专利名称：具有抗肿瘤活性的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的具有抗肿瘤活性的化合物。明确地，本发明提供了通式(I)化合物用于制备抗肿瘤药物的用途 其中，X+选自N+(R1，R2，R3)和P+(R1，R2，R3)，其中，R1、R2和R3相同或不同，选自氢和C1-C9直链或直链烷基、-CH＝NH(NH2)、-NH2、-OH；或两个或更多R1、R2和R3与它们连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的、单环或二环杂环系；条件是R1、R2和R3中至少一个不是氢；Z选自-OR4，-OCOOR4，-OCONHR4，-OCSNHR4，-OCSOR4，-NHR4，-NHCOR4，-NHCSR4，-NHCOOR4，-NHCSOR4，-NHCONHR4，-NHCSNHR4，-NHSOR4，-NHSONHR4，-NHSO2R4，
-NHSO2NHR4，-SR4，其中，R4是C2-C20饱和或不饱和的、支链或直链烷基；Y-选自-COO-、PO3H-、-OPO3H-、四唑(tetrazolate)-5-基。
第一组优选化合物包括式(1)化合物，其中，X是N+(R1，R2，R3)，更优选三甲铵。第二组优选化合物包括式(I)化合物，其中，两个或更多R1、R2和R3与它们连接的氮原子一起形成杂环系，它优选选自吗啉、吡啶、吡咯烷、喹啉、奎宁环。
第三组优选化合物包括式(1)化合物，其中，R1和R2是氢，和R3选自-CH＝NH(NH2)、-NH2和-OH。
在本发明的不同实施方案中，R4基团优选是C7-C20饱和或不饱和的、直链或支链烷基。优选的R4基团选自庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。
Z基团的优选实例是脲基(-NHCONHR4)和氨基甲酸酯(-NHCOOR4、-OCONHR4)基。
特别优选的是式(I)化合物，其中，X+、R1、R2、R3具有以上公开的含义，Z是脲基(-NHCONHR4)或氨基甲酸酯(-NHCOOR4、-OCONHR4)，R4是C7-C20，优选C9-C18饱和或不饱和的、直链或支链烷基。
式(I)化合物在与Z基团连接的碳原子处具有不对称中心。对于本发明目的来说，每一式(I)化合物既可以以R，S外消旋混合物存在，又可以以单独的R/S异构形式存在。
式(I)化合物是季铵或总包含Y-阴离子基团的衍生物(X+)。根据pH，每一式(I)化合物可以无关要紧地以两性离子(内盐)或以化合物(其中Y-为YH形式)的形式存在。在这种情况下，X+与药理学可接受的酸成盐。式(I)涵盖了所有这些不同的可能性。
一组特别优选的化合物包括1)R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；2)R，S-4-奎宁环-3-(十四烷氧羰基)-氧基丁酸盐；
3)R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氧基丁酸盐；4)R，S-4-三甲铵-3-(壬基氧羰基)-氧基丁酸氯化物；5)R，S-4-三甲基-3-(壬基氨基甲酰基)-氧基丁酸盐；6)R，S-4-三甲铵-3-(辛基氧羰基)-氨基丁酸盐；7)R，S-4-三甲铵-3-(壬基氧羰基)-氨基丁酸盐；8)R，S-4-三甲铵-3-辛基氧基丁酸盐；9)R，S-4-三甲铵-3-十四烷基氧基丁酸盐；10)R，S-1-胍(guanidinium)-2-十四烷氧基-3-(四唑-5-基)-丙烷；11)R，S-1-三甲铵-2-十四烷氧基-3-(四唑-5-基)-丙烷；12)R，S-3-奎宁环-2-(十四烷氧羰基)-氧代-1-丙烷一碱价膦酸盐；13)R，S-3-三甲铵-2-(壬基氨基羰基)-氧代-1-丙烷一碱价膦酸盐；14)R，S-3-吡啶-2-(壬基氨基羰基)-氧代-1-丙烷膦酸氯化物；15)R-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；16)R-4-三甲铵-3-(十一烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；17)R-4-三甲铵-3-(庚基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；18)R，S-4-三甲铵-3-(壬基硫代氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