专利名称：得自山茶科植物的生物活性组合物及其生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本申请要求保护2004年1月12日提交的美国临时专利申请序号60/535,861的权益。
本发明涉及得自山茶科(Theacea)植物的生物活性组合物、其生产方法和这些组合物的用途。
背景技术：
山茶(茶植物)科包括含约40个属和600个种的树或灌木。茶树(Camellia sinensis)在山茶科中占据着独特的位置，因为此特殊的植物种主要用作生产全部三种基本茶类绿茶、乌龙茶和红茶的单一原料源(在本文统称为“茶植物”)。按照某些来源，有第4类茶，即所谓的“白茶”，其专门由茶植物的芽或梢生产。
茶的三种基本形式由加工程度决定，加工使用同等嫩幼茶叶。采集、分拣、清洁叶子，以不同方式氧化，然后蒸煮或干燥。术语“发酵”经常用于描述茶的加工，但术语“氧化”是对所发生的化学转变的更精确描述。
尽管加工有一些变化，但一般认为绿茶氧化程度最低，红茶最高。乌龙茶被认为是部分氧化的，因此处于绿茶和红茶之间的位置。就加工而言，绿茶和白茶之间的差异非常小(或根本没有差异)。
蒸煮并萎凋鲜叶，然后立即干燥，由此制备绿茶。使叶萎凋，在滚筒中碾碎，然后使其氧化几小时，之后干燥，由此制备红茶。乌龙茶得自干燥前仅部分氧化的叶子。
在世界范围内，茶是第二大(在水之后)最常饮用的液体，在美国是第六大(在水、软饮料、咖啡、啤酒和奶之后)最常饮用的液体。茶消费量在世界范围内持续增加，这尤其归因于关于该液体健康利益的公众认知逐渐增加。有越来越多的出版物提出茶及其成分的抗血管生成、抗细菌、抗癌、抗炎症、抗诱变、抗氧化物、抗脓毒和解毒特性。茶益处的名单还包括降低类风湿性关节炎风险、降低胆固醇水平和抗糖尿病特性。不是所有这些利益都被证明是统计学显著的。不过，非常广泛范围的茶益处反映了非常强生物活性物质的独特组成，这些物质存在于新鲜植物叶中，并经得住常规的茶加工。
具体地说，业已报道茶树的鲜叶含22.2％多酚、17.2％蛋白、4.3％咖啡因、27.0％粗纤维、0.5％淀粉、3.5％还原糖、6.5％果胶、2.0％醚提取物和5.6％灰分(Duke，J.A.，Handbook of Energy Crops(1983)，参见www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.html)。据报道每100g叶含8.0g H2O、24.5g蛋白、2.8g脂肪、58.8g总碳水化合物、8.7g纤维、5.9g灰分、327mg Ca、313mg P、24.3mgFe、50mg Na、2700μg β-胡萝卜素等同物、0.07mg硫胺素、0.8mg核黄素、7.6mg烟酸和9mg抗坏血酸。另一个报道记录到8.0g H2O、28.3g蛋白、4.8g脂肪、53.6g总碳水化合物、9.6g纤维、5.6g灰分、245mg Ca、415mg P、18.9mg Fe、60mg Na、8400μg β-胡萝卜素等同物、0.38mg硫胺素、1.24mg核黄素、4.6mg烟酸和230mg抗坏血酸。再另一个报道得到8.1g H2O、24.1g蛋白、3.5g脂肪、59.0g总碳水化合物、9.7g纤维、5.3g灰分、320mg Ca、185mg P、31.6mg Fe、8400μg β-胡萝卜素等同物、0.07mg硫胺素、0.79mg核黄素、7.3mg烟酸和85mg抗坏血酸(J.A.Duke和A.A.Atchley，“Proximate Analysis，”载于Christie，B.R.(编辑)，The Handbook ofPlant Science in Agriculture，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1984))。
叶还含有胡萝卜素、核黄素、烟酸、泛酸和抗坏血酸。咖啡因和丹宁是其中最有活性的组分(Council for Scientific and IndustrialResearch，1948-1976)。鲜叶中存在的抗坏血酸在制备红茶时被破坏。存在苹果酸和草酸，以及山奈酚、槲皮苷、茶碱、可可碱、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、树胶、糊精和肌醇。挥发油(叶鲜重的0.007-0.014％)的主要组分是己烯醛、已烯醇和低级醛、丁醛、异丁醛(isobuteraldehyde)、异戊醛以及正-己基、苄基和苯乙基醇、苯酚、甲酚、己酸、正-辛醇、香叶醇、沉香醇、苯乙酮、苄醇和柠檬醛。
已发现鲜茶叶通常具有高水平的多酚(儿茶素)黄烷醇基团，其可高达叶干物质的30％。儿茶素主要包括(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。另外存在茶独有的3-没食子酰基奎宁酸(茶没食子素)和氨基酸茶氨酸(5-N-乙基谷氨酰胺)(Duke，J.A.，Handbook of Energy Crops(1983)，参见www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.html)。
茶叶含高水平的多酚氧化酶和过氧化物酶。第一种酶催化儿茶素的需氧氧化，该过程在叶细胞结构完整性被破坏时启动。酚氧化酶负责产生双黄烷醇、茶黄素、表茶黄酸和Thearubigens，它们构成了红茶中可提取物质的最大部分。这些化合物大部分易于和咖啡因形成复合物，咖啡因在鲜叶中具有显著水平(干物质的2-4％)。过氧化物酶在与原花色素产生上述复合物时起重要作用。在红茶香味组分中存在的数百种挥发性化合物中，有多种化合物的形成也由儿茶素醌启动。另外，发生相对可溶性的糖苷向较低溶解性糖苷配基的转变。
以上过程的所有复杂级联都由叶细胞结构的破坏启动，并随氧化时间加强。因此，通常以强烈揉或切或相对长时间氧化加工的红茶组成与鲜叶的组成极为不同。尽管绿茶(和白茶)以最小氧化加工，其组成与鲜叶的组成更类似，但也有非酶或酶催化的变化，这些变化在采摘后极为快速地发生，在干燥阶段产生新的挥发性物质。因此，即便是相对温和的绿茶加工也产生了与原始新鲜植物组成的某些偏离，可降低鲜茶植物叶的治疗价值和其它疗效。
众多的近期研究清楚表明，茶的疗效以下列顺序降低白茶＞绿茶＞乌龙茶＞红茶。因此，研究新鲜茶植物可防止由于常规茶加工而观察到的特定活性降解。鲜嫩山茶(Camellia)叶含约80％水。细胞的坚固细胞壁防止细胞膨胀和脱水。细胞壁结构的破坏引起新鲜植物组织脱水，接着引起一系列有害的物理化学和生物化学过程渗压休克、酶区室化丧失和破坏、水解和氧化、酚聚合、糖苷转变成糖苷配基、产生Maillard反应产物、异构化和微生物污染。因此，鲜山茶含非常广泛范围的生物活性物质，其仅有一部分在常规提取过程中变成可利用的。因此，仅有细胞壁、分解代谢产物和稳定代谢物可用沸水提取，以获得茶饮料，或用不同的溶剂提取，以获得有限部分的生物活性组分(主要为多酚和类黄酮)。
按照鲜茶叶作为有价值治疗剂和其它潜在有益生物活性组合物来源的潜能，需要研究鲜茶植物，以确定如何最大化其治疗作用和其它潜在的有益生物活性特性。
发明概述本发明涉及一种生物活性组合物。在一个实施方案中，生物活性组合物包括得自山茶科植物的分离生物活性组分。合适的生物活性组分可包括但不限于细胞壁组分、细胞壁组分提取物、膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物、细胞汁浆液和/或其组合。
本发明还涉及适于局部施用于哺乳动物的生物活性局部制剂。在一个实施方案中，生物活性局部制剂包含局部有效量的本发明生物活性组合物。生物活性局部制剂可进一步包含局部可接受的载体。
本发明还涉及在哺乳动物皮肤组织中抑制炎性活性的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以在皮肤组织中有效抑制炎性活性的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
本发明还涉及保护哺乳动物皮肤组织免受紫外线诱导损伤的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以有效减轻皮肤组织紫外线诱导损伤和防止皮肤组织氧化损伤的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
本发明还涉及使哺乳动物皮肤组织中的皮肤病正常化的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括以有效使皮肤组织的细胞疾病正常化的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
本发明还涉及用于分离得自山茶科植物细胞汁的生物活性组分的方法。该方法包括提供山茶科植物。然后将山茶科植物分离成细胞汁和细胞壁组分。然后在有效生产生物活性组分的条件下处理细胞汁。合适的生物活性组分包括但不限于膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物和/或细胞汁浆液。然后分离生物活性组分和处理的细胞汁。本发明进一步涉及由该方法生产的分离生物活性组合物。
本发明进一步涉及用于分离得自山茶科植物细胞壁组分的生物活性组分的方法。该方法包括提供山茶科植物。然后将山茶科植物分离成细胞汁和细胞壁组分。然后在有效生产生物活性组分的条件下处理细胞壁组分。然后分离生物活性组分和处理的细胞壁组分。本发明进一步涉及由该方法生产的分离的生物活性组合物。
本发明用于解决常规茶加工法的缺陷，具体地说是常规茶加工不能保存广泛范围的有效生物活性组合物的缺陷。如本发明所提供的，在没有发酵和过度热处理的情况下加工新鲜山茶生物质，可产生比常规茶加工产物更强和更多样化的生物活性组合物。
附图简述
图1是一幅示意图，示范了本发明生物活性组合物制备方法的一个实施方案。
图2图示了细胞壁组分提取物和常规茶(稀释度1∶1000)的UV/VIS光谱。
图3图示了山茶生物活性组合物(稀释度1∶4000)的UV/VIS光谱。
图4图示了应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的细胞壁组分提取物和常规茶的吸收光谱。干物质水平相等。
图5图示了应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶生物活性组合物的吸收光谱。干物质水平相等。
图6图示了应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶生物活性组合物和白茶提取物的吸收光谱。
图7A图示了在稀释溶液(1∶200)中和应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶膜组分提取物的吸收光谱。图7B图示了在稀释溶液(1∶200)中和应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶细胞汁浆液的吸收光谱。
图8A图示了在稀释溶液(1∶200)中和应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的大麦(Hordeum vulgare)细胞汁浆液的吸收光谱。图8B图示了在稀释溶液(1∶200)中和应用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的鼠尾草(Salviaofficinalis)细胞汁浆液的吸收光谱。
图9图示了广谱UV照射对Vitro-Skin测试底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)的作用。
图10图示了广谱UV照射对应用在Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的白茶提取物的作用。
图11图示了广谱UV照射对应用在Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的细胞壁组分提取物的作用。
图12图示了广谱UV照射对应用在Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的山茶膜组分提取物的作用。
图13图示了广谱UV照射对应用在Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上的山茶细胞汁浆液的作用。
图14图示了白茶提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的作用。
图15图示了白茶提取物对培养24小时(对照)和在5ng/ml TGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的作用。
图16图示了细胞壁组分提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的作用。
图17图示了细胞壁组分提取物对培养24小时(对照)和在5ng/mlTGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的作用。
图18图示了膜组分提取物对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的作用。
图19图示了膜组分提取物对培养24小时(对照)和在5ng/mlTGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的作用。
图20图示了细胞汁浆液对培养24小时和48小时的MDA-MB-435S细胞的作用。
图21图示了细胞汁浆液对培养24小时(对照)和在5ng/ml TGF-β存在下培养24小时和48小时的MCF-7细胞的作用。
图22图示了白茶提取物对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图23图示了白茶提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图24图示了细胞壁组分提取物对培养24小时和48小时的MonoMac 6细胞的作用。
图25图示了细胞壁组分提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图26图示了膜组分提取物对培养24小时和48小时的Mono Mac6细胞的作用。
