专利名称：特异地结合链球菌表面抗原Ⅰ/Ⅱ的双价抗体及其使用方法
特异地结合链球菌表面抗原I /II的双价抗体及其使用方法
背景技术：
龋齿是人类最普遍的传染病。主要的病原体是一组链球菌，总称
为变异链球菌(Balakrishnan等。(2000) 8月。Dent. J. 45: 235-45)。
变异链球菌己被鉴定为这种疾病的主要病原体。与许多其他疾病不同， 龋齿在西方发达国家如同在发展中国家一样流行，因此受到内科和牙 科权威部门以及药物公司的广泛关注。感染开始的第一步是细菌粘附 到合适的受体； 一个理想的介入位点。变异链球菌的两组蛋白质代表 了人龋齿疫苗主要的候选蛋白合成粘性聚糖并使微生物聚集的葡萄 糖基转移酶；以及介导对分泌唾液粘膜粘附的细胞表面纤维蛋白 (Hajishengallis禾口 Michalak( 1999)Oral Microbiol. Immunol. 14: 1-20)。 细菌的粘附素SAI/II是分子量为190kDa的表面显示蛋白质(Russell, 等。(1978) Arch. Oral Biol. 23: 7-15)，在变异链球菌与牙齿表面 的最初粘附中起重要作用。
特异性识别变异链球菌的SAI/II蛋白和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus) (Smith和Lehner ( 1989)，如上所述)的鼠单克隆抗体 Guy's 13 (Smith禾口 Lehner ( 1989) Oral Microbiol. Immunol.4: 153-8) 己经被成功地用于预防非人类灵长类动物体内变异链球菌的定殖和龋 齿的发展(Lehner，等(1985) Infect. Immun. 50: 796-9)。在人类临 床试验中抗体也能阻止细菌的定殖(Ma,等。(1990) Infect. Immun. 58: 3407-14; Ma，等。(1989) Clin. Exp. Immunol. 77: 331-7)。然 而，像其他的鼠抗体一样，临床应用中主要的限制可能是人抗鼠抗体 反应(HAMA)，这能够增加清除率并引发过敏性反应(Saleh，等。 (1999) Cancer Immunol. Imm腦ther， 32: 185-90)。鼠抗体相关的 问题可以通过用他们的人对应物替换鼠的序列而被克服，例如通过嵌 合化(Mountain禾口 Adair(1992)Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142)，CDR移植(Kettleborough，等。(1991) Protein Eng 4: 773-83)以及 应用噬菌体显示技术所指导的选择(Beiboer，等。(2000) J. Mol. Biol， 296: 833-49)替换。此外，使用抗体片段而不是整个抗体也可以除去 那些可能引起免疫反应的恒定区。
其中的抗SAI/II抗体和片段已公开在美国专利5,518,721; 5,612,031;以及5，854，402和WO 88/06455中。这些公开物教导人们应 用牙膏，嗽口水，口香糖，锭剂或凝胶的形式的抗SAI/II抗体组合物 抗击龋齿。
然而，尽管事实上教导了使用抗SAi/n的抗体抗击龋齿的几种可 能的治疗，但是尚未确认克服了与传统抗体相关的问题而且能够有效
用于治疗龋齿的基因工程化人双价抗体(diabodies)的生产和出现。
发明概述
本发明提供一种分离的双价抗体(双价抗体)，它可以特异性结合链 球菌表面抗原I/II (SAI/II)，其中双价抗体由人重链可变区和人轻链 可变区组成。在一个实施方案中，重链可变区有SEQIDNO: 3， SEQ ID NO: 5，或SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在另一实施方案中，轻 链可变区有SEQIDNO: 4， SEQ ID NO: 6，或SEQ ID NO: 8的氨基 酸序列。在特殊的实施方案中，双价抗体含有位于重链可变区和轻链 可变区之间的短衔接序列而且是SEQIDNO: 9所代表的序列。
含有编码能够特异性结合链球菌SAI/II的双价抗体核酸序列的载 体和含有而且能够表达其的宿主细胞是本发明进一步的实施方案。
本发明的另一实施方案是预防或治疗与链球菌相关的口腔疾病的 方法。该方法包括施用有效量的能特异性结合链球菌SAI/II的双价抗 体从而使口腔疾病的至少一种体征或症状得以预防或治疗。本发明还提供了含有能特异性结合链球菌SAI/II的双价抗体的组 合物和试剂盒。
图1显示了单克隆抗体Guyl3抑制嵌合scFv (mGuyl3VH/huVL; Al， A6， A9， B4， C6和G4)与SAI/II的结合。 图2显示了人scFv抗体片段的氨基酸序列。
图3显示了结合SAI/II和变异链球菌的人scFv(B10，D12和H6)。 图4显示了结合SAI/II和变异链球菌的人双价抗体(BIO， D12， 和H6)。
发明详述
识别口腔病原体变异链球菌的抗体提供了控制和预防龋齿的新方
法。特异性结合变异链球菌的sai/ii表面粘附素的单克隆抗体已被分
离(Saleh，等，(1990)如上所述)而且在植物中表达为分泌型的IgA (slgA) (Ma，等，(1998) Nat. Med。 4: 601-6)。在临床试验的 第二阶段，这种重组抗体已经显示出在最初的细菌根除之后被涂抹在 牙齿和齿龈上时可以阻止变异链球菌在口腔内重新定殖。slgA是抑制 变异链球菌在牙齿表面定殖的抗体的局部施用的合适形式，因为slgA 是唾液中所发现的天然抗体的主要形式。然而，每个sIgA都含有4种 不同类型的十肽链，这使得在传统的生产体系中难以大规模生产。
作为替代，应用基于人抗体可变基因噬菌体显示文库的链移动 (shuffle)法鼠Guy's 13抗体的人双价抗体衍生物已被生产。人抗体片 段在细菌中被表达为scFv和双价抗体衍生物并在体外被用于聚集变异 链球菌。双价抗体能聚集细菌因此可用作治疗或预防龋齿的治疗剂。
本发明的双价抗体衍生物比本领域已知的抗体和抗体片段更有 用，因为它们容易大量表达，能容易地穿透组织而且缺少促进通常不 需要的和常常多余的效应物功能的恒定区。此外，因为本发明的双价抗体不是鼠源性的，在人宿主中不会引发免疫反应，而这种免疫反应 能导致快速的清除而且在长期治疗过程中疗效较差。因为龋齿趋于慢 性而非急性，就长期而言鼠抗体对病人的益处较少。虽然针对SAI/II
的scFvs已被生产(Ma，等，(1990)如上所述)，而与理想的slgA 形式相比scFvs有两个缺陷，即单价性和不稳定性。ScFvs是单价体， 因为重链和轻链通过一挠性的肽衔接物连接，所述衔接物可以使两个 区折叠而且彼此相互作用。通过使用双价抗体，连接肽被縮短从而迫 使重链和轻链可变区相互作用形成二聚体，使用scFvs的缺陷得以克 服。此外，作为这种相互作用的结果，双价抗体与亲本免疫球蛋白一 样是双价体，因此也增加了结合的亲和力。
例如，利用两轮连续的可变区移动和噬菌体文库选择构建基于鼠 单克隆抗体Guy's 13为的人scFv抗体片段。首先，通过扩增鼠Guy's 13 的重链可变区，并将其插入人轻链可变区噬菌体显示文库来产生嵌合 的scFv。所得的噬菌体显示文库的组成为5X1()s。在纯化、固定的SAI/II 抗原上选择具有适当结合活性的单链Fv抗体片段。进行三轮选择，然 后通过ELISA法鉴定独特的候选抗体。随后的测序得到5个抗体片段 (chimscFvAl， chimscFvA6， chimscFvA9， chimscFvB4禾口 chimscFvG4)。 人可变基因的测序显示两个克隆chimscFvA6和chimscFvB4属于V k 1家族而克隆chimscFvA6与HK137同源，克隆chimscFvB4与L12 种系基因家族同源。ChimscFvA9属于V k 4 DP k 24家族。ChimscFvAl 和chimscFvG4属于V入3 DPL16家族。抑制ELISA法显示所有6个嵌 合scFvs与SAI/II的结合能被Guy's 13鼠单克隆抗体抑制。嵌合scFvs A6， A9， B4和C6的结合被抑制大约80%，提示表位识别仍然存在(图 1)。嵌合scFvs Al和G4的结合仅仅被抑制约30%，提示这些抗体识 别不同的表位。