；19)R-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；20)S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；21)S-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；22)R，S-4-三甲铵-3-十四烷基氨基丁酸盐；23)R，S-4-三甲铵-3-辛基氨基丁酸盐；24)R，S-4-三甲铵-3-(癸烷磺酰基)氨基丁酸盐；25)R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨磺酰基)氨基丁酸盐；26)S-4-三甲铵-3-(十二烷磺酰基)氨基丁酸盐；27)R-4-三甲铵-3-(十二烷磺酰基)氨基丁酸盐；28)S-4-三甲铵-3-(十一烷基氨磺酰基)氨基丁酸盐；
29)R-4-三甲铵-3-(十一烷基氨磺酰基)氨基丁酸盐；30)R-4-三甲铵-3-(十二烷基氨基甲酰基)氨基丁酸盐；31)R-4-三甲铵-3-(10-苯氧基癸基氨基甲酰基)氨基丁酸盐；32)R-4-三甲铵-3-(反式-b-苯乙烯磺酰基)氨基丁酸盐。
式(I)化合物的制备公开在以WO 99/59957号公布的国际专利申请中，与本申请名称相同，其引入本文以作参考。其中描述的是化合物(I)治疗高血糖状态例如糖尿病和与其相关的病理学的用途。化合物(I)的治疗活性归因于肉毒碱棕榈酰基转移酶的抑制作用。
在对不同肿瘤细胞系的体外研究中，已经出人意料地发现了化合物(I)具有显著的抗增殖和杀肿瘤作用，它与CPT抑制无关，这通过观察一种已知的CPT-1抑制剂乙莫克舍而得以确认，当在与化合物(I)使用的相同实验条件中进行测定时，它没有显示任何抗增殖或杀肿瘤活性。使用肿瘤动物模型随后在体内证实了该体外结果。也在这些条件下，低剂量的化合物(I)证明有效减小了肿瘤块而没有相关的副作用。
相应地，本发明的目标是化合物(I)制备抗肿瘤药物的用途。
优选根据本发明治疗下列肿瘤白血病、癌症、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、直肠癌和膀胱癌，尤其是白血病和肝癌。治疗可以在肿瘤生长、增殖和扩散的各个阶段应用。
为了用于治疗，化合物(I)可与药学可接受的载体和赋形剂制成药剂。本发明的组合物适于口服、胃肠外、直肠、经皮和经病变内给药。口服和胃肠外剂型的例子包括胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、糖浆和各自的溶液剂和乳剂。
化合物(I)的剂量可根据所用的具体产品、根据给药途径和根据疾病进程而变化。提供0.1到0.50μM，优选0.5-30μM的活性物质血浆浓度的剂量通常是可接受。
本发明的进一方面关注包含化合物(I)和不同抗肿瘤剂联合的药物制剂，用于同时、分别或顺序对肿瘤患者进行给药。可以与化合物(I)联合使用的抗肿瘤剂的实例包括细胞毒性化合物或细胞生长抑制化合物、抗代谢物、激素拮抗剂、生物碱(alcaloids)、抗生素，尤其是蒽环类抗生素(antracyclines)、烷化剂、肽、调节生物响应的试剂、细胞因子。
对活性物质的具体联合、它们的剂量和给药途径的选择，取决于肿瘤类型、肿瘤对药理学治疗的抵抗、患者对治疗本身的耐受性和以各个病例为基础评价的不同变量。
下列非限制性实施例进一步详细地阐述了本发明。
实施例1化合物R-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐(ST1326)对人肝癌细胞(HepG2)增殖和促凋亡活性的体外抑制作用肿瘤细胞系HepG2由ATCC(American Type Cell Culture-Mannas，Virginia，acc.no.HB-8065)提供，随后在我们的实验室中进行培养。该细胞在完全培养基，即添加了10％FCS、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和抗生素(青霉素/链霉素)的MEM中培养。该培养基、培养物产物和试剂都购自Hyclone-Celbio(Milan，Italy)。将细胞接种在60mm直径的Petri培养皿中。铺板后，在处理前让细胞生长24小时。