图27图示了膜组分提取物对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图28图示了细胞汁浆液对培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图29图示了细胞汁浆液对在10nM PMA存在下培养24小时和48小时的Mono Mac 6细胞的作用。
图30图示了白茶提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞分泌的MMP水平的作用。
图31图示了细胞壁组分提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞分泌的MMP水平的作用。
图32图示了膜组分提取物对PMA刺激的Mono Mac 6细胞分泌的MMP水平的作用。
图33图示了细胞汁浆液对PMA刺激的Mono Mac 6细胞分泌的MMP水平的作用。
图34是Mono Mac 6细胞接触白茶提取物48小时后收集的培养基的明胶酶谱，以及由在无(U)或有(S)10nM PMA但无山茶组合物的情况下培养的细胞收集的培养基的明胶酶谱。
图35是Mono Mac 6细胞接触细胞壁组分提取物48小时后收集的培养基的明胶酶谱，以及由在无(U)或有(S)10nM PMA但无山茶组合物的情况下培养的细胞收集的培养基的明胶酶谱。
图36是Mono Mac 6细胞接触膜组分提取物48小时后收集的培养基的明胶酶谱，以及由在无(U)或有(S)10nM PMA但无山茶组合物的情况下培养的细胞收集的培养基的明胶酶谱。
图37是Mono Mac 6细胞接触细胞汁浆液48小时后收集的培养基的明胶酶谱，以及由在无(U)或有(S)10nM PMA但无山茶组合物的情况下培养的细胞收集的培养基的明胶酶谱。
图38是对比白茶提取物(“WTE”)和本发明的细胞壁组分提取物(“CWFE”)、膜组分提取物(“MFE”)以及细胞汁浆液(“CJS”)中的各种儿茶素含量的条形图。
发明详述本发明涉及一种生物活性组合物。在一个实施方案中，生物活性组合物包括得自山茶科植物的分离的生物活性组分。本文使用的术语“分离的生物活性组分”意欲包括分离自还没有经历任何常规茶加工(例如热处理、氧化、发酵、干燥)的山茶科植物(例如山茶科植物的新鲜生物质)的组分。合适的分离的生物活性组分可包括但不限于细胞壁组分、细胞壁组分提取物、膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物、细胞汁浆液和/或其组合。
本发明的生物活性组合物和生物活性组分可具有如下限定的各种儿茶素分布和总儿茶素含量，并使用本领域众所周知的常规儿茶素检定方法测定。本文使用的术语“儿茶素”一般指所有的儿茶素，包括但不限于以下特定类型的儿茶素(i)(-)-表没食子儿茶素(参见CAS No.970-74-1，其通过引用整体结合到本文中)；(ii)(+)-儿茶素(参见CAS No.7295-85-4，其通过引用整体结合到本文中)；(iii)(-)-表儿茶素(参见CAS No.490-46-0，其通过引用整体结合到本文中)；(iv)(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(参见CAS No.989-51-5，其通过引用整体结合到本文中)；(v)(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(参见CAS No.4233-96-9，其通过引用整体结合到本文中)；和(vi)(-)-表儿茶素没食子酸酯(参见CAS No.1257-08-5，其通过引用整体结合到本文中)。“总儿茶素含量”(如本文使用的)指包含在本发明的具体生物活性组合物或生物活性组分中的所有儿茶素的组合含量水平，不是指限于仅上文列出的特定类型儿茶素的含量水平。本文使用的术语“儿茶素含量分布”用于描述在本发明的具体生物活性组合物或生物活性组分中包含的选定儿茶素的量。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为细胞壁组分。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为细胞壁组分提取物。在本发明的一个具体实施方案中，细胞壁组分提取物可具有约2.1至约4.5mg总儿茶素含量/g干物质，具体地说为约2.6至约4.0mg总儿荼素含量/g干物质，更具体地说为约3.0至约3.6mg总儿茶素含量/g干物质。在另一个具体实施方案中，细胞壁组分提取物可具有如下的儿茶素含量分布(i)约2.0至约3.0mg(+)-儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；(ii)约0.005至约0.02mg(-)-表儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；(iii)约0.005至约0.02mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质；和(iv)约0.003至约0.01mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质。更具体地说，细胞壁组分提取物可具有如下的儿茶素含量分布(i)约2.2至约2.7mg(+)-儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；(ii)约0.01至约0.015mg(-)-表儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；(iii)约0.01至约0.015mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质；和(iv)约0.005至约0.007mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为膜组分。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为膜组分提取物。在本发明的一个具体实施方案中，膜组分提取物可具有约15.0至约30.5mg总儿茶素含量/g干物质，具体地说为约18.0至约27.5mg总儿茶素含量/g干物质，更具体地说为约21.0至约24.5mg总儿茶素含量/g干物质。在另一个具体实施方案中，膜组分提取物可具有如下的儿荼素含量分布(i)约1.7至约3.3mg(-)-表没食子儿茶素/g膜组分提取物干物质；(ii)约6.1至约10.2mg(+)-儿茶素/g膜组分提取物干物质；(iii)约0.3至约1.1mg(-)-表儿茶素/g膜组分提取物干物质；(iv)约6.2至约12.5mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；(v)约0.007至约0.03mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；和(vi)约1.3至约3.3mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质。更具体地说，膜组分提取物可具有如下的儿茶素含量分布(i)约2.0至约3.0mg(-)-表没食子儿茶素/g膜组分提取物干物质；(ii)约7.0至约9.0mg(+)-儿茶素/g膜组分提取物干物质；(iii)约0.5至约0.9mg(-)-表儿茶素/g膜组分提取物干物质；(iv)约8.0至约10.0mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；(v)约0.01至约0.02mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；和(vi)约1.8至约2.8mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为胞质组分。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为胞质组分提取物。
在本发明生物活性组合物的一个实施方案中，生物活性组分可为细胞汁浆液。在一个具体实施方案中，细胞汁浆液可具有约8.0至约20.0mg总儿茶素含量/g干物质，具体地说为约10.0至约18.0mg总儿茶素含量/g干物质，更具体地说为约12.0至约16.0mg总儿茶素含量/g干物质。在另一个具体实施方案中，细胞汁浆液可具有如下的儿茶素含量分布(i)约2.1至约4.4mg(-)-表没食子儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(ii)约4.2至约8.6mg(+)-儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(iii)约0.2至约2.0mg(-)-表儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(iv)约1.2至约3.2mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；(v)约0.01至约0.1mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；和(vi)约0.2至约1.3mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质。更具体地说，细胞汁浆液可具有如下的儿茶素含量分布(i)约3.0至约3.5mg(-)-表没食子儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(ii)约5.0至约7.0mg(+)-儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(iii)约0.7至约1.5mg(-)-表儿茶素/g细胞汁浆液干物质；(iv)约1.7至约2.7mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；(v)约0.03至约0.07mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；和(vi)约0.5至约1.0mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质。
在一个实施方案中，山茶科植物的新鲜生物质可用于分离本发明的生物活性组合物。新鲜生物质可取自属于山茶属和/或柃木属的山茶科植物。用于本发明的山茶属的合适种可包括但不限于茶树(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。用于本发明的柃木属的合适种可包括但不限于Eurya sandwicensis。
本发明的生物活性组合物可进一步包含稳定剂。合适的稳定剂是本领域常用的那些稳定剂。特别合适的稳定剂可包括但不限于乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质和/或其混合物。
在本发明的一个方面，生物活性组分可对至少一种哺乳动物细胞功能具有调节活性。这种调节活性可包括例如细胞生长抑制活性、细胞生长刺激活性、酶分泌活性、酶抑制活性、抗氧化剂活性、UV防护活性、抗炎活性、伤口愈合活性和/或这些活性的组合。对于细胞生长抑制活性，这种活性可包括癌细胞生长抑制。本发明的生物活性组分可抑制其生长的合适癌细胞可包括但不限于乳癌细胞和/或结肠癌细胞。所述细胞生长抑制活性还可包括白血病细胞生长抑制。本发明的生物活性组分可抑制其生长的合适白血病细胞可包括但不限于单核细胞白血病细胞。
在另一个实施方案中，生物活性组合物可有效抑制皮肤细胞的有害过度增殖或增殖不足和/或抑制皮肤细胞中有害的、不协调的酶活性或酶分泌过程。
在另一个实施方案中，本发明的生物活性组合物可进一步包含本领域常用的、用于全身或局部给予的传递系统。
本发明还涉及适合局部施用于哺乳动物的生物活性局部制剂。在一个实施方案中，生物活性局部制剂包含局部有效量的本发明生物活性组合物。生物活性局部制剂还可包含局部可接受的载体。合适的局部可接受的载体可包括但不限于亲水膏剂型基质、亲水洗剂型基质、亲水表面活性剂基质、亲水凝胶型基质、亲水溶液型基质、疏水膏剂型基质、疏水洗剂型基质、疏水表面活性剂基质、疏水凝胶型基质、疏水溶液型基质。在一个实施方案中，生物活性组合物可以生物活性局部制剂总重的约0.001％至约90％的量存在。
本发明还涉及在哺乳动物皮肤组织中抑制炎性活性的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括将生物活性组合物以有效抑制皮肤组织中的炎性活性的量应用于皮肤组织。在该方法的一个实施方案中，生物活性组合物还可包含稳定剂(其合适的实例如本文所述)。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含局部可接受的载体(其合适的实例如本文所述)。
本发明还涉及保护哺乳动物皮肤组织免受紫外线诱导损伤的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括将生物活性组合物以有效减轻皮肤组织的紫外线诱导损伤和防止皮肤组织氧化损伤的量应用于皮肤组织。在一个实施方案中，该方法用于保护皮肤组织免受约320至约400nm范围的紫外线引起的紫外线诱导损伤。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含稳定剂(其合适的实例如本文所述)。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含局部可接受的载体(其合适的实例如本丈所述)。
本发明还涉及在哺乳动物皮肤组织中使皮肤病正常化的方法。该方法包括提供本发明的生物活性组合物。该方法进一步包括将生物活性组合物以使皮肤组织中的细胞疾病正常化的有效量应用于皮肤组织。在该方法的一个实施方案中，生物活性组合物还可包含稳定剂(其合适的实例如本文所述)。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含局部可接受的载体(其合适的实例如本文所述)。
