医用全氟化合物乳剂及其制备方法

专利名称：医用全氟化合物乳剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物物理学及医学领域，具体地，涉及用于治疗血液丧失、缺氧和缺血病症的药物，以及用于改善血液氧运输和保存分离的灌流器官和组织的药物。
缩写、参考符号、单位和术语列表表面活性剂表面活性物质P-268、F-268 Proxanol 268、Pluronic 268PFD 全氟萘烷PFMHP 全氟甲基环己基哌啶PFOB 全氟辛基溴Fl代表全氟三丙胺及其副产物顺式和反式异构体全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的混合物的有机液体。
PFCs 氟碳化合物PFTBA 全氟三丁胺PFTPA(PAF-3) 全氟三丙胺大豆-P大豆磷脂卵-P 卵磷脂n 波长指数Cv氟碳化合物在乳剂中的体积含量(ml/dl)a 平均粒径λ波长Ip反应原性指数成功开发含有氟碳化合物乳剂的灌流介质的关键主要取决于所选择的PFC以及基于这些PFC的乳剂的理化性质和制备方法。
医用PFC代表不同类的氟碳化合物。它们在外观上为无色无味的澄清液体，密度很高，约为水的两倍。异常强的C-F键(485.6KJ/mol)使这些化合物的分子间力非常弱。弱的分子间力表现在它们溶解气体包括血液气体的异常强的能力。
PFC的强的C-F键使得其具有化学惰性的特征。它们难溶于水，不能形成在生物体中代谢的基础。PFC的化学惰性不能等于其生物学惰性。静脉内注射PFC基乳剂后，这些乳剂保留在器官和组织中，其停留时间取决于PFC的性质和乳剂的剂量。
对不同类的全氟化合物的生物学性质的研究表明其消除速率取决于一系列相关的理化参数，即取决于结构和分子量、沸点、蒸气压和在己烷中的临界溶解温度(T临界)。T临界是待测化合物与己烷相等体积混合的温度。T临界被认为是PFC在脂质中相对溶解度的值，该值表征通过膜的速率。T临界越低，化合物越容易溶于脂质，从生物体中消除的速度越快。表1中列出了作为医学应用的PFC选择标准的理化参数。
表1不同化合物[1]在己烷中的临界溶解温度(T临界)、蒸气压(P)和分解半衰期(t1/2)的值
从上述数据中可见T临界与t1/2之间存在强相关性。对蒸气压未观察到这种相关性。在很大程度上T临界与分子量是相互关联的。PFC的最适分子量在460至520之间。总体而言，为医用PFC所提供的所有选择标准彼此间并不矛盾，而具有定量特征。目前，致力于开发和研究全氟碳乳剂的研究者正将注意力放在相对有限数目的化合物上。表2和表3中列出了最常见的PFC化合物的结构式以及主要的理化性质。
表2最常用和最具希望的PFV的结构式
当研究不同PFC的主要生物学性质时，制定了一条重要的要求即不存在无法鉴别的混合物。当静脉内注射时性质未知的混合物可能歪曲基本物质的真实行为特征(器官中的贮留时间、毒性、对生物体不同系统的影响)。
表3构成医用制剂基础的PFC的理化性质
注PFD/PFTPA是Fluosol-DA制剂的基础；PFD/PFMHP是Perftoran制剂的基础；PFOB/PFDB是Oxygent制剂的基础。
PFC液体是各种水溶性生物活性物质的不良溶剂。基于这一原因，PFC作为氧运输介质应用时被分散至含水乳剂溶液中直至得到微细分布的乳剂。
PFC交换气体的能力由乳剂中总氧含量确定。氧浓度遵循Henry定律，与氧压成正比。在PFC中气体的物理溶解度的原则也适用于全氟碳乳剂。溶于乳剂中的氧量取决于氟碳相，而不取决于粒径，即溶解在氟碳乳剂中的氧量与由每相中气体量值的和(水相中的氧量加上PFC中的氧量)计算的值相近。在PFC和血浆的混合物中惰性气体的含量也遵循每相中气体量相加性定律。因此，乳剂中每种气体的含量可以根据基于气体分压和部分PFC/H2O体积比的溶解度的物理定律计算。这意味着全氟碳乳剂中的氧含量越高，则它的分压或它的张力(pO2)越高，氟碳相的比例越高。
当注射入体内时，每种制剂的具体的(功能性)作用由该制剂的相容性决定，相容性由LD50值以及不存在副作用决定，副作用看起来主要为反应原性。PFC乳剂的LD50值的大小主要取决于粒径。平均粒径不应该超过0.2μm。大粒径(平均粒径在0.4μm以上)的比例增加3％-10％时，所述乳剂的LD50值降低两倍。当研制基于静脉内注射用全氟碳乳剂的药物剂型时，研究全氟碳乳剂可能的反应原性是必须解决的最困难的问题。当使用反应原性制剂时，可能在人中产生过敏反应，其表现形式有多种，从皮肤的轻微发红至导致呼吸和心脏停搏的过敏性反应。