所选择的人Vl基因被引入人Vh文庠(组成为8X108)而且组成 为1乂106的组合文库得以建立。使用偶联至顺磁性珠子的SAI/II抗原 在溶液中进行3轮选择。通过ELISA法鉴定11个人scFvs。随后的序列分析鉴定出3个人scFvs:huscFv B10克隆，huscFv D12克隆和huscFv H6克隆。图2显示人scFv抗体片段的氨基酸序列。嵌合scFv A6 (V k1 HK137)中的人VL区被选择，与两个不同的人可变重链结合分别 产生人scFvsB10和H6。人scFvB10 (SEQIDNO: 3)的Vh区与Vh1 家族的DP10同源，而人scFvH6 (SEQIDNO: 7)的Vh区与Vh3家 族的DP35同源。在嵌合scFvB4 (Vk 1 L12) (SEQIDNO: 6)选择 人Vl区，与一个人可变重链结合产生人scFvD12。人scFvD12的Vh 区(SEQ ID NO: 5)与VH5家族的DP73同源。图3显示了 3个人scFvs 与SAI/II抗原和病原菌变异链球菌的结合。抑制ELISA限制所有的3 个人scFvs与SAI/II的结合能被Guy's 13抑制，提示表位的识别仍然存 在。
重组体抗体片段可工程化组装成具有高结合亲和力和特异性的稳 定的多聚寡聚体(Kortt，等，(2001) Biomol. Eng. 18: 95-108)。被 3-12个残基的衔接物连接的scFv分子不能折叠成功能性Fv区而且相 反与第二个scFv分子结合形成二价的二聚体(双价抗体，分子量约为 60kDa)。对于细胞表面抗原的交联，至少需要两个结合部分。双价抗 体是能够满足这一需要的最小的二价抗体分子。通过PCR扩增来自人 scFvs BIO， D12和H6和鼠scFv Guy's 13的可变重链和轻链基因，而 且在连续两个步骤中将扩增子插入含有10个氨基酸残基衔接物的载体 pHenIXdia中，构建人双价抗体(表2)。克隆的完整性通过测序被证 实而且结合活性通过使用SAI/II抗原和变异链球菌细胞的ELISA法证 明(图4)。因为F (ab') 2衍生物而非单价体Fab片段对龋齿有保护 作用，所以鼠Guy's 13的二价结合对于保护是必须的(Ma，等。(1990) 如上所述)。当变异链球菌在鼠双价抗体Guy's 13和人双价抗体D12 存在的条件下生长时，变异链球菌以剂量依赖方式聚集，然而，在相 似的浓度下人，双价抗体比Guy's 13有显著的优越性。因此，在产生 结合链球菌SAI/II的人双价抗体中结合亲和力好象没有显著的损失。
因此，本发明涉及含有单克隆抗体Guy's 13的人可变区的双价抗体，其中所述的双价抗体特异性结合链球菌SAI/II而且促进链球菌细 胞的聚集。结合链球菌SAI/II的双价抗体是基因工程抗体，它可以与
SAI/II物理性相互作用，特别是与来自变异链球菌和远缘链球菌的 SAI/II相互作用，阻断SAI/II的粘附作用从而预防链球菌对宿主的定 殖。因为本发明的双价抗体源自于Guy's 13的可变区，所以可以设想 所述的双价抗体可用于预防变异链球菌和远缘链球菌的定殖。
正如此处使用的，术语双价抗体是指基因工程化抗体构建物，所 述构建物是通过分离结合抗体的结合区(重链和轻链)，而且在相同 的多肽链上供给连接或可操作连接重链和轻链的连接部分，从而保护 结合功能进行制备，如Holliger等(1993)在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444中的详细描述，而且由Poljak(1994)在Structure 2: 1121-1123 中进行了论述。实际上，这形成了为结合抗原所必需具备的唯一可变 区的完全简化的抗体。通过使用太短而不能在相同链的两个区之间进 行配对的衔接物，这些区域被迫与另一链的互补区进行配对而且产生 两个抗原结合位点。这些二聚物抗体片段，或者双价抗体是二价体而 且有双特异性。显而易见，可以使用此处引用作为参考的例如Holliger 等(1993)描述的，Poljak (1994)论述的，Zhu等(1996) Biotechnology 14: 192-196，以及美国专利6,492,123的任一产生双价抗体的方法。一 旦产生，结合特异性可以通过例如平衡法(例如酶联免疫吸附试验 (ELISA)或者放射性免疫分析法(RIA))，或者动力学(例如 BIACORETM分析法)进行确定。或者，双价抗体可被用于其他的生物 活性分析，例如细菌聚集或定殖分析，以便评价其效力或药理学活性 以及作为治疗剂的潜在效能。所述的分析被公开在此处而且是本领域 公知的。
含有人可变区的双价抗体的产生进一步描述在在本申请的实施例中。
显而易见，此处描述的双价抗体并不局限于识别与单克隆抗体Guy's 13相同的表位，而是也可能包含其他抗SAI/II抗体的可变区，诸 如在美国专利5,518,721; 5,612,031禾卩5,854,402以及WO 88/06455中 描述的抗SAI/II抗体。
虽然本发明的双价抗体特异性结合SAI/II,本领域技术人员可以 认识到双价抗体也含有不同特异性的两个scFv's。例如，本发明的双价 抗体可以同时一方面结合SAI/n，另一方面靶向另一个分子，诸如粘性 聚糖或者任一其他分子。
在本发明的一个实施方案中，结合SAI/II的双价抗体是含有SEQ ID NO: 5的人重链可变区和SEQ ID NO: 6的轻链可变区的命名为D12 的双价抗体(图2)。在另一个实施方案中，结合SAI/II的双价抗体是 含有SEQ ID NO: 3的人重链可变区和SEQ ID NO: 4的轻链可变区的 命名为B10的双价抗体。在另外的实施方案中，结合SAI/II的双价抗 体是含有SEQIDNO: 7的人重链可变区和SEQIDNO: 8的轻链可变 区的命名为H6的双价抗体。
在特殊的实施方案中，本发明的双价抗体的重链和轻链可变区被 衔接物序列连接或可操作地连接。衔接物可以是短肽，具有的氨基酸 太少以至于不能使链上的VL区与那条链的Vh区結合。氨基酸可能少 于10个，例如5， 4， 3， 2或1个氨基酸。在某些情况下9， 8， 7，或 6个氨基酸可能是合适的。有时候，可能是"-l"，即Vh和Vl区被直 接连接在一起而他们其中之一丢失了一个氨基酸。在某些情况下，一 或两个区丢失的氨基酸多于一个可能是适宜的。用于本发明的双价抗 体合适的衔接物包括，但不局限于，Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ala-Leu (SEQIDNO: 9) ; Ser-Val-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-His (SEQ ID NO: 10) ; Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 11);以及公开在美 国专利6，492，123中的衔接物。
本发明也包括含有编码本发明双价抗体的核酸序列的载体和宿主细胞。
对于双价抗体的重组体生产而言，编码双价抗体的核酸序列被分 离而且被插入可复制的载体中用于更进一步的克隆(DNA的扩增)或 表达。编码本发明双价抗体的核酸序列容易被分离而且使用传统方法
很容易进行序列测定(例如使用此处公开的能够特异性结合编码SAi/n
双价抗体重链和轻链基因的寡聚核苷酸探针)。可以获得许多载体。
载体组分通常包括，但不局限于， 一个或多个下列成分信号序列， 复制起点， 一个或多个标记基因，增强子元件，启动子以及转录终止 序列。