本发明还涉及用于分离得自山茶科植物细胞汁的生物活性组分的方法。该方法包括提供山茶科植物(例如为新鲜生物质形式)。适用于该方法的山茶科植物如上文所述。然后将山茶科植物(例如新鲜生物质)分离成细胞汁和细胞壁组分。然后在有效产生生物活性组分的条件下处理细胞汁。合适的生物活性组分包括但不限于膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物和/或细胞汁浆液。然后分离生物活性组分和处理的细胞汁。在一个实施方案中，由该方法生产的各种合适的生物活性组分如本文所述。本发明进一步涉及由该方法生产的分离的生物活性组分。
本发明还涉及用于分离得自山茶科植物细胞壁组分的生物活性组分的方法。该方法包括提供山茶科植物(例如为新鲜生物质形式)。然后将山茶科植物(例如新鲜生物质)分离成细胞汁和细胞壁组分。在有效产生生物活性组分的条件下处理细胞壁组分。然后分离生物活性组分和处理的细胞壁组分。在一个实施方案中，由该方法生产的各种合适的生物活性组分如本文所述。本发明进一步涉及由该方法生产的分离的生物活性组分。
作为实例，用于制备本发明的生物活性组分(如上文所述)的全过程以示意图形式示于图1。加工步骤的细节进一步描述于实施例(见下丈)。如图1所示，在有效破坏坚固细胞壁的条件下，对山茶科植物的新鲜生物质10(例如新鲜植物生物质)进行研磨、浸渍和挤压20，由此产生植物细胞汁30和细胞壁32。新鲜生物质10还用于常规茶加工22，以生产阳性对照150，用于对比测试和评价。对细胞汁30进行凝结40(例如微波处理)，以实现新鲜植物生物质10膜组分的定量凝结。凝结40足以能够在随后使细胞汁30的凝结膜组分与其它未凝结组分分离。如图1所示，这种分离的一个实施方案如下实现冷却和离心42，以获得膜组分(沉淀)50和上清液60，上清液60无特异性叶绿体膜组分，例如叶绿素和磷脂。
为生产细胞壁组分提取物(即组合物A 110)，对细胞壁32进行干燥34(例如随后的几次微波处理)，然后在常用于制备常规茶的条件下将干燥的材料与水36混合(混合在85℃的水中)。
为生产膜组分提取物(即组合物B 120)，使膜组分50与溶剂52混合，然后离心54，得到上清液56和组合物B 120。
为生产胞质组分提取物(即组合物C 130)，对上清液60进行凝结62(例如等电沉淀)和离心64，以产生含大部分可溶性胞质蛋白的胞质组分(沉淀)70。然后使胞质组分(沉淀)70与溶剂72混合，接着离心74，获得上清液76，然后获得组合物C 130。
为生产细胞汁浆液(即组合物D 140)，对上清液60进行凝结62(例如等电沉淀)和离心64，得到细胞汁浆液(上清液)66，然后获得组合物D 140。
新鲜生物质10的常规茶加工22用于生产例如阳性对照150(各种茶的阳性对照，包括例如白茶、绿茶、乌龙茶和红茶)。
然后，组合物A 110、组合物B 120、组合物C 130、组合物D 140和阳性对照150可用于过滤和测试80。
本发明还涉及将生物活性组合物的低分子量和还原、非氧化组分选择性分散入液体中的装置。在一个实施方案中，该装置包括本发明的生物活性组合物。生物活性组合物可封装在滤袋中。合适的滤袋可为有效将生物活性组合物的低分子量和还原、非氧化的组分选择性分散入液体中的滤袋。在一个实施方案中，滤袋包含使生物活性组合物的低分子量和还原、非氧化组分由滤袋中分散入液体中的选择性膜，但该膜抑制滤袋中的高分子量和氧化组分由滤袋中分散入液体中。本文使用的术语“低分子量和还原、非氧化的组分”包括低于或等于约5,000道尔顿的本发明生物活性组合物组分。在该方法的一个实施方案中，生物活性组合物还可包含稳定剂(其合适的实例如本文所述)。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含局部可接受的载体(其合适的实例如本文所述)。
本发明还涉及制备含低分子量和还原、非氧化生物活性组合物的治疗性饮料的方法。该方法包括提供按照本发明方法生产的装置。该装置在有效使生物活性组合物的低分子量和还原、非氧化组分分散入液体中的条件下使装置与液体接触。在该方法的一个实施方案中，生物活性组合物还可包含稳定剂(其合适的实例如本文所述)。在该方法的另一个实施方案中，生物活性组合物还可包含局部可接受的载体(其合适的实例如本文所述)。适用于该方法的液体可包括但不限于水。水可为热水和冷水。本发明还涉及按照该方法生产的治疗性饮料。
实施例实施例1-得自茶树(Camellia sinensis)植物的生物活性组合物的制备本发明生物活性组合物制备方法的一个实施方案的流程图示于图1。以下是本发明方法的一个实施方案的相关方面的描述。
生物质制备。收集足量的新鲜山茶(Camellia Sinensis)植物生物质(仅具有芽的顶端幼嫩叶组织)，以获得约100kg干物质。经计算，新鲜生物质的干物质水平为21.70％，需要收集约461kg新鲜植物生物质来获得100kg干物质。小心保存植物生物质的固有含水量，并小心避免由于水分丢失而萎凋。以避免或最小程度切碎、捣碎和碾碎所收集的生物质的方式进行收集，以避免破坏叶细胞结构，破坏叶细胞结构可触发由酚氧化酶和过氧化物酶催化的内源性酶反应。因为这些反应随氧化时间加强，所以所有步骤都在尽可能最短的时间段内完成。例如，收集的生物质在轧切后不超过10分钟就付与加工。进行此步骤是为了使植物生物质与阳光、高温和其它负面环境因素的接触最小。进行清洗步骤，以在进一步加工前去除土壤颗粒和植物的其它碎屑。此清洗可通过在≤1kg/cm2水压下清洗收集的植物≤5分钟完成。残余的水清洗液不包含任何绿色或褐色色素，这表明水压和清洗持续时间正确。由清洗的植物生物质中去除过量的水。
研磨、浸渍和挤压植物生物质。在收获、收集和清洗植物生物质后，接着对植物进行研磨、浸渍和挤压，以提取胞内成分(即植物细胞汁)，将其与富含纤维的细胞壁组分(细胞壁组分)分离。使用具有10马力发动机和显示屏组件的锤磨机(型号VS 35，VincentCorporation，FL)研磨生物质，以在最短时间内获得合适小尺寸的植物组织颗粒，而不显著增加生物质温度。设定锤磨机，以在≤10秒的处理过程中产生最大尺寸≤0.5cm的浸渍物颗粒。生物质温度仅增加≤5℃。立即使用水平连续螺旋压榨机(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，FL)由植物中提取植物细胞汁。螺旋压榨机锥体上的压力保持在24kg/cm2的水平，螺旋速度为12rpm，温度仅增加≤5℃。此处理产生185kg干物质水平为41.39％的细胞壁组分和276kg干物质水平为8.49％的植物细胞汁。
细胞壁组分提取物(组合物A)的制备。将初始干物质水平41.39％的细胞壁组分等份在排风式微波炉(Model GH9115XE，Whirlpool)中干燥30秒，然后冷却30秒。重复此处理几次，直至细胞壁组分中的干物质水平达到96.52％。将温度为85℃的66.0L去离子水加入到4.0kg干细胞壁组分中，以高搅拌操作5分钟。这些条件与描述于D’Amelio，F.S.，Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference，Boca Raton，London，New York，Washington，D.C.CRC Press，361页(1999)(其通过引用整体结合到本文中)(另参见www.leaftea.com；www.divinitea.com；www.equatorcoffee.com的讨论，其通过引用整体结合到本文中)的茶制备方法一致。将混合物通过4层尼龙纤维过滤，然后通过0.8μm孔径滤器过滤。获得的细胞壁提取物的pH等于5.24，干物质水平等于0.84％。此提取物进一步用于测试其活性。
膜组分与细胞汁的分离。干物质水平为8.49％的初始植物细胞汁含小纤维颗粒，其可通过4层尼龙纤维过滤或使用低速离心生物质去除。使过滤的植物细胞汁暴露于使用温度传感器控制的微波处理。继续此处理，直至细胞汁温度达到60℃。一旦诱发凝结，就立即将处理的细胞汁冷却至40℃。使用高于或等于3,000g、大于或等于20分钟的离心实现膜组分与凝结细胞汁的分离。这产生了膜组分(沉淀)以及含胞质组分和细胞浆液组分(即低分子量可溶性组分)的细胞汁上清液。使用干物质水平32.89％的膜组分制备来源于膜提取物的生物活性组合物。细胞汁上清液用于进一步加工，以获得胞质组分和细胞汁浆液。
膜组分提取物(组合物B)的制备。在恒定搅拌下于室温将1份膜组分(10.0kg)和2份二甲基亚砜(20.0kg)混合1小时。然后材料以高于或等于4,000g、大于或等于45分钟离心。弃去沉淀，上清液通过0.8μm孔径滤器过滤。干物质水平为6.83％的此滤过液—膜组分提取物(组合物B)进一步用于测试其活性。
胞质组分与细胞汁上清液的分离。为了分离出胞质组分，对细胞汁上清液进行等电沉淀。使用采用5.0N盐酸(HCl)的滴定法使细胞汁上清液的pH达到4.0，诱使胞质组分沉淀。通过以高于或等于3,000g、大于或等于20分钟离心，实现干物质水平14.5％的沉淀胞质组分与上清液的分离。
胞质组分提取物(组合物C)的制备。在恒定搅拌下于室温将1份胞质组分(10.0kg)和2份二甲基亚砜(20.0kg)混合1小时。然后材料以高于或等于4,000g、大于或等于45分钟离心。弃去沉淀，上清液通过0.8μm孔径滤器过滤。干物质水平为3.50％的此滤过液—胞质组分提取物(组合物C)进一步用于测试其活性。
细胞汁浆液(组合物D)的制备。在分离胞质组分后，上清液含悬浮颗粒。为分离这些颗粒，以高于或等于7,500g、大于或等于30分钟离心上清液。通过0.8μm孔径滤器过滤透明上清液—细胞汁浆液。干物质水平为5.69％的此滤过液(组合物D)进一步用于测试其活性。
常规茶提取物—对照的制备。使用制备组合物A、B、C和D的相同批次新鲜山茶叶生产常规白茶和红茶。
使用以下的方法生产白茶。将含21.70％干物质的新鲜生物质置于沸水中20秒，以失活内源性酶—酚氧化酶和过氧化物酶。在该方法的过程中，叶保持在尼龙筛袋中。然后将处理的叶在微波中干燥30秒，然后冷却30秒。重复此处理几次，直至生物质中的干物质水平达到93.74％。然后将66.0L温度为85℃的去离子水加入到4.0kg干叶中，以高搅拌操作5分钟。这些条件与描述于D′Amelio，F.S.，Botanicals.A Phytocosmetic Desk Reference，Boca Raton，London，NewYork，Washington，D.C.CRC Press，361页(1999)(其通过引用整体结合到本文中，另参见www.leaftea.com；www.divinitea.com；和www.equatorcoffee.com的论述，其通过引用整体结合到本文中)的茶制备方法一致。通过4层尼龙纤维过滤混合物，并通过0.8μm孔径滤器过滤。获得的细胞壁组分提取物的pH等于5.52，干物质水平等于1.10％。该提取物进一步用于测试其活性。
使用以下的方法生产红茶。在周期性(1小时“开”和1小时“关”)换气下将含21.70％干物质的新鲜生物质保持于25℃，直至干物质水平达到35％。然后将叶研磨(碾碎)成2-3mm大小颗粒。该方法导致生物质温度增加至约30℃。将研磨的生物质以层(2″高)的形式放置在塑料传送带上，于25℃发酵(氧化)90分钟。所获的褐色发酵生物质于130℃干燥30分钟，以达到97.5％的干物质水平。然后将66.0L温度为85℃的去离子水加入到4.0kg干叶中，以高搅拌操作5分钟。这些条件与描述于D′Amelio，F.S.，Botanicals.A Phytocosmetic DeskReference，Boca Raton，London，New York，Washington，D.C.CRCPress，361页(1999)(其通过引用整体结合到本文中，另参见www.leaftea.com；www.divinitea.com；和www.equatorcoffee.com的论述，其通过引用整体结合到本文中)的茶制备方法一致。通过4层尼龙纤维过滤混合物，并通过0.8μm孔径滤器过滤。获得的细胞壁组分提取物的pH等于4.96，干物质水平等于1.38％。该提取物进一步用于测试其活性。
实施例2-关于茶树(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camellia reticulate)、茶梅(Camellia sasanqua)和Euryasandwicensis的生物活性组合物制品的干物质分布分析在生物活性组合物生产过程中收集的各种组分，并比较干物质分布。表1显示了茶植物分离产物中100kg干物质的分布。经测定，本发明的方法允许将提取收率转换成占初始生物质干物质约20-30％的植物细胞汁。膜组分干物质的收率为5％-10％初始生物质干物质和25％-35％细胞汁干物质。表1显示胞质组分干物质的收率不超过1.0％初始生物质干物质，因此不超过2.5％细胞汁上清液干物质。大部分细胞汁上清液干物质浓缩在细胞汁浆液中。细胞壁组分、膜组分和胞质组分用作其提取物的制备源，这些提取物被分类为生物活性组合物。细胞汁浆液“原态”直接用作不具有外源溶剂的后续生物活性组合物。
表1-100kg新鲜生物质分离产物中的干物质分布
应当指出的是，三种选定材料是存在于新鲜植物组织中的所有功能性结构的最多样化的代表。仅有可溶性细胞汁浆液具有允许直接给予常用的体外测试系统的物理化学特性。细胞壁组分、膜组分和胞质组分用作溶剂提取原料。因为细胞壁组分在结构上类似于常规茶植物产物，所以该组分用水提取，以提供与常规茶的最佳比较。膜组分用二甲基亚砜提取，二甲基亚砜利于整合在叶绿体和线粒体结构中的疏水和亲水组分二者的有效溶解。胞质组分用水提取。细胞汁浆液“原样”使用。
表2显示了100kg初始生物质干物质的全部4种测试生物活性组合物细胞壁组分提取物(组合物A)、膜组分提取物(组合物B)、胞质组分提取物(组合物C)、细胞汁浆液(组合物D)和对照—白茶提取物或红茶提取物的收率。
表2-100kg初始生物质的生物活性组合物收率
表2表明，100kg茶树(Camellia sinensis)干物质的生物活性组合物A、B、C和D的总收率等于33.3％，非常显著地超过了常规茶处理的收率-15.14…19.36％。
实施例3-组合物A(细胞壁组分提取物)和常规茶提取物的对比检测由相同批次新鲜茶树(Camellia sinensis)获得的生物活性组合物A和常规白茶和红茶提取物的各种参数，由此获得的参数结果示于表3(使用的实验方法述于实施例9和20和美国专利申请说明书第2003/0175235号，其通过引用整体结合到本文中)。
表3-生物活性组合物A和常规白茶和红茶提取物的各种参数
