免疫原性较弱的结合分子的制作方法

专利名称：免疫原性较弱的结合分子的制作方法
技术领域：
本发明提供双特异性的结合分子，其中所述分子包含至少两个结构域或由之组成，其中所述至少两个结构域之一与人CD3复合物特异结合/相互作用且所述结构域包含来自抗体的轻链氨基酸序列，其中所述氨基酸序列为含有特异氨基酸替换的具体鉴定的氨基酸序列，且另一结构域是或含有至少一个其他抗原相互作用位点和/或至少一个其他效应物结构域。本发明还提供编码本发明双特异性结合分子的核酸分子，含有所述核酸分子的载体和用所述载体转化的宿主细胞。另外，本发明涉及产生本发明双特异性结合分子的方法和含有本发明双特异性结合分子、本发明核酸分子或本发明宿主细胞的组合物。
在本说明书全文中引用了若干文件。本文引用的每个文件(包括生产商说明书等)此处整体引入作为参考。
背景技术：
由于基因工程的发展，已使用免疫疗法治疗大量重病，例如肿瘤疾病。然而，当用作人治疗方案的一部分时，来自非人源抗体的使用引起若干问题。
首先，非人源抗体可能引起“细胞因子释放综合症(CRS)”。CRS是临床综合症，其在施用第一批抗CD3抗体药剂后观察到，其与许多抗CD3的抗体会促有丝分裂这一事实有关。在体外，抗CD3的促有丝分裂抗体诱导T细胞增殖和细胞因子产生。在体内，该促有丝分裂活性在第一次注射抗体后起初的数小时内引起细胞因子(包括许多来自T细胞的细胞因子)的大规模释放。CD3特异抗体的促有丝分裂能力依赖于单核细胞/巨噬细胞，并涉及由这些细胞产生IL-6和IL-1β。CRS症状范围从经常报道的温和“流感样”症状到较不经常报道的严重“休克样”反应(其可以包括心血管和中枢神经系统表现)。症状特别包括头疼、战栗、恶心/呕吐、腹泻、腹痛、不适和肌肉/关节疼痛、全身虚弱、心肺呼吸事件以及神经-精神事件。流体过剩的患者和显示没有流体过剩的患者中发生了严重的肺水肿(Chatenoud，2003 Nat.Rev.Immunol.3123-132)。
其次，鼠抗体被引起小型治疗窗带的人抗鼠抗体体液免疫应答(HAMA)识别(Schroff(1985)Cancer Res.45879-885，Shawler(1985)J.Immunol.1351530-1535)。HAMA通常在用鼠源治疗性抗体治疗的第二周产生，并通过封闭其与预期靶的结合而中和鼠抗体。HAMA应答可依赖于鼠恒定(“Fc”)抗体区或/和鼠可变(“V”)区的性质。该宿主应答显著地改变抗体的药代动力学类型，引起抗体的快速清除并阻止重复剂量(Reff，2002 CancerControl 9152-166)。
已改良了四种基本的抗体策略以解决治疗抗体的免疫原性嵌合、提供完整的人V区、去免疫和人源化。嵌合抗体基于恒定区为免疫原性提供重要组件，用人恒定区代替鼠恒定区。存在两种产生完整人V区的方法从噬菌体文库中选择人抗体V区和产生自身免疫球蛋白基因被人免疫球蛋白基因代替的转基因小鼠。去免疫中，根据特定算法用具有减少的或没有免疫原性的免疫原性肽替换特异的免疫原性肽。
一般而言，人源化需要用相应的人序列取代可变区中非人抗体构架序列，例如CDR移植的情况。现有技术描述了若干人源化抗体的方法。这些方法之一为CDR移植进入外源构架，其中来自一个物种的CDR被移植进入人构架(EP 239400)。然而，这类人源化的抗体常有结合能力不足的问题(Riechmann，1988，Nature 332323-327)。这可通过修饰(通过向人构架引入额外突变)上述方法克服。使用这类方法的实例描述于EP469167、EP 971959、EP 940468。人源化抗体的其他方法为通过噬菌体展示(US5,565,322)人源化和通过表面重建(resurfacing)/贴面(veneering)人源化，其中鉴定抗体暴露于表面的氨基酸并用与人框架类似或相同的氨基酸将其替换(参阅例如EP 519596，EP 592106)。
人CD3是指在T细胞中作为多分子T细胞复合物的部分表达的抗原，其由三个不同链组成CD3-ε、CD3-δ和CD3-γ。CD3在T细胞上的成簇(例如通过固定的抗CD3抗体)引起与T细胞受体衔接类似但不依赖于其克隆典型特异性的T细胞激活(参阅WO 99/54440或Hoffman(1985)J.Immunol.1355-8)。
现有技术描述了特异识别CD3抗原的抗体，例如Traunecker，EMBOJ 10(1991)，3655-9和Kipriyanov，Int.J.Cancer 77(1998)，763-772。最近，已经提出将抗CD3的抗体用于治疗多种疾病。如EP 1 025 854所公开的，这些抗体或抗体构建体作为T细胞消除剂或作为促有丝分裂剂作用。WO00/05268中公开了与人CD3抗原复合物特异结合的人/啮齿动物杂合抗体，并提出作为免疫抑制剂，例如用于治疗肾脏、败血症和心脏异体移植后的排斥事件。WO 03/04648公开了抗CD3和卵巢癌抗原的双特异性抗体。此外，Kufer(1997)Cancer Immunol Immunother 45193-7涉及用于治疗最小残余癌的对CD3和EpCAM特异的双特异性抗体。
已经进行了一些人源化CD3结合抗体的尝试。US 5,929,212、US5,859,205、WO 91/09968、WO 91/09967和Adair，1994Hum.Antibod.Hybridomas，541-48描述用于鼠抗人CD3单克隆抗体OKT3的人源化方法，其中将鼠(供体)CDR移植进入人(受体)构架并向构架中引入供体氨基酸残基。US 6,407,213和WO 92/22653描述了人源化的UCHT1抗体，其中按照达到可与鼠亲本抗体相比的抗原结合亲和力和生物性质的要求向共有的人可变结构域序列内容中引入最小数量的鼠CDR和FR残基。人源化的CD3抗体的其他实例为EP 0626390(OKT3)、US 5,885,573(OKT3)、US 5,834,597(OKT3)、US 5,585,097(YTH 12.5)和US2002131968(YTH12.5)。
然而，观察到以双特异性结合分子形式的来自OKT3的人源化抗体构建体降低了比活性，例如通过结合CD3/与CD3相互作用诱导信号的能力。

发明内容
因此，本发明面临的技术问题在于提供用于供应高效抗体衍生化合物的手段和方法，所述化合物可以减少的副作用用于治疗人疾病。具体而言，副作用的减少是定向的，其中副作用由化合物的免疫原性诱导并引起化合物活性的降低。
通过提供权利要求中表征的实施方案解决所述技术问题。
因此，本发明涉及双特异性结合分子，其中所述分子包含至少两个结构域或由之组成，(a)其中所述至少两个结构域之一与人CD3复合物特异结合/相互作用，其中所述结构域含有来自抗体的轻链氨基酸序列，其中所述氨基酸序列为(i)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(ii)对应于SEQ ID NO1的核酸序列编码的氨基酸序列；(iii)与如(ii)定义的核酸序列互补链在严格条件下杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和(iv)由于遗传密码简并性而与(ii)和(iii)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列；条件为(i)到(iv)的氨基酸序列在轻链CDR区根据Kabat系统的位置L24、L54和L96上含有氨基酸替换，且(b)其中另一结构域是或包含至少一个其他抗原相互作用位点和/或至少一个其他效应物结构域。
本发明上下文中使用术语“结合/相互作用”定义至少两个“抗原相互作用位点”的彼此结合/相互作用。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义多肽的基序，所述基序显示与特异抗原或特异抗原组特异相互作用的能力。所述结合/相互作用还理解为定义“特异识别”。根据本发明，术语“特异识别”是指抗体分子能够与每个本文定义的人靶分子的至少两个氨基酸特异相互作用和/或结合。抗体可识别和/或结合相同靶分子的不同表位或与之相互作用。所述术语涉及抗体分子的特异性，即其区分本文定义的人靶分子特异区的能力。抗原相互作用位点与其特异抗原间的特异相互作用可引发信号，例如由于诱导抗原构象的变化，抗原的寡聚化等。因此，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序是它们一级、二级或三级结构的结果以及所述结构的二级修饰的结果。
本发明使用的术语“特异相互作用”理解为定义本发明的双特异性结合分子的CD3特异结构域不与或基本上不与类似结构的(多)肽交叉反应。可测试一组被研究的结合分子的交叉反应性，例如通过测定所述单链结合分子在常规条件(参阅例如Harlow和Lane，《AntibodiesA Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988和Using AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)下与目的(多)肽以及大量或多或少(结构和/或功能)密切相关的(多)肽的结合。这些方法可特别包括用结构和/或功能密切相关的分子的结合研究、封闭研究和竞争研究。这些结合研究还包括FACS分析、表面等离振子共振(SPR，例如用BIAcore)、分析型超速离心、等温滴定量热法、荧光各向异性、荧光光谱或通过放射标记的配体结合测定。因此，抗原相互作用位点与特定抗原的特异相互作用的实例可包括配体对其受体的特异性。所述定义特别包括配体的相互作用，所述配体与其特异受体结合后诱导信号。相应配体的实例包括细胞因子，所述细胞因子与其特异的细胞因子受体相互作用/结合。所述相互作用的另一实例(其也特别包含于所述定义)为抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用。所述相互作用还表征为抗体的抗原结合位点与其他类似结构的表位没有或基本没有交叉反应性。
术语“结合/相互作用”的定义被理解为包括结合结构域与线性表位以及与构象表位的结合/相互作用，所述构象表位也指结构表位或非连续表位。相应的表位的定义是本领域已知的。所述表位例如可以由人靶分子的两个区域组成或其部分。在本发明上下文中，构象表位定义为两个或更多分散在一级序列中的不连续氨基酸序列，所述氨基酸序列在多肽折叠为天然蛋白质时在分子表面聚拢(Sela，(1969)Science 166，1365and Laver，(1990)Cell 61，553-6)。
术语“非连续表位”在本发明上下文中特别理解为定义非线性表位，所述非线性表位由来自多肽链上远离部分间的残基装配。当多肽链折叠为三维结构以构成构象/结构表位时，这些残基在表面聚拢。
还设计本发明的结合分子与构象表位的至少一个结合结构域结合/相互作用，所述构象表位含有人CD3复合物的至少两个区域和/或由之组成，或含有独立组件(如CD3-ε，CD3-δ和CD3-γ)和/或所述组件的组合(如CD3-ε/CD3-δ或CD3-ε/CD3-γ)或由之组成。此外，设计本文描述的所述构象/结构表位含有人CD3复合物单一组分的至少两个区域的独立部分/区域/片段，优选CD3-ε的至少两个部分/区域/片段，更优选CD3-ε的细胞外结构域。
如上文所定义，本发明双特异性结合分子的另一结构域与至少一个其他抗原相互作用位点和/或至少一个其他效应物结构域结合。术语“效应物结构域”在本发明上下文中表征本发明分子的结构域，所述结构域引发生物效应，例如诱导一级或二级刺激信号，诱导细胞毒效应(包括诱导凋亡的信号)或只具有与特定抗原相互作用位点结合/相互作用的能力。“细胞毒效应”还包含T细胞产生的细胞毒性。因此，本发明的双特异性结合分子由至少两个不同的特异性表征。