在该试验中，将增加量的试验分子加入到半融合HepG2细胞中(Kogure等人，Cancer Chemother.Pharmacol.，2003；DOI.10.1007/s)；从细胞播种开始的不同时间测定抗增殖和促凋亡作用。
在某些情况下，实验设计是一旦准备好了细胞培养就加入试验化合物，在另一些情况下，在适当地除去条件培养基和用新的(完全)培养基洗涤细胞后每24小时将培养物暴露于化合物。用活体染料适当稀释以显现活细胞后，在Bürker室中计算细胞数量。尤其是，使用锥虫蓝排除法在处理后的0、24和48小时进行细胞计数。每次实验至少进行10次细胞计数，每次处理都进行四次。
进一步的分析包括利用碘化丙锭(propidium iodide)作为活细胞标记物的细胞荧光测定法。分析试验化合物，与CTP抑制剂乙莫克舍比较，以证明杀肿瘤作用是否是由于CPT-1抑制或包括了新的机制。附图
中显示了显著的数据。
出人意料地是，结果显示只有化合物ST1326能产生伴随显著杀肿瘤活性的体外抗增殖作用。
除此之外，使用流动细胞荧光测定法进行细胞生存能力分析。表1中记录的数据表示的是仅处理1次的细胞(0时)；细胞死亡率(24、48和72小时)计算为相对于10,000个所得事件的百分比(平均数±标准偏差)。
表1
如上所述，在适当地除去上清液(surnatants)并用完全培养基洗涤培养物以后，在进一步的实验中每24小时加入一次试验分子。在这种情况下，随后加入的试验分子显示了对细胞生存能力的累加效应(表2)。在对照组中，除去上清液，单独将完全培养基加入到培养物中。细胞死亡率(在48和72小时)计算为相对于10,000个所得事件的百分比(平均数±标准偏差)。
表2
*在除去上清液之后第二次加入试验分子；**在除去上清液之后第三次加入试验分子。
实施例2化合物ST1326对急性白血病T细胞(Jurkat)的体外促凋亡活性。
肿瘤细胞系Jurkat由ATCC(American Type Cell Cul ture-Mannas，Virginia，acc.No.TIB-152)提供，随后在我们实验室中培养。这些细胞在添加了10％FCS(胎牛血清)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES和抗生素(青霉素/链霉素)的包含RPMI 1640的完全培养基中培养。该培养基、培养产物和试剂都购自Hyclone-Celbio(Milan，Italy)。细胞接种在25mm2的烧瓶中。铺板后，在处理前让细胞生长24小时。
通过加入增加量的试验分子到半融合Jurkat细胞中来进行试验；从培养制备开始在不同时间测定促凋亡作用。
试验设计是仅在细胞培养开始时加入试验化合物，在规定的时间测定结果。仅使用碘化丙锭流动细胞荧光测定法技术获得细胞死亡率数据。那些活着的细胞悬浮在培养基中的事实使得这些分析非常容易进行。
表3显示了对于化合物的杀肿瘤作用来说，Jurkat细胞比HepG2细胞敏感得多。由于该原因，仅在处理后2小时和24、48和72小时就测定细胞死亡率。
死亡率计算成相对于10,000个获得的标准结果的百分比。由于结果几乎刚好重叠，每个单个试验的所有数据偏差很小，所以5次细胞荧光测定法读数的平均值记录在下表中，而不包括标准偏差。
表3
除此之外，为了排除试验分子在正常PBMC中诱导的毒性，也使用取自健康个体的淋巴细胞与试验化合物接触进行生存能力试验。
表4中记录的结果显示证实能够杀死Jurkat细胞的相同剂量的试验化合物在72小时之后对PBMC没有毒性。
表4
实施例3ST1326化合物的亚最佳剂量对多柔比星对人肝癌细胞(HepG2)抗肿瘤作用的体外拮抗活性。
肿瘤细胞系HepG2由ATCC(American Type Cell Culture-Mannas，Virginia，No.HB-8065)提供，随后在我们实验室中培养。这些细胞培养在添加了10％FCS(胎牛血清)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和抗生素(青霉素/链霉素)的包含MEM的完全培养基中。该培养基、培养产物和试剂都购自Hyclone-Celbio(Milan，Italy)。实验设计使用ST1326和已知的抗肿瘤药，例如多柔比星(HepG2细胞对多柔比星显示了高耐药性)，来测定化合物的激动作用。使用ST化合物其浓度在之前的实验中证明仅能部分产生杀肿瘤作用(0.1μM；～50％细胞死亡率)。在该实验中，将下列化合物加入到96孔板的半融合HepG2细胞中-0.25、0.5、5.0μg/mL多柔比星；-0.1μM ST和0.25μg/mL多柔比星组合。