表3表明，和常规白茶和红茶提取物相比，细胞壁组分提取物的干物质、电解质和溶解性固体的水平较低。UN/VIS光谱数据表明，细胞壁组分提取物的光谱曲线下面积的比值最高，即此特定山茶产物(组合物A)每单位干物质的光活性成分水平最高。另外，细胞壁组分提取物的氧化还原电位值较低，这表明该组合物比常规白茶和红茶提取物较少氧化。细胞壁组分提取物表现出超氧化物清除活性，其以比白茶和红茶提取物低得多的浓度产生50％的细胞色素c还原抑制(ICR50)。选择定量描述分析(“QDA”)测试法，根据支配茶饮料可接受性的颜色、气味和口感系统表征和定量荼。QDA法使用一组受过培训的专业品尝员量化茶饮料相对于限定参比标准的上述品质。茶的颜色、气味和口感的对比评价表明，细胞壁组分提取物明显超过常规茶的相同特征。
因此，由新鲜山茶生物质获得而没有任何发酵(氧化)和热处理的细胞壁组分明显不同于所有其它茶(Wilson等编辑，TeaCultivation toConsumption，LondonChapman Hall(1992)，其通过引用整体结合到本文中)。另外，关键的山茶酶(酚-氧化酶和过氧化物酶)总是保留在常规茶中。而本发明包括将新鲜山茶叶分离成细胞壁组分和细胞汁，细胞汁富含这些酶，因此细胞壁组分不含内源性酚-氧化酶和过氧化物酶。因此细胞壁组分必须被分类为与白茶、绿茶、乌龙荼和红茶相比具有根本差异的新茶类。此新细胞壁组分茶可以散装或袋装形式或其它表现形式用于制备广泛范围的饮料、营养添加剂和功能食品。
实施例4-不同应用的生物活性组合物的制备所有的生物活性组合物都可用作溶液、悬浮液、分散液、糊浆或干燥粉末，掺入到各种全身或局部给予的制剂中。溶解形式的组合物可通过0.2μm孔径滤器过滤，以完全去除不完全溶解的小颗粒和内源性微生物。生物活性组合物在除菌过滤前后的干物质水平示于表4。
表4-生物活性组合物在除菌过滤前(分子)和后(分母)的干物质水平
表4表明，所有生物活性组合物中的干物质水平在除菌过滤后都下降。但是，此下降未导致其生物活性出现任何损失或明显下降，在2-14％的范围内。因此，大部分组合物由可溶性生物活性成分提供。
鲜山茶叶含相对较低分子量(还原、非氧化)的成分。由于在常规茶生产中的氧化和聚合过程，上述有效成分转变成具有相对较低活性的高分子量物质部分。
不进行发酵(氧化)和过度热处理，获得本发明的生物活性组合物。这又防止了新鲜植物活性的不可逆损失，此新鲜植物活性可使用例如新茶袋或类似的传递系统以最大效力传递。作为允许所有溶解性茶成分通过大孔迁移入周围水中的常规纸茶袋的替代，新茶袋由半透膜制备。该袋在内部含生物活性组合物，仅允许分子量低于一定膜截流分子量(例如5,000道尔顿)的成分穿透至周围水相。较高分子量的成分保留在袋内部，因此不包含在饮料中。
因此，截流分子量高于某一水平的成分使得可生产不具有氧化成分的饮料，因为生物活性组合物中分子量高于某一水平的所有氧化成分都保留在袋内。新茶袋设计可基于利用透析膜管的锥形茶袋构造。新茶袋设计还可以包括内部具有生物活性组合物的薄塑料框和由半透膜制作的两个透明表面。具体膜截流值的选择根据生物活性组合物的类型确定，但一般来说较高截流分子量能够使较高百分率的组合物干物质释放入周围水相中，优选较低的氧化还原电位值。
实施例5-得自细胞汁浆液的局部成分SF的制备细胞汁浆液(组合物D)不能用作局部产物的活性成分，原因是缺乏稳定性以及颜色和气味退化。所描述的方法允许精制细胞汁浆液组分，以生产稳定和有活性的局部成分SF(该方法类似于先前美国专利申请说明书第2003/0175235号的描述，该专利申请通过引用整体结合到本文中)。细胞汁浆液的精制包括以下步骤热处理、冷却、过滤和稳定化。在如实施例1所述分离细胞汁浆液和胞质组分后立即进行精制。细胞汁浆液暴露于使用温度传感器控制的微波处理。该处理持续进行，直至细胞汁浆液温度达到99℃(如先前美国专利申请说明书第2003/0175235号所述需要90℃，该专利申请通过引用整体结合到本文中)。一旦诱发凝结，立即将处理的细胞汁浆液冷却至10℃。凝结的细胞汁浆液通过0.8μm孔径滤器(在美国专利申请说明书第2003/0175235号中使用双层Whatman No.2滤器，该专利申请通过引用整体结合到本文中)真空过滤。弃去沉淀，获得的细胞汁浆液滤液用于进一步的加工(即稳定化)。通过加入防腐剂(如先前的美国专利申请说明书第2003/0175235号所述，不需要外源抗氧化剂，该专利申请通过引用整体结合到本文中)并温育混合物，直至达到完全溶解，实现细胞汁浆液滤过液的稳定化。使用的防腐剂包括以下物质0.1％山梨酸钾、0.1％苯甲酸钠、0.1％甲基羟苯甲酸钠和0.1％柠檬酸。该制备导致产生16.3kg干物质收率(或约286L)的局部成分SF，其用于表征其物理化学和生物活性性质。局部成分SF的推荐储存条件包括储存在避光保护的密闭容器中，温度为15℃-25℃。
实施例6-得自细胞汁浆液组分的局部成分SF的产品规格按照以上实施例5描述的方法制备局部成分SF。如下所述对局部成分SF进行分析，以确定其各种物理化学、微生物、细胞毒性和生物活性特征。局部成分SF是清澈液体，具有淡黄褐色和清淡特征气味。未将溶剂(即乙二醇、油或水)加入到载体介质中。表5概述了局部成分SF的物理和化学数据。
表5-局部成分SF的物理和化学参数
参考[1]Handbook of Chemistry and Physics，第80版，CRCPress，1999-2000，5-90；[2]Handbook of Chemistry and Physics，第80版，CRC Press，1999-2000，8-21；其通过引用整体结合到本文中。
表6描述了关于局部成分SF的UV光谱数据。
表6-局部成分SF(1∶500稀释度)的UV光谱
按照以下方法(USP<61>)进行的微生物分析表明，局部成分SF包含的菌落形成单位/g样品少于100个，没有病原体(大肠杆菌、白假丝酵母(Candida albicans)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。该数据表明，局部成分SF满足局部产物成分的工业要求。
经测定，当局部成分SF于15-25℃的温度储存在避光保护的密闭容器中时，其稳定(即保持物理和化学完整性)至少12-18个月。局部成分SF是生物可降解产物。在可控的临床评价中，局部成分表现出生物活性，这些活性概述于表7。
表7-局部成分SF的生物活性
参考[1]Cannel等，Planta Medica 5410-14(1988)，其通过引用整体结合到本文中。
表7表明，局部成分SF表现出超氧化物清除能力。在可控的临床评价中，局部成分SF以69.5μg干物质/ml的浓度表现出50％的细胞色素c还原抑制(ICR50)。阳性对照(迷迭香酸)的ICR50＝26.5μg/ml。除了抗氧化剂特性以外，局部成分SF表现出抗肽水解酶的抗蛋白水解活性，例如弹性蛋白酶、明胶酶B或所谓的基质金属蛋白酶9(MMP-9)和胰蛋白酶。在这些酶当中，弹性蛋白酶和MMP-9处于独特的地位，其协同起作用，在皮肤炎症中起极为重要的作用。应当指出的是，弹性蛋白酶和MMP-9均由白血球(中性白细胞)分泌，这些酶在导致炎症的最终通路中是关键酶。一般认为如果制剂可抑制两种酶(弹性蛋白酶和MMP-9)，则认为这种制剂对治疗炎性过程非常有效。
应当指出的是，皮肤老化过程、晒伤、形成伤口和瘢痕具有非常相似的炎症机制，该机制同时涉及MMP-9和弹性蛋白酶。因此，能够抑制以上两种酶的局部成分SF具有非常广泛的应用，其中由于以下原因出现炎症损伤的情况a.这两种酶可协同降解人组织胞外基质的所有组分；b.弹性蛋白酶可使机体自身对抗MMP-9的抑制性防御失活；c.MMP-9可使机体自身对抗弹性蛋白酶的抑制性防御失活。局部成分SF的抗炎和抗氧化剂特性的组合提示，此基于生物活性组合物D的亲水制品能够系统地作用于非常基本的皮肤病问题。
实施例7-得自膜组分的局部成分MF的制备新鲜获得的膜组分是具有深色和特定气味的糊。该组分主要由叶绿体代表，其组成主要包括磷脂、膜蛋白、叶绿素和类胡萝卜素。膜组分干燥导致许多探索测膜组分为局部成分所需要的有价值特性不可逆损失。在不干燥的情况下，不稳定的的膜组分快速转变成具有强烈非特征性气味、深色、不分散、不溶性的团块。因此，这种物质不能用作局部成分。以下描述的方法允许将新鲜获得的膜组分转化为稳定和有活性的局部成分(该方法类似于先前在美国专利申请说明书第2003/0175235号中描述的方法，该专利申请通过引用整体结合到本文中)。
在按照以上实施例1描述的方法分离膜组分和细胞汁后，立即稳定化膜组分，并掺入到聚合物基质中。为制备约100g局部成分MF，通过将细胞膜组分与非离子型乳化剂Polysorbate 80(Tween 80)和抗氧化剂(Tenox 4)混合稳定化细胞膜组分。具体地说，将20g新鲜膜组分与3.5g Tween 80和0.1g Tenox 4(丁羟茴醚和丁羟甲苯的油溶液)剧烈混合，直至均匀，同时在搅拌过程中避免曝气。
一旦稳定化，将膜组分掺入到聚合物基质(即聚合乳化剂丙烯酸酯/C10-C30丙烯酸酯交联共聚物的分散液)中。通过将0.9g PemulenTR-2分散在69.2g热去离子水中，并使用中等搅拌混合，直至均一，同时避免曝气，制备聚合物基质。平行地，将5g甘油和1.0g Phenonip(苯氧基乙醇(和)羟苯甲酸甲酯(和)羟苯甲酸丁酯(和)羟苯甲酸乙酯(和)羟苯甲酸丙酯的混合物)合并在单独的容器中，混合直至均一。在中等搅拌下，将含Pemulen的相和含Phenonip的甘油合并，混合，直至均一。为将膜组分掺入到聚合物基质中，将含膜组分、Tween 80和Tenox 4的相加入到含Pemulen、甘油和Phenonip的相中，然后在避免曝气的同时在剧烈搅拌下混合。通过用氢氧化钠(NaOH)的18％水溶液中和膜组分混合物，并剧烈混合，以产生pH为5.0±0.4的均一体系，实现膜组分混合物稳定化。该制备由100kg新鲜山茶生物质(约461kg鲜叶，干物质为21.7％)开始，导致生产出11.85kg干物质收率(或约172L)的局部成分MF，其用于表征其物理化学特性和生物活性特性。局部成分MF推荐的储存条件包括于2-8℃的温度储存在避光保护的密闭容器中。
实施例8-得自膜组分的局部成分MF的产物规格按照以上实施例7描述的方法制备局部成分MF。如下所述对局部成分MF进行分析，以确定其各种物理化学、微生物、细胞毒性和生物活性特征。局部成分MF是不透明胶体，具有褐绿色和清淡特征性气味。使用以聚合物凝胶化的天然细胞汁成分配制局部成分MF。以确保最高水平的纯度均一性、相容性、稳定性、安全性和有效性。
表8描述了局部成分MF的物理和化学数据。
表8-局部成分MF的物理和化学参数
表9概述了关于局部成分MF的L*a*b*值数据。
表9-局部成分MF的L*a*b*值
微生物分析表明，局部成分MF满足了局部成分关于CFU和没有病原体(USP<61>)的工业要求。
经测定，当局部成分SF于2-8℃的温度储存在避光保护的密闭容器中时，其稳定(即保持物理和化学完整性)至少12-18个月。局部成分MF是生物可降解产物。在可控的临床评价中，局部成分MF表现出弹性蛋白酶抑制活性和胰蛋白酶抑制活性。表10概述了局部成分MF的某些生物活性结果。
表10-局部成分MF的生物活性结果
参考[1]Cannel等，Planta Medica 5410-14(1988)，其通过引用整体结合到本文中。
表10表明，局部成分MF表现出的特性类似于局部成分SF(参见实施例6)。尽管局部成分MF不具有超氧化物清除活性，但其表现出高于局部成分SF的酶抑制比活。因此，基于生物活性组合物B的局部成分MF应被认为是有效的多相抗炎成分，对治疗皮肤病具有广泛用途。
实施例9-得自茶树(Camellia sinensis)植物的生物活性组合物的光谱分析光谱分析介绍。紫外(UV)照射对人皮肤具有损伤作用。短期作用包括晒成褐色和晒伤，而累积UV暴露的长期作用包括皮肤光老化和增加皮肤癌风险。紫外皮肤损伤由氧化损伤介导，许多具有抗氧化剂活性的植物提取物显示出作为保护剂的前景葡萄种子提取物(Carini等，“Protective Effect of Procyanidines from Vitis vinifera Seedson UV-Induced PhotodamageIn vitro and In vivo Studies，”Proceedingsof the 19th IFSCC Congress 355-63(1996)，其通过引用整体结合到本文中)、番茄红素(Di Mascio等，“Lycopene as the Most EfficientBiological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher，”Archives ofBiochemistry and Biophysics 274532-8(1989)；和Ribaya-Mercado等，“Skin Lycopene is Destroyed Preferentially Over During UltravioletIrradiation in Humans”Journal of Nutrition 1251854-9(1995)，其通过引用整体结合到本文中)、水飞蓟素(Morazzoni等，“Silybum marianum(Carduus marianus)，”Fitoterapia 663-42(1995)；Katiyar等，“ProtectiveEffects of Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model，”Journalof the National Cancer Institute 89556-66(1997)，其通过引用整体结合到本文中)，尤其是和由其它植物源生产的提取物相比具有较高效力的绿茶提取物(Katiyar等，“Protection Against Ultraviolet-BRadiation-Induced Local and Systemic Suppression of ContactHypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green TeaPolyphenols，”Photochemistry and Photobiology 62855-61(1995)；Ruch等，“Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of IntercellularCommunication by Antioxidant Catechins Isolated from Chinese GreenTea，”Carcinogenesis 101003-8(1989)；Wang等，“Protection AgainstUltraviolet B Radiation-Induced Photocarcinogenesis in Hairless Mice byGreen Tea Polyphenols，”Carcinogenesis 121527-30(1991)，其通过引用整体结合到本文中)。