可通过本领域已知方法和本文公开并描述的方法实验测定特异性。这类方法包括(但不仅限于)Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试和肽扫描。
本文使用术语“CDR”是指“互补决定区”，其为本领域所公知。CDR是免疫球蛋白决定所述分子特异性并与特异配体接触的部分。CDR是分子变化最大的部分，并促成了这些分子的多样性。每个V结构域有三个CDR区CDR1、CDR2和3。CDR-H表征可变重链的CDR区而CDR-L指可变轻链的CDR区。H表示可变重链而L表示可变轻链。来自Ig区域的CDR区可如Kabat(1991；《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，NIH出版号91-3242U.S.Department of Health and Human Services)、Chothia(1987；J.Mol. Biol.196，901-917)和Chothia(1989；Nature，342，877-883)所述确定。
在本发明上下文中，“Kabat系统”是指用与根据Kab at(1991；《Seq uences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，NIH出版号91-3242U.S.Department of Health and Human services)和Chothia(1987；J.Mol.Biol.196，901-917)一致的方法为残基编号的标准。该编号系统为技术人员广泛使用并基于序列可变性和可变结构域区域的三维结构环，所述三维结构环对抗原结合活性是重要的。轻链或重链的所有残基具有不同的Kabat位置，即Kabat编码系统适用于CDR以及构架。任何抗体的特异残基位置都可以根据Kabat编码。编码系统和抗体的特异残基的Kabat位置在http//www.bioinf.org.uk/abs标明。例如，本发明所述的位置L24根据Kabat系统是指轻链的残基24。因此，L54和L96根据Kabat系统是指抗体轻链的位置54和96。
根据Kabat鉴定VH和VL链的CDR区的规则在www.bioinf.org.uk/abs和表1中显示。
表1重链(CDR-H区)和轻链(CDR-L区)中CDR的鉴定



根据本发明，构架区涉及在免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域(VH或VL结构域)中的区域，所述区域为与抗原接触的高变互补决定区(CDR)提供蛋白质支架。每个V结构域中存在四个构架区，指定为FR1、FR2、FR3和FR4。构架1包括从V结构域N末端到CDR1开始的区域，构架2涉及CDR1和CDR2之间的区域，构架3包括CDR2和CDR3之间的区域而构架4是指从CDR3末端到V结构域C端的区域；特别参阅Janeway，《Immunobiology，Garland Publishing》，2001，第五版。因此，构架区包括VH或VL结构域中除CDR区之外的所有区域。
本领域技术人员能够容易地从给定序列中推出构架区和CDR；参阅Kabat(1991)《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，NIH出版号91-3242U.S.Department of Health and Human Services，Chothia(1987).J.Mol. Biol.196，901-917和Chothia(1989)Nature，342，877-883。
根据本发明，“双特异性结合分子”是必然与人CD3复合物的一个结构域和/或其个别组件特异结合的(多)肽。本文使用术语“(多)肽”描述一组分子，其包括一组肽以及一组多肽。该组肽由多至30个氨基酸的分子组成，该组多肽由多于30个氨基酸组成的分子组成。最优选，所述“双特异性结合分子”选自抗体、抗体片段、抗体衍生物、特异结合的肽和特异结合的蛋白质。所述抗体片段为本领域公知并包括(但不仅限于)Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段等。抗体衍生物包括(但不仅限于)标记的抗体/抗体片段以及化学修饰的抗体分子/抗体片段。如下文将详述的，本发明上下文中特别优选的抗体衍生物为scFv。
本发明双特异性结合分子的一个结构域来自人源化的CDR移植的CD3抗体。本文上下文中对抗体和抗体构建体使用的术语“人源化的”可定义为用相应的人序列替换非人序列。这可通过将鼠CDR移植进入人构架或用相应位置上的单个人氨基酸替换构架中的单个鼠氨基酸来完成。本发明使用的术语“人源化”还包括引入其他突变以促进蛋白质的结合或细胞毒性活性。这些其他突变不必须是用人残基替换鼠残基。
替换氨基酸的方法，特别是用具体选定的氨基酸替换给定氨基酸序列上特定位置的氨基酸的方法为本领域技术人员公知，并代表标准实验室方法。这类方法的一个实例为引物诱变(Sambrook等，1989)。
惊奇地发现，在如上所述双特异性结合分子的内容中，轻链CDR中包含额外氨基酸替换的人源化CD3特异抗体构建体具有细胞毒活性。这些分子有诱导靶细胞细胞死亡的能力。相反，当本领域描述的人源化CD3特异抗体构建体(例如Adair，1994Hum.Antibod.Hybridomas，541-48)在上文定义的双特异性结合分子中表达时，所述构建体显示显著受损的诱导靶细胞细胞死亡的能力。
具体而言，本发明双特异性分子显示对其特异表位的显著结合(参阅实施例4，图2)和高度细胞毒活性(参阅实施例6，图6)。本发明双特异性的人源化CD3(其CD3结合部分的轻链CDR中存在替换)显示50pg/ml的EC50值，而含有Adair，1994Hum.Antibod.Hybridomas，541-48所述人源化OKT3的双特异性抗体构建体的EC50值为195pg/ml。由于细胞毒活性四倍的提高，本发明双特异性分子可有效地用于治疗行为。此外，提供具有高细胞毒活性的人源化双特异性分子显示在医药领域的主要优点，因为达到对患者的治疗效果需要少量本发明双特异性分子。因此治疗患者时，本发明双特异性分子提供现有技术抗体之上的重要优点，因为它们由于人源化而显示高细胞毒活性且同时免疫原性较弱。它们由此提供了医药领域的明确进展。
本发明的双特异性结合分子与本领域描述的人源化分子差异在于上述轻链CDR中的三个氨基酸替换。
由于抗体与其特异抗原通过分子内力(其受CDR具体氨基酸序列影响)结合/相互作用，本领域技术人员没有替换CDR区氨基酸序列的氨基酸以提高抗体的生物活性。相反，技术人员保持了原始的鼠CDR序列。因此，本发明的双特异性结合分子具有如此高的细胞毒活性是令人惊奇的。
特别优选的与人CD3复合物结合/相互作用的结构域表征为在位置L24具有丝氨酸，位置L54具有缬氨酸和位置L96具有亮氨酸。位置L24是指如Kabat(1991；《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，NIH出版号91-3242U.S.Department of Health and Humanservices)和Chothia(1987；J.Mol.Biol.196，901-917)和http//www.bioinf.org.uk/abs所述的轻链位置24。类似的，位置L54和L96分别代表如Kabat和Chothia所述的轻链的残基54和96。
本发明双特异性结合分子在一个实施方案中还表征为所述轻链CDR区含有SEQ ID NO4、6或8的氨基酸序列或由SEQ ID NO3、5或7的核酸序列编码的氨基酸序列。
本发明设计与人CD3复合物结合/相互作用的结构域为scFv。
术语“scFV”(单链Fv)为本领域所深入理解。在本发明上下文中优选scFv，因为它们的小尺寸和重组产生这些抗体衍生物的可能性。
还设计与人CD3复合物结合/相互作用的本发明双特异性结合分子的结构域含有SEQ ID NO10(本发明人源化的CD3结合分子的轻链)的氨基酸序列或由之组成，或由SEQ ID NO9的核酸序列编码。
优选本发明的结合分子为以下结合分子其中与人CD3复合物结合/相互作用的结构域含有如SEQ ID NO14所述的或由SEQ ID NO13的核酸序列编码的氨基酸序列或由之组成。
本发明还设计双特异性结合分子为下述结合分子其中所述另一结构域为至少一个特异于一个或多个细胞表面分子的其他抗原相互作用位点。
本文使用术语“细胞表面分子”表示出现在或/和附着于细胞表面的分子。所述细胞表面分子的实例为膜蛋白和跨膜蛋白(包括修饰的变体，例如糖基化的变体)，附着于所述蛋白质或细胞表面或糖基化部分(例如糖脂)的分子。“附着”应理解为优选为了形成完整膜蛋白、GPI连接的(糖基磷脂酰肌醇连接的)蛋白质，蛋白质或非蛋白质部分与另一载体分子(例如糖部分或神经节苷脂部分)共价或非共价结合。优选所述细胞表面分子为肿瘤特异分子。肿瘤特异分子为肿瘤相关的细胞表面抗原，其只在肿瘤细胞中发现或与非恶性细胞相比在肿瘤细胞中过表达。肿瘤相关细胞表面抗原不仅可以在肿瘤细胞中表达，还可以在细胞/组织中表达，所述细胞/组织为对生存不必须的细胞/组织或可以由不表达肿瘤相关细胞表面抗原的干细胞补充。此外，肿瘤相关细胞表面抗原可在恶性细胞或非恶性细胞中表达，但是在恶性细胞中更容易受目的治疗试剂影响。过表达的肿瘤相关细胞表面抗原实例为HER-2/neu、EGF受体、HER-3和HER-4。肿瘤特异的肿瘤相关细胞表面抗原的实例为EGFRV-III。出现在对生存非必须的细胞中的肿瘤相关细胞表面抗原实例为PSMA。出现在补充的细胞中的肿瘤相关细胞表面抗原实例为CD19、CD20和CD33。在恶性状态下比非恶性状态下更容易受影响的肿瘤相关细胞表面抗原实例为EpCAM。
优选所述另一结构域(其至少为一个其他抗原相互作用位点)为包含多肽序列的来自抗体的区域，所述多肽序列对应于至少一个抗体可变区。更优选所述另一结构域为其他scFv。本发明特别优选的分子形式提供双特异性单链抗体构建体形式的多肽构建体，其中来自抗体的区域包含一个VH区和一个VL区。VH和VL区可以以任何顺序排列。
术语“双特异性单链抗体构建体”是指包含两个如下结构域的构建体一个结构域由如上定义的能够与人CD3/人CD3复合物特异相互作用/结合的(至少一个)可变轻链组成，而另一结构域由如上定义的能够与其他抗原特异相互作用/结合的(至少一个)可变区(或其部分)组成。可变区的一部分可以是至少一个CDR(“互补决定区”)，最优选至少CDR3区。优选所述单链抗体构建体中两个结构域/区域相互共价连接为单链。可直接(结构域1与CD3相互作用-结构域2与其他抗原相互作用或结构域1与其他抗原相互作用-结构域2与CD3相互作用)或通过额外的多肽接头序列(结构域1-接头序列-结构域2或结构域2-接头序列-结构域1)实现该连接。在使用接头的情况下，接头优选长度和序列足够保证两个结构域可各自独立地保持它们不同的结合特异性。最优选并如附带的实施例中引证的，“双特异性单链抗体构建体”为双特异性单链Fv(bscFv)。双特异性单链分子的分子形式为本领域所公知并描述于例如WO 99/54440，Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970，Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025；Kufer，Cancer Immunol.Immunother.，(1997)，45，193-197；Lffler，Blood，(2000)，95，6，2098-2103；Brühl，Immunol.，(2001)，166，2420-2426。这类本发明双特异性单链抗体构建体的具体实例在本文下文中提供并在附带的实施例中说明。
