量表现出一定的量效关系；(3)木豆叶水提物各剂量组软骨细胞内蛋白合成量均高于醇提物组(P＜0.01)，差异有显著性意义。
3.4含药血清对体外软骨细胞总蛋白合成的影响表9不同灌胃量的10％血清对软骨细胞总蛋白合成的影响(x±s)

注与兔血清组相比**P＜0.01；与醇提物组相比##P＜0.01。
从表9可以看出(1)木豆叶水提物和醇提物不同灌胃量的10％血清均能促进软骨细胞总蛋白的合成，与兔血清相比P＜0.01，差异有显著性意义；(2)不同的剂量表现出一定的量效关系；(3)木豆叶水提取物5倍和10倍等效量10％血清的软骨细胞总蛋白合成量均高于醇提物组(P＜0.01)，差异有显著性意义。
骨性关节炎是活动关节的一种慢性退行性疾病，以关节软骨胶原纤维断裂、蛋白多糖进行性耗损为特征。而软骨细胞的病变是该病产生的根源。我们运用含药血清培养软骨细胞，使中药更加接近于在体内的作用环节，更能反映中药对软骨细胞的作用。
试验结果证明(1)木豆叶水提物和醇提物含药血清均能够促进体外培养软骨细胞的增殖；(2)木豆叶水提物和醇提物含药血清无论对软骨细胞内蛋白还是总蛋白的合成均具有明显的促进作用。
权利要求
1.木豆叶用于制备治疗骨性关节炎的药物用途。
2.根据权利要求1的用途，其中使用的木豆叶是木豆叶提取物。
3.根据权利要求2的用途，其中使用的木豆叶提取物是木豆叶水提物。
4.根据权利要求2的用途，其中使用的木豆叶提取物是木豆叶醇提物。
5.根据权利要求3的用途，其中使用的木豆叶水提物通过下列方法制备取木豆叶，加药材重量的10倍水浸泡约1小时，加热煎煮，提取三次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05-1.10，过滤，滤液经干燥，得到木豆叶水提物干浸膏粉。
6.根据权利要求4的用途，其中使用的木豆叶醇提物通过下列方法制备取木豆叶，用4倍重量的20％-80％(v/v)乙醇回流，提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压回收乙醇后，调节相对密度为1.10，干燥，得到木豆叶醇提取物。
7.根据权利要求1-6之一的用途，其中木豆叶或者木豆叶提取物可以单独使用或者与其它治疗骨性关节炎的药物配伍使用。
8.根据权利要求1-6之一的用途，其中木豆叶或者木豆叶提取物制成药物组合物使用。
9.根据权利要求8的用途，其中所述药物组合物是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、注射剂、或缓控释制剂。
全文摘要
本发明提供了一种木豆叶用于制备治疗骨性关节炎药物的用途。木豆叶是指木豆(Cajanus canjan(L.)Millsp.)的干燥叶及嫩枝，木豆叶经过传统的煎煮或者粉碎压片，可以用于治疗骨性关节炎；本发明的用途更理想的是通过制备木豆叶提取物实现。本发明的木豆叶提取物包括木豆叶水提物和醇提物，研究表明，木豆叶提取物在体内对骨性关节炎动物模型有显著疗效，在体外能够促进软骨细胞的增殖，对软骨细胞内蛋白和总蛋白的合成均具有明显的促进作用，可用于制备治疗骨性关节炎的药物。
文档编号A61P19/00GK1772033SQ200510117299
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者袁捷 申请人:浙江海正药业股份有限公司