专利名称：可基因组整合的重组腺相关病毒载体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，提供一种能够产生基因组定位整合的重组腺相关病毒载体的构建方法。
背景技术：
腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是一种复制缺陷型病毒，其基因组是一条长约4.7kb的单链DNA，且DNA两端有长为145个核苷酸的末端反转重复序列(ITRs)。AAV的核苷酸序列已经明确，并且明确了ITR内包括了指导腺相关病毒DNA复制、病毒包装和发生宿主细胞基因组整合的顺式作用元件。p5、p19和p40三个启动子驱动腺相关病毒基因组内两个编码rep基因和cap基因的开放阅读框的表达。p5和p19两个启动子驱动rep基因的表达，并通过AAV内含子的不同剪接，产生四个不同的Rep蛋白，分别是Rep78、Rep68、Rep52、Rep40。Rep蛋白拥有多个酶学活性，参与病毒基因组的复制。p40启动子作用于cap基因，不同的翻译启始位点则是产生VP1、VP2、VP3三个相关的外壳蛋白的主要原因。腺相关病毒在感染人类细胞后，病毒的基因组整合到人细胞19号染色体，进入细胞内的潜伏感染阶段。在辅助病毒(如腺病毒)存在的情况下，才会发生感染性病毒的再生。腺相关病毒所拥有的一个性质就是能够作为一个载体将外源DNA转移到细胞内。腺病毒感染培养的细胞是不会产生任何病理反应的，对人类和其他动物的感染也不会产生任何可感知的症状，并且腺相关病毒可以在机体内感染许多组织以及大部分哺乳类动物细胞。通过ITR和Rep蛋白(Rep78/68)的诱导作用，AAV的基因组可以定点整合到人类细胞第19条染色体上，并且至今未发现有关的不良作用。但AAV的定位整合的必需条件是ITR和Rep蛋白同时存在，如只有ITR的作用，则只能产生随机的非定位整合，则有引起其它不良后果的可能。
本发明是应用腺相关病毒的rep蛋白和ITRs作为基因转导系统的组成部分，以实现外源基因的定位整合。实现外源基因的定位整合可以提供一更有效的、更安全的基因转导方法。而其它转导方式只能有低效率地随机非定位整合，并且需要以周期细胞作用应用目标，即使发生了整合也是在基因组的随机的位置上发生的。随机整合存在使有害基因的激活或必需基因的失活等无心的潜在风险。许多临床基因治疗实验和协议都采用了基于病毒的基因转导系统，所以本发明为风险更低的病毒载体用于人类的基因治疗的系统提供了一种参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种能够产生基因组定位整合的重组腺相关病毒载体的构建方法，以及该腺相关病毒载体在疼痛的基因治疗的有关应用。
本发明是按以下方法实现的由于腺相关病毒实现基因组的定位整合需要有其ITR和Rep蛋白的共同作用和诱导，所以在基因转导系统中必须同时包括上述两种成分(除基因治疗中所涉及的治疗基因外)。又由于腺相关病毒的Rep蛋白对哺乳动物细胞有一定的毒性作用而影响重组腺相关病毒载体的生产，所以在生产阶段应屏蔽Rep蛋白的表达，只能在治疗中感染后才能有Rep蛋白的表达，与ITR共同诱导定位整合的发生。
本发明主要涉及两个病毒载体，其中之一是基因转导系统的主载体(pAAV-MG)，其结构见附图-1。它的DNA序列中不仅包括了常规的重组腺相关病毒载体的结构，如两端的ITRs、治疗基因的DNA基因序列，还包括了能够驱动rep基因表达的启动子(如HCMV启动子等)、rep基因的部分序列、某人源基因的内含子的部分序列；另一个载体的辅助载体(pAAV-SV)，其结构见附图-2。它主要包含了rep基因的其余部分序列(与主载体中相应部分相比)、某人源基因的内含子的其余部分序列(与主载体中相应部分相比)、腺相关病毒基因组两端的ITRs序列。
主载体(pAAV-MG)和辅助载体(pAAV-SV)构建成功后，分别用于生产相应的重组腺相关病毒rAAV-MG和rAAV-SV(生产方法可参见其它文献中所述，此处不赘述)。
应用上述病毒时，将上述两种病毒按1∶1的比例(活性颗粒数或根据滴度决定)混合于病毒缓冲液内，同时应用于实验对象。两种病毒进入同一细胞后，两种病毒的基因组可在细胞内形成二聚体的形态，即rAAV-MG右侧的ITR与rAAV-SV的左侧的ITR通过重组而形成二聚体形态，其结构可见附图3。此时，位于内含子内部的ITR则成为内含子的组成部分，该时的内含子在上游的启动子驱动rep基因转录时则通过剪切机制被切除(相应的是，rep基因在两个生产质粒中都是不完整的，所以在生产重组病毒时不会影响其生产)，则可以顺利地翻译出成熟的Rep蛋白，后者与重组病毒基因组两端的ITRs共同诱导基因组对细胞染色体的定位整合，而达到提高基因治疗的安全性。
图1为质粒pAAV-MG的结构简图。
图2为质粒pAAV-SV的结构简图。
图3为rAAV-MG与rAAV-SV的基因组形成二聚体的结构简图。
权利要求
1.一种用于生产重组腺相关病毒的质粒载体，其特点是(1)包含了腺相关病毒基因组中的未端反转重复序列(Inverted Terminal Repeats，ITR)；(2)包含了表达治疗某种疾病的物质的目标基因；(3)包含了腺相关病毒的rep基因的一部分DNA序列；(4)包含了人类基因的某一内含子的一部分DNA序列。
2.一种用于生产重组腺相关病毒的质粒载体，其特点是(1)包含了腺相关病毒基因组中的未端反转重复序列(Inverted Terminal Repeats，ITR)；(2)包含了权利要求1中内含子的另一部分DNA序列；(3)包含了腺相关病毒的rep基因的其余DNA序列。
3.由权利要求1所述的质粒载体生产的重组腺相关病毒，其特点是(1)包含了表达治疗某种疾病的物质的目标基因；(2)包含了腺相关病毒的rep基因的一部分DNA序列；(3)包含了人类基因的某一内含子的一部分DNA序列。
4.由权利要求2所述的质粒载体生产的重组腺相关病毒，其特点是(1)包含了权利要求1中所及内含子的另一部分DNA序列；(3)包含了腺相关病毒的rep基因的其余DNA序列。
5.一种重组腺相关病毒的应用方法，其特征是同时应用权利要求3和权利要求4所述的两种重组腺相关病毒。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，提供了一种能够产生基因组定位整合的重组腺相关病毒载体的构建方法。本发明利用腺相关病毒在感染细胞内其基因组能够形成首尾相连的二聚体形态的机制，并结合了真核基因内含子的剪切机制，使腺相关病毒rep基因在感染细胞后可正常表达，在不影响重组腺相关病毒生产的条件下，Rep蛋白和腺相关病毒ITR共同诱导重组腺相关病毒基因组实现定位整合，提高了重组腺相关病毒用于人类疾病基因治疗的安全性，如此生产的重组腺相关病毒可安全地用于各种相应疾病的基因治疗。
文档编号A61K48/00GK1958803SQ20051011897
公开日2007年5月9日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者俞卫锋, 徐学武 申请人:俞卫锋, 徐学武