培养24小时以后，将包含不同浓度多柔比星和ST/多柔比星混合物的培养基除去，用完全培养基洗涤细胞。3天的处理之后，与在完全培养基中培养了相同时间的对照细胞比较，测定试验化合物的抗肿瘤作用。
表5显示，只有最高剂量的多柔比星(5.0μg/mL)能够引起显著的细胞死亡率。加入浓度分别为0.1μM和0.25μg/mL的ST和多柔比星显示了它们的联合的促进杀肿瘤作用。细胞死亡率计算为相对于10,000个所得事件的百分比(平均数±标准偏差)。
表5
实施例4ST1326化合物对患吉田(Yoshida)肿瘤大鼠的体内抗肿瘤作用。
将体重190-200g的雄性Wistar鼠(Morini s.r.l.)维持在22±2℃下，12小时的明/暗周期，自由接近水和食物(标准饮食)。用来自AH-130吉田肝细胞瘤性腹水的10×107个细胞在一些大鼠的腹膜内接种(Llovera等人，Int.J.Cancer 61138-41(1995)；品种由Prof.JM Argiles赠与)。接种5-7天后，这些大鼠生成了通过腹部肉眼分析可检测到的腹水。穿刺显示存在大约80-100ml腹水，它有时表现为血性的，平均包含15-20×106/ml肿瘤细胞。
试验设计为引起腹水7天后，15只动物(处理组)接受2ml包含ST(25mg/Kg腹腔内注射)的缓冲盐水，而另外15只动物(对照组)只接受缓冲盐水。隔日进行相同的处理，每只动物一周至多进行总共4次处理。根据初步研究选择剂量，其中，腹膜内给药5小时后ST的血浆浓度达到了6.1μM。随后观察这些动物3周(追踪观察)，检查腹水渗出物，接种部位的皮下肿瘤块的存在和死亡率。
最令人感兴趣的观察是治疗组动物在3周的追踪观察期间存活，而对照大鼠在第一和第二周之间死亡。
对照动物的尸体解剖检查显示腹腔中存在包含肿瘤细胞的腹水，肠派伊尔(Peyer)淋巴集结增生，不存在累及腹腔器官的肿瘤损伤，最后在肿瘤细胞接种部位肿瘤损伤发展为接近于肌肉筋膜。处理后的大鼠在第三周末被处死，它们的尸体解剖检查显示在腹腔内没有任何变化，或在腹水中或在接种部位中没有存在肿瘤细胞。
试验数据/结果的概要显示在下表6和7中。
表6
表7
口服和静脉注射给药获得的实验结果显示了试验化合物在不同剂量下的治疗效果(口服途径100mg/Kg；静脉注射2mg/Kg)。
附图的简要说明关于细胞生存能力的数据表示为活细胞数量与对照培养物的百分比(＝100％)。(E＝乙莫克舍；ST1326＝受试化合物)。仅24小时后就观察到了在小于10μM ST存在下的培养细胞数量的显著减少。相同浓度的乙莫克舍无效。
权利要求
1.通式(I)化合物、其盐、对映体和外消旋混合物用于制备抗肿瘤药物的用途 其中，X+选自N+(R1，R2，R3)和P+(R1，R2，R3)，其中，R1、R2和R3相同或不同，选自氢和C1-C9直链或直链烷基、-CH＝NH(NH2)、-NH2、-OH；或两个或更多R1、R2和R3与它们连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的、单环或二环杂环系；条件是R1、R2和R3中至少一个不是氢；Z选自-OR4，-OCOOR4，-OCONHR4，-OCSNHR4，-OCSOR4，-NHR4，-NHCOR4，-NHCSR4，-NHCOOR4，-NHCSOR4，-NHCONHR4，-NHCSNHR4，-NHSOR4，-NHSONHR4，-NHSO2R4，-NHSO2NHR4，-SR4，其中，R4是C2-C20饱和或不饱和的、支链或直链烷基；Y-选自-COO-、PO3H-、-OPO3H-、四唑-5-基。
2.根据权利要求1的式(I)化合物的用途，其中，各自独立地，-X是三甲铵或基团N+(R1，R2，R3)，其中，两个或更多个R1、R2和R3与它们连接的氮原子一起形成杂环系，其选自吗啉、吡啶、吡咯烷、喹啉和奎宁环；-R4选自庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基；-Z是脲基(-NHCONHR4)或氨基甲酸酯(-NHCOOR4、-OCONHR4)基。