本发明的双价抗体不仅能够被直接重组生产，而且可作为具有异 源多肽的融合多肽，异源多肽是信号序列或者是在成熟蛋白或多肽的
N-末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列通常
是能够被宿主细胞识别而且加工(即被信号肽酶剪切)的序列。对于 原核宿主细胞而言，信号序列能够包括例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp， 或者热稳定性的肠毒素II前导物。对于酵母分泌而言，前导序列来自
酵母转化酶，a因子(包括酵母属和克鲁维酵母a因子前导物)，或 酸性磷酸酶，白色念珠菌(C. albicans)葡糖淀粉酶前导物或者在WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞的表达中，哺乳动物信号序 列以及病毒分泌的前导物，例如单纯疱疹gD信号是可以使用的。所述 前体氨基酸序列的核酸序列在阅读框架过程中被连接到编码双价抗体 的核酸序列上。
表达和克隆的载体含有能够使载体在一或多种选择的宿主细胞中 进行复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这个序列是能够使载体 独立复制宿主染色体DNA，而且包括复制起点或者自主复制序列的序 列。这种序列对各种细菌，酵母菌和病毒而是公知的。质粒pBR322的 复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，2U质粒起点适于酵母菌，而且 多种病毒复制起点(SV40，多形瘤，腺病毒，VSV或者BPV)可用于哺乳动物细胞的克隆载体。通常，对哺乳动物表达载体来说，复制组 分的起点是不需要的(通常可能仅仅使用SV40复制起点，因为它含有 早期启动子)。
表达和克隆载体也可以含有选择基因，也被称作选择标记。典型 的选择基因编码蛋白质，所述蛋白质对抗生素或其他毒素提供抗性， 例如氨苄青霉素，新霉素，氨甲喋呤或者四环素；补充营养缺陷；或 者供给不能从复合培养基中获得的关键营养素，例如编码杆菌右旋丙 氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基 因成功转化的那些细胞产生赋予了药物抗性的蛋白质而且因此经历了 选择体系之后幸存下来。这种优势选择的例子使用的药物是新霉素， 霉酚酸和潮霉素。
哺乳动物细胞合适的选择标记的另一个例子是能够鉴定有能力吸 收诸如DHFR，胸腺嘧啶核苷激酶，金属硫蛋白I和II，腺苷脱氨酶， 鸟氨酸脱羧酶等的双价抗体核酸序列的细胞。
例如，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂氨甲喋呤(Mtx)的培 养基中培养所有的转化细胞，首先鉴定出用DHFR选择基因转化的细 胞。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，用编码双价抗体，野生型DHFR蛋白质，和诸如氨基糖苷 3'-磷酸转移酶(APH)的另一选择标记的核酸序列转化的或共转化的 宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)通过在含有诸如 氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素，新霉素，或G418的选择性试剂作 为选择性标记的培养基中生长细胞进行选择。参见美国专利4,965,199。用于酵母菌的一个合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7 (Stinchcomb，等(1979) Nature 282: 39)中的trpl基因。trpl基因 为在色氨酸中无法生长的酵母菌突变株提供选择标记，例如ATCC 44076或PEP4-1 (Jones (1977) Genetics 85: 12)。然后，酵母菌宿 主细胞基因组中存在trpl损伤的存在提供了一个在缺乏色氨酸的情况 下通过生长来检测转化的有效环境。同样地，Leu2缺陷的酵母菌株 (ATCC 20,622或38,626)通过已知含有Leu2基因的质粒得以补偿。
此外，源自1.6um环状质粒pKDl的载体可用于克鲁维酵母的转 化。或者，为大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统已被报道为乳酸 克鲁维酵母(K. lactis) (VandenBerg(1990)Bio/Technology 8: 135)。 已经公开了用于由克鲁维酵母工业菌株分泌成熟重组体人血清白蛋白 的稳定的多拷贝表达载体(参见例如Fleer，等(1991) Bio/Technology 9: 968-975)。
表达和克隆载体通常含有能被宿主生物体识别而且被可操作地连 接到双价抗体核酸序列上的启动子。适合用于原核宿主的启动子包括 phoA启动子，P-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp) 启动子系统，以及诸如tac启动子的杂合启动子。然而，其他已知的细 菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有可操作地连接 于编码双价抗体的DNA的Shine-Dalgarno序列。
启动子序列以用于真核生物而闻名。用于酵母菌宿主的合适的启 动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖酵解酶，诸如烯醇酶， 甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡 萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异 构酶，磷酸葡糖异构酶，和葡萄糖激酶。
其他的酵母菌启动子是诱导型启动子，对被生长条件控制的转录 有额外的优点，这些启动子是乙醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以 及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母菌表达的合
适的载体和启动子在EP 73,657中被更进一步地描述。酵母增强子也与 酵母菌启动子一起优选使用。
从哺乳动物宿主细胞中的载体转录抗体例如受到启动子的控制， 所述启动子获自诸如多形瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(诸如腺病毒2)， 牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病 毒以及最优选的猿猴病毒40 (SV40)的病毒基因组，获自例如肌动蛋 白启动子或免疫球蛋白启动子的异源哺乳动物启动子，获自热休克启 动子，条件是这种启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒早期和晚期启动子作为含有SV40病毒复制起点的 SV40的限制性片段可以很方便获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子 作为HindIII限制性片段可以方便获得。在哺乳动物宿主中将牛乳头瘤 病毒用作载体的DNA表达系统被公开在美国专利4，419，446中。对这 种系统的改进描述在美国专利4,601,978中。或者，rous肉瘤病毒长末 端重复序列可以用作启动子。
