专利名称：用于促进血管发生的柑桔类水果皮提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进血管发生的柑桔类水果皮提取物的用途。具体而言，本发明涉及葡萄柚皮提取物用于治疗如冠心病、中风或溃疡的需要促进血管发生疾病或病症的用途，并包括辅助伤口愈合。
背景技术：
血管发生是新血管的生长和增生。血管发生在很多生理和病理病症中起重要作用。在健康机体中，血管发生发生在伤口愈合的增生期，用于在损伤或创伤后将血流恢复到组织，而在女性中，血管发生发生在月生殖周期和怀孕期间。
健康机体通过一系列“开”和“关”开关控制血管发生。所述“开”开关已知为刺激血管发生生长因子，实例包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)。相反，所述“关”开关称为血管发生抑制因子。血管发生抑制因子的实例包括血小板反应蛋白-1、制管张素和金属蛋白酶抑制因子。在正常健康机体中，为了促进血管发生的活化和抑制，血管发生生长因子和血管发生抑制因子的表达得到细微地平衡。
血管发生的失控可导致很多严重病状。当存在过量的或不足的新血管生长时，导致依赖于血管发生的疾病。由血管发生生长因子的过量产生引起的过量血管增生可引起增强的肿瘤生长和扩散，或引起风湿性关节炎、牛皮癣或糖尿病失明。事实上，约有70种病症起因于所谓的“过量血管发生”。在很多这些病症中，新血管供应疾病组织、破坏正常组织，以及在癌症的情况下，新血管允许建立已通过血液循环扩散到其他组织的肿瘤细胞(即肿瘤转移)。
相反，如冠心病、溃疡、中风和延期伤口愈合的病症起因于“不足的血管发生”，因为组织不能产生足量的血管发生生长因子。例如，由于心脏血供应减少，发生心绞痛或胸痛。在这些病症中，没有足够的血管以恢复适当的血液循环，引起组织坏死的风险。
延期伤口愈合和溃疡也是由不足的血管发生引起的。伤口愈合是对组织损伤的自然恢复反应，并包括可用3个典型阶段即发炎、增生和熟化(或重构)描述的细胞事件的复杂级联的相互作用。血管发生发生在伤口愈合的增生期，以促进伤口周围血管系统组织的修复，并增加来自血流的营养供给，以刺激对于愈合必要的局部细胞活性。而且，形成血管衬的内皮细胞是组织愈合反应的重要组织者和调节者。
已知调节伤口愈合的多种方法。具体而言，已知应用某些植物提取物促进伤口愈合。这类植物提取物包括非水果植物提取物以及来自柑桔类和非柑桔类水果的水果提取物。
EP 0210785描述一种在大鼠和小鼠中均显示增强伤口愈合活性的源于七叶树(Aesculus hippocastanum，Horse Chestnus)的果皮、树皮、树枝的原花色素(proanthocyanide)A2提取物。US 4,587,124描述一种马钱子(Strychnos ignatii Berg，森林藤本植物)的热处理油提取物，以及通过施用该提取物治疗皮肤伤口的方法。
DE 19929298中描述一个具有生物活性的柑桔类水果提取物的实例。描述了用葡萄柚的果肉和/或种子提取物处理的橡皮膏或垫的用途。所述葡萄柚提取物描述为具有杀细菌、杀真菌、抗病毒和抗寄生活性，引起增强伤口愈合并减少瘢痕形成。WO 2004/091569描述一种柑桔果皮提取物，其已被如真菌或细菌病原体的植物或动物病原体“活化”。这种提取物的用途显示限于皮肤病症的治疗。