根据本发明的双特异性结合分子，其中所述另一结构域与选自以下的抗原特异结合/相互作用EpCAM、CCR5、CD19、HER-2、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(黏蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、bhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、多聚SA、GD2、Carboanhydrase IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6桥粒芯糖蛋白4、E-钙黏着蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和Muellerian抑制物质(MIS)II型受体、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TF抗原、Cora抗原、CD7、CD22、Igα、Igβ、gp100、MT-MMPs、F19抗原和CO-29。
根据本发明优选的实施方案，所述另一结构域与CD19分子特异结合/相互作用。
特别设计与CD3和CD19分子特异结合/相互作用的本发明双特异性结合分子的特征在于所述另一结构域包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO16或18的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO15或17的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码子的简并性而与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
更优选双特异性结合分子包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO20的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO19的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码子的简并性而与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
所述双特异性结合分子优选双特异性scFv构建体，其中一个scFv与CD3特异结合/相互作用而另一scFv与CD19特异结合/相互作用。
根据本发明优选的实施方案，所述另一结构域与EpCAM分子特异结合/相互作用。
特别设计与CD3和EpCAM特异结合/相互作用的本发明双特异性结合分子的特征在于所述另一结构域包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO22、24、26、28、30或32的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO21、23、25、27、29或31的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与下述(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和
(d)由因为遗传密码子的简并性而与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
更优选双特异性结合分子包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO34或36的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO33或35的核酸序列编码的氨基酸序列(c)由与(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码子的简并性而与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
所述双特异性结合分子优选双特异性scFv构建体，其中一个scFv与CD3特异结合/相互作用而另一scFv与EpCAM特异结合/相互作用。
还优选所述本发明双特异性结合分子的至少一个其他抗原相互作用位点被人源化。
在另一实施方案中，本发明包括编码上文定义的本发明双特异性结合分子的核酸序列。
优选所述核酸序列选自(a)编码下述蛋白质成熟形式的核苷酸序列，其中包含选自SEQID NO20、34或36的氨基酸序列；(b)包含或由选自SEQ ID NO19、33或35的DNA序列组成的核苷酸序列；(c)与(b)定义的核苷酸序列互补链在严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；(d)编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质通过替换、缺失和/或添加由(a)或(b)核苷酸序列编码的氨基酸序列的一个或多个氨基酸而衍生自由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白质；(e)编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质含有与(a)或(b)核苷酸序列编码的氨基酸序列有至少60％，优选70％，更优选80％，特别优选90％，甚至更优选95％和最优选99％同一性的氨基酸序列；
(f)由于遗传密码子简并性而与(a)到(e)任一核苷酸序列简并的核苷酸序列。
本文使用术语“杂交”是指能够与所述核酸序列互补链或其部分杂交，或与所述核酸序列或其部分杂交的多核苷酸。因此，所述核酸序列可分别在RNA或DNA制品的Northern或Southern印迹分析中用作探针，或可在PCR分析中根据其各自的大小用作寡核苷酸引物。优选所述杂交多核苷酸含有至少10个，更优选至少15个核苷酸而要用作探针的本发明杂交多核苷酸优选含有至少100个，更优选至少200个或最优选至少500个核苷酸。
本领域众所周知如何用核酸分子进行杂交实验，即本领域技术人员知道根据本发明应使用何种杂交条件。这类杂交条件在标准教科书(例如Sambrook等，上述)或本领域技术人员已知的或如上所述的其他标准实验室手册中涉及。根据本发明优选的多核苷酸能够与本发明多核苷酸或其部分在严格杂交条件下杂交。
“严格杂交条件”是指在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt杂交溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的、剪切的鲑精DNA的溶液中42℃孵育过夜，然后在0.1×SSC中在约65℃洗涤滤膜。还考虑在低严格杂交条件下与本发明多核苷酸杂交的核酸分子。杂交和信号检测严格度的改变基本通过操作甲酰胺浓度(较低百分比的甲酰胺引起较低的严格度)、盐条件或温度完成。例如，较低严格条件包括在含有6× SSPE(20× SSPE＝3M NaCl；0.2MNaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA的溶液中37℃孵育过夜，然后在50℃用1× SSPE、0.1％SDS洗涤。此外，为了达到更低严格度，在严格杂交后进行的洗涤可在更高盐浓度(如5× SSC)下进行。值得注意的是上述条件的变化可通过包含和/或替换用于抑制杂交实验背景的代替封闭剂来实现。一般的封闭剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性的鲑精DNA和市售专利制剂。由于兼容性的问题，具体封闭剂的使用可能需要修饰上述杂交条件。
所述核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合体核酸分子或其嵌合体混合物，所述嵌合体包含单独的这些多核苷酸或它们的组合。
本领域技术人员明白可向本发明核酸分子添加调节序列。例如，可以使用启动子、转录增强子和/或允许诱导本发明多肽表达的序列。适当的诱导系统为例如四环素调节的基因表达(如例如Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，5547-5551)和Gossen等(Trends Biotech.12(1994)，58-62)所述)或地塞米松诱导的基因表达系统(如Crook(1989)EMBO J.8，513-519所述)。
此外，为了其他目的，设计核酸分子可包含例如硫酯键和/或核苷酸类似物。所述修饰可用于使核酸分子免于受细胞中的核酸内切和/或外切酶作用而稳定。所述核酸分子可被含有嵌合基因的合适载体转录，所述嵌合基因允许所述核酸分子在细胞中转录。在该方面还应理解这类多核苷酸可用于“基因寻靶”或“基因治疗”途径。在另一实施方案中，标记所述核酸分子。用于检测核酸的方法(例如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸)为本领域所公知。该实施方案可用于下述筛选方法，所述方法用于证实基因治疗方法中上述核酸分子的成功引入。
所述核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，其包含单独的或组合的任何上述核酸分子。优选核酸分子为载体的部分。
本发明因此还涉及含有本发明核酸分子的载体。
许多合适的载体为分子生物学领域的技术人员所公知，其选择应基于功能目的，并包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常规使用的其他载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建多种质粒和载体，参阅例如Sambrook等(上述引文中)和Ausubel，《Current Protocols in Molecular Biology》，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)，(1994)描述的技术。另外，本发明多核苷酸和载体可重建入脂质体用于递送至靶细胞中。如下文更详细讨论的，使用克隆载体分离个体DNA序列。相关的序列可转移进入特定多肽表达所需的表达载体中。一般的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。一般的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
优选所述载体包含下述核酸序列，所述核酸序列是和所述编码本文定义的单链抗体构建体的核酸序列有效连接的调节序列。
这类调节序列(控制元件)为技术人员公知并可包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子、用于向载体引入插入片段的翻译和插入位点。优选所述核酸分子与所述允许在真核或原核细胞中表达的控制序列有效连接。
设计所述载体为包含编码本发明双特异性结合分子的核酸分子的表达载体。
术语“调节序列”是指下述DNA序列，其对影响与它们连接的编码序列的表达是必须的。这类控制序列的性质根据宿主生物而不同。原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核细胞中控制序列通常包括启动子、终止子和(在一些情况下)增强子、反式激活蛋白或转录因子。术语“控制序列”旨在(最小范围)包括所有其存在是表达所必须的组件，并可包括另外的有利组件。
术语“有效连接”是指并列，其中所述组件有允许它们按照应有方式作用的关系。与编码序列“有效连接”的控制序列以下述方式连接编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。控制序列为启动子的情况下，技术人员明白优选使用双链核酸。