已发现茶植物(茶树(Camellia sinensis))叶具有高含量的、具有抗氧化剂活性的多酚，包括(-)-表儿荼素、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素和(-)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。绿茶提取物已显示出抗过氧化氢和超氧化物自由基的抗氧化物活性和防止氧化细胞毒性。提取物还可以防止对胞内通信的抑制，该抑制是一种可能的肿瘤促进机制。UV诱导的免疫抑制和出现皮肤癌之间有密切关联，业已发现绿茶提取物起抗UV-B照射引起的炎症和免疫抑制的保护作用。在饮用水中口服给予或局部施用的绿茶提取物在动物模型中起抗UV-B诱导的皮肤癌发生的保护作用。这些结果表明，口服摄取的绿茶提取物可能有助于预防皮肤癌。
尽管已经确立了山茶产物的UV保护特性，但茶植物作为有效保护皮肤抗日光损伤的来源的巨大潜能由于常规技术的限制还没有被完全开发，驱使常规技术集中于有限的、相对狭窄的活性成分条带主要是儿茶素。
现在，本文描述的“新”和“常规”山茶产物之间的对比性UV防护特性研究已经表明，“新鲜山茶分离”技术能够生产更有效的产物。使用常用于测定溶液光谱特性和体外阳光保护因子(SPF)的方法进行比较。
方法学AUV/VIS光谱。使用符合药典的分光光度计Ultrospec4300 Pro(Amersham Biosciences Ltd.，Buckinghamshire，England)获得山茶产物在200-450nm区域的UV/VIS光谱。按照USP<197>中描述的方法测定稀释在蒸馏水中的山茶产物的光谱参数。
方法学B吸收光谱。使用UV-1000S透光度分析仪(Labsphere，North Sutton，NH)和模拟人皮肤表面特性的Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)获得山茶产物在250-450nm区域的吸收光谱。Vitro-Skin测试底物含有优化蛋白和脂质组分两者，被设计成具有类似于人皮肤的表面状况、pH、临界表面张力和离子强度。
将山茶样品均一地涂在预水合底物表面上(施用剂量＝2.0μl/cm2)。在施用后15分钟以后，经5次重复实验获得初始吸收光谱。然后用配有300W氙气灯的广谱太阳光刺激器(型号16S-300 SinglePort，Solar Light Company，Inc.，Philadelphia，PA)照射具有施用产物的底物。剂量控制系统PMA 2100-DCS允许精确控制传递至样品的剂量。
在照射(照射剂量＝60焦耳/cm2)后立即以5次重复实验获取相同位置的吸收光谱。照射前后的样品吸收光谱用于统计分析。
样品。评价按照以上实施例1所述方法制备的下述生物活性组合物组合物A(具有0.84％干物质的细胞壁组分提取物)、组合物B(具有6.83％干物质的膜组分提取物)、组合物D(具有5.69％干物质的细胞汁浆液)。使用具有1.10％干物质的常规白茶提取物和具有1.38％干物质的常规红茶提取物作为对照。所有的样品都得自在CharlestonTea Plantation，SC收集的相同批次的新鲜山茶。这些样品不含任何添加剂。
分析。已发现所有的山茶样品都具有高UV吸光度值，因此将其稀释在蒸馏水中。稀释的山茶产物的UV-VIS光谱示于图2和3。
所有液体样品的光谱都具有一定相似性。例如，峰的位置在λmax1＝269-274nm和λmax2＝205-208nm的相对狭窄范围中变化，这表明在所有测试样品中都存在芳族环和σ-π键的共轭系统。但是，峰的顶点值、各峰下面积和完整光谱曲线下的总面积是不同的(表11)，这提示测试样品具有不同的光学活性成分组成。
表11-山茶产物的UV/VIS光谱参数
*光谱下面积值以样品稀释度为基准标准化。
由200nm-450nm获得的完整光谱曲线下面积的对比清楚表明，膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)具有较高的吸光度值(表11)。比率“光谱下面积∶干物质”表明，样品的比吸光度值以下述顺序增加红茶提取物＞白茶提取物＞细胞壁组分提取物＞细胞汁浆液＞膜组分提取物(表12)。
表12-山茶产物的选定光谱特征
根据吸光度值的对比，新生物活性组合物似乎是比常规白茶和红茶提取物更有效抗日光损伤的皮肤保护剂。应当指出的是，使用与290nm-400nm区域相关的吸光度数据应更好地评价山茶产物的UV防护特性，因为光谱的此特定部分负责UV诱导的皮肤损伤(Sayre等，“A Method for the Determination of UVA Protection for NormalSkin，”Journal of American Academy of Dermatology 23429-40(1990)，其通过引用整体结合到本文中)。尽管测试的液体样品在290-400nm区域的吸光度仅占总UV/VIS吸光度的约10％，但新山荼组合物在上述光谱区域同样有较高吸光度。
因此，与山茶样品的稀释溶液相关的数据提供了对测试产物UV保护效力的初始评价，使用Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)对其进一步评价。结果示于图4-13。已发现，新山茶组合物和常规白茶和红茶提取物即使以干物质水平相等的浓度施用在底物上以后，也具有不同的光谱特性(图4和5)。
施用在Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶样品的光谱包含4-2个具有不同顶点值的特征峰(表13)。
表13-施用在Vitro-Skin测试底物上的山茶产物的吸收光谱参数
应当指出的是，山茶产物溶液特征峰的参数(表11)和施用在测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶产物特征(表13)相比非常不同。如对照实验所示，Vitro-Skin表面上的较低pH水平(约5.5)可能与上述差异无关，这些差异可能是山茶产物和用于制备Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的成分之间化学作用的结果。因此，Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)同时含可与山茶酚成分化学相互作用的蛋白和脂质组分。应当注意的是，观测到所有生物活性组合物以及常规茶提取物的测试产物光谱特性位移。
考虑到测试样品干物质含量的差异，还以“原样”对比了新山茶组合物和常规山茶产物提取物的光谱。以等体积应用到Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的山茶产物的吸收光谱示于图6。
尽管细胞壁组分提取物和白茶提取物之间存在一些相似性，但第一个产物在250-280nm区域和近UV区域具有较高吸光度。应当指出的是，较高吸光度不对应于干物质水平，白茶提取物的干物质水平(1.10％)比细胞壁组分提取物(0.84％)高。这提示这两种样品的组成不同，细胞壁组分提取物还具有较低的电导率，其由较大的非解离光学活性成分构成，这些成分是产生高吸光度的原因(参见表3提供的数据)。
另外发现膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)的光谱不同于细胞壁组分提取物(组合物A)和白茶提取物的光谱。因此，膜组分提取物和细胞汁浆液光谱再次表明这些产物具有与白茶提取物和细胞壁组分提取物不同的组成。同时，光谱数据提示，膜组分提取物和细胞汁浆液的组成不同。例如，膜组分提取物在260nm、286nm和394nm具有3个特征峰。细胞汁浆液光谱在260nm和286nm含两个峰。
这两个光谱的对比表明，膜组分提取物具有的消光度是细胞汁浆液的大约2倍高，尽管干物质水平差异仅为约1％。因此，4个测试山茶产物具有显著不同的成分组成，这些成分在250-450nm区域有光学活性。
与山茶产物定量对比相关的数据示于表14。
表14-应用于Vitro-Skin测试底物的山茶产物的选定特征
表14表明，样品在250-450nm区域和290-400nm区域的吸光度以下述顺序渐增白茶提取物＞细胞壁组分提取物＞细胞汁浆液＞膜组分提取物。该顺序与在稀释溶液中测试的山茶产物比吸光度值顺序(表12)完全一致。当测试样品应用在Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上时，250-400nm区域的吸光度对由250nm-450nm获取的光谱吸光度的贡献达约55-60％。
应当指出的是，新山茶组合物的光谱在稀释溶液中和在施用于Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上之后显著不同。这些差异对膜组分提取物和细胞汁浆液既是定量的，也是定性的。因此，在250nm-450nm范围内，膜组分提取物溶液的峰位于274nm。相同的膜组分提取物在施用于Vitro-Skin测试底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)上时，在以上波长未显示任何特征峰，而是在260nm和286nm具有两个特征峰(图7A)。
对细胞汁浆液观察到光谱特性的相似模式，尽管在施加于Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上的样品中于约360nm鉴别出另外的吸光度，但在相同组合物溶液的UV/VIS光谱中未记录到此现象(图7B)。
应当指出，光谱间的上述差异可能是源于新山茶组合物和具有蛋白和脂质成分、模拟人皮肤的Vitro-Skin测试底物(IMS TestingGroup，Milord，CT)表面之间的化学相互作用。这些相互作用导致负责UV照射损伤作用的光谱区的吸光度急剧增加，即新山茶组合物具有显著的UV保护效力。用大麦(Hordeum vulgare)(图8A)和鼠尾草(Salviaofficinalis)(图8B)细胞汁浆液的对照实验表明，对于山茶以外的植物源，未观察到相同样品在溶液中和在施加于Vitro-Skin测试底物(IMSTesting Group，Milord，CT)上之后的光谱差异。因此，山茶产物在施加于Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)上之后的光谱位移表明，特异性相互作用仅发生在新山茶产物和模拟人皮肤的底物之间。
用预水合底物的对照实验表明，在照射后Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的吸光度显著降低，尤其是在260-330nm的范围(图9)。该作用反映出以高剂量广谱太阳光照射的未保护底物的光稳定性相对较低。
照射施加白茶提取物的底物使吸收光谱发生变化(图10)，该变化类似于未保护Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的光谱变化。当消除底物影响时，未照射和照射样品的光谱表现出一定相似性，但未表现出完全相同的形态。例如，290-310nm范围内的吸光度下降，但在360nm开始形成宽峰。
照射细胞壁组分提取物(图11)使吸收光谱产生相似的变化，尤其是对于消除(扣除)底物影响后获得的曲线而言。
尽管白茶提取物和细胞壁组分提取物的组成不同，但在其光谱中照射诱生的修饰模式相当相似。应当注意的是，白茶提取物和细胞壁组分提取物均不能完全保护底物对抗照射的破坏作用，因此，Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的吸光度下降得几乎和该底物根本未保护时的情况一样多(图9)。在250nm-330nm范围特别明显，尽管在较长的波长观察到吸光度有些增加。
照射膜组分提取物对其吸收光谱产生非常不同的作用(图12)。例如，照射在250-285nm的光谱范围内不产生任何变化。正如所述，被照射的Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的破坏对光谱的该特定范围有非常显著的影响，因此，光谱对比提示，底物的破坏完全被其表面上存在的膜组分提取物阻止。
但是，在膜组分提取物光谱中记录到某些变化。例如，290-320nm范围的吸光度稍微下降，并伴有吸光度在较长波长的小幅增加。尤其要指出的是，膜组分提取物被证明在核酸和芳族氨基酸于260nm和其后的280nm具有特征峰的光谱范围中非常有效。因此，膜组分提取物的作用使得该产物可用作局部施用的预期UV防护成分。
在照射后，浆液组分在其吸收光谱中表现出一定变化(图13)。
一般来说，这些变化可被描述为250-340nm范围的吸光度稍微下降，340-450nm的吸光度稍微增加。应当注意的是，消除Vitro-Skin测试底物(IMS Testing Group，Milord，CT)的光破坏作用产生的可能贡献(见未照射浆液组分初始光谱上方光谱上的红色曲线)清楚表明，底物被其表面上施加的浆液组分有效防护。
观察与结论。以上结果清楚显示，最好的常规山茶产物—白茶提取物提供了相对较弱的抗UV照射破坏作用的保护。细胞壁组分提取物表现出与白茶提取物类似的特性，但膜组分提取物和细胞汁浆液具有更加有效的UV防护特性。
已发现山茶产物的UV防护特性以下述顺序增加白茶提取物＝细胞壁组分提取物＞细胞汁浆液＞膜组分提取物。
应当注意的是，山茶产物的光谱特性和这些特性在UV照射后的变化模式提供了强有力的证据证明，白茶提取物(对照)、细胞壁组分提取物、膜组分提取物和细胞汁浆液的成分组成全都不同，并都表现出独特的活性。特别令人感兴趣的是新山茶组合物的情况，其中上述UV活性不能归因于多酚，而对白茶提取物则要归因于多酚。
实施例10-山茶产物的对比评价综述实施例10-19描述了实验相关的方法、结果和分析，进行这些实验是为了评价与本发明的茶树(Camellia sinensis)生物活性组合物调节细胞功能相关的生物活性范围。主要目标是评价由本发明方法获得的产物的生物活性范围，并将其与通过常规(传统)茶技术获得的最好产物—白茶提取物的活性对比，白茶提取物作为阳性对照进行研究，并与以下的本发明生物活性组合物对比(1)鲜叶的细胞壁组分提取物(组合物A，如本文所定义)；(2)膜组分提取物(组合物B，如本文所定义)；和(3)细胞汁浆液(组合物D，如本文所定义)。