大多数研究者认为最大部分的反应原性取决于用于分散乳剂的氟碳基础(basis)以及在颗粒周围形成(表面)吸收层的乳化剂的性质。认为第一代乳剂的反应原性是由氧乙烯和聚氧丙烯的非离子嵌段聚合物Pluronic F68(F-68)引起，用天然磷脂代替它们完全解决反应原性问题。这种观点不完全正确，因为尽管脂肪乳剂通过天然磷脂而稳定，但还是具有反应原性。全氟碳乳剂的反应原性不能通过简单地使用磷脂作为乳化剂和稳定剂而消除。实际上，已发现PFC乳剂的反应原性还是首要受乳化的颗粒的表面性质影响，即受稳定颗粒的乳化剂层的状态的影响。除了化学结构之外，表面活性分子的性质以及决定如下的主要参数也起部分作用分散系统和可能的次级反应的稳定性、表面活性剂与乳剂颗粒的油核的结合强度、分子在表面的位置、其堆积密度、相对于血流中存在的蛋白质和其它生物活性分子的吸收性质的存在以及最后乳剂的粒径。最后一个参数应该特别提及。只使用聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物Proxanol 268稳定的制剂Perftoran中的乳剂平均粒径的降低导致次级反应的迅速下降，Proxanol 268是与F-68最接近的原型。由此可清楚看出，在乳剂的开发、制剂和制备方法中，表面现象(两种异质系统——乳剂和血液或血浆的相互作用)在静脉内注射乳剂的行为中起关键的作用。因此油核的成分以及与油核共同起作用的表面活性剂都应该通过实验进行选择，并且所使用的技术的可行性也应该进行测试。
开发本发明的医用全氟碳乳剂及其制备方法时，通过动物模型的方法对每种制剂和每种技术元件进行生物学作用的研究。已知兔子在注射全氟碳乳剂时的反应原性反应表现为外周血中嗜中性白细胞急速下降。评价全氟碳乳剂的可能反应原性时在测试中使用反应原性指数Ip，其根据公式Ip＝Ck/Cv计算，其中Ck和Cv表示相对于对照组和测试组的起始水平的中性粒细胞的百分数。若5分钟和20分钟后Ip小于3，则反应原性的概率是最低的[3]。
已知不同的制备全氟碳乳剂的方法。包括全氟碳乳剂在内的并且其中全氟碳基础是油相的水包油型乳剂的制备需要耗费高能量。油相的粉碎通过超声方法或机械方法实施。
在超声的作用下，通过强烈的局部压力变化产生的摩擦力实现分散，局部压力的剧烈变化由两个原因导致。第一，在波传递的液体中局部压力和张力的改变。第二，空穴的形成，即由溶于水中的气体填满的腔的形成和塌陷。制备亚微乳剂所必需的超声能量和力都很大，以致除了分散外，还导致C-F键的断裂。结果在乳剂水相中出现高毒性浓度的F-离子，约为3-5mmol。含有如此高浓度F-的乳剂不能用作血液替代物或保存灌流器官。必需通过离子交换树脂去除过量的F-离子。经超声分散的乳剂的第二个缺点是分散范围过大，平均粒径为0.1μm，但有大的部分颗粒的粒径可能在0.4μm以上或在0.01μm以下。
通过振摇或剧烈搅拌的机械分散法得到仅粗糙分散的粒径在1毫米以上的乳剂，其对于生物医学应用而言是不可接受的。为制备微细分布的乳剂，在高压(挤出)下将分散相通过微细孔压入分散介质中，其结果使液体喷射破裂成为微滴。通过压力梯度和液压摩擦力进行分散。乳剂通常在高压均化器中制备。在表面活性物质或乳化剂的辅助下使得到的乳剂稳定化。对于这些物质的稳定化作用有两种原因解释一是通过降低两相之间过剩的表面能量或通过降低表面张力，二是通过形成结构上的机械屏障(吸附层)，其保证颗粒的稳定性并防止颗粒互相接触或粘附或附聚。
在许多表面活性剂中，只有一些满足制备静脉内注射制剂应用的要求(表4)。
表4用于制备全氟碳乳剂的常规表面活性物质
目前，主要有两种乳化剂用于制备全氟碳乳剂，即Proxanol-268(Pluronic F-68)和天然磷脂(卵磷脂和大豆磷脂等)。