由较高等真核生物转录编码本发明的双价抗体的DNA通常可以 通过将增强子序列插入载体中得以增加。现在，来自哺乳动物基因(球 蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，a-胎蛋白以及胰岛素)的许多增强子序 列是己知的。然而，有代表性的是使用来自真核细胞病毒的增强子。 例子包括位于复制起点(100-270个bp)后侧的SV40增强子，巨细胞 病毒早期启动子增强子，位于复制起点后侧的多形瘤增强子，以及腺 病毒增强子。也参见Yaniv ( 1982) Nature 297: 17-18关于真核生物启 动子活化的增强元件。增强子可以在双价抗体编码序列的5'或3'处被剪 接进入载体，但是通常位于启动子的5'处。
被用于真核生物宿主细胞(酵母菌，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)的表达载体也将含有使转录
终止而且稳定mRNA的必需序列。这种序列通常可以获自真核生物或 病毒DNAs或cDNAs非翻译区的5'端以及偶而从3'端。这些区域含有 在编码抗体的mRNA的非翻译部分中被转录成聚腺苷酸化片段的核苷 酸片段。 一个有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见 WO94/11026以及其中公开的表达载体。
可以设想本发明的双价抗体可以从植物被表达和分离。在植物细 胞中，表达系统通常来源于重组体Ti和Ri质粒载体系统。在穿梭载体 的共整合体组中，通过遗传重组，目的基因被插入非原癌基因的Ti质 粒中，这种质粒包含在植物转化中需要的顺式作用和反式作用元件。 示范的载体包括pMLJl穿梭载体(DeBlock，等(1984) EMBO J. 3: 1681-1689)和非原癌基因的Ti质粒pGV2850 (Zambryski，等(1983) EMBOJ. 2: 2143-2150)。在二元系统中，目的基因被插入含有植物转 化所需要的顺式作用元件的穿梭载体中。其他所需的功能由非原癌基 因的Ti质粒反式提供。示范的载体包括pBIN19穿梭载体(Bevan( 1984) Nucl.Acids Res. 12: 8711-8721)和非原癌基因的Ti质粒pAL4404 (Hoekema，等(1983) Nature 303: 179-180)。
用于植物表达系统中的启动子一般来源于植物细胞的基因组(例 如热休克启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的 启动子)或来源于植物病毒(例如CaMV的35S RNA启动子；TMV 的外壳蛋白启动子)。
用于在此处载体中克隆或表达双价抗体核酸序列的合适的宿主细 胞是原核生物，酵母菌，或所述的高等真核生物细胞。为了这个目的， 合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例 如，肠杆菌科的埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)，肠杆菌属，欧文氏 菌属，克雷伯氏杆菌属，变形杆菌，沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)， 沙雷氏菌属(例如粘质沙雷氏菌)，以及志贺氏菌属，以及芽胞杆菌属，诸如枯草芽孢杆菌和地衣型芽孢杆菌(例如被公开在DD 266,710 中的地衣型芽孢杆菌41P)，假单胞菌，诸如P.铜绿假单胞菌，以及链 霉菌属。尽管诸如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776 (ATCC 31,537)和大 肠杆菌W3110 (ATCC 27,325)其他的菌株也是合适的，但示范的大肠 杆菌克隆宿主是大肠杆菌294 (ATCC 31,446)。这些例子是作例证的 而不是用于限制性目的。
除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母菌的真核微生物是双价抗 体编码载体合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母或者普通的面包酵母是 最常用的低等真核宿主微生物。然而，许多其他的属，种，和菌株通 常是可以获得而且可用在此处，诸如裂殖酵母属栗酒裂殖糖酵母；克 鲁维酵母宿主诸如乳克鲁维氏酵母，脆壁克鲁维氏酵母(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维氏酵母(ATCC 16,045)，威克曼氏克鲁维 氏酵母(ATCC 24,178) ， K. waltii (ATCC 56,500)，果蝇克鲁维氏酵 母(K. drosophilarum) (ATCC 36，906) ， K. thermotolerans，以及马 克斯克克鲁维氏酵母(K. marxianus) ; yarrowia (EP 402,226);巴斯 德毕赤氏酵母(Pichiapastoris) (EP 183,070);念珠菌属；Trichoderma reesia (EP 244,234);粗糙链孢霉；许旺氏酵母(Schwanniomyces) 诸如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalism);以及丝状真菌 诸如脉孢菌，青霉，Tolypocladium，以及曲霉宿主诸如构巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
在多细胞生物体中表达双价抗体的合适的宿主细胞包括无脊椎动 物细胞，诸如植物和昆虫细胞。许多杆状病毒株和变种以及来自诸如 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(蚊子)， 白纹伊蚊(蚊子)，黑腹果蝇(果蝇)，以及家蚕(Bombyxmori)宿 主的相应允许的昆虫宿主细胞已经被鉴定出来。用于转染的各种病毒 株是可以公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica) NPV 的L-l型变种和家蚕NPV的Bm-5株。棉花，谷类，马铃薯，大豆，矮牵牛花，番茄和香蕉，烟草等植 物以及植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，而且培养物(组织培养)中 的脊椎动物细胞的繁殖已变成例行程序。有用的哺乳动物宿主细胞系
的例子是被SV40转化的猴肾脏CV1系(COS-7, ATCC CRL 1651); 人胚肾系(悬液培养生长的293或293细胞亚克隆，Graham等(1977) J. GenVirol， 36: 59);幼仓鼠肾细胞(BHK， ATCC CCL 10);中 国仓鼠卵巢细胞Z-DHFR (CHO， Urlaub等(1980) Proc.Natl.Acad.Sci， 美国77: 4216);鼠足细胞(TM4， Mather (1980) Biol. Reprod， 23: 243-251);猴肾脏细胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲绿猴肾脏细胞 (VERO-76， ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA， ATCC CCL 2);犬肾脏细胞(MDCK， ATCC CCL 34);水牛鼠肝细胞(BRL3A， ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138， ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2， HB 8065);鼠乳腺肿瘤(MMT 060562， ATCC CCL51) ; TRI 细胞(Mather,等(1982) Annals NY Acad. Sci， 383: 44-68) ; MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤系(HepG2)。