进行测试以评价这些山茶生物活性组合物对三种人细胞系生长模式的作用，这三种人细胞系为具有单核细胞白血病细胞特征的骨髓细胞系(Mono Mac 6)和两种乳癌细胞系具有体内恶性肿瘤早期特征的乳癌细胞系(MCF-7)以及具有晚期癌症特征的更高度侵袭、转移和雌激素不敏感的细胞系(MDA-MB-435S)。
已发现常规白茶提取物对某些肿瘤细胞的代谢活性表现出一定抑制作用。但是，这种抑制的程度对所有类型的测试细胞都不显著，甚至在检测这种抑制时，其也一般不完全，而是最小或有限的。细胞壁组分提取物表现出的特性类似于白茶提取物的特性。
值得注意的是，两种细胞汁衍生物膜组分提取物和细胞汁浆液，都是存在或不存在不同刺激物时培养的所有测试细胞系代谢功能的更有效抑制剂。例如，膜组分提取物明确表现出更大的抑制效力，其在0.001％剂量时的作用可容易地被检测到。细胞汁浆液表现出复杂的反应在较低剂量时刺激，在高剂量时抑制。
应当指出的是，膜组分提取物和细胞汁浆液似乎在肿瘤细胞中启动程序化或凋亡细胞死亡通路，而不是诱导坏死性细胞溶解。实验数据表明，该通路是线粒体功能丧失引起的，可能需要24-48小时接触来检测。
由于接触生物活性组合物，所有测试的肿瘤细胞系MCF-7，早期人乳癌模型；MDA-MB-435S，晚期乳癌模型；和Mono Mac 6，单核细胞白血病模型，其代谢功能都被抑制，膜组分提取物最有效，细胞汁浆液有效性较低，但更有选择性。引人注目的是，白茶提取物和细胞壁组分提取物被证实无效或比以上组合物B和D效力低得多。这种趋势被不同条件下测试的细胞明确证实没有和存在转化生长因子情况下的MCF-7细胞、MDA-MB-435S细胞以及刺激和未刺激的单核细胞Mono Mac 6细胞。
这些结果提供了强有力的证据表明本发明的方法能够急剧增加山茶植物的效力，产生令人印象非常深刻的新产物，其表现出的活性甚至连常规茶技术的最好产物也没有鉴别出来。
本发明的山茶组分对细胞介导的蛋白水解活性的作用与炎性组织损伤以及肿瘤侵入和转移有关。因此，可明确提示乳癌细胞和白血病细胞为本发明生物活性组合物的预期靶，最值得注意的是膜组分提取物。应当指出的是，先前表明，结肠癌衍生细胞系COLO 205释放出显著水平的MMP-2，然后其被也是由该细胞分泌的胰蛋白酶样酶活化。根据Mono Mac 6细胞的结果，这也是本发明山茶组分的潜在靶之一。
由这些研究已得出结论分离自新鲜山茶的本发明生物活性组合物具有对关键细胞功能产生重要调节的活性。已观察到的作用可具有有价值的应用由个人护理用品至营养补充品和潜在的药品。
还应当指出的是，本发明的非常有效的生物活性组合物不是单一纯化组分，而是分离的成分复合物。膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)的进一步分离可得到对于正在发展中的天然药品市场来说极为有效的成分。
实施例11-山茶产物的对比评价测试组合物在实施例10-19描述的实验中使用以下的生物活性组合物(1)阳性对照按照实施例1和4描述的方法制备的白茶提取物。
(2)组合物A鲜山茶叶的细胞壁组分提取物，其按照实施例1和4描述的方法制备。
(3)组合物B由新鲜加工的山茶叶获得的膜组分提取物，其按照实施例1和4描述的方法制备。
(4)组合物D新鲜加工的山茶叶的细胞汁浆液，其按照实施例1和4描述的方法制备。
上述产物由相同批次的新鲜山茶获得，以制备常规白茶提取物和本发明的三种“平行”产物(组合物A、B和D)。
文献中有许多报道提示山茶叶提取物具有一系列生物活性，这些活性主要是源于加工过程中形成显著浓度的多酚丹宁。业已报道这些多酚以及聚合丹宁的较低分子量前体如表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)表现出有效的抗氧化剂活性。有越来越多的出版物提示，由山茶干叶制备的茶不仅具有抗氧化剂特性，而且具有抗血管生成、抗细菌、抗肿瘤、抗炎、抗诱变、抗脓毒和解毒特性。上述特性还没有全部被证实赋予统计学显著的利益。其中仅有一些以已使用多个测试系统以综合研究证实。
应当指出的是，作为与过去的对比，由采用生物活性组合物(使用本发明技术由山茶以外的众多新鲜植物源分离)的过去经验证实，这种组合物远比使用美国专利申请说明书第2003/0175235号(其通过引用整体结合到本文中)先前描述的众多参数由相同的干燥植物分离的常规产物有效。例如，在其它类型的植物(紫花苜蓿(Medicagosativa)、大麦(Hordeum vulgare)、薰衣草(Lavandula angustifolia)、金盏菊(Calendula officinalis)和鼠尾草(Salvia officinalis))中，已鉴别和评价了使用本发明方法制备的组合物的几种令人印象深刻的生物活性，包括高抗弹性蛋白酶活性和抗明胶酶B(MMP-9)活性、中性粒细胞呼吸暴发的新型调节和对活性氧物质的显著超氧化物清除活性。除了清除活性以外，这些活性似乎不能归因于单独的多酚混合物。
因此，尤其令人感兴趣的是开发更全面的方法来比较可在本发明的山茶组合物中检测到的活性范围和使用常规(传统)山茶技术由相同的干燥植物获得的提取物中存在的活性。因此，业已检测了由新鲜收集的山茶叶制备的细胞壁组分提取物(组合物A)、膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)对哺乳动物活细胞功能的调节。对比这些组合物和由干燥山茶叶制备的常规白茶提取物。
应当注意的是，按照多个常规山茶产物的研究，白茶提取物表现出较高的比活性，因此选择该类制品作为代表性阳性参比对照，以和本发明的新山茶产物对比。
实施例12-山茶产物的对比评价细胞系的选择原理作为细胞功能调节的测试系统，使用两种人乳癌衍生细胞系作为肿瘤细胞模型(MCF-7和MDA-MB-435S)，人单核细胞系(Mono Mac6)用作炎性细胞模型。以上细胞系描述于实施例21。
MCF-7被认为是早期或较少去分化乳癌的模型。该细胞系仍保留雌激素敏感性，并具有相对较低侵入性的表型；其在免疫缺陷动物模型中转移的能力相当有限。在以前的研究中，已表明MCF-7细胞系表现出对转化生长因子-β(TGF-β)的特征性反应在TGF-β存在下培养24小时后，细胞分泌增加水平的蛋白水解酶的基质金属蛋白酶(MMP)家族和促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)，这是侵入性和转移潜力增强的两种不同标记物。与生长停止相反，针对TGF-β的该反应是肿瘤和某些肿瘤细胞系的标志，其在正常细胞中由生长因子诱导。为评价本发明的生物活性组合物，使用在没有和有TGF-β的情况下培养的MCF-7细胞作为靶。
MDA-MB-435S系具有更高侵入性、转移性和雌激素不敏感性。此人癌衍生细胞系还表现出一定的TGF-β敏感性，但是，即使在没有生长因子的情况下，其也自发释放出比MCF-7高水平的MMP和VEGF，这与其用作更晚期癌症模型相一致。在本评价中，检测生物活性组合物对仅在无TGF-β情况下培养的MDA-MB-435S细胞的作用。
人单核细胞系Mono Mac 6表达众多与静止单核细胞或巨噬细胞一致的生物标记，并和人单核细胞或巨噬细胞一样对促炎活化刺激物如乙酸肉豆蔻佛波醇酯(PMA)起反应。检测生物活性组合物对没有和有PMA情况下培养的Mono Mac 6细胞的作用，以用作静止和活化单核细胞/巨噬细胞模型。
因此，选择的上述细胞系组合为评价山茶生物活性组合物的抗肿瘤和抗炎效力提供了可靠基础。用多种功能探测手段平行测试选定细胞系提供了一个机会，即和研究单个测试靶或对某些刺激物具有相似敏感性或相似反应性的多个靶的反应相比，可获得关于产物活性及其活动机制的更有价值的结论。
实施例13-对比评价山茶生物活性组合物实验的选择原理初始评价是基于两个存活力实验和一种细胞功能探测手段(参见实施例20，“方法8”)。
第一个实验检测胞质酶乳酸脱氢酶的水平，乳酸脱氢酶仅在细胞裂解时释放入胞外培养基中。传统上认为这种细胞膜完整性的丧失是坏死性细胞死亡的标志，反映了细胞毒性模式。
第二个实验检测线粒体脱氢酶活性，该活性由四唑盐还原成其有色甲膳反映。当将MTS试剂(四唑盐)应用于活细胞时，其转变为深色化合物(甲膳)。线粒体脱氢酶活性丧失还可能和细胞死亡相关，但其通常是程序化细胞死亡或凋亡通路早期步骤的标志，其中在核已凝聚和线粒体已失去功能以后细胞膜完整性一般保持完好。
乳酸脱氢酶泄漏表明与细胞溶解相关的存活力完全丧失，而四唑盐还原下降表明线粒体活性丧失，但细胞膜完整性或存活力不一定不可挽回地丧失。
作为细胞功能的另一种检测手段，已检测了山茶生物活性组合物对Mono Mac 6细胞系分泌的蛋白酶水平的作用(参见实施例20，“方法9”)。在使用该细胞系的先前研究中，观察到在与PMA温育后，Mono Mac 6细胞分泌两种所谓液化明胶的基质金属蛋白酶MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)。这些MMP还由许多肿瘤及其周围基质分泌，涉及炎性组织损伤以及肿瘤侵入和转移。先前还表明，作为抗炎和抗肿瘤药物开发的某些物质(已知所研究的这些物质减轻炎性组织破坏以及肿瘤细胞系的侵入和转移)，除了对MMP蛋白水解活性的任何直接抑制之外，似乎还降低细胞产生的MMP的水平。这些研究的目标是评价本发明的山茶生物活性组合物可能具有降低活化Mono Mac 6细胞释放的MMP水平的类似能力的可能性。
因此，选定实验将使人们容易评价广泛范围的代谢过程和有效获得重要数据，这可能揭示由某些山茶生物活性组合物触发的作用机制。
实施例14-对比评价山茶产物山茶生物活性组合物对乳癌细胞系的作用在整个这些研究中，只通过将四唑盐MTS还原成其甲膳的实验检测线粒体功能。应当注意的是，已观测到较高浓度的本发明山茶组合物的某些固有能力在没有任何活细胞的情况下直接还原MTS，在本文报告的所有结果中，已经由在存在细胞时观测到的还原酶活性水平中扣除这种没有细胞时甲膳的背景形成。
图14-21图示了在加入由0.01％或0.02％(w/v，在培养基中的终浓度，以山茶组合物中的固体干重为基准)至0.0001％各种剂量的4种山茶组合物的每一种后24小时和48小时，在没有和有5ng/mlTGF-β时培养的MCF-7细胞和仅在没有TGF-β时培养的MDA-MB-435S细胞的还原酶活性大小。
实施例15-山茶生物活性组合物的对比评价MCF-7细胞在没有TGF-β时，最高测试浓度(0.01％)的组合物A和白茶提取物(阳性对照)对MCF-7细胞的MTS还原具有显著作用。在该浓度和山茶组合物A接触24小时后，有显著但不完全抑制的还原酶活性(约50-70％抑制)。在接触白茶提取物24小时后检测到相似的还原酶活性抑制。
相反，由山茶细胞汁制备的两种山茶生物活性组合物(膜组分提取物和细胞汁浆液)在没有TGF-β存在时在MCF-7细胞中是更有效的还原酶活性抑制剂。膜组分提取物(组合物B)在剂量依赖性方面类似于白茶提取物，除了效力稍高以外，实际上在最高测试剂量0.01％时产生完全抑制。细胞汁浆液(组合物D)实际上也在0.01％时产生完全抑制，但在0.0025％的较低剂量时，有一些刺激还原酶活性的迹象。较低剂量的组合物D没有显著作用。
当在存在生长因子TGF-β的情况下培养MCF-7细胞时，其对山茶组合物的敏感性显著改变。在接触细胞壁组分提取物和白茶提取物24小时或48小时后，没有证据表明任何剂量对还原酶活性的刺激或抑制作用，最高剂量(0.01％)白茶提取物低于20％的轻度抑制是例外。
相反，使TGF-β处理的MCF-7细胞接触0.02％剂量的膜组分提取物24小时，对还原酶活性产生70％抑制，在48小时后，还原酶活性实际上被完全去除。在24小时后可检测到较低剂量的膜组分提取物更轻微的抑制，但在48小时后检测到还原酶活性显著活化。在接触48小时后检测到低剂量细胞汁浆液同样活化还原酶活性，以及最高剂量(0.02％)时显著抑制，但在更有限地接触24小时后，该组合物在TGF-β处理的MCF-7细胞中对还原酶活性仅具有最小作用，与剂量无关。
在评价时，对甚至接触最高剂量的任何山茶组合物24小时的MCF-7细胞，也没有检测到乳酸脱氢酶显著释放到其培养基中。似乎在这些细胞中线粒体功能的丧失不伴有细胞坏死性裂解。如果细胞实际上在接触的首个48小时内死亡，则更有可能是启动了程序性细胞死亡或凋亡通路。此结论得到光学显微镜观察结果的支持，光学显微镜观察结果揭示在接触过程中细胞有一些变圆，但没有形成碎片或膜片段。
因此，抑制线粒体功能似乎是所有测试山茶产物的主要作用模式，根据释放的乳酸脱氢酶水平所示，其没有表现出细胞毒性或坏死。
实施例16-山茶生物活性组合物的对比评价MDA-MB-435S细胞MDA-MB-435S细胞对山茶组合物的反应模式类似于MCF-7细胞，因为最有效的组合物是组合物B和D，膜组分提取物(组合物B)显示出比细胞汁浆液(组合物D)稍微高一点的效力。在接触24小时后，仅有膜组分提取物对还原酶活性产生显著抑制。在0.01％的最高剂量抑制达到对照还原酶值的70％，但即使在最低剂量的不寻常浓度0.0001％，也能容易地检测到10％的轻度抑制。其它的测试组合物在接触24小时时仅具有轻度的抑制作用，并且仅是在较高测试浓度的情况下。
在接触48小时后，在各组合物存在下，还原酶活性以剂量依赖方式被抑制，但最高剂量组合物的效力未达到接近100％抑制，除了膜组分提取物以外。该组合物于0.001％在48小时后抑制还原酶活性达50％。白茶提取物和细胞壁组分提取物在接触48小时后对MDA-MB-435S细胞也具有显著抑制活性，其实际上高于细胞汁浆液的抑制活性。在该细胞系中没有任何制品的剂量能诱导还原酶活性活化，与接触时间长度无关。
应当注意的是，仅在24小时后难以观测到对高度侵袭、转移和雌激素不敏感细胞系MDA-MB-435S的任何影响。因此，在24小时和48小时后组合物B的作用是相当引人注目的，表明该制品具有显著活性。
实施例17-山茶生物活性组合物的对比评价山茶组合物对单核细胞的作用线粒体脱氢酶活性对乳癌细胞系的初步研究揭示的某些趋势已证实和Mono Mac 6细胞对4种测试的山茶组合物的反应一致。膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)在此炎性细胞系中是比细胞壁组分提取物(组合物A)和白茶提取物(阳性对照)更有效的MTS还原酶活性抑制剂，膜组分提取物(组合物B)明显具有最大的抑制效力。检测保持未刺激的细胞和用10nM PMA刺激的细胞中对MTS还原酶的作用，并评价接触山茶组合物24和48小时后的还原酶活性。这些组合物对Mono Mac 6细胞中MTS还原酶活性的作用示于图22-33。