Proxanol的结构与水溶性表面活性剂具有的极性头(亲水部分)和非极性尾(疏水部分)的特征性分子性质不相应。在Proxanol中，亲水性分子特征由两个聚氧乙烯链决定，氢键是与水分子形成的。聚氧丙烯中的甲基是其分子具有亲脂性的必要前提。F-68和P-268中聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段的比例大致相同，平均为80∶20。这些乳化剂的稳定作用主要通过表面活性分子在氟碳颗粒周围形成的保护膜的立体效应实现。除了结合于吸收层中的表面活性剂以外，表面活性剂分子中的最大部分在水相中形成各种胶束结构，其中也包括不含氟碳化合物的胶束。在吸收层中的表面活性剂分子与水相的胶束中的表面活性剂分子之间存在动态平衡，该平衡一方面是吸收层稳定所需要的，另一方面在长期储存中扰乱吸收层中表面活性剂分子的堆积密度。
磷脂是来源于天然的化合物的混合物，其一般结构见表4所示。尽管磷脂被PFD和PFTPA部分溶解在磷脂酰胆碱颗粒双层中，但是就不同的氟碳化合物而言，磷脂是水溶性的，同时也是亲脂性差的活性物质。磷脂与氟碳化合物在水相中的联合具有双重特性。在磷脂的片层结构中可能包含氟碳化合物，并(或)可能形成与颗粒表面不可逆地相连的单层磷脂。在含有氟碳化合物和磷脂的乳剂中可能存在非同质颗粒，即被含有磷脂和不含磷脂的保护层覆盖的颗粒。这种非同质性可以归因于制备的特性和/或磷脂相对于氟碳相过量。
对于微细分布的乳剂，关于细度下降(颗粒粗糙化)的决定性机制在于通过氟碳化合物分子从分散介质中扩散而使分散相从小颗粒到较大颗粒的等温或分子物质蒸馏。这一过程被称为乳剂的“Ostwald熟化”或“浓缩”。这一过程的驱动力是与较大颗粒相比，小颗粒上面的饱和蒸气压力的增加。在这种情况下，氟碳化合物在水介质中的溶解度水平也是一个重要的参数。防止再凝聚对于获得全氟碳乳剂的抗聚集状态，即获得颗粒的细度和单个性具有至关重要的作用。失去稳定性，即分子扩散和较不显著的絮凝和凝集的主要路线是其中氟碳相体积低于20％的相对较稀的乳剂和其中氟碳相体积为50％的较浓乳剂的特征。
全氟碳乳剂的稳定化路线是已知的。胶体系统的稳定化的基本原理是防止它们分解的机制。向基于PFC/磷脂的乳剂中加入糖和带有负电荷的共乳化剂(磷脂的次要组分)通过改变表面活性剂分子在吸收层中的空间相互作用和通过增加颗粒间的静电排斥力而防止颗粒的絮凝。
通过向具有较高沸点的氟碳化合物基础中加入第二种水溶性较差的组分(另一种氟碳化合物)来降低全氟碳乳剂中由分子扩散而引起的主要分解过程，并使这一过程减慢。
在开发Fluosol-DA、Perftoran和Oxygent制剂中都使用了这一稳定化原理。下表5中给出了所述制剂的组分和理化性质的汇编数据。
表5收集的关于Fluosol-DA(日本)、Perftoran(俄罗斯)和Oxygent(美国)/2/制剂的组分数据
在前两种制剂中，将氟碳化合物全氟三丙胺和全氟甲基环己烷哌啶作为具有较高沸点和较低水溶性的补充剂加入具有最高油相比例的全氟萘烷中。含有磷脂补充剂(Fluosol-DA)的水溶性Pluronic F-68或其原型Proxanol-268(Perftoran)被用作乳化剂。根据它们的理化性质它们差异很小。它们属于第一代制剂，其一般缺点是由于稳定性不足，它们必须冷冻储存。将具有较高沸点和较低水溶性的全氟癸基溴加入Oxygent(全氟辛基溴)的氟碳基础中。Oxygent属于第二代制剂，其优点是在非冷冻状态下储存。此外，作为该制剂氟碳基础的全氟辛基溴以与全氟萘烷基本相同的速率(相当于t1/2为～4和7天)从生物体中迅速清除。
Oxygent是组成上有点不同的灌流介质中的一个商品名。
该乳化剂不仅有助于H2O/PFC系统中细度所要求的相界面的表面张力的降低。乳化剂性质的改变可影响分子扩散的速率。认为分子中含有氟疏水性部分和非氟亲水性部分的氟化表面活性剂是将来有希望的表面活性剂。最近法国化学家在用于氟碳化合物的氟化表面活性剂的合成中取得较大成功[4]。合成的氟化表面活性剂的一般结构是全氟链和极性头的组合。烃链被用作这些元件的结合连接。极性头选白天然物质或其衍生物。含有醇或糖衍生物作为极性头的氟化表面活性剂与Pluronic F-68具有协同作用。磷脂、糖磷酸酯或磷脂酰胆碱在氟化表面活性剂中用作极性头增加含有天然磷脂作为乳化剂的氟碳乳剂的稳定性。一类新的混合氟化表面活性剂被建议用于稳定化[4]。这一类氟化表面活性剂分子是两个线性成分即烃成分和全氟成分的嵌段。这些化合物的通式如下CnF2n+1CmH2m+1或CnF2n+1CH＝CHCmH2m+1本发明的发明人将这些分子命名为“销钉(dowel)”，其字面意义为“弹簧”或“连接元件”。