为了双价抗体的生产，宿主细胞用上述的表达或克隆载体转化而 且为了诱导启动子，选择转化体，或者扩增编码目的序列的基因，宿 主细胞在适当修饰的传统培养基中培养。
被用于生产本发明的抗体变体的宿主细胞可以在多种培养基中培 养。可以市售获得的培养基，诸如Ham's F10 (Sigma， St丄ouis， MO), 极限必须培养基((MEM) ， Sigma) ， RPMI-1640 (Sigma)，以及 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ( (DMEM) ， Sigma)适于培养宿 主细胞。此外，在Ham，等(1979) Meth. Enz， 58: 44; Barnes,等
(1980) Anal. Biochem， 102: 255;美国专禾!j 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655;或者5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 或者美国专利RE 30,985中任一描述的培养基都可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长 因子(诸如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，
钙，镁以及磷酸盐)，缓冲液(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和 胸腺嘧啶)，抗生素(诸如庆大霉素)，微量元素(被下定义为无机 化合物，通常终浓度在微摩尔的范围内)，以及葡萄糖或相当的能源。 任何其他所需的补充物也可以本领域技术人员公知的适当的浓度包含 其中。诸如温度，pH值等的培养条件是先前挑选的用于表达的宿主 细胞所使用的条件，而且对专业人士来说是非常明了的。
当使用重组体技术时，双价抗体可以在细胞内，周质间隙内产生， 或者被直接分泌到培养基中。如果细胞内产生双价抗体作为第一步， 微粒碎片，或者是宿主细胞的或者是细胞溶解的片段被除去，例如通 过离心或超滤除去。Carter等(1992)在Bio/Technology 10: 163-167
中描述了一个可以把分泌到大肠杆菌周质间隙中的抗体分离出来的方 法。简而言之，在乙酸钠(pH3.5) ， EDTA，和苯甲基磺酰氟(PMSF) 存在的情况下大约30分钟解冻细胞糊。细胞碎片能够通过离心被除去。 双价抗体被分泌入培养基时，所述表达系统的上清液通常首先使用市 场上可买到的蛋白浓縮过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤 装置被浓縮。诸如PMSF的蛋白酶抑制剂可用于任何所述的步骤来抑 制蛋白水解而且抗生素可以用来阻止外来污染物的生长。
使用例如羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析或亲和色谱法，纯化 从细胞制备的双价抗体组合物。被亲和配体附着的基质最常见的是琼 脂糖，但是其他基质也是有效的。机械性稳定的基质，诸如可控孔度 玻璃或聚(苯乙烯丁二烯)苯与琼脂糖相比允许较快的流速和更短的 处理时间。蛋白提纯的其他技术，诸如离子交换柱上的分馏，乙醇沉 淀法，反向高压液相色谱，硅石上的色谱，阴离子或阳离子交换树脂
(诸如聚天门冬氨酸柱)上的肝素琼脂糖凝胶色谱，层析聚焦， SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也是有效的。此处公开的人双价抗体衍生物能够聚集变异链球菌，使其作为一 种有用的候选药物用于口腔疾病的被动免疫。因此，治疗组合物或双 价抗体剂型是本发明更进一步的实施方案。本发明的双价抗体可以通 过任一便利的方法被施用于哺乳动物口中的牙齿。多种方法可用于利 用多种用于不同目的的材料治疗牙齿。如果牙科医生来进行治疗，那 么通常的惯例是将双价抗体方便地涂抹在牙齿的表面。如果双价抗体 是患者自己使用，那么双价抗体可以包括在牙膏，嗽口水，口香糖， 锭剂或凝胶中并且在常规刷洗过程中应用，或者双价抗体可以被配制 和被包裹成单独的治疗剂而且在常规刷洗时间之前，之后和/或期间单 独施用。牙膏等自用方法可以导致可能每天的重复应用，而锭剂的使 用则能使双价抗体的应用更频繁。为此目的，口香糖和凝胶剂被认为 是在半小时或更长的时间内提供一定量的双价抗体的持续释放而且实 际上，如果需要双价抗体的持续释放，那么可以使用适当的制剂，可 以使剂型中的抗体根据口腔内的温度或唾液情况缓慢释放入口腔。在 某些情况下，人们希望提供抗体与牙表面更匀称的长期接触，而且在 这种情况下，可以使用适当的牙托或粘合带预定的时间来覆盖涂有双 价抗体组合物的牙齿而且阻止双价抗体被例如唾液除去。根据公知的 方法(Remington:药剂学的科学与实践，Alfonso R. Gennaro编辑，第 20版，Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA， 2000)，通 过将具有所需纯度水平的双价抗体与任选的生理上可接受的载体，赋 形剂或稳定剂混合，可以制备本发明用于治疗用药的双价抗体的制剂。 可接受的载体，赋形剂或稳定剂所使用的剂量和浓度对使用者来说是 无毒性的，而且包括缓冲液，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，及其他的有机 酸；抗氧化剂；防腐剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白 质，诸如血清白蛋白，明胶或其他的免疫球蛋白；亲水聚合物；氨基 酸；单糖，二糖，及包括葡萄糖，甘露糖或糊精的其他碳水化合物； 螯合剂诸如EDTA;糖；形成盐的反离子；金属复合物(例如锌蛋白复
合物)；禾n/或非离子型表面活性剂诸如TWEEN， PLURONICS或聚乙 二醇(PEG)。双价抗体组合物也可能含有超过一种的可操作性或者非可操作性 连接的活性化合物，根据需要用于被治疗的特定适应症，特别是那些 具有并不有害彼此影响的的互补活性的化合物。例如，可能希望进一 步提供抗生素，与本发明的双价抗体组合物结合或作为本发明双价抗 体组合物的一部分。这种分子以有效用于所需目的的量适当地组合存 在。
在本发明的另一实施方案中，此处公开的双价抗体可被可操作性
连接到一种治疗剂，例如葡萄糖氧化酶或防卫素(例如，参见Maisetta， 等(2003) Antimicrob. Agents Chemother。 47:3349-3351)。正如此处 所使用的，可操作性相连或可操作性连接是指双价抗体和治疗剂相连 或结合在一起。在双价抗体和治疗蛋白的情况下，它们可以通过翻译 邻近相同的mRNA序列被可操作性的连接。或者，双价抗体和治疗剂 可以通过诸如此处公开的衔接物被共价连接。此外，诸如抗生素的治 疗剂可以通过酰胺键被连接到本发明双价抗体的赖氨酸侧链氨基上。
本发明更进一步的实施方案是预防或治疗与诸如变异链球菌和远 缘链球菌的链球菌相关的口腔疾病的方法。该方法包括施用有效量的 本发明的双价抗体，通过改善或消除本领域技术人员确定的疾病的至 少一种体征或症状(细菌定殖)或其他的指标来抑制或逆转口腔疾病 实现改善。根据良好的医疗实践，考虑单个病人的临床情况，给药的 部位和方法，给药的方案，病人年龄，性别，体重，及执业医生知道 的其他因素，对双价抗体或双价抗体组合物给药和定量。
双价抗体的局部给药是最实用的给药方法。重要的是将双价抗体 引入与牙齿表面接触而且理想状态来讲，双价抗体应该被应用于牙齿 所有的光滑面和咬合面。