白茶提取物在接触PMA刺激的细胞48小时后，表现出弱但剂量依赖性的还原酶活性抑制；在没有PMA时还原酶活性没有显著损失，和剂量或接触时间长度无关，任何剂量在接触PMA处理的细胞24小时后都没有任何作用。细胞壁组分提取物对Mono Mac 6细胞没有作用，与剂量和接触时间无关，与细胞是未受刺激还是用PMA刺激无关。
鲜山茶叶的细胞汁浆液在接触24或48小时后以剂量依赖方式适度抑制未受刺激的Mono Mac 6细胞还原酶活性。在最高剂量0.01％(w/v，在培养基中的终浓度，以初始制品中的固体干重为基准)时的最大抑制仅为对照活性的约20-30％。PMA刺激的细胞的抑制达到对照活性的50％，但这仅是在最高剂量的组合物D(0.01％)且仅在接触48小时后发生。
新鲜收获的山茶的膜组分提取物(组合物B)在抑制Mono Mac 6细胞还原酶活性方面被证明是最有效的测试制品，同其对乳癌细胞系的情况一样。PMA刺激作用或接触组合物的时间长度对抑制的作用很小，其在有或无PMA的情况下是剂量依赖性的，在接触24小时或48小时后大致相同。在最高剂量0.02％下，PMA存在时还原酶活性被抑制70％，没有PMA时还原酶活性被抑制80-90％，但在0.001％剂量下可容易地检测到较低水平的抑制(15％)。还没有对胞质酶释放进行检测来证实还原酶活性丢失与坏死性细胞溶解解无关，但通过光学显微镜检查接触0.02％的任何生物活性组合物48小时的MonoMac 6细胞未能观察到膜碎裂的证据。而且，如下文所示，在MTS还原被显著降低的情况下细胞似乎仍能够分泌至少一种MMP。
这些结果提示，在这些细胞以及乳癌细胞系中，还原酶活性的丢失与线粒体功能相对选择性的丢失相关，可反映出程序性细胞死亡或凋亡通路启动。
MMP的分泌。已使用两种不同的实验检测Mono Mac 6细胞释放的两种明胶酶MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)的水平。这些MMP涉及炎性组织损伤以及肿瘤侵入和转移。首先使用用于MMP-2和MMO-9的酶联免疫吸附测定(ELISA)，评价在10nM PMA和不同剂量的三种山茶生物活性组合物和阳性对照存在下，培养48小时的Mono Mac 6细胞培养基中两种酶的总水平。
该细胞系在未受刺激时仅分泌MMP-2，但在其被活化时同时分泌MMP-2和MMP-9。(在24小时后释放的MMP水平通常太低，以至于不容易被检测到)。
ELISA检测结果示于图34-37。正如所观测到的细胞壁组分提取物和白茶提取物对Mono Mac 6细胞的MTS还原的作用一样，任何剂量的这些提取物在分泌的MMP-2或MMP-9水平方面都没有显著改变。在最高剂量(0.01w/v)的膜组分提取物和细胞汁浆液下，观察到MMP-2水平降低，在该剂量膜组分提取物表现出最大效力。应当注意的是，在次最高剂量组合物B(0.001％)和组合物D(0.002％)下，观察到表观上稍微刺激MMP-2释放。此刺激使人联想到相似剂量的这些组合物在TGF-β处理的MCF-7细胞中刺激MTS还原酶活性。
通过ELISA检测到的MMP-2水平剂量依赖性减少与膜组分提取物和细胞汁浆液对MMP-9水平的作用不相对应。这些水平在最高剂量时增加(细胞汁浆液在此方面显然更显著)，但在较低测试剂量时未改变。接触仅在24小时后就对MTS还原酶活性产生显著抑制的山茶制品剂量48小时的Mono Mac 6细胞，其分泌的MMP-9水平未改变或增加，该检测结果进一步表明，接触山茶膜组分提取物或细胞汁浆液的Mono Mac 6细胞中线粒体功能丧失未反映出坏死性细胞溶解，在该情况下MMP分泌应突然终止。
作为山茶组合物对Mono Mac 6细胞分泌MMP的作用的进一步证据，使用明胶酶谱(gelatin zymography)技术检查如上对ELISA检测所述收集的培养基。在此方法中，首先在十二烷基硫酸钠存在下在明胶浸制的聚丙烯酰胺凝胶中对培养基进行电泳(SDS-PAGE)，以基于分子量分离蛋白。然后将SDS洗出凝胶，以使存在的任何酶的至少一部分复性，将凝胶在使MMP活性最大化的培养基中温育。MMP无论存在于哪里都可溶解明胶。在用蛋白染料显色凝胶块中的未消化明胶之后，扫描凝胶，MMP表现为与染色背景相反的澄明区域。本文提供了负影象，使得MMP表现为与亮背景相反的暗区域。
应当注意的是，大部分细胞分泌的MMP为失活前体，其然后在胞外活化。但是，因为在酶谱中使用的变性和复性顺序，即使是MMP的所谓失活前体形式，也获得了明胶液化活性，产生澄明区域。图34-37图示了以下培养基的明胶酶谱负影象Mono Mac 6细胞接触不同的山茶生物活性组合物48小时后收集的培养基，以及由没有(U)或有(S)10nM PMA但没有山茶组合物时培养的细胞收集的培养基。
仅对最低剂量(0.0001％，“lo”)和最高剂量(0.01％，“hi”)的制品评价组合物A和阳性对照的作用，而在0.001％的中间剂量(“med”)评价了组合物B和D的作用。由4幅图显然可知，在没有PMA时Mono Mac 6细胞仅释放MMP-2(约67kD)，发现该酶主要为前体形式。用10nM PMA处理导致诱导MMP-9分泌(约92kD)，以及进一步产生蛋白水解活性，该活性将显著水平的两种MMP的前体形式转变成其稍微低分子量的活性形式。
和ELISA结果相一致，经明胶酶谱显色，使PMA刺激的MonoMac 6细胞接触细胞壁组分提取物和白茶提取物对前体形式或活性形式的两种MMP的任一种的水平都没有可检测的作用。相反，经明胶酶谱显色，接触最高剂量的组合物B和D使MMP-2水平产生显著减少，但MMP-9水平没有明显变化。
在由用最高剂量组合物B和D处理的细胞收集的培养基中，同时出现前体形式和活性形式的MMP-9，以及对应于活性形式MMP-2的弱但可识别条带，这提示这些组合物的作用主要是调节MMP-2的释放，不涉及对这些培养细胞中MMP活化机制的其它作用。
实施例18-山茶生物活性组合物的对比评价结果概述实验数据表明，山茶生物活性组合物触发MTS还原酶活性的剂量依赖性损失，这一般归因于线粒体功能的丧失。此抑制可能需要长达48小时的接触才能被检测，至少在前24小时，胞质酶没有可检测的释放，这提示生物活性组合物不是诱导坏死性细胞溶解，而是在肿瘤细胞中启动程序性或凋亡细胞死亡通路。
MCF-7细胞和MDA-MB-435S细胞反应在时间和剂量依赖性方面的差异，以及TGF-β处理MCF-7细胞的作用，都表明更加侵入性和转移性的表型对白茶提取物、细胞壁组分提取物的抗性稍微增加，在某种程度上对细胞汁浆液的抗性增加，以在接触的前24小时内还原酶活性损失相对有限为证。但是，膜组分提取物在24小时内抑制TGF-β处理的MCF-7细胞以及MDA-MB-435S细胞中的MTS还原酶活性证明了其效力更高的趋势。
测试的山茶生物活性组合物对人单核细胞/巨噬细胞模型MonoMac 6细胞的作用同观察到的对乳癌细胞系的作用具有一定相似性。根据在乳癌细胞系培养基中没有乳酸脱氢酶和在Mono Mac 6细胞培养基中存在正常至增加水平的分泌MMP-9，已可推断这些组合物不诱导坏死性细胞溶解，即便在最高的测试剂量(0.01％w/v)。
但是，两种生物活性组合物(膜组分提取物和细胞汁浆液)诱导线粒体还原酶活性的剂量依赖性抑制，其反映出在Mono Mac 6细胞中程序性细胞死亡的凋亡通路启动。而且，这些炎性细胞接触膜组分提取物和细胞汁浆液导致明胶液化酶MMP-2(明胶酶A)水平选择性降低。明胶酶谱表明，“前体形式”或酶原活化的机制未受山茶生物活性组合物的影响，所以非常不可能是培养基中MMP-2水平降低反映蛋白水解破坏作用增强。
因此，所有的测试细胞系(即早期人乳癌模型、晚期人乳癌模型和单核细胞白血病模型)的代谢活性都受到膜组分提取物(组合物B)的有效抑制，在大部分情况下，受到细胞汁浆液(组合物D)的抑制。引人注目的是，茶细胞壁提取物(组合物A)和白茶提取物(阳性对照)被证实无活性或远比以上的组合物B和D效力低。
对于没有或有转化生长因子的情况下的所有测试MCF-7人癌细胞、晚期人乳癌细胞MDA-MB-435S以及刺激和未刺激的单核细胞Mono Mac 6细胞，此趋势都被明确证实。表15提供了与生物活性山茶组合物测试和评价的概述相关的数据。
表15-生物活性山茶组合物测试和评价的概述
表15表明，山茶制品以剂量依赖方式调节细胞功能的能力以下述顺序增加白茶提取物＝细胞壁组分提取物＞细胞汁浆液＞膜组分提取物。实验数据提示，通过将新鲜植物组织加工成细胞汁衍生膜组分提取物(组合物B)和细胞汁浆液(组合物D)制备的新生物活性山茶组合物未触发任何针对细胞的明显坏死毒性。
因此，本发明的技术表现出急剧增加山茶生物活性组合物效力的能力和生产非常令人印象深刻的新产物的能力，其中所述新产物对活体人细胞表现出的活性在通过常规山茶技术生产的最好产物(例如白茶提取物)中也没有表现出来。
实施例19-山茶生物活性组合物的对比评价与未来研究的关系本发明的山茶生物活性组合物对细胞介导的蛋白水解活性的作用涉及炎性组织损伤以及肿瘤侵入和转移。因此，可提议乳癌细胞和单核细胞白血病细胞作为本发明山茶生物活性组合物的预期靶，最值得注意的是组合物B(膜组分提取物)。先前已表明，结肠癌衍生细胞系COLO 205释放显著水平的MMP-2，然后其被也是由该细胞分泌的胰蛋白酶样酶活化。基于Mono Mac 6细胞的结果，该类肿瘤细胞是本发明山茶生物活性组合物的众多潜在靶之一。
由这些研究人们可确信，本发明的分离自新鲜山茶的生物活性组合物具有显著活性，其对关键细胞功能产生重要调节。已观察到的作用具有有价值的应用，由个人护理用品至营养补充品和潜在的药品。
实施例20-用于测定生物活性组合物的某些特征的方法以下是用于测定生物活性组合物的某些特征的各种方法。这些方法在整个上述实施例中都有提及。下文提到的“测试产物”或“测试样品”是指生物活性组合物。
方法1；测定固体含量的方法。测定固体含量的方法包括在100℃水浴中蒸发测试生物活性组合物，至水完全蒸发，105℃用烘箱储存样品3小时，冷却至室温，立即测定具有固体物质的容器的重量。
方法2测定不挥发性残余物的方法。测定不挥发性残余物的方法包括于105℃用烘箱储存测试生物活性组合物5小时，冷却，立即测定具有固体物质的容器的重量。
方法3测定L*a*b*值的方法。测定L*a*b*值的方法使用配有检测0°/45°几何结构的几何比色计的Hunter Labscan。使用具有朝上视窗的标准光源D65。将具有测试生物活性组合物的容器放置在视窗上，通过底部检测。使用以下的CIELAB等式C*=(a*2+b*2)1/2]]>DE*＝[(DL)2+(Da*)2+(Db*)2]DH＝[(DE*)2-(DL*)2-(DC*)2]1/2方法4测定总类胡萝卜素含量和叶黄素含量的方法。用丙酮提取测试生物活性组合物。在匀浆和真空过滤后，用30％氢氧化钾的甲醇溶液皂化所有的提取物。用石油醚由生物活性组合物中连续提取类胡萝卜素。在乙醇中再次处理和重溶解后，在446nm检测所有样品。
为了测定叶黄素含量，使用各样品提取物的另外干燥样品进行高效液相层析(“HPLC”)分析。干燥样品在MTBE和甲醇中再溶解。使用采用(250×4.60mm内径)5μm C18柱(“Vydac”)的反向HPLC系统。叶黄素的鉴别通过与可信标准共层析确认。叶黄素的乙醇溶液的摩尔吸光系数是144,800cm-1mol-1。
方法5测定弹性蛋白酶抑制活性的方法。使用以下实验测定测试生物活性组合物的弹性蛋白酶抑制活性该实验使用中性粒细胞弹性蛋白酶(由“Elastin Products”生产的纯化酶制品)和“Sigma”生产的合成肽可溶性底物甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺。酶切割底物导致产生随时间逐渐增加的黄色(405nm)；通过增加含抑制活性的测试生物活性组合物的浓度降低颜色产生的速率。分析抑制的浓度依赖性允许定量抑制活性的效力，其表示为达到50％抑制(IC50)时所需的各测试生物活性组合物中的干物质浓度，而且提供与抑制模式相关的信息。
对于IC50测定，弹性蛋白酶的浓度为2.5μg/ml，底物浓度为150μm。对于Ki测定，底物浓度为100μM和200μM。
方法6测定明胶酶B(MMP-9)抑制活性的方法。在洗去其它蛋白酶后，使用商业性分布实验(由“Amersham Pharmacia”生产的MMP-9活性ELISA)，其通过免疫识别将明胶酶B特异性捕获在多孔微量培养板上。通过明胶酶B的低分子量合成底物APMA的水解，于405nm检测酶活性。抑制的浓度依赖性分析用于确定测试生物活性组合物干物质的效力。
方法7测定超氧化物清除活性的方法。使用采用黄嘌呤氧化酶(由“Sigma”生产的纯化酶制品)的酶系统以高产量和可控方式生产超氧阴离子。该酶将黄嘌呤转变为羟基黄嘌呤，此转变产生一定量的超氧阴离子，使用高铁细胞色素c向亚铁细胞色素c的还原作为超氧化物水平的敏感检测。当将测试生物活性组合物加入到反应系统中时，检测亚铁细胞色素c水平(550nm)允许测定测试生物活性组合物的超氧化物清除活性。每个孔的最终浓度为细胞色素c，75μM；黄嘌呤，425μm/L；以及黄嘌呤氧化酶，10mU/ml。
方法8测定体外毒性和凋亡的方法。开发了CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖实验和Cyto Tox 96非放射性细胞毒性实验和后续的方法(两个实验均由Promega Corporation，Madison，WI生产)。
第一个实验是测定活细胞数的比色法，其开发了四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS和电子偶联试剂(吩嗪硫酸甲酯；PMS)。MTS被细胞生物还原为在组织培养基中可溶的甲产物，其在490nm具有最大吸光度。MTS向水性、溶解性甲的转变通过存在于代谢活性细胞中的脱氢酶实现，甲产物的量与培养的活细胞数成正比。
第二个实验定量检测乳酸脱氢酶(LDH)，乳酸脱氢酶是在细胞裂解时释放的稳定胞质酶。用30分钟偶联酶实验检测释放在细胞培养物上清液中的LDH，30分钟偶联酶实验使四唑盐(INT)转变成红色甲产物。形成颜色的量与裂解细胞数成比例。
方法9测定受刺激细胞分泌的酶水平的方法。在与PMA温育后，Mono Mac 6细胞分泌两种明胶液化基质金属蛋白酶MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)。用二维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测试生物活性组合物存在时这些酶的水平。
实施例21-用于测试山茶产物的某些生物活性特征的细胞系由美国典型培养物保藏中心(ATCC编号HTB-129)获得细胞系MDA-MB-435S，其被认为是晚期乳癌模型。在以下ATCC培养基中于37℃培养该细胞系含补加0.01mg/ml胰岛素的2mM L-谷氨酰胺的Leibovitz L-15培养基，90％；胎牛血清，10％。