因此，所述载体优选表达载体。“表达载体”是可用于转化选定的宿主并提供编码序列在选定宿主中表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合型载体。优选表达包括核酸分子转录为可翻译的mRNA。本领域技术人员熟知保证原核和/或真核细胞中表达的调节元件。真核细胞的情况下，它们通常包括保证转录起始的启动子和可选的保证转录结束和转录物稳定的多聚A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能调节元件包括例如大肠杆菌(E.coli)PL、lac、trp或tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调节元件实例为酵母中的AOX1或GAL1启动子或CMV、SV40、RSV启动子(劳斯氏肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或哺乳动物和其他动物细胞中的珠蛋白内含子。
除负责转录起始的元件外，这类调节元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40多聚A位点或tk多聚A位点。另外，根据使用的表达系统，可以向所述核酸序列的编码序列添加前导序列，所述前导序列能够将多肽定向至细胞区室或将其分泌进入培养基，并为本领域所熟知，还参阅例如附带的实施例3。前导序列以适当的相位与翻译起始和终止序列装配，并优选前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌进入周质空间或细胞外培养基。任选地，异源序列可编码含有赋予目的特征(例如稳定表达的重组产物或简化其纯化，如上)的N末端鉴定肽的融合蛋白。在本文中，合适的表达载体为本领域公知，例如Okaya ma-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Mack等PNAS(1995)92，7021-7025和Raum等CancerImmunol Immunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选表达控制序列为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可以使用原核宿主的控制序列。载体整合进适当的宿主中后，将宿主保持在适合核苷酸序列高水平表达的条件下，并如所需随后收集并纯化本发明的双特异性结合分子，参阅例如附带的实施例。
可用来表达细胞周期相互作用蛋白质的另一表达系统为昆虫系统。在一个这类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)作为在秋夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。可将所述核酸分子的编码序列克隆进该病毒的非必须区(例如多角体蛋白基因)并置于多角体蛋白启动子控制之下。所述编码序列的成功插入将使得多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用重组病毒感染秋夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，本发明蛋白在其中表达(Smith，J.Virol.46(1983)，584；Engelhard，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91(1994)，3224-3227)。
其他调节元件可包括转录和翻译增强子。有利地，上述本发明载体包含选择性和/或scorable标记物。
用于选择转化的细胞和例如植物组织和植物的选择性标记基因为本领域技术人员熟知，并包含例如以抗代谢物抗性作为选择基础的赋予甲氨喋呤抗性的dhfr(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994)，143-149)，赋予氨基糖苷新霉素、卡那霉素和巴龙霉素抗性的npt(Herrera-Estrella，EMBO J.2(1983)，987-995)和赋予潮霉素抗性的hygro(Marsh，Gene 32(1984)，481-485)。已描述了其他的选择性基因，即允许细胞使用吲哚代替色氨酸的trpB，允许细胞使用组胺醇代替组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8047)的hisD，允许细胞使用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(WO 94/20627)和赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO(McConlogue，1987，《CurrentCommunications in Molecular Biology》，Cold Spring HarborLaboratory编辑)抗性的ODC(ornithine decarboxylase)或来自土曲霉(Aspergillus terreus)的赋予杀稻瘟菌素S抗性的脱氨基酶(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)，2336-2338)。
有用的scorable标记物也为本领域技术人员公知并可商业获得。有利的是，所述标记物为编码荧光素酶(Giacomin，Pl.Sci.116(1996)，59-72；Scikantha，J.Bact.178(1996)，121)、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBS Lett.389(1996)，44-47)、或β-葡糖醛酸酶(Jefferson，EMBO J.6(1987)，3901-3907)的基因。该实施方案特别适用于简单快速筛选含有所述载体的细胞、组织和生物。
如上所述，为了纯化和基因治疗的目的，可单独或作为载体的一部分使用所述核酸分子，以在细胞中表达本发明双特异性结合分子。将含有编码上述任一本发明双特异性结合分子的DNA序列的核酸分子或载体引入细胞，所述细胞随后产生目的多肽。以通过离体或体内技术向细胞引入治疗基因为基础的基因疗法是最重要的基因转移应用之一。用于体外或体内基因疗法的合适的载体、方法或基因递送系统描述于文献并为本领域技术人员熟知，参阅例如Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Verma，Nature 389(1994)，239；Isner，Lancet348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood 91(1998)，30-36；Verma，Gene Ther.5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene The r.9(1998)，2243-51；Wang，Nature Me dicine 2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,589,466；or Schaper，Current Opinion inBiotechnology 7(1996)，635-640。所述核酸分子和载体可设计为用于直接引入细胞或通过脂质体或病毒载体(例如腺病毒，逆转录病毒)引入细胞。优选所述细胞为生殖系细胞、胚胎细胞或卵细胞或由此派生的细胞，最优选所述细胞为干细胞。胚胎干细胞的实例可以为(特别是)如Nagy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，8424-8428所述的干细胞。
本发明还提供用本发明载体转化或转染的宿主。可通过向宿主中引入所述至少一个上述本发明载体或至少一个上述本发明核酸分子产生所述宿主。所述至少一个载体或至少一个核酸分子在宿主中的存在可介导编码上述单链抗体构建体的基因表达。
上述被引入宿主的本发明核酸分子或载体可以整合进宿主基因组或其可以保持在染色体之外。
宿主可以是任何原核或真核细胞。
术语“原核”旨在包括所有可以用DNA或RNA分子转化或转染以表达本发明蛋白质的细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核”旨在包括酵母、高等植物、昆虫和优选哺乳动物细胞。取决于重组产生方法中使用的宿主，本发明多核苷酸编码的蛋白质可以是糖基化的或可以是非糖基化的。特别优选使用含有本发明多肽编码序列并遗传上融合了N末端FLAG标签和/或C末端His标签的质粒或病毒。优选所述FLAG标签长度为约4到8个氨基酸，最优选8个氨基酸。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将上述多核苷酸用于转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、有效连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法为本领域所公知(Sambrook，上述引文)。
优选所述宿主为细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
特别设想所述宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞系(如SP2/0或NS/0)。如附带的实施例中所演示的，特别优选CHO细胞作为宿主。
更优选所述宿主为人细胞或人细胞系，例如per.c6(Kroos，Biotechnol.Prog.，2003，19163-168)。
因此在另一实施方案中，本发明涉及用于产生本发明双特异性结合分子的方法，包括在适合表达/允许表达双特异性结合分子的条件下培养本发明细胞和/或宿主和从细胞或培养物/培养基中分离/回收双特异性结合分子。
转化的宿主可以在发酵罐中生长并根据本领域已知技术培养以达到最佳细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解液或细胞膜级分中分离本发明多肽。可通过任何常规方法分离和纯化例如微生物表达的本发明多肽，例如制备型层析分离和免疫分离，如涉及使用抗本发明多肽标签的单克隆或多克隆抗体的或如附带的实施例中所述的分离方法。
本领域已知用于宿主培养的允许表达的条件依赖于这类方法中使用的宿主系统和表达系统/载体。本领域已知为达到允许重组多肽表达的条件而需进行修饰的参数。因此，本领域技术人员可以无需更多的创造性投入而确定合适的条件。
表达后可根据本领域标准方法纯化本发明双特异性结合分子，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱层析、凝胶电泳等，参阅Scopes，《Protein Purification》，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。制药用途优选至少约90％到95％同质性的，更优选98到99％或更高同质性的基本纯净的多肽。部分纯化或纯化至所需同质性后，可将本发明双特异性结合分子用于治疗(包括体外)或用于研发和实施测定操作。此外，用于从培养物中回收本发明双特异性结合分子的方法实例在附带的实施例中详细描述。
此外，本发明提供下述组合物，其含有本发明双特异性结合分子或用如上公开的方法产生的双特异性结合分子、本发明核酸分子、本发明载体或宿主。所述组合物还可任选地包含能够为免疫效应物细胞提供激活信号的蛋白质化合物。最优选所述组合物为还含有任选的适当的载体、稳定剂和/或赋形剂制剂的药物组合物。