有种观点认为含有一般线性RH-RF结构的氟化表面活性剂分子具有加强元件的作用，其烃基末端进入覆盖全氟碳颗粒的脂质膜中，而其另一氟末端则进入油相，即RH-RF分子改善了表面活性剂表面层的粘附性质。
目前，全氟萘烷和全氟辛基溴是最被接受的用于制备生物医用乳剂的化合物，其原因是它们与其它氟碳化合物相比能够从生物体中迅速清除。
已知其中描述了血液替代剂组分的专利[5，6]，其中氟碳基础是不同比例的两种氟碳化合物(全氟萘烷/全氟甲基环己基哌啶或全氟萘烷/全氟三丁胺或全氟辛基溴/全氟甲基环己基哌啶)、三种氟碳化合物(全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟甲基环己基哌啶或全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟三丁胺)或甚至四种氟碳化合物(全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟甲基环己基哌啶/全氟三丁胺)的混合物。通过水溶性乳化剂Proxanol P-268将这些混合物分散。使用这一乳化剂并不能使所述混合物在正温度下储存。此外，这些乳化剂冻融后在+4℃下的储存期有限(至多一个月)。这是它们的主要缺点。
含有氟化表面活性剂的乳剂受专利保护。含有氟化表面活性剂的微乳剂[7]目前还没有作为灌流介质的实际应用，主要是因为它们在体内不够稳定。已知另一个通过混合的氟化表面活性剂制备的全氟碳乳剂组合物，在该分子中所述表面活性剂含有亲氟部分和亲脂部分[8]。这些乳剂实际上在正温度下只能在3个月之内保持其平均粒径。
已知一个其中用10％liposyn脂肪乳剂作为脂质源制备乳剂的专利[9]。有三组氟碳化合物作为氟碳基础受专利保护。第一组是全氟环烷或全氟烷基环烷(其中包括全氟萘烷、全氟甲基萘烷、全氟全氢化菲等)。第二组包括全氟烷基饱和的杂环化合物。第三组包括全氟叔胺，包括全氟三丁胺、全氟三丙胺等。全氟辛基溴属于可应用的氟碳化合物。但是还不可能在10％liposyn的辅助下制备稳定的全氟萘烷乳剂。它的最长储存期为25天。
在另一份专利[10]中使用卵磷脂制备乳剂。氟碳相的比例在10-50体积％的较大范围内变动，而磷脂的比例为0.5-7重量％。作为油相，仅从来自这一大类化合物的PFC中选出一种用于该专利中，所述PFC即为具有1-24个氟原子的全氟氢化菲组，全氟萘烷、全氟辛基溴、全氟甲基金刚烷和全氟全氢化菲。
上述两篇专利主要集中在通过使用所制备的氟碳乳剂用以保存不同器官和系统的方法上。在生理测试的开始阶段，将乳剂与晶体溶液和/或胶体渗透压活性物质(白蛋白、羟乙基淀粉)等混合。所述乳剂实际上属于第二代乳剂，但是它具有很大的缺点。在两份专利中，并未给出对乳剂稳定性的检查结果，即在长期储存(1个月)时粒径保持情况的结果。刚提及的这两篇专利[9，10]本文认为是原型。
与本发明的乳剂最为接近的原型是下面提及的乳剂[11]。这一乳剂被认为是原型，属于第二代乳剂，含有迅速清除的量为40-50体积％的氟碳化合物和量为5-10体积％的高沸点全氟补充剂。使用全氟萘烷或全氟辛基溴(主要组分)作为迅速清除的氟碳化合物，并使用全氟甲基环己基哌啶作为补充剂。乳化剂是卵磷脂或大豆磷脂。
全氟环己基哌啶使乳剂稳定化，降低主要组分(全氟萘烷或全氟辛基溴)的分子扩散率(再凝聚)，并用于制备不同组分的乳剂，即Perftoran。从专利[11]中已知的乳剂的主要缺点是粒径相对较大，平均在0.2μm以上。
本发明的目的是增加乳剂的稳定性，改善乳剂质量，即获得与生物介质(血液、血浆和血清)的生物相容性，储存期在非冷冻状态下至少为6-12个月。
本发明的医用乳剂含有迅速清除的全氟萘烷或全氟辛基溴，还含有全氟补充剂和磷脂。该乳剂的特征在于使用全氟萘烷和全氟辛基溴混合的组合物作为迅速清除的组分，在于全氟补充剂是全氟叔胺混合物，并在于磷脂作为在水盐介质中的分散体使用。
该乳剂的特征还在于氟碳化合物的总浓度为2-40体积％。
该乳剂的特征还在于所述组合物含有比例为10∶1至1∶10的迅速清除的全氟萘烷和全氟辛基溴，在于全氟补充剂占氟碳化合物总含量的1-50％，并含有全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体，还含有另外的全氟-N-甲基环己基哌啶及其副产物。