通常，双价抗体被应用的精确量好象并不是关键的，因为以这种 类型的方法，双价抗体的重复应用并不难而且实际上，特别是在牙科医生初步处理之后，维持治疗或者极化治疗可以由使用者进行，可以 使用任一所需的频率。作为指导，在任何施用双价抗体的情况下，10 到500微克顺序的双价抗体可被用于任一牙齿，但是的确可以施用超 过这个范围的双价抗体的用量，而不会对患者造成伤害。双价抗体的 用量不足仅仅意味着防护水平没有达到应有的水平，而过量使用双价 抗体并没有改善防护而且仅仅导致不必要的使用双价抗体。
双价抗体的确切制剂不是特别重要的问题，而完全是依赖于被采
用的用法和用户的方便。任何情况下，重要的事情是在合适的pH值和
不含可能引起蛋白质降解的其他有害材料的环境中配制双价抗体而且 剂型当然也应该不含在患者口内可能有害的微生物杂质。例如，为了
口腔外科的使用，双价抗体可被配制成每100微升液体中含有0.1到 10毫克双价抗体的单纯水分散体，而且所述浓度的液体可以每个牙齿 大约1到IO微升的比率施用于牙齿。当双价抗体被配制成患者自己用 药时，可以根据上述指导，即，在任何自己用药情况下通常采用的制 剂量以及双价抗体的过量给药不会有害的事实来选择浓度。
双价抗体也可用于在诊断分析，例如检测龋齿中表达SAI/II的链 球菌细胞的存在。
为了诊断应用，双价抗体通常用可检测的部分进行标记。许多标
记是可以获得的，通常被划分成下列类别放射性同位素，荧光标记，
或者不同的酶底物标记。
放射性同位素诸如358， 14C， 1251， 311以及1311。双价抗体可以用 放射性同位素，采用例如描述在Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2，Coligen等，Ed. Wiley-Interscience，New York, N.Y.，出版(1991)的技术进行标记，而且使用闪烁计数测量放射性。
荧光标记，诸如稀土螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，l-二甲胺基萘-5-磺酰，丽丝胺，藻红蛋白以及德
克萨斯红是可以获得的。采用例如上所述Current Protocols in Immunology中公开的技术，可以将荧光标记结合到双价抗体上。可以 利用荧光计对荧光进行定量。
不同的酶底物标记是可以获得的，而且美国专利4,275,149提供了 其中一些的综述。通常酶催化显色底物的化学变化，而显色底物可以 通过采用不同的技术测量。例如，酶可以催化底物使其变色，这种变 化可以通过分光光度计法测得。或者，酶能改变底物的荧光或者化学 发光。定量荧光改变的技术在上面已经描述过。化学发光的底物通过 化学反应被电子激发而且可能发出可测量(例如用化学冷光测量器) 光线，或者将能量传递给荧光受体。酶标记的例子包括萤光素酶(例 如荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素， 2,3-二氢二氮杂萘二酮，苹果酸脱氢酶，尿素酶，过氧化物酶诸如辣根 过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，e-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶， 溶菌酶，糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧 化物酶，微过氧化酶等等。将酶与抗体结合的技术描述在O'Sullivan 等，"制备用于酶免疫分析中的酶抗体结合物的方法"，Methods in Enzymology ( LLangone& H.Van Vunakis编辑)，Academic press, New York, 73: 147-166 ( 1981)。
有时，标记物与双价抗体间接结合。本领域技术人员知道完成这 种结合的各种技术。例如，双价抗体可与生物素结合而且任何上述的 三类标记物可以与抗生物素蛋白结合，或者反之亦然。生物素选择性 结合抗生物素蛋白，而且因此标记与双价抗体以这种间接的方式结合。 或者，为了完成标记物与双价抗体的间接结合，双价抗体与小的半抗 原结合(例如，地高辛)结合，而且上述不同类型标记物中的一种与 抗半抗原抗体的变体结合(例如抗地高辛抗体)。因此，可以实现标 记物与双价抗体的间接结合。双价抗体也可以直接融合到例如碱性磷酸酶上作为重组体蛋白质。
在本发明的另一实施方案中，双价抗体不需要被标记，而且它的 存在可以利用结合到双价抗体上的标记抗体进行检测。
本发明的双价抗体可被应用于任一已知的试验方法中，诸如竞争 性结合试验，直接和间接夹层试验，以及免疫沉淀试验。Zola， Monoclonal Antibodies: A Manual of Technique, pp. 147-158 (CRC Press, Inc， 1987)。
为方便起见，本发明的双价抗体可以提供在试剂盒中，即预定量 试剂的包装组合，带有为了进行诊断试验的说明书。双价抗体用酶标 记时，试剂盒将包括底物和酶必需的辅因子(例如能提供可检测出的 发色团或荧光团的底物前体)。此外，也可以包括其他的添加剂，诸 如稳定剂，缓冲液(例如封闭缓冲液或溶解缓冲液)等。各种试剂的 相对量可能变化很大以便在试剂的溶液中提供不同的浓度，这个浓度 使试验的敏感性得到显著的优化。尤其是，可以提供干粉形式(通常 为冻干粉)的试剂，包括赋形剂，当溶解时能提供具有合适浓度的试 剂溶液。
通过下列非限制的实施例，可以更详细地描述本发明。
实施例1:变异链球菌的增殖
变异链球菌20523的血清型c组购自DSMZ(Braunschweig，德国)， 而且使用之前在S2密封实验室里在胰胨豆胨酵母抽提物培养基中(30 g/L胰胨豆胨肉汤，3g/L酵母抽提物，pH值7.0-7.2) 37。C生长2天。
实施例2: spaP基因的克隆
编码SAI/II抗原的spaP基因的第214到3048核苷酸(Bleiweis， 等(1990) Arch. Oral Biol. 35 Suppl: 15S-23S)作为SfiI/Notl片段从PUC18被除去而且被插入细菌表达载体pCantab5E (Pharmacia, Freiburg,德国)和pSinl( Amersdorfer和Marks( 2000)Methods MoI.Biol。 145: 219-40)中，这些细菌表达载体已经被相同的酶消化。pCantab5E 载体含有编码E-tag的额外序列，E-tag能促进用单克隆抗体5E (Pharmacia)检测所表达的蛋白质。pSinl载体同样含有编码MYC-tag， 促进用鼠单克隆抗体9E10 (ATCCCRL 1729)检测的序列，以及允许 通过固定的金属-螯合物亲和色谱法(IMAC)纯化被表达的蛋白质以及 允许用鼠Penta-HIS抗体(Qiagen， Hilden，德国)检测的His6tag。用 pSinl表达的SAI/II被用于选择来自噬菌体-显示文库的抗体。pCantab5E 中表达的SAI/II被用于酶联免疫吸附试验(ELISAs)。
实施例3:用SAI/II涂覆顺磁性的珠子
为了选择噬菌体-显示的抗体，将250 y L用PBS冲洗的Dynabeads (Dynal Biotech GmbH， Hamburg,德国)重悬于500 u L 0.1M的磷酸 盐缓冲液中(pH值7.4)而且被轻轻地混合2分钟。通过磁铁收集珠 子，丢弃上清液并将珠子重悬于250u L同样的缓冲液中，接着添加500 u L的SAI/II抗原。在37i:伴随缓慢倾斜旋转孵育16小时后，经磁铁 收集珠子并丢弃上清液。有涂层的珠子被冲洗4次，两次用0.13M的 NaCl， 1%奶粉的0.01M磷酸盐缓冲液(pH值7.4)溶液4°C冲洗5分 钟， 一次是用0.2M Tris-HCl (pH值8.5) 37。C冲洗4小时，然后在相 同的缓冲液中fC再次冲洗5分钟。
实施例4:在pSinl中克隆scFv Guy's 13