就本发明观点来看，所述提供免疫效应物细胞激活信号的“蛋白质化合物”可以是例如T细胞激活信号。优选的蛋白质化合物的形式包括双特异性抗体和片段或其衍生物，例如双特异性scFv。优选的，所述T细胞激活信号可经由T细胞受体(TCR)提供，更优选经由TCR的CD3分子提供。蛋白质化合物可包括(但不仅限于)CD3特异的scFv、T细胞受体特异的scFv或超级抗原。超级抗原以不依赖于MHC的方式与T细胞受体可变区的某些亚家族直接结合，从而介导了初级T细胞激活信号。蛋白质化合物还可提供非T细胞免疫效应物细胞的激活信号。非T细胞的免疫效应物细胞包括(特别是)B细胞和NK细胞。
根据本发明，术语“药物组合物”是指用于对患者(优选人患者)施用的组合物。在优选的实施方案中，药物组合物包括用于肠胃外、经皮肤、腔内、动脉内、鞘内施用或通过直接注射进组织或肿瘤的组合物。特别设计所述药物组合物通过输注或注射施用给患者。可通过不同的路径施用适当的组合物，例如通过静脉、腹膜内、皮下、肌内、体表或皮内施用。本发明药物组合物可还包含可药用载体。合适的制药载体实例为本领域公知，并包括磷酸缓冲的盐溶液、水、乳剂(例如油/水乳浊液)、多种类型的湿润剂、无菌溶液等。含有这类载体的组合物可通过公知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者。给药方案应由主治医师和临床因素决定。如医学领域所公知的，用于任一患者的剂量依赖于许多因素，包括患者身材、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。一般而言，药物组合物的常规给药方案应在每天1μg到5g单位的范围内。然而，连续输注的更优选剂量可以在每小时每千克体重0.01μg到2mg，优选0.01μg到1mg，更优选0.01μg到100μg，更优选0.01μg到50μg和最优选0.01μg到10μg单位的范围内。特别优选的剂量在下文中描述。可通过周期性的评估监控过程。剂量会变化但是静脉施用DNA的优选剂量为从约106到1012拷贝DNA分子。本发明组合物可局部或全身性施用。施用通常是肠胃外的(例如静脉内)，DNA也可直接施用于靶位点，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶位点或通过导管递送至动脉中的位点。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浊液和乳浊液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯类(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳浊液或悬浊液，包括盐水和缓冲的培养基。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格溶液或不挥发油。静脉载体包括流体和营养补充物、电解质补充物(例如以林格葡萄糖为基础的那些)等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，本发明药物组合物可包含蛋白质载体，如例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。依赖于本发明药物组合物预期的用途，还可以设计该药物组合物包含除蛋白质CD3结合分子或核酸分子或编码相同产物的载体(如本发明所述)外的生物活性试剂。这类试剂可以是本领域已知的作用于胃肠系统的药物、作为细胞生长抑制剂作用的药物、预防高尿酸血的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质激素)、作用于循环系统的药物和/或如T细胞共刺激分子或细胞因子的试剂。
本发明组合物施用的可能适应症为肿瘤疾病、癌症，特别是上皮癌(例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头与颈癌、非黑色素沉着皮肤癌)、生殖泌尿道癌症(例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌)和肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌以及其他肿瘤疾病例如血液肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、肉瘤(例如骨肉瘤)。本发明组合物施用的其他适应症为增生疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。
如上所述的本发明组合物还可以是诊断组合物，所述诊断组合物还包括任选的用于检测增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的手段和方法。
本发明双特异性结合分子还适用于免疫测定，在所述免疫测定中可以使用液相或结合在固相载体上的双特异性结合分子。可以使用本发明多肽用于例如诊断目的的免疫测定实例为直接或间接方式的竞争或非竞争性免疫测定。这类免疫测定的实例为酶联免疫吸附法(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)、夹层(免疫测定)、斑点印迹和Western印迹测定法。其他可用于在例如诊断测定中检测双特异性结合分子的测定法为基于FACS的测定、细胞毒素测定(Cr51，荧光释放)或染料释放测定。
本发明双特异性结合分子可与许多不同的载体结合并用于分离与所述多肽特异结合的细胞。公知的载体实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙稀、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸盐、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和变性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。就本发明而言，载体的性质可以是可溶或不可溶的(例如珠子)。
所述诊断组合物可装在一个或多个容器内，所述容器任选的含有实施医药或科学目所需的缓冲液、储藏液和/或保持试剂或材料。此外，本发明诊断组合物的部分可单独包装在管或瓶中或共同包装在容器或多容器单元中。
本领域普通技术人员已知许多不同的标签和标记的方法。可用于本发明的标签类型实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。
在本发明最优选的实施方案中，设计了本发明的双特异性结合分子或由本发明方法产生的结合分子、本发明载体或宿主用于制备药物组合物的用途。所述药物组合物可用于预防、治疗或改善增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。
本发明还涉及用于预防、治疗或改善增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，包括向需要这类预防、治疗或改善的受试者施用有效数量的本发明双特异性结合分子或由本发明方法产生的结合分子、本发明载体或宿主。优选的受试者为人。
还设计治疗方法包括施用有效数量的能够提供免疫效应物细胞激活信号的蛋白质化合物。优选所述蛋白质化合物与本发明双特异性结合分子或由本发明方法产生的双特异性结合分子、本发明核酸分子、载体或宿主同时或非同时施用。
最后，本发明提供含有本发明双特异性结合分子或由本发明方法产生的双特异性结合分子，本发明核酸分子、载体或宿主的试剂盒。
所述试剂盒特别适用于制备本发明药物组合物并(特别是)可由适用于注射或输注的容器组成。本发明试剂盒还可有利地包含任选的实施医药或科学目的缓冲液、储藏液和/或保持试剂或材料。此外，本发明试剂盒的各部分可单独包装在管或瓶中或共同包装在容器或多容器单元中。本发明的试剂盒可有利地用于(特别是)实施本发明的方法并可用于本文提及的多种应用(例如用作研究工具或医药工具)。优选按照本领域技术人员已知的标准方法制造试剂盒。
本发明的描述和实施例公开并包含了这些实施方案和其他的实施方案。其他涉及本发明将使用的任何抗体、方法、用途和化合物的文献可从公共图书馆和数据库使用例如电子设备查到。例如，可使用国际互联网上例如在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html下可获得的公共数据库″Medline″。其他数据库和地址如http//www.ncbi.nlm.nih.gov/、http//www.infobiogen.fr/、http//www.fmi.ch/biology/research tools.html、http//www.tigr.org/为本领域技术人员已知并也可使用例如http//www.lycos.com或http//www.google.com获得。


图1A)人源化的抗CD3抗体轻链和重链的核苷酸和氨基酸序列(SEQ IDNO9-12)；B)双特异性抗CD19×人抗CD3抗体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO19、20)；C)双特异性抗EpCAM(5-10)×人抗CD3抗体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO35、36)；D)双特异性抗EpCAM(3-1)×人抗CD3抗体的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO33、34)，图2FACS分析不同构建体与CD3和CD19或EpCAM的结合亲和力。
用CD3阳性的Jurkat细胞进行CD3结合的FACS分析。A)双特异性抗CD19×人抗CD3抗体构建体(SEQ ID NO20)与CD19的结合用CD19阳性的Nalm6细胞显示；B)双特异性抗EpCAM(3-1)×人抗CD3抗体构建体(SEQ ID NO34)与EpCAM的结合用EpCAM阳性的KatoIII细胞显示；C)双特异性抗EpCAM(5-10)×人抗CD3抗体构建体(SEQ IDNO36)与EpCAM的结合用EpCAM阳性的KatoIII细胞显示。向右的偏移显示结合。
图3含有双特异性抗CD19×人抗CD3抗体的蛋白质级分从锌鳌合Fractogel柱上的洗脱模式。
来自50-530ml保留时间的280nm处的高吸光度是由于柱流出液中未结合的蛋白质。617.44ml处峰的箭头指出使用的或进一步纯化的含有人源化双特异性构建体的蛋白质级分。
图4Sephadex S200凝胶过滤柱的蛋白质洗脱模式含有针对抗CD19×人抗CD3双特异性抗体的82.42ml处的蛋白质峰对应约52kD的分子量。从40-120ml滞留时间收集级分。
图5A)SDS-PAGE分析双特异性抗CD19×人抗CD3抗体蛋白质级分。泳道M分子量标记物，泳道1细胞培养物上清液；泳道2IMAC洗脱液；泳道3凝胶过滤聚集峰；泳道4纯化的双特异性抗体抗CD19×人抗CD3；B)Western印迹分析纯化的双特异性抗CD19×人抗CD3抗体。泳道M分子量标记物，泳道1细胞培养物上清液；泳道2IMAC洗脱液；泳道3凝胶过滤聚集峰；泳道4从凝胶过滤获得的纯化的双特异性抗体抗CD19×人抗CD3。
图6双特异性抗CD19×人抗CD3抗体(SEQ ID NO20)的细胞毒性测定。
以1∶10的E∶T比例使用NALM-6细胞作为靶细胞以及CD4阳性的CB15T细胞作为效应物细胞。
参考以下生物学的实施例描述本发明，所述实施例只用作说明而不曲解为限制本发明的范围。
实施例1.