该乳剂的特征还在于，它含有在水盐介质中的卵磷脂和大豆磷脂或这些脂质的混合物的分散体，其浓度为0.2-5重量％。
该乳剂的特征还在于，水盐介质中的磷脂分散体含有占磷脂总含量1-15％的辅剂。植物油被用作辅剂，实际上有效比例的大豆、葵花子或蓖麻油或这些油的混合物以两倍或三倍混合物的形式使用。
该乳剂的特征还在于，所述水盐介质含有氯化物和磷酸盐的钠盐和钾盐，以及于注射水中的单糖甘露糖醇，水盐介质中的组分浓度具有100-350 mosmol/l的渗透压。
该乳剂的特征还在于，其平均粒径不超过0.2μm，粒径范围为0.06-0.2μm。
通过均化法制备本发明乳剂的方法的特征在于该方法包括多个步骤，其包括在水盐介质中分散磷脂，在该磷脂分散体中均化，将制备的乳剂加热灭菌，以及之后在+4℃下以非冷冻状态储存至少6个月。
本发明的制备方法的特征还在于磷脂在水盐介质中的分散通过均化法在至少100atm的高压下进行，之后还进行灭菌。
本发明的制备方法的特征还在于磷脂分散体中的氟碳化合物在300-650atm压力下均化。
本发明的制备方法的特征还在于磷脂分散体和乳剂在100℃的温度下灭菌。
如上所述，本发明的目的是增加乳剂的稳定性，改善乳剂质量，即获得与生物介质(血液、血浆和血清)的生物相容性，储存期在非冷冻状态下为6-12个月。术语生物相容性包括不同的变量，对于乳剂而言应将其精确化。在上述专利[8-11]中，对于生物相容性的理解是所选择的PFC的相对高的清除速率，保存该乳剂灌流的组织和器官的能力和对动物相对低毒(至少为流通血量的两倍体积)，这些观点彼此之间并不互相排斥，但没有反映第一个步骤，即这些颗粒在血流中与血浆和血液的共同作用。本发明中，生物相容性从本发明的乳剂与生物介质(血液、血浆或血清)之间共同作用(反应)的显著性水平开始。该共同作用的结果不仅可以在体内进行评价，也可以在体外通过在储存期间和乳剂渗透入血流期间一系列模拟吸收层破坏的因素对乳剂稳定性水平的影响来进行评价。
乳剂的质量和稳定性通常以粒径为特征，实际上平均粒径不应该超过0.2-0.3μm。该方法对于用于静脉内注射的生物医学分散制剂而言是不够的。这基于氟碳颗粒在渗透进入血流期间，作为外源物质与血浆中的蛋白和其它化合物分子以及与血细胞共同作用这一事实。该共同作用的一般特征取决于颗粒表面性质。乳剂的功能性活性(气体运输功能)基本上取决于乳化颗粒的表面与血液和血浆之间的相容性，因为例如在外源体表面上补体系统激活以后，引发反应级联，这一反应级联由血管痉挛引起并干扰局部血流。还应该注意体外乳剂的稳定性受颗粒周围的表面活性剂的吸收层性质(强度、表面形态学等)影响很大。在以上所述的意义上，乳剂的稳定性问题只能通过通常的颗粒研究化学胶体方法解决，而不评价结构特性。能够提供关于粒径及颗粒结构整体性的信息的简单方法和手段的发展非常有限。因此术语结构本身应该就乳剂而言更精确。
乳剂体外和体内稳定性研究的进展与术语结构的广义化和延伸有关，也取决于结构研究方法的发展。术语制剂的或物质的稳定性由该物质的性质或不同制剂的稳定性决定。决定乳剂性质的参数不足以表征乳剂稳定性。在这一方面的测试中，考虑到乳剂结构特征的关于乳剂稳定性的观点得到扩展。
碳乳剂的稳定性通常在储存期间乳剂的粒径发生变化后进行评价。这种纯的化学胶体方法是不够的。对于代表制剂基础并用于静脉内注射的乳剂而言，乳剂稳定性的信息不仅对于体外测试具有重要意义，而且对于乳剂流经血流时的稳定性的预测也提供了可能性。如果关于乳剂结构的信息非常清楚，则也可以获得这种信息。乳剂颗粒具有双层球体形状，中间有PFC(颗粒核)，表面有乳化剂层(壳)[12]。乳化剂的壳厚度不厚，为颗粒直径的5-10％。乳剂在血流中的行为(与血浆蛋白和血细胞的共同作用、清除速率等)以及长期储存的稳定性大部分取决于颗粒周围表面活性物质的强度和状态。基于这一原因，必需同时获取在这些作用或其它作用的情况下，关于待测介质中粒径和结构变化的信息。
对于作为灌流媒介基础的乳剂中结构变化的理论描述和分析应该强调以下观点[13]1)乳剂的“总体结构”以及它们的变化的特征是平均粒径和粒径分布。