已知非柑桔类水果也促进伤口愈合。例如，RU 2140254描述一种包括用于加速伤口愈合的桧柏果实提取物的化妆液。JP 2124809描述一种含有来自reishi果实的提取物的化妆品制剂也用于增强伤口痊愈。另一实例为CN 1103802，其涉及一种含有纱彩(cnidium)水果提取物的栓剂，以促进组织再生和伤口愈合。
然而，继续寻找改进的促进血管发生的物质。很多已知的促进血管发生的植物提取物难于获得、具有不需要的杂质、并且可能生产成本高。另外，大多数对血管发生有效的植物提取物为抑制血管发生的提取物。促进血管发生的提取物较不普遍，并因此引起受到很大关注。使用水果提取物也存在问题，即由于一般提取整个水果(包括皮、果肉和种子)，通常得到含有不需要的杂质的复杂混合物。
本申请人现已惊奇地发现，柑桔类水果皮的提取物具有促进伤口愈合和/或血管发生的活性。
因此，本发明目的为提供一种柑桔类水果皮的提取物在与促进血管发生或伤口愈合相关的治疗中的用途，或至少提供一种有用的选择。
发明内容
在第一个技术方案中，本发明提供一种促进血管发生或治疗希望促进血管发生的疾病或病症的方法，该方法包括向人类或非人类的动物施用治疗有效量的柑桔类水果皮的提取物。
优选，所述疾病或病症为肌肉局部缺血、中风或溃疡。更优选，所述肌肉局部缺血为骨骼肌局部缺血或由冠状动脉病引起。
所述促进血管发生可辅助伤口愈合。或者，所述促进血管发生可为在组织培养中的工程的或再生的组织中。
优选，所述柑桔类水果为葡萄柚、桔子、柠檬、酸橙、中国柑桔(mandarin)、桔柚(tangelo)、红桔(tangerine)或牙买加丑桔(uglis)。在本发明的优选实施方式中，所述柑桔类水果为葡萄柚(Citrus paradisii)。
优选，对于治疗外伤，所述提取物以凝胶、喷雾、乳膏或洗剂的形式局部施用。或者，可经口、腹腔、静脉、皮下、肌肉或任一其他适当的方式施用所述提取物。
在第二个技术方案中，本发明提供一种治疗有效量的柑桔类水果的皮的提取物在制备用于促进血管发生或治疗希望促进血管发生的疾病或病症的药物中的用途。
在另一技术方案中，本发明提供一种包括适用于促进血管发生或治疗希望促进血管发生的疾病或病症的柑桔类水果皮的提取物的组合物。
在又一技术方案中，本发明提供了一种制备柑桔属水果的皮的提取物的方法，包括以下步骤
(a)匀浆所述柑桔类水果的皮并向所得的匀浆加入约5倍体积的水性溶剂；(b)搅拌步骤(a)中制得的混合物；(c)过滤步骤(b)中制得的混合物，以得到滤液；(d)在约45℃减压下浓缩所述滤液；(e)将浓缩的滤液进行层析纯化，其中，用水洗脱后，取得用醇洗脱得到的部分；(f)在约45℃减压下浓缩该醇部分，以得到所述提取物。
可任意重复搅拌所述混合物和过滤的步骤以使来自果皮的提取物最大化。
优选所述浓缩的滤液的层析纯化通过将所述浓缩的滤液吸附到非离子树脂层析介质上，首先用水洗脱以除去不需要的物质，然后用醇洗脱得到含有所述提取物的部分而完成。
用于步骤(a)的水性溶剂中的溶剂可为选自包括甲醇、乙醇、丙醇和丙酮的组。
优选，步骤(a)的水性溶剂中所用的溶剂为70％的含水丙酮。也优选步骤(e)中所用的非离子树脂为聚苯乙烯。另外优选在步骤(f)中使用甲醇从柱洗脱所述吸附的部分。
图1A～1I比较在17日期间在路易斯大鼠背部造成的两个基本相同的圆形切割伤口。每隔一日已用25μl葡萄柚皮提取物(10mg/ml)处理左侧伤口。
图2A～2I也比较在17日期间在路易斯大鼠背部造成的两个基本相同的圆形切割伤口。这次，每隔一日已用25μl葡萄柚皮提取物(1mg/ml)处理左侧伤口。