用寡聚核苷酸引物LMB3 (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'; SEQ ID NO: 12)禾口 fdSeq 1 (5'-GAA TTT TCT GTA TG/AG GG-3'; SEQ ID NO: 13)扩增鼠单克隆抗体Guy's 13的可变区基因，接着用 Sfil和Notl消化。产物被插入用相同的酶处理过的噬菌粒载体pSinl 中，然后将重组体载体引入大肠杆菌TG1菌株中。
实施例5:人SAI/II特异性scFv抗体鼠抗体Guy's 13的可变重链抗体区在含有源自天然人外周血单核 细胞(8X108)的轻链抗体噬菌体-显示文库的细菌表达载体pHenIX中 作为Sfil/Sall片段被克隆出来。这个载体是基于噬菌粒载体pHenl
(Hoogenboom，等(1991) Nucl. Acids Res， 19: 4133-7)，而噬菌 粒载体pHenl被设计用来将抗体片段表达为具有丝状噬菌体M13的少 量外壳蛋白的N端融合蛋白。位于两个融合部分之间的琥珀终止密码 子可以允许表达溶解的抗体片段和噬菌体颗粒显示重组体抗体。重组 体载体被引入大肠杆菌TGI菌株。根据已经确立的方法(Marks,等
(1991) J. Mol. Biol。 222: 581-97)用固定的SAI/II抗原进行三轮选 择。用单克隆抗体Guy's 13进行洗脱以便选择能识别相同表位的粘合 剂。溶解型scfvs的表达用标准的方法完成(Marks,等(1991)如上 所述)而且对SAI/II抗原特异性的scFvs利用SAI/II抗原通过ELISA 进行鉴定。所选择的移动的人轻链的可变抗体区基因在含有人可变重 链文库(8X108)的pHenIX中作为ApaLI和Notl片段被克隆出来而 且被引入大肠杆菌TG1。这是通过PCR扩增人轻链基因而完成，所用 的弓l物为V" ApaLI (5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3'; SEQ ID NO: 14) ， V k 1 ApaLI( 5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3'; SEQ ID NO: 15)禾卩J k 1 Notl (5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT C/TTC CAC/G CTT GGT CCC-3'; SEQ ID NO: 16)。用被固定在Dynabeads上的SAI/II抗原进行三轮选择。简言之， 150ii g涂有SAI/II的珠子用2mL 2%的奶粉封闭1小时。用磁铁收集 珠子，在PBS中冲洗而且在转盘上用抗体噬菌体显示文库孵育1小时。 珠子用PBS/0.05% TWEEN 20冲洗15次而且用PBS冲洗15次以除去 未结合的噬菌体。结合的噬菌体在转盘上用lOOliL lOOmM三乙醇胺 洗脱10分钟接着在200" L 1M Tris-HCl (pH值8.0)中进行中和。洗 脱的噬菌体用于感染按指数生长的大肠杆菌TGI而且在含有lOOti g/mL氨苄青霉素，1%葡萄糖的TYE平板上30。C生长过夜。选择，噬 菌体拯救和可溶解scFv表达的诱导用标准方法(Marks,等(1991)如 上所述)进行。抗原特异性人scFv片段经ELISA法用SAI/II抗原被鉴定出来。
实施例6:噬菌体显示抗体文库的增殖
l升2xTY (补充有100!ig/mL氨苄青霉素，1%葡萄糖)用一小 份噬菌体抗体文库甘油原种接种。噬菌体的拯救和诱导基本上根据已 确立的方法(Marks，等(1991)如上所述)进行。通过添加101()单位 的辅助噬菌体VCSM13 (Pharmacia)到正在生长的噬菌体抗体文库中， 进行噬菌粒的拯救。培养基换成含有lOOyg/mL氨苄青霉素和25 ii g/mL卡那霉素的2x TY，并在250 rpm的轨道振荡器上3(TC被孵育过 夜。经PEG沉淀(20% PEG, 2.5MNaCl)纯化噬菌体两次，并被重新 悬浮在终容积为2mL的PBS中。噬菌体在4'C储存直到进一步使用。
实施例7: DNA序列测定
利用引物LMB3(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'; SEQ ID NO: 12)和fdSeql (5'-GAA TTT TCT GTA TG/AG G-3'; SEQIDNO: 13)
通过重组体抗体插入片段的PCR扩增确定独特克隆的数目，接着用限 制性内切酶BstNI消化(New England Biolabs， Beverly, MA)。根据 厂家的说明书(LI-COR， Lincoln, NE)，使用红外线标记的引物，通 过PCR循环测序法分析来自每一限制性图谱的两个克隆的的可变抗体 基因。测序反应在LI-COR自动DNA测序仪(4000L)上进行，并用 SEQUENCHER 3.1分析序列(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) 。 VH和VL基因的序列与V-BASE数据库中的种系序列进行比较 (http:〃www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php menu=901; Tomlinson等， MCR Center for Protein Engineering,金U桥，英国)。
实施例8:双价抗体的构建
通过PCR扩增载体人scFv克隆的可变重链和轻链抗体区并将其 亚克隆在载体pHenIXdia中来进行双价抗体的构建(Holliger，等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci，美国90: 6444-8)。双价抗体构建物由被10个 氨基酸衔接物(Thr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ala-Leu; SEQ ID NO: 9)连接的可变重链和轻链抗体区构成，迫使被表达的区域在溶液中附着到 互补链上以产生两个抗原结合位点。用来构建双价抗体抗体形式的引 物列在表1中。
表1
模板VL扩增pHenIX人scFvB10 pHenIX Human scFv H6 pHenIX Human scFv D12 pHenIX scFv mGuy 13V k 1 ApaLI V k 1 ApaLI V k 4 ApaLI mGuyl3 ApaLIJ k 1 Notl J k 1 Notl J k 1 Notl mGuyl 3 Notl
pHenIX人scFvB10 pHenIX人scFv H6 pHenIX人scFvD12 pHenIX scFv mGuyl3VH4 Sf薩col VH6 Sfi馳ol VH4 Sfil/Ncol VH4 Sfil/NcolJH3用于Sail JH2用于Sail JH2用于Sail mGuyl3 Sail
其中，
V k 1 ApaLI: 5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3' (SEQIDNO: 15);
V k 4 ApaLI: 5'-TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3' (SEQIDNO: 14);
J k 1 Notl: 5'-GAG TCAT TCT CGA CTT GCG GCC GCA CGT TTG ATC/T TCC AC/GC TTG GTC CC-3' (SEQIDNO: 16);
VH4 Sf謹col: 5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CA/GG AGT CGG G-3' (SEQ ID NO: 17);