特异于CD3抗原的人源化抗体的产生参考Kabat，EA，等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，第3卷，Bethesda，MDNational Institutes ofHealth.National Center for Biotechnology Information，1991；2597.NIH出版号91-3242CD3确定CD3特异的抗体OKT3的CDR的位置。
选择用于接受移植的CDR的人构架区分别为接受重链的KOL和接受轻链的REI。这些蛋白质的结构已被结晶学解出(REIPalm(1975)HoppeSeylers Z Physiol Chem 356，167-191，KOLSchmidt(1983)Hoppe SeylersZ Physiol Chem 364，713-747.)。
根据Adair 1994 Hum.Antibod.Hybridomas，541-48，向人可变区构架中引入大量额外的鼠残基。这些被改变的残基对维持原有抗原特异性是重要的。向轻链的CDR1、CDR2和CDR3中引入额外的突变。表2显示人源化OKT的CDR序列和本发明的改进的人源化CD3。图1A显示改进的人源化CD3结合分子的序列(SEQ ID No9-12)。
表2.CD3特异抗体OKT3的轻链CDR。

实施例2具有人源化抗CD3部分的双特异性单链抗体的构建实施例2.1具有人源化抗CD3部分的双特异性单链抗CD19×抗CD3抗体的构建通过基因合成获得编码产生的人源化抗体的scFv的DNA，并将其与CD19特异的scFv基因融合以获得双特异性单链抗体(图1B，SEQ IDNO19、20)。用限制性酶EcoRI和SalI将双特异性单链抗体亚克隆至哺乳动物表达载体pEF-DHFR。
实施例2.2具有人源化抗CD3部分的双特异性单链抗EpCAM ×抗CD3抗体的构建除实施例1.1中所述双特异性构建体之外，构建两个其他的有不同肿瘤特异性的双特异性单链抗体。用两个选定的EpCAM抗体5-10和3-1代替双特异性抗CD19×抗CD3的CD19特异性。因此获得两个EpCAM特异的双特异性单链抗体构建体抗EpCAM(5-10)×人抗CD3(SEQ IDNO35、36)和抗EpCAM(3-1)×人抗CD3(SEQ ID NO33、34)。
实施例3具有人源化抗CD3部分的双特异性单链抗体的表达如Mack，M.等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，7021-7025所述通过稳定转染进DHFR缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗CD19×人抗CD3和抗EpCAM ×人抗CD3构建体(SEQ ID NO 19、20、33、34、35、36)。表达载体的转染在用磷酸钙处理细胞后进行(Sambrook等，1989)。
实施例4FACS分析具有人源化抗CD3部分的单链双特异性抗体的结合活性为了测试关于结合能力的功能性，进行FACS分析。
实施例4.1流式细胞结合分子抗CD19×人抗CD3双特异性抗体使用CD19阳性Nalm 6细胞(人B细胞前体白血病)和CD3阳性Jurkat细胞(人T细胞白血病)。200,000Nalm 6细胞和200,000Jurkat细胞与50μl用抗CD19×人抗CD3特异多肽转染的CHO细胞的纯细胞培养物上清液在冰上孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次。然后使用鼠PentaHis抗体(用含2％FCS的50μl PBS 1∶20稀释，Qiagen)，之后洗涤并使用含2％FCS的50μl PBS 1∶100稀释的藻红蛋白缀合的Fcγ特异抗体(Dianova)，通过构建体C端组氨酸标签检测其结合，(图2A，粗线)。使用新鲜细胞培养基而不是细胞培养物上清液作为阴性对照(图2，细线)。
在FACS-Calibur(Becton Dickinson，Heidelberg)上通过流式细胞术分析细胞。如《Current Protocols in Immunology》(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)所述进行荧光强度的FACS染色和测量。如现有技术所述将双特异性结合分子的结合活性与相应的有人源化OKT3部分的对照双特异性抗体相比较。
如图2所示，抗CD19×人OKT3和抗CD19×人抗CD3(改进的人OKT3)均与CD19和CD3良好结合。
实施例4.2抗EpCAM ×人抗CD3双特异性抗体的流式细胞结合分析为了测试EpCAM特异的双特异性抗体的结合能力，在具有以下修改的情况下重复实施例4.1所述的测定使用EpCAM阳性Kato III(胃癌细胞系，ATCC HTB-103)细胞代替Nalm 6细胞并使用用EpCAM双特异性抗体转染的CHO细胞的上清液。图2B和2C显示EpCAM结合测定的结果。使用如现有技术描述的有人源化OKT3的相应双特异性抗体作为对照。
如图2B和2C所示，含有本发明人源化抗CD3(SEQ ID NO34、36)的双特异性构建体显示比有人源化OKT3的构建体更好的结合。
实施例5.
纯化有改进的人源化抗CD3部分的双特异性构建体为了纯化双特异性单链构建体，将用抗CD19×人抗CD3稳定转染的CHO细胞在有HiCloneCHO修饰的DMEM培养基(HiQ)的摇瓶中培养7天后收获。通过离心去除细胞并将含有表达的蛋白质的上清液保存在-20℃。
层析仪使用kta FPLC System(Pharmacia)和UnicornSoftware。所有的化学品均为研究级别并购自Sigma(Deisenhofen，Germany)或Merck(Darmstadt，Germany)。人源化双特异性单链构建体蛋白质用两步纯化方法分离，所述方法包括固定的金属亲和层析(IMAC)和凝胶过滤。
使用根据生产商方案用ZnCl2装载的Fractogel column(Pharmacia)进行IMAC(固定金属层析)。用缓冲液A2(20mM磷酸钠，pH 7.5，0.4MNaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速上柱。用缓冲液A2洗涤柱以去除未结合的样品。使用2步梯度的缓冲液B2(20mM磷酸钠pH 7.5、0.4M NaCl、0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质，步骤110倍柱床体积的20％缓冲液B2；步骤210倍柱床体积的100％缓冲液B2。合并100％步骤洗脱的蛋白质级分用于进一步纯化。(图3)在用PBS(Gibco)平衡的Sephadex S200HiPrep column(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析。将洗脱的蛋白质样品(留出速率1ml/min)进行SDS-PAGE和Western印迹进行检测。柱预先标好刻度用于分子量确定(分子量标记物试剂盒，Sigma MW GF-200)。(图4)使用蛋白质测定染料(Micro BCA，Pierce)和IgG(Biorad)作为标准蛋白质确定纯化的构建体的蛋白质浓度。表2显示蛋白质的产量。所有的构建体应从细胞培养物上清液中纯化。获得了抗CD19×人抗CD3(16μg/ml)和抗CD19×人OKT3(13，6μg/ml)的相当的纯化蛋白质产量。
纯化的产物在PBS凝胶过滤的天然条件测定下具有52kDa的分子量。
在4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen)上进行纯化的双特异性蛋白质的SDS-PAGE。样品制备和应用根据生产商方案。用MultiMark protein standard(Invitrogen)确定分子量。用胶体考马斯(Invitrogen方案)染色的凝胶显示52kDa的条带。分离的蛋白质的纯度显示＞95％。
根据生产商方案使用Optitran BA-S83m embrane和Invitrogen Blot Module进行Western印迹。使用的抗体为PentaHis(Quiagen)和山羊抗小鼠碱性磷酸酶(AP)(Sigma)，染色液为BCIP/NBT(Sigma)。由Western印迹检测人源化的双特异性蛋白质，所述Western印迹显示对应于考马斯染色的SDS凝胶(图5A)中纯化的双特异性蛋白质的52kD条带(图5B)。
实施例6.