2)“微结构”的特征是壳中的乳化剂状态以及乳化剂与PFC之间共同作用的程度、表面活性剂分子的相互位置、它们的排列、堆积密度、氧化程度和结构分子的相状态。
迄今为止，所有的研究者都局限在对于“一般结构”的分析上，而这一点是远远不够的。因为乳剂稳定性、生物相容性，特别是颗粒表面性质和颗粒吸收能力都是由微结构决定。
将本发明的乳剂与原型进行比较，首先研究在制备的乳剂的不同的储存时间内表征一般结构变化的参数。
第二，在可以评价乳剂微结构状态的条件下，模拟破坏性因素对乳剂的作用。采取用水稀释形式的称为“应激作用”的方法，与未经处理的乳剂做比较，研究参数的具体变化。用水稀释乳剂将扰乱分散介质中的表面活性剂吸收层(壳)与表面活性剂分子之间的固有平衡。基于这一原因，它对于维持亚稳定系统(氟碳乳剂)的稳定性或其分解有特别的预测意义。
此外，研究在与作为系统模型的血清的接触过程中乳剂微结构和相容性(研究体外测试中乳剂的生物相容性)。两种异质分散系血清和氟碳乳剂的共同作用的特征是在渗透入血流过程中表面颗粒性质的变化和乳剂在储存中微结构的变化。在12个月的相同时间段内，研究一般结构和微结构的变化。
为检测上述状态参数在储存期间的变化，需要在测量期间不向待测系统中引入其它干扰因素的方法。因此，选择、测试并建立了光学测试方法。
为评价一般结构，本发明的发明人选择比浊法或浊度光谱法[14]。该方法还用于评价离心和分级分离后乳剂中的粒径分布情况。通过间接方法评价由氟碳化合物周围吸收层中的表面活性剂分子之间的相互作用的变化引起的乳剂微结构的变化或颗粒表面性质的变化，以找到待测乳剂与血清的相互作用因子(Kτ)，与乳剂与常规生理盐溶液的相互作用因子相比相对浊度Kτ＝τ1/τ2，τ1和τ2是指血清/乳剂和血清/常规生理盐溶液混合物的浊度，混合物中组分的比例进行相应的变化[15]。此外，将τ值的计算值和实验值进行比较以证实乳化颗粒性质的一致性τ计算＝∑Ni·τi(∑Ni＝1)，τi和Ni是指清除部分的浊度或比例，τ实验是同一乳剂样品在分级分离之前的浊度。
I.以下是本发明乳剂的具体组成。
组成1该乳剂含有40体积％的含有比例为1∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量50％的为全氟三丙胺及其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体的混合物的全氟补充剂，用5％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有卵磷脂，蓖麻油作为辅剂，其浓度为该卵磷脂总含量的15％，分散于具有以下组分的水盐介质中2mmol(115mg/l)氯化钠、2mmol一取代磷酸二氢钾(310mg无水盐/l)、7.5mmol二取代磷酸二氢钠(460mg无水盐/l)、318mmol甘露糖醇(58g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为310mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.195μm。
组成2根据组成1的乳剂，其特征在于它含有20体积％的含有比例为10∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量25％的量的为全氟三丙胺与其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体的混合物和另外的全氟-N-甲基环己基哌啶的混合物的补充剂，用25％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有大豆磷脂，大豆油作为辅剂，其量为卵磷脂总含量的10％，分散于具有以下组分的水盐介质中2mmol一取代磷酸二氢钠(276mg无水盐/l)、7.5mmol二取代磷酸二氢钠(460 mg无水盐/l)、278mmol甘露糖醇(50g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为270mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.1μm。