VH6 Sfi固col: 5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CA/GC AGT CAG G-3' (SEQ ID NO:18);
JH3 Sail: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC GGT GAC CAT TGTCCC-3' (SEQIDNO: 19);
JH2 Sail: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC AGT GAC CAG GGTGCC-3' (SEQIDNO: 20);
mGuyl3 ApaLI: 5'隱TGA GCA CAC AGT GCA CTC GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CC陽3' (SEQIDNO: 21);
mGuyl3 Notl: 5'-TTT TCC TTT TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT陽3' (SEQIDNO: 22); 以及
mGuyl3 Sail: 5'-GAG TCA TTC TCG TGT CGA CAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GGT-3' (SEQ ID NO: 23)。
实施例9:大规模重组蛋白质的生产
用终浓度为0.5mM的IPTG在3(TC诱导3-4小时后从细菌的周质 回收重组体蛋白质(Breitling等，(1991) Gene 104: 147-153)。离 心后(4000Xg，4。C，30分钟)，将沉淀重悬在含有20%蔗糖，lmM EDTA 的lOmL 30mM Tris-HCl (pH值8.2)中，在冰上孵育15分钟而且如上 所述进行离心。将沉淀重悬浮在10mL的5mM MgS04， lmM EDTA 中，而且在如上所述的最后一次离心之前在冰上孵育15分钟。将两次 的上清液合并，用PBS透析而且在4'C储存。在渗透压下、相容的溶 质存在的情况下，重组体蛋白质在周质中也能表达(Barth，等(2000) Appl.Environ.Microbio。 66: 1572-9)。简言之，细菌在含有100 P g/mL 氨苄青霉素和0.5mM ZnCl2的Terrific Broth中(TB) (12g/L细菌用 胰胨，24g/L细菌酵母菌提出物，4mL/L甘油)26t生长过夜。培养物 在200mL同样的培养基中稀释30倍。当培养物的OD6。。nm达到2.0时， 补充以0.5M山梨糖醇，4%NaCl， 40mM甘氨酸甜菜碱并在26"再孵 育30-60分钟。用终浓度为lmM的IPTG诱导表达并在26"C生长6小 时。通过30，000Xg离心10分钟收获细胞。如上所述，从周质间隙中 分离重组体抗体片段。将周质和渗透休克碎片合并，并用PBS透析。添加苯甲基磺酰氟(PMSF)直到终浓度为lmM。 实施例10:重组体蛋白质的纯化
按照众所周知的方法(Griffiths,等(1994)EMBO J。 13: 3245-3260) 利用His6 tag经IMAC纯化人scFv和双价抗体抗体片段。简言之，10mL 柱(BIO-RAD Polyprep层析柱)填充以500 n L Ni-NTA树脂(Qiagen) 而且在重组体蛋白质上样之前用5倍于柱体积的PBS冲洗。柱用10倍 于柱体积含10mM咪唑的PBS冲洗。结合蛋白质用250mM咪唑洗脱， 并收集lmL的级份。蛋白质浓度通过分光光度测定法进行测定，假定 A 280nm=l相当于浓度为0.7mg/mL的scFv或双价抗体。凝胶过滤用 来做进一步的纯化。SEPHADEX 200柱(Pharmacia)用PBS平衡。ScFv 或双价抗体抗体片段上样而且以lmL/分钟进行。抑肽酶(6500 Da)， 细胞色素C (12,400 Da)，碳酸酐酶(29,000 Da) ， BSA (66，000Da) 和Dextran Blue (2,000,000 Da)用作分子量标准(Fluka， Buchs，瑞士)。
实施例ll:酶联免疫吸附试验(ELISA)
将变异链球菌，SAI/II抗原或牛血清白蛋白(BSA)涂布在ELISA 平板上(Nalge Nunc International, Rochester, NY)过夜，PBS中的;农 度为l-10ug/孔，温度为4"。平板用PBS冲洗3次而且在PBS中在 室温下用2%奶粉封闭2小时。scFvs用浓度为1 ii g/孔或100" L/孔的 过夜诱导的培养物测试。含有MYC tag的重组体抗体用鼠9E10单克隆 抗体(ATCC CRL1729)检测。含有His6 tag的抗体用鼠抗Penta-HIS 抗体(Qiagen)检测。鼠抗体用山羊抗鼠(Fc特异性)过氧化物酶标 记的抗体检测。用3,3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB) (Sigma, St. Louis, MO)显色进行分析。通过20分钟后添加H2S04终止反应并在OD450nm 时进行读数。在每个孵育步骤之间，平板用PBS/0.05% TWEEN20和 PBS分别冲洗三次。
实施例12:变异链球菌的聚集
将培养的变异链球菌分成20HL的小份而且用细菌表达的重组体抗体的系列稀释液在Lab-Tek II槽载波片上(Nalge Nunc International) 4'C孵育2天或者在37"C孵育1小时。丢弃过多的培养基并空气干燥细 胞。用Gram溶液(Diagnostica Merck， Darmstadt,德国)对细菌进行 对比染色。载波片上设置Immunofluor培养基(ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa， CA)而且用Zeiss Axioskob免疫荧光显微镜进行照相。
权利要求
1.特异性结合链球菌表面抗原I/II的分离的双价抗体，其中双价抗体含有人重链可变区和人轻链可变区。
2. 权利要求1的分离的双价抗体，其中重链可变区具有SEQ ID NO: 3， SEQ ID NO: 5或者SEQ ID NO: 7的氮基酸序列。
3. 权利要求1的分离的双价抗体，其中轻链可变区具有SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。
4. 权利要求1的分离的双价抗体，此外还含有位于重链可变区和 轻链可变区之间的短的衔接物序列。
5. 权利要求4的分离的双价抗体，其中衔接物含有SEQIDNO:9。
6. 权利要求1的分离的双价抗体，此外还含有可操作性连接到所 述双价抗体的治疗剂。
7. 含有编码权利要求1的双价抗体的核酸序列的载体。
8. 含有权利要求7的载体的宿主细胞。
9. 含有权利要求7的载体而且能够表达权利要求7的载体的宿主 细胞。
10. 含有权利要求1的双价抗体的组合物。
11. 预防或治疗与链球菌相关的口腔疾病的方法，包括施用有效量的权利要求1的双价抗体以使口腔疾病的至少一种体征或症状得以 预防或治疗。
12.用于诊断龋齿的试剂盒，含有权利要求1的双价抗体。
全文摘要
诸如牙周炎和龋齿的普通口腔疾病可以通过被动免疫有效预防。本发明提供了人单链Fv(scFv)和基于鼠单克隆抗体Guy′s 13的结合特性的双价抗体抗体片段。如亲本抗体一样，这些衍生物特异性结合SAI/II，链球菌的表面粘附素和人双价抗体的衍生物能够聚集链球菌细胞，从而使其可用作针对口腔疾病的被动免疫的有用候选治疗剂。
文档编号A61K31/00GK101495512SQ200580012663
公开日2009年7月29日 申请日期2005年4月21日 优先权日2004年4月22日
发明者里卡达·芬纳恩, 雷纳·费希尔 申请人:弗劳恩农场主协会应用研究开发E.V.