图3比较伤害后作为时间的作用的处理和未处理的伤口的平均伤口大小。处理的伤口每隔一日接受25μl葡萄柚皮提取物(10mg/ml)。该比较表示为原始伤口面积的百分比。对于各点，n＝5。
图4比较伤害后作为时间的作用的处理和未处理的伤口的平均伤口大小。处理的伤口每隔一日受到25μl葡萄柚皮提取物(1mg/ml)。该比较表示为原始伤口面积的百分比。对于各点，n＝5。
具体实施例方式
如本文中所述，柑桔类水果的“皮”意为在已去除内部可食用的果肉和种子后柑桔类水果的剩余部分。
本发明涉及一种柑桔类水果皮的提取物，该提取物具有促进血管发生的活性。因此，所述提取物用于治疗希望促进血管发生的疾病或病症，如冠心病、中风或溃疡。所述提取物也可用于辅助伤口愈合。另外，所述提取物用于促进组织培养中如在用于组织移植中的细胞外基质中的工程或再生组织的血管发生。在组织培养中，所述提取物可促进可支持细胞外基质中的工程或再生组织的需要的血管供应。
有利地，所述活性提取物从通常为商业柑桔类水果加工的废品的柑桔类水果的皮得到。另外，从柑桔类水果的皮得到所述提取物的方法是直接的。所述皮的提取物也具有比整个水果提取物具有更少的不需要的杂质的优点。
本发明详细描述了关于作为本发明的优选的柑桔类水果的葡萄柚。然而，应理解本发明涉及包括但不限于葡萄柚、桔子、柠檬、酸桔、中国柑桔、桔柚、红桔或牙买加丑桔的任一柑桔类水果。
为了确定葡萄柚皮提取物对血管发生的作用，应用用于定量评价大鼠主动脉中的血管发生速度的体外培养试验(实施例2)。与对照相比，对于用葡萄柚皮提取物处理的组织，相对于主动脉环的微血管生长的面积引起381％的新血管形成增加。该结果清楚地表明葡萄柚皮提取物对于促进血管发生的有效性。
为了检验葡萄柚提取物对伤口愈合的作用，对于遭受基本相同的圆形切割伤口的路易斯大鼠，确定伤口恢复速度(测量为总的伤口面积)。一个伤口作为试验伤口，而另一个作为对照。进行两个单独的试验，其中，葡萄柚皮提取物的剂量为10mg/ml和1mg/ml。
对于第一个试验，在17日的试验期一般以10mg/ml的剂量每隔一日向试验伤口(左侧伤口)施用葡萄柚皮提取物(图1A～1I)。图1A显示紧接伤口造成后的试验和对照伤口。图1B～1I显示伤害后直至17日两日间隔的相同伤口(图1I)。显然，试验伤口的愈合显著快于对照的愈合。
为了量化伤口恢复的相对速度，测量各伤口的总的伤口面积。表1和图3列出数据作为原始伤口面积对时间的总百分比。在表1中，也给出试验和对照伤口的总的伤口面积的比值。由于在各时间点，比值小于1.00，暗示处理伤口比对照伤口正在更快愈合。在最初5日，伤口表面积减少显著加速(图3)。有趣的是，注意伤口愈合的血管发生期主要发生在这时期。
表1
对于第二个实验，以1mg/ml的剂量局部施用葡萄柚皮提取物。图2A显示紧接伤口造成后的试验和对照伤口。图2B～2I显示伤害后直至17日两日间隔的相同伤口(图2I)。再次，试验伤口的愈合显著快于对照的愈合。
如第一个实验，表2和图4列出与对照相比测定的施用1mg/ml葡萄柚皮提取物的大鼠的总的伤口面积(表示为原始伤口面积的百分比)的测量。即使在较低浓度下，葡萄柚皮提取物对伤口恢复的整体速度具有很相似的作用。
表2
本领域技术人员应理解，可以凝胶、喷雾、乳膏或洗剂的形式局部施用所述柑桔属水果皮提取物。根据待治疗的疾病或病症，也可经口、腹腔、静脉或任一其他适当的方式施用所述提取物。
根据患者和待治疗的病症的性质和程度，待施用的提取物的量将宽泛地变化。