3.根据权利要求2的化合物的用途，所述化合物选自-R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R，S-4-奎宁环-3-(十四烷氧羰基)-氧基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氧基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(壬基氧羰基)-氧基丁酸氯化物；-R，S-4-三甲基-3-(壬基氨基甲酰基)-氧基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(辛基氧羰基)-氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(壬基氧羰基)-氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-辛基氧基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-十四烷基氧基丁酸盐；-R，S-1-胍-2-十四烷氧基-3-(四唑-5-基)-丙烷；-R，S-1-三甲铵-2-十四烷氧基-3-(四唑-5-基)-丙烷；-R，S-3-奎宁环-2-(十四烷氧羰基)-氧代-1-丙烷一碱价膦酸盐；-R，S-3-三甲铵-2-(壬基氨基羰基)-氧代-1-丙烷一碱价膦酸盐；-R，S-3-吡啶-2-(壬基氨基羰基)-氧代-1-丙烷膦酸氯化物；-R-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(十一烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(庚基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(壬基硫代氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-S-4-三甲铵-3-(壬基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-S-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-十四烷基氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-辛基氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(癸烷磺酰基)氨基丁酸盐；-R，S-4-三甲铵-3-(壬基氨磺酰基)氨基丁酸盐；-S-4-三甲铵-3-(十二烷磺酰基)氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(十二烷磺酰基)氨基丁酸盐；-S-4-三甲铵-3-(十一烷基氨磺酰基)氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(十一烷基氨磺酰基)氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(十二烷基氨基甲酰基)氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(10-苯氧基癸基氨基甲酰基)氨基丁酸盐；-R-4-三甲铵-3-(反式-b-苯乙烯磺酰基)氨基丁酸盐。
4.根据权利要求3的用途，所述化合物是R-4-三甲铵-3-(十四烷基氨基甲酰基)-氨基丁酸盐。
5.根据权利要求1-4的化合物(I)在制备用于治疗白血病和肝癌的抗肿瘤药物中的用途。
6.治疗制剂，包含根据权利要求1-4任一项的化合物联合选自以下的抗肿瘤剂细胞毒性或细胞生长抑制化合物、抗代谢物、激素拮抗剂、生物碱、抗生素，尤其是蒽环类抗生素，烷化剂、肽、调节生物反应的试剂、细胞因子，用于同时、分别或顺序对肿瘤患者进行给药。
7.根据权利要求6的制剂，包含权利要求1-4任一项的化合物和蒽环类抗生素的联合。
8.根据权利要求7的制剂，其中，蒽环类抗生素是多柔比星。
全文摘要
公开了式(I)化合物，任选与不同生物活性物质联合用于制备抗肿瘤药物的用途，其中，X、Y和Z如本发明说明书中所定义。
文档编号A61P35/00GK1917867SQ200580004628
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月8日 优先权日2004年2月12日
发明者G·佩鲁索, M·卡尔瓦尼 申请人:迪菲安特制药有限公司