具有人源化抗CD3部分的双特异性抗体的生物活性为了证明构建的双特异性抗体的高细胞毒活性，进行以下测定。
实施例6.1抗CD19×人抗CD3双特异性抗体(SEQ ID NO20)用10μM钙荧光素AM(分子探针)在细胞培养基中将靶NALM-6细胞(1.5×107)在37℃标记30分钟。用细胞培养基洗涤两次后，计数细胞并与CD4阳性的CB15T细胞混和。产生的效应物靶细胞混合物每毫升含有2×105Nalm6细胞和2×106CB15细胞(1∶10的E∶T比例)。用RPMI/10％FCS将抗体稀释至要求的浓度。向细胞悬液中添加50μl该溶液并在37℃/5％CO2中孵育2小时。细胞毒性反应后，用荧光读数器定量孵育的培养基中释放的染料，并与不含有细胞毒性化合物的阴性对照反应的荧光信号以及作为阳性对照反应测定的总裂解细胞(1％皂苷10分钟)的荧光信号相比较。基于这些读数，根据以下公式计算相对细胞毒性(specificcytotoxicity)∶[荧光(样品)-荧光(对照)]∶[荧光(全部裂解)-荧光(对照)]×100。
如Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)测定的，S形剂量应答曲线一般具有＞0.97的R2值。使用由分析程序计算的EC50值比较生物活性。图6显示有人源化CD3部分的针对CD19和CD3的双特异性抗体的细胞毒性。使用现有技术描述的相应的有人源化OKT3的双特异性抗体作为对照。
与Adair所述的人源化OKT3(EC50值195pg/ml)相比双特异性人源化的改进的CD3(人抗CD3)(SEQ ID NO20)双特异性形式具有显著提高的细胞毒活性(EC50值50pg/ml)。因此，这些结果正明了改进的与本发明CD3结合的人源化抗体的主要优点。由于双特异性形式中改进的人源化CD3的细胞毒活性四倍的提高，该分子用于治疗应用高度有利。基于更强的细胞毒活性，与现有技术的分子相比治疗需要更低数量的蛋白质。因此治疗患者时，本发明双特异性分子提供超越现有技术抗体的重要优点，因为它们由于人源化而显示高细胞毒活性且同时免疫原性较弱。它们由此提供了医药领域的明确进展。
序列表<110>麦克罗梅特股份公司<120>免疫原性较弱的结合分子<130>H3150 PCT<160>36<170>PatentIn 版本3.1<210>1<211>318<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明OKT3 light chain″<400>1gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gtgcaagttc aagcgtaagc tacatgaatt ggtatcagca gacaccaggg 120aaagccccta agagatggat ctatgacaca tccaaattgg cttctggggt cccatcaagg 180ttcagtggca gtggatctgg gacagattac actttcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240gatattgcaa cttactactg tcaacagtgg agtagtaacc cttttacttt tggccagggg 300accaagctgc agatcacc 318<210>2<211>106<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明OKT3 VL″<400>2Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
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<221>来源
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Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser1 5<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>来源<223>/note＝″人工序列说明人CD3 VL″
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<400>11caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60tcctgtaagt cttctggata caccttcact aggtatacga tgcactgggt ccgccaggct 120ccagggaagg ggctggagtg gattggatac ataaatccta gccgtggtta tactaattat 180aatcagaagg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacggccttt 240ctgcaaatgg acagcctgag acccgaggac acgggtgtgt atttctgtgc gagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc cagggcaccc cggtcaccgt ctcctca357<210>12<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
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ctgcaaatgg acagcctgag acccgaggac acgggtgtgt atttctgtgc gagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctattggggc cagggcaccc cggtcaccgt ctcctcagtc 360gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtgga cgacatccag 420atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 480agagcaagtt caagcgtaag ctacatgaat tggtatcagc agacaccagg gaaagcccct 540aagagatgga tctatgacac atccaaagtg gcttctgggg tcccatcaag gttcagtggc 600agtggatctg ggacagatta cactttcacc atcagcagtc tgcaacctga agatattgca 660acttactact gtcaacagtg gagtagtaac cctctcactt ttggccaggg gaccaagctg 720cagatcacc 729<210>14<211>243<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明人CD3 VH-VL″<400>14Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30
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<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
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<220>
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<221>来源<223>/note＝″人工序列说明抗CD19×人抗CD3″<400>20Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp20 25 30Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr85 90 95Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly100 105 110Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val115 120 125Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val130 135 140Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met145 150 155 160Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln165 170 175Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly180 185 190Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln195 200 205Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg210 215 220Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln245 250 255Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser260 265 270Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr275 280 285Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly290 295 300Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys305 310 315 320Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu325 330 335Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala340 345 350Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr355 360 365Pro Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly370 375 380Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro385 390 395 400Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg405 410 415
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly420 425 430Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly435 440 445Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe450 455 460Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln465 470 475 480Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln485 490 495Ile Thr<210>21<211>360<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明5-10VH″<400>21gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtaa ggcctgggac ttcagtgaag60
atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag120aggcctggac atggacttga gtggattgga gatattttcc ctggaagtgg taatatccac180tacaatgaga agttcaaggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcttc gagcacagcc240tatatgcagc tcagtagcct gacatttgag gactctgctg tctatttctg tgcaagactg300aggaactggg acgagcctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc360<210>22<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明5-10VH″<400>22Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn20 25 30Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>23<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明5-10VL″<400>23gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc120tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg180gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc240atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat300ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaa 339
<210>24<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明5-10VL″<400>24Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110
Lys<210>25<211>360<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明3-1VH″<400>25gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtga aacctggggc ctcagtgaag 60atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag120aggcctggac atggacttga gtggattgga gatcttttcc ctggaagtgg taatactcac180tacaatgaga ggttcagggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcctc gagcacagcc240tttatgcagc tcagtagcct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgcaagattg300aggaactggg acgaggctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc360<210>26<211>120<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明3-1VH″<400>26Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn20 25 30Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Asp Leu Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg50 55 60Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>27<211>321
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明3-1VL″<400>27gagctcgtca tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct120gggaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca180aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct240gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat atccgtacac gttcggaggg300gggaccaagc ttgagatcaa a 321<210>28<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明3-1VL″<400>28Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>29<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明4-7VH″<400>29gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggcga ggcctggggc ttcagtgaag60
ctgtcctgca aggcttctgg ctacaccttc acaaactatg gtttaagctg ggtgaagcag120aggcctggac aggtccttga gtggattgga gaggtttatc ctagaattgg taatgcttac180tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcg240tccatggagc tccgcagcct gacctctgag gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg300ggatcctacg atactaacta cgactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc360accgtctcct cc372<210>30<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明4-7VH″<400>30Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn20 25 30Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>31<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明4-7VL″<400>31gagctcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc60atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagcttgag atcaaa 336<210>32<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明4-7VL″<400>32Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>33<211>1470<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明抗EpCAM(3-1)×人抗CD3″<400>33gagctcgtca tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact60attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct 120gggaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat atccgtacac gttcggaggg 300gggaccaagc ttgagatcaa aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt 360ggttctgagg tgcagctgct cgagcagtct ggagctgagc tggtgaaacc tggggcctca 420gtgaagatat cctgcaaggc ttctggatac gccttcacta actactggct aggttgggta 480aagcagaggc ctggacatgg acttgagtgg attggagatc ttttccctgg aagtggtaat 540actcactaca atgagaggtt caggggcaaa gccacactga ctgcagacaa atcctcgagc 600acagccttta tgcagctcag tagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta tttctgtgca 660agattgagga actgggacga ggctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctccggag gtggtggatc ccaggtgcag ctggtgcagt ctgggggagg cgtggtccag 780cctgggaggt ccctgagact ctcctgtaag tcttctggat acaccttcac taggtatacg 840atgcactggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt ggattggata cataaatcct 900agccgtggtt atactaatta taatcagaag gtgaaggacc gattcaccat ctccagagac 960aactccaaga acacggcctt tctgcaaatg gacagcctga gacccgagga cacgggtgtg 1020tatttctgtg cgagatatta tgatgatcat tactgccttg actattgggg ccagggcacc 1080ccggtcaccg tctcctcagt cgaaggtgga agtggaggtt ctggtggaag tggaggttca 1140ggtggagtgg acgacatcca gatgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga 1200gacagagtca ccatcacttg cagagcaagt tcaagcgtaa gctacatgaa ttggtatcag 1260cagacaccag ggaaagcccc taagagatgg atctatgaca catccaaagt ggcttctggg 1320gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt acactttcac catcagcagt 1380ctgcaacctg aagatattgc aacttactac tgtcaacagt ggagtagtaa ccctctcact 1440tttggccagg ggaccaagct gcagatcacc 1470<210>34<211>490<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明抗EpCAM(3-1)×人抗CD3″<400>34