本申请人已发现，从通常为商业柑桔类水果加工的废品的果皮有利地制备所述柑桔果皮提取物。粉碎后，在如70％的含水丙酮的70％的水性溶剂中提取所述果皮。去除溶剂，并通过层析容易地实现纯化。
用如甲醇的醇洗脱，得到可浓缩的部分，用水吸收，然后冻干，以得到所需要的提取物。
参照以下实施例进一步描述本发明。然而，应理解本发明不限于这些实施例。
实施例实施例1提取步骤在电动混合器中粉碎来自柑桔类水果的剥皮，并向该材料加入5倍体积的70％的含水丙酮(丙酮/水7∶3v/v)。搅拌该混合物2小时，然后置于室温下过夜。在尼龙布上过滤所得的混合物，与此同时挤压该浆液。在水性溶剂中重悬浮固体残渣，搅拌1小时，然后过滤。合并滤液，并在45℃减压下通过浓缩除去丙酮。轻轻倒出剩余水性部分用于收集，并在非离子聚苯乙烯树脂的柱上处理。以3倍体积的蒸馏水洗涤所述的柱，用甲醇洗脱被吸附的物质，并在减压下浓缩。用1倍体积的蒸馏水稀释剩余物质，冻干以制得所述活性提取物。
实施例2血管发生试验去除脂肪和血管周围的纤维组织后，将大鼠主动脉切成约2mm厚度的环。通过向溶于MCDB 131培养基中的纤维蛋白原溶液加入凝血因子制备在24孔培养平板的一孔中形成一块血纤蛋白凝胶(0.4ml)。将主动脉环置于各孔中央，并用另一块血纤蛋白覆盖。各凝胶用MCDB131培养基(1.5ml)覆盖，并于37℃在3％CO2/97％空气的气氛中孵育。待试验样品作为补充物加入所述培养基。各样品重复试验3次。
约5日后，可检测到微血管从环的周边生长。在5～14日之间的规则间隔，用连接于倒置显微镜的数码相机记录各孔的图像。在各时间点测量对于各图像相对于环的周长微血管生长的面积。对于各样品，测定生长速度的平均值，然后计算微血管的速度。
实施例3伤口愈合在肩部正下方用0.8cm的皮肤活组织检查穿孔机(skin biopsy punch)在各大鼠背部中建立两个圆形切割伤口。在中线的各侧造成一个伤口。分析两个剂量的试验材料。对于每个实验，使用5只雄性路易斯大鼠。每隔一日，将溶于生理盐水中的葡萄柚皮提取物的等分试样(25μl)局部施用到各动物的左侧伤口。对一组大鼠，浓度为10mg/ml，且对于第二组大鼠，浓度为1mg/ml。将载体加入对侧伤口作为对照。在每次加入前用佳能EOS 3000 N相机(F2.8微镜头)和富士专业400NPH胶卷拍摄每对伤口的照片。数码记录各曝光的照片，并使用NIH Image 1.63软件从这些图像计算各伤口的面积。在图1和2中可见结果。
尽管已通过实施例的方式描述本发明，应理解不偏离权利要求书的范围可作出变化和修改。另外，在已知存在具体特征的等价物之处，如果在说明书中明确指出，可并入这类等价物。
工业适用性本发明能够促进血管发生。这对于促进伤口愈合以及治疗包括冠心病、中风和溃疡的各种疾病或病症具有适用性。一种制备本发明中所用的柑桔果皮提取物的方法涉及用水性溶剂提取柑桔类水果的皮、纯化滤液、然后通过去除溶剂得到所述提取物。
权利要求
1.一种促进血管发生或治疗需要促进血管发生的疾病或病症的方法，该方法包括向人类或非人类的动物施用治疗有效量的柑桔类水果皮的提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述疾病或病症为肌肉局部缺血、中风、或溃疡。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述肌肉局部缺血为骨骼肌局部缺血或由冠状动脉病引起。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述促进血管发生将辅助伤口愈合。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述促进血管发生为在组织培养中的工程的或再生的组织中。