组成3根据组成1的乳剂，其特征在于它含有15体积％的含有比例为1∶10的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量5％的量的为全氟三丙胺与其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体和另外的全氟-N-甲基环己基哌啶的混合物的补充剂，用2％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有大豆磷脂和卵磷脂，葵花子油作为辅剂，其浓度为磷脂总含量的5％，分散于具有以下组分的水盐介质中1mmol一取代磷酸二氢钠(138mg无水盐/l)、3.7mmol二取代磷酸二氢钠(230mg无水盐/l)、100mmol甘露糖醇(18g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为105mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.08μm。
组成4
根据组成1的乳剂，其特征在于它含有10体积％的含有比例为2∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量0.2％的量的为全氟三丙胺与其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体和另外的全氟-N-甲基环己基哌啶的混合物的补充剂，用2％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有卵磷脂，葵花子油和大豆油作为辅剂，其量为卵磷脂总含量的2％，分散于具有以下组分的水盐介质中1mmol一取代磷酸二氢钠(138mg无水盐/l)、3.7mmol二取代磷酸二氢钠(230mg无水盐/l)、90mmol甘露糖醇(13g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为100mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.07μm。
组成5根据组成1的乳剂，其特征在于它含有2体积％的含有比例为1∶2全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量10％的量的为全氟三丙胺与其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体和另外的全氟-N-甲基环己基哌啶的混合物的补充剂，用0.2％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有大豆磷脂，大豆油和蓖麻油作为辅剂，其量为大豆磷脂总含量的5％，分散于具有以下组分的水盐介质中2mmol氯化钠(115mg无水盐/l)、2mmol一取代磷酸二氢钠(276mg无水盐/l)、7.5mmol二取代磷酸二氢钠(460mg无水盐/l)、318mmol甘露糖醇(58g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为350mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.06μm。
组成6根据组成1的乳剂，其特征在于它含有10体积％的含有比例为4∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及为氟碳化合物总含量4％的量的为全氟三丙胺与其副产物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体的混合物的补充剂，用2％磷脂分散体稳定在乳化状态，该磷脂分散体含有大豆磷脂，葵花子油和蓖麻油作为辅剂，其浓度为磷脂总含量的4％，分散于具有以下组分的水盐介质中2mmol一取代磷酸二氢钠(276mg无水盐/l)、7.5mmol二取代磷酸二氢钠(460mg无水盐/l)、200mmol甘露糖醇(36g甘露糖醇/l)，在注射用水中。渗透压为225mosmol/l。乳剂颗粒的平均直径为0.09μm。
在下表6中，根据组成1-6列出本发明乳剂的组成。
表6氟碳乳剂的组成1-6
II本发明的乳剂组合物的制备方法的具体实施方案和所述乳剂的理化性质。