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser100 105 110Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu115 120 125Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser130 135 140Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val145 150 155 160Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Leu Phe Pro165 170 175
Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg Phe Arg Gly Lys Ala Thr180 185 190Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser195 200 205Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn210 215 220Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val225 230 235 240Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly245 250 255Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser260 265 270Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro275 280 285Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr290 295 300Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp305 310 315 320Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu325 330 335Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys340 345 350
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Val Glu355 360 365Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp370 375 380Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly385 390 395 400Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met405 410 415Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr420 425 430Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser435 440 445Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu450 455 460Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr465 470 475 480Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr485 490<210>35<211>1488<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明抗EpCAM(5-10)×人抗CD3″<400>35gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc120tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg180gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc240atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat300ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc360ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg420gtaaggcctg ggacttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaac480tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct ggacatggac ttgagtggat tggagatatt540ttccctggaa gtggtaatat ccactacaat gagaagttca agggcaaagc cacactgact600gcagacaaat cttcgagcac agcctatatg cagctcagta gcctgacatt tgaggactct660gctgtctatt tctgtgcaag actgaggaac tgggacgagc ctatggacta ctggggccaa720gggaccacgg tcaccgtctc ctccggaggt ggtggctccc aggtgcagct ggtgcagtct780gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtaagtc ttctggatac840accttcacta ggtatacgat gcactgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg900attggataca taaatcctag ccgtggttat actaattata atcagaaggt gaaggaccga960ttcaccatct ccagagacaa ctccaagaac acggcctttc tgcaaatgga cagcctgaga 1020cccgaggaca cgggtgtgta tttctgtgcg agatattatg atgatcatta ctgccttgac 1080
tattggggcc agggcacccc ggtcaccgtc tcctcagtcg aaggtggaag tggaggttct 1140ggtggaagtg gaggttcagg tggagtggac gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 1200ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca gagcaagttc aagcgtaagc 1260tacatgaatt ggtatcagca gacaccaggg aaagccccta agagatggat ctatgacaca 1320tccaaagtgg cttctggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagattac 1380actttcacca tcagcagtct gcaacctgaa gatattgcaa cttactactg tcaacagtgg 1440agtagtaacc ctctcacttt tggccagggg accaagctgc agatcacc 1488<210>36<211>496<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>来源<223>/note＝″人工序列说明抗EpCAM(5-10)×人抗CD3″<400>36Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr AsD Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly130 135 140Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn145 150 155 160Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp165 170 175Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys180 185 190Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala195 200 205Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe210 215 220
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln225 230 235 240Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln245 250 255Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg260 265 270Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His275 280 285Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile290 295 300Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg305 310 315 320Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met325 330 335Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr340 345 350Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val355 360 365Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly370 375 380Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser385 390 395 400
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser405 410 415Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala420 425 430Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro435 440 445Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile450 455 460Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp465 470 475 480Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr485 490 49权利要求
1.双特异性结合分子，其中所述分子包含至少两个结构域或由之组成(a)其中所述至少两个结构域之一与人CD3复合物特异结合/相互作用，其中所述结构域含有来自抗体的轻链氨基酸序列，其中所述氨基酸序列为(i)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(ii)对应于SEQ ID NO1的核酸序列编码的氨基酸序列；(iii)与如(ii)定义的核酸序列互补链在严格条件下杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和(v)由于遗传密码简并性而与(ii)和(iii)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列；条件是(i)到(iv)的氨基酸序列在轻链CDR区根据Kabat系统的位置L24、L54和L96上含有氨基酸替换，和(b)其中另一结构域是或包含至少一个其他抗原相互作用位点和/或至少一个其他效应物结构域。
2.根据权利要求1的双特异性结合分子，其中与人CD3复合物结合/相互作用的结构域表征为在位置L24有丝氨酸，位置L54有缬氨酸和位置L96有亮氨酸。
3.根据权利要求1或2的双特异性结合分子，其中所述轻链的CDR区包含SEQ ID NO4、6或8的氨基酸序列或SEQ ID NO3、5或7的核酸序列编码的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1到3任一项的双特异性结合分子，其中与人CD3复合物结合/相互作用的结构域为scFv。
5.根据权利要求1到4任一项的双特异性结合分子，其中与人CD3复合物结合/相互作用的结构域含有SEQ ID NO10的氨基酸序列或SEQ IDNO9的核酸序列编码的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1到5任一项的双特异性结合分子，其中与人CD3复合物结合/相互作用的结构域含有如SEQ ID NO14所述的或由SEQ IDNO13的核酸序列编码的氨基酸序列或由之组成。
7.根据权利要求1到6任一项的双特异性结合分子，其中所述另一结构域为至少一个特异于一个或多个细胞表面分子的其他抗原相互作用位点。
8.根据权利要求7的双特异性结合分子，其中所述一个或多个细胞表面分子为肿瘤特异的分子。
9.根据权利要求7或8的双特异性结合分子，其中所述另一结构域为另一scFv。
10.根据权利要求7到9任一项的双特异性结合分子，其中所述另一结构域与选自下述的抗原特异结合/相互作用EpCAM、CCR5、CD19、HER-2、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(黏蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、bhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、多聚SA、GD2、Carboanhydrase IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、Ly-6桥粒芯糖蛋白4、E-钙黏着蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和Muellerian抑制物质(MIS)II型受体、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、L6、SAS、CD63、TF抗原、Cora抗原、CD7、CD22、Igα、Igβ、gp100、MT-MMPs、F19抗原和CO-29。
11.根据权利要求10的双特异性结合分子，其中所述另一结构域包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO16或18的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO15或17的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码简并性与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
12.根据权利要求11的双特异性结合分子，其中所述分子包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO20的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO21的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码简并性与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
13.根据权利要求10的双特异性结合分子，其中所述另一结构域包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO22、24、26、28、30或32的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO21、23、25、27、29或31的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码简并性与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
14.根据权利要求13的双特异性结合分子，其中所述分子包含选自以下的氨基酸序列或由之组成(a)对应SEQ ID NO34或36的氨基酸序列；(b)由对应SEQ ID NO33或35的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)定义的核酸序列在严格杂交条件下杂交的核酸序列编码的氨基酸序列；和(d)由因为遗传密码简并性与(b)和(c)任一的核苷酸序列简并的核酸序列编码的氨基酸序列。
15.根据权利要求7到11或13任一项的双特异性结合分子，其中所述至少一个其他抗原相互作用位点被人源化。
16.核酸序列，其编码根据权利要求1到15任一项的双特异性结合分子。
17.权利要求16的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列(a)编码蛋白质成熟形式的核苷酸序列，其中包含选自SEQ ID NO20、34或36的氨基酸序列；(b)包含或由选自SEQ ID NO19、33、35的DNA序列组成的核苷酸序列；(c)与(b)定义的核苷酸序列互补链在严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；(d)编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质通过替换、缺失和/或添加由(a)或(b)核苷酸序列编码的氨基酸序列的一个或多个氨基酸而衍生自由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白质；(e)编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与(a)或(b)核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％同一性的氨基酸序列；(f)由于遗传密码子简并性而与(a)到(e)任一核苷酸序列简并的核苷酸序列。
18.含有根据权利要求16或17的核酸序列的载体。
19.权利要求18的载体，其还包含核酸序列，所述核酸序列为与所述根据权利要求16或17的核酸序列有效连接的调节序列。
20.权利要求18或19的载体，其中载体为表达载体。
21.用根据权利要求18到20任一项的载体载体转化或转染的宿主。
22.用于产生根据权利要求1到15任一项的双特异性结合分子的方法，所述方法包括在允许表达双特异性结合分子的条件下培养权利要求21的宿主和从培养物回收产生的双特异性结合分子。
23.组合物，所述组合物含有根据权利要求1到15任一项的或由权利要求22的方法产生的双特异性结合分子、权利要求16或17的核酸分子、权利要求18到20任一项的载体或权利要求21的宿主和任选的能够提供免疫效应物细胞激活信号的蛋白质化合物。
24.权利要求23的组合物，其为还含有合适载体、稳定剂和/或赋形剂制剂的药物组合物。
25.权利要求23的组合物，其是诊断组合物，所述诊断组合物还包括用于检测增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的手段和方法。
26.根据权利要求1到15任一项的或由权利要求22的方法产生的双特异性结合分子、权利要求16或17的核酸分子、权利要求18到20任一项的载体或权利要求21的宿主用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防、治疗或改善增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。
27.用于在需要预防、治疗或改善下述疾病的受试者中预防、治疗或改善增生疾病、肿瘤疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，所述方法包括施用有效数量的根据权利要求1到15任一项的或由权利要求22的方法产生的双特异性结合分子、权利要求16或17的核酸分子、权利要求18到20任一项的载体或权利要求21的宿主的步骤。
28.权利要求27的方法，其中所述受试者为人。
29.权利要求27或28的方法，其还包括施用能够提供免疫效应物细胞激活信号的蛋白质化合物。
30.权利要求29的方法，其中所述蛋白质化合物与根据权利要求1到15任一项的或由权利要求22的方法产生的双特异性结合分子、权利要求16或17的核酸分子、权利要求18到20任一项的载体或权利要求21的宿主同时或非同时施用。
31.包含根据权利要求1到15任一项的或由权利要求22的方法产生的双特异性结合分子、权利要求16或17的核酸分子、权利要求18到20任一项的载体或权利要求21的宿主的试剂盒。
全文摘要
本发明提供双特异性的结合分子，其中所述分子包含至少两个结构域或由之组成，其中所述至少两个结构域之一与人CD3复合物结合/相互作用且所述结构域包含来自抗体的轻链氨基酸序列，其中所述氨基酸序列为含有特异氨基酸替换的具体鉴定的氨基酸序列，且另一结构域是或者包含至少另一抗原相互作用位点和/或至少另一效应物结构域。本发明还提供编码本发明双特异性结合分子的核酸分子，含有所述核酸分子的载体和用所述载体转化的宿主细胞。另外，本发明涉及产生本发明双特异性结合分子的方法和含有本发明双特异性结合分子、本发明核酸分子或本发明宿主细胞的组合物。
文档编号A61P37/00GK1950399SQ200580008594
公开日2007年4月18日 申请日期2005年2月16日 优先权日2004年2月16日
发明者P·库弗, U·伦凯里-许茨, R·卢特比泽, B·科赫莱森 申请人:麦克罗梅特股份公司