6.如权利要求1至5中任一项的方法，其中，所述柑桔类水果为葡萄柚、桔子、柠檬、酸橙、中国柑桔、桔柚、红桔、或牙买加丑桔。
7.如权利要求1至6中任一项的方法，其中，所述柑桔类水果为葡萄柚(Citrus paradisii)。
8.如权利要求1至4、6或7中任一项的方法，其中，所述提取物为经口、腹腔、静脉、皮下、或肌肉施用。
9.如权利要求1至4、6、7或8任一项的方法，其中，对于治疗外伤，所述提取物以凝胶、喷雾、乳膏或洗剂的形式局部施用。
10.治疗有效量的柑桔类水果皮的提取物在制备用于促进血管发生或治疗需要促进血管发生的疾病或病症的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述疾病或病症为肌肉局部缺血、中风或溃疡。
12.如权利要求11所述的用途，其中，所述肌肉局部缺血为骨骼肌局部缺血或由冠状动脉病引起。
13.如权利要求10所述的用途，其中，所述促进血管发生将辅助伤口愈合。
14.一种包括柑桔类水果皮的提取物用于促进血管发生或治疗需要促进血管发生的疾病或病症的组合物。
15.一种制备柑桔类水果的皮的提取物的方法，包括以下步骤(a)匀浆所述柑桔类水果的皮并向所得的匀浆加入约5倍体积的水性溶剂；(b)搅拌步骤(a)中制得的混合物；(c)过滤步骤(b)中制得的混合物，以得到滤液；(d)在约45℃减压下浓缩所述滤液；(e)将浓缩的滤液进行层析纯化，其中，用水洗脱后，取得用醇洗脱得到的部分；以及(f)在约45℃减压下浓缩该醇部分，以得到所述提取物。
16.如权利要求15所述的方法，其中，可重复搅拌所述混合物和过滤的步骤以使来自果皮的提取物最大化。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中，所述浓缩的滤液的层析纯化通过将所述浓缩的滤液吸附到非离子树脂层析介质上，首先用水洗脱以除去不需要的物质，然后用醇洗脱得到含有所述提取物的部分而完成。
18.如权利要求15至17中任一项的方法，其中，用于步骤(a)的水性溶剂中的溶剂选自包括甲醇、乙醇、丙醇和丙酮的组。
19.如权利要求15至18中任一项的方法，其中，步骤(a)的水性溶剂中所用的溶剂为70％的含水丙酮。
20.如权利要求15至19中任一项的方法，其中，步骤(e)中所用的非离子树脂为聚苯乙烯。
21.如权利要求15至20中任一项的方法，其中，步骤(f)中使用甲醇从柱洗脱吸附的部分。
全文摘要
柑桔类水果皮提取物用于促进血管发生、或治疗需要促进血管发生的疾病或病症的用途。这类疾病包括冠心病、中风、或溃疡。一种适用于促进血管发生或治疗需要促进血管发生的疾病或病症的包括柑桔类水果皮提取物的组合物。一种制备柑桔类水果皮提取物的方法。所述柑桔类水果可为葡萄柚、桔子、柠檬、酸橙、中国柑桔、桔柚、红桔或牙买加丑桔，优选葡萄柚(Citrus paradisii)。
文档编号A61P43/00GK1976713SQ200580013833
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者保罗·弗兰克·戴维斯, 拉伊·耶普·富 申请人:工业研究有限公司, 奥塔哥创新有限公司