细胞系MCF-7得自ATCC(编号HTB-22)，其被认为是早期或较少分化的乳癌模型，将该细胞系在以下ATCC培养基中于37℃培养含2mM L-谷氨酰胺的最低必须培养基(Eagle)和Earle BSS，其被调节至含1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠，并补加0.01mg/ml牛胰岛素，90％；胎牛血清，10％。
细胞系MonoMac6(MM6，得自德国微生物和细胞培养物保藏中心)与分化人单核细胞密切相似(Ziegler-Heitbrock等，“Establishementof a Human Cell Line(Mono Mac 6)with Characteristics of MatureMonocytes，”International Journal of Cancer 41456-461(1988)，其通过引用整体结合到本文中)。细胞保持在RPMI 1640中，其中补加2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠、10％FCS、非必需氨基酸、9μg/ml胰岛素和1mM草酰乙酸。对于实验条件，还加入0.2％葡萄糖。
实施例22-山茶产物的儿茶素分析分析本发明的细胞壁组分提取物、膜组分提取物和细胞汁浆液的各种儿茶素含量。白茶样品用作对照。测定以下的儿茶素(-)-表没食子儿荼素、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯和(-)-表儿茶素没食子酸酯。
样品使用0.1％H3PO4提取，并超声约15分钟。在离心后，将提取物注射在HPLC上。使用C-18反向柱作为固定相。使用0.1％磷酸和乙腈作为流动相。于280nm检测。根据列出的各儿茶素与其纯标准品的面积对比进行计算。结果示于图38和表16(见下文)。
表16-生物活性山茶组合物的儿茶素含量
尽管本文已详细描述了优选实施方案，但对相关领域技术人员来说显而易见的是，可进行各种修改、增补、替换等而不偏离本发明的精神，因此这些被认为在以下权利要求书所限定的本发明范围内。
权利要求
1.一种生物活性组合物，所述组合物包含得自山茶科(Theacea)植物的分离生物活性组分，其中所述生物活性组分选自细胞壁组分、细胞壁组分提取物、膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物、细胞汁浆液及其组合。
2.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为细胞壁组分。
3.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为细胞壁组分提取物。
4.权利要求3的生物活性组合物，其中所述细胞壁组分提取物的总儿茶素含量为约2.1至约4.5mg/g干物质。
5.权利要求3的生物活性组合物，其中所述细胞壁组分提取物的儿茶素含量分布包含约2.0至约3.0mg(+)-儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；约0.005至约0.02mg(-)-表儿茶素/g细胞壁组分提取物干物质；约0.005至约0.02mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质；约0.003至约0.01mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞壁组分提取物干物质。
6.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为膜组分。
7.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为膜组分提取物。
8.权利要求7的生物活性组合物，其中所述膜组分提取物的总儿茶素含量为约15.0至约30.5mg/g干物质。
9.权利要求7的生物活性组合物，其中所述膜组分提取物的儿茶素含量分布包含约1.7至约3.3mg(-)-表没食子儿茶素/g膜组分提取物干物质；约6.1至约10.2mg(+)-儿茶素/g膜组分提取物干物质；约0.3至约1.1mg(-)-表儿茶素/g膜组分提取物干物质；约6.2至约12.5mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；约0.007至约0.03mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质；和约1.3至约3.3mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g膜组分提取物干物质。
10.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为胞质组分。
11.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为胞质组分提取物。
12.权利要求1的生物活性组合物，其中所述生物活性组分为细胞汁浆液。
13.权利要求12的生物活性组合物，其中所述细胞汁浆液的总儿茶素含量为约8.0至约20.0mg/g干物质。
14.权利要求12的生物活性组合物，其中所述细胞汁浆液的儿茶素含量分布包含约2.1至约4.4mg(-)-表没食子儿茶素/g细胞汁浆液干物质；约4.2至约8.6mg(+)-儿茶素/g细胞汁浆液干物质；约0.2至约2.0mg(-)-表儿茶素/g细胞汁浆液干物质；约1.2至约3.2mg(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；约0.01至约0.1mg(-)-没食子儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质；和约0.2至约1.3mg(-)-表儿茶素没食子酸酯/g细胞汁浆液干物质。
15.权利要求1的生物活性组合物，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
16.权利要求15的生物活性组合物，其中所述山茶属(Camellia)植物选自茶树(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camellia reticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
17.权利要求15的生物活性组合物，其中所述柃木属(Eurya)植物为Eurya sandwicensis。
18.权利要求1的生物活性组合物，所述组合物进一步包含稳定剂。
19.权利要求18的生物活性组合物，其中所述稳定剂选自乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质及其混合物。
20.一种适于局部施用给哺乳动物的生物活性局部制剂，所述生物活性局部制剂包含局部有效量的权利要求1的生物活性组合物和局部可接受的载体。
21.权利要求20的生物活性局部制剂，其中局部可接受的载体选自亲水膏剂型基质、亲水洗剂型基质、亲水表面活性剂基质、亲水凝胶型基质、亲水溶液型基质、疏水膏剂型基质、疏水洗剂型基质、疏水表面活性剂基质、疏水凝胶型基质和疏水溶液型基质。
22.权利要求20的生物活性局部制剂，其中生物活性组合物以生物活性局部制剂总重的约0.001％至约90％的量存在。
23.一种在哺乳动物皮肤组织中抑制炎性活性的方法，所述方法包括提供权利要求1的生物活性组合物和以在皮肤组织中有效抑制炎性活性的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
24.权利要求23的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
25.权利要求23的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含稳定剂。
26.权利要求25的方法，其中所述稳定剂选自乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质及其混合物。
27.权利要求23的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含局部可接受的载体。
28.权利要求27的方法，其中局部可接受的载体选自亲水膏剂型基质、亲水洗剂型基质、亲水表面活性剂基质、亲水凝胶型基质、亲水溶液型基质、疏水膏剂型基质、疏水洗剂型基质、疏水表面活性剂基质、疏水凝胶型基质和疏水溶液型基质。
29.一种保护哺乳动物皮肤组织免受紫外线诱导损伤的方法，所述方法包括提供权利要求1的生物活性组合物和以有效减少皮肤组织的紫外线诱导损伤和防止皮肤组织氧化损伤的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
30.权利要求29的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
31.权利要求29的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含稳定剂。
32.权利要求31的方法，其中所述稳定剂选自乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质及其混合物。
33.权利要求29的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含局部可接受的载体。
34.权利要求33的方法，其中局部可接受的载体选自亲水膏剂型基质、亲水洗剂型基质、亲水表面活性剂基质、亲水凝胶型基质、亲水溶液型基质、疏水膏剂型基质、疏水洗剂型基质、疏水表面活性剂基质、疏水凝胶型基质和疏水溶液型基质。
35.权利要求29的方法，其中所述紫外线诱导的损伤由约320至约400nm范围的紫外线引起。
36.一种使哺乳动物皮肤组织中的皮肤病正常化的方法，所述方法包括提供权利要求1的生物活性组合物，和以有效使皮肤组织中细胞疾病正常化的量将生物活性组合物施用于皮肤组织。
37.权利要求36的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
38.权利要求36的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含稳定剂。
39.权利要求38的方法，其中所述稳定剂选自乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、聚合物基质及其混合物。
40.权利要求36的方法，其中所述生物活性组合物进一步包含局部可接受的载体。
41.权利要求40的方法，其中局部可接受的载体选自亲水膏剂型基质、亲水洗剂型基质、亲水表面活性剂基质、亲水凝胶型基质、亲水溶液型基质、疏水膏剂型基质、疏水洗剂型基质、疏水表面活性剂基质、疏水凝胶型基质和疏水溶液型基质。
42.一种用于分离得自山茶科(Theacea)植物细胞汁的生物活性组分的方法，所述方法包括提供山茶科(Theacea)植物；将山茶科(Theacea)植物分离成细胞汁和细胞壁组分；在有效生产生物活性组分的条件下处理细胞汁，其中所述生物活性组分选自膜组分、膜组分提取物、胞质组分、胞质组分提取物和细胞汁浆液；以及分离所述生物活性组分和处理的细胞汁。
43.权利要求42的方法，其中所述生物活性组分为膜组分。
44.权利要求42的方法，其中所述生物活性组分为膜组分提取物。
45.权利要求42的方法，其中所述生物活性组分为胞质组分。
46.权利要求42的方法，其中所述生物活性组分为胞质组分提取物。
47.权利要求42的方法，其中所述生物活性组分为细胞汁浆液。
48.权利要求42的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
49.权利要求48的方法，其中所述山茶属(Camellia)植物选自茶树(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japomca)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
50.权利要求48的方法，其中所述柃木属(Eurya)植物为Euryasandwicensis。
51.一种分离的生物活性组合物，所述组合物按照权利要求42的方法生产。
52.一种用于分离得自山茶科(Theacea)植物细胞壁组分的生物活性组分的方法，所述方法包括提供山茶科(Theacea)植物；将山茶科(Theacea)植物分离成细胞汁和细胞壁组分；在有效生产生物活性组分的条件下处理细胞壁组分；和分离生物活性组分和处理的细胞壁组分。
53.权利要求52的方法，其中所述生物活性组分为细胞壁组分。
54.权利要求52的方法，其中所述生物活性组分为细胞壁组分提取物。
55.权利要求52的方法，其中所述山茶科(Theacea)植物为山茶属(Camellia)植物或柃木属(Eurya)植物。
56.权利要求55的方法，其中所述山茶属(Camellia)植物选自茶树(Camellia sinensis)、茶花(Camellia japonica)、云南山茶花(Camelliareticulate)和茶梅(Camellia sasanqua)。
57.权利要求55的方法，其中所述柃木属(Eurya)植物为Euryasandwicensis。
58.一种分离的生物活性组合物，所述组合物按照权利要求52的方法生产。
全文摘要
本发明涉及分离的生物活性组合物，其包含得自山茶科(Theacea)植物的生物活性组分。本发明还涉及含生物活性组合物的生物活性局部制剂。本发明进一步涉及使用本发明的生物活性组合物的方法，包括例如在哺乳动物皮肤组织中抑制炎性活性的方法、保护哺乳动物皮肤组织免受紫外线诱导损伤的方法，以及使哺乳动物皮肤组织中的皮肤病正常化的方法。本发明还涉及分离得自山茶科(Theacea)植物的细胞汁或细胞壁组分的生物活性组分的方法。
文档编号A61P17/00GK1929851SQ200580007271
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月12日
发明者M·科加诺夫 申请人:综合植物科技有限责任公司