实施例1无菌条件下制备乳剂1.1为制备，用10体积％的PFC和1％磷脂分散体制备11乳液。
1.2第一步分散体的制备向无菌圆底烧瓶中加入100ml10％卵磷脂的乙醇溶液。在旋转蒸发仪中蒸馏乙醇。加入1g蓖麻油(辅剂浓度为卵磷脂含量的10％)和900ml水盐溶液。
1.3使用无热原的水制备水盐溶液。将含有一取代磷酸二氢钠、二取代磷酸二氢钠和甘露糖醇晶体的粉末在干燥箱中在110℃下干燥2小时。此后，在无菌条件下的层流装置中，将0.138g无水一取代磷酸二氢钠、0.523g无水二取代磷酸二氢钠和50.0g甘露糖醇溶于11无热原的水中。将所得的水盐溶液滤过从Millipor公司获得的孔径为0.4μm的无菌滤器。
1.4在烧瓶中将植物油和水盐溶液的混合物机械搅拌至获得乳黄色匀质悬浮液。将所得的磷脂悬浮液加入高压均化器的无菌容器中。
1.5提前将均化器用过热水蒸气和500ml乙醇灭菌，并用500ml无热原的热水洗涤。
1.6在100atm压力下，将磷脂悬浮液通过均化器处理4次直至获得半透明的匀质液体。将所得分散体滗出至玻璃容器中。用无菌惰性气体(氮气、氩气或氮气和二氧化碳的混合物)将玻璃容器处理2-4分钟。
1.7用胶皮密封物将玻璃容器密封，盖上铝帽。此后，将容器在100℃下灭菌1小时。将容器储存于室温下直至下一制备步骤。
1.8下步中处理PFC。将72ml PFD与8ml PFOB混合。将20ml全氟三丙胺加入80ml该组合物中。将所获得的含有PFD和PFOB的组合物和氟碳补充剂与等体积的医用乙醇混合。用分液漏斗将较重的全氟碳相从乙醇中分离出来。将分离的混合物与三倍体积的无热原的水混合，振摇，并在分液漏斗中分离(氟碳比重差不多超过水比重两倍)。
1.9此后制备乳剂。将900ml磷脂分散体和100ml处理过的氟碳混合物(含有PFD/PFOB＝9/1+PFTPA-20％的组合物)加入均化器中。将内容物在500atm下机械搅拌使之分散，整个体积流经该器8次，直至获得半透明、带有乳白色的淡黄色液体即亚微乳剂。将乳剂滗出至每个为100ml的玻璃容器中。用胶皮密封物将玻璃容器密封，盖上铝帽。
1.10将容器中的乳剂在100℃加热灭菌1小时，然后冷却并在4℃储存一年。
所得乳剂具有以下组成氟碳相(Cv)10体积％，PFD与PFOB比例9/1，PFTPA在氟碳混合物中的相对含量为20％，卵磷脂浓度为1重量％，蓖麻油浓度为0.1重量％(悬浮液中作为辅剂的蓖麻油的相对含量为卵磷脂总含量的10％。批号1。
用BПЖ-2型粘度计测量该批的粘度，为0.953cP(厘泊)。与含有相同氟碳相含量的Perftoran相比，粘度为2.5cP(厘泊).
实施例2乳剂如实施例1所述相同的组成制备。选择1∶1的大豆油和蓖麻油混合物作为辅剂。乳剂具有以下组成Cv10体积％，PFD/PFOB 9∶1，PFTPA相对含量20％，卵磷脂浓度1重量％，相对辅剂含量(大豆油/蓖麻油1∶1)为10％。批号2。
实施例3乳剂如实施例1所述相同的组成制备，不过体积为800ml，氟碳含量为20体积％。将200ml 10％大豆磷脂的乙醇溶液加入圆底烧瓶中。在旋转蒸发仪中蒸馏乙醇。加入3g辅剂(大豆油和蓖麻油的1∶2混合物，辅剂浓度为卵磷脂的15％)。水盐溶液含有0.276g无水一取代磷酸二氢钠、1.046g无水二取代磷酸二氢钠和10.0g甘露糖醇。将11水盐溶液加入含有辅剂的烧瓶中，在均化器中振摇分散，如实施例1所述滗出至玻璃容器中并灭菌。制备氟碳相，将40ml PFOB加入160ml PFD中。从这一量中，取出160ml与40ml PFTPA混合。清洁后，将所得的200ml全氟碳混合物逐滴加入含有800ml大豆磷脂分散体的均化器中。将所得乳剂滗出并灭菌。
该乳剂具有以下组成Cv＝20体积％，PFD与PFOB比例8∶2，PFTPA相对含量20％，大豆磷脂浓度2重量％，相对辅剂含量(大豆油/蓖麻油1∶2)为15％。批号3。
实施例4乳剂的制备如实施例1所述，只是PFD与PFOB的比例为8∶2。将30ml PFMHP加入170ml该组合物中，振摇混合，按常规方法清洁，并逐滴加入均化器中，该均化器中含有800ml含大豆磷脂的分散体(如实施例3中所述获得)和相同辅剂量为大豆磷脂含量的15％的比例为1∶2的大豆油和蓖麻油。将乳剂在400atm压力下分散。
乳剂具有以下组成Cv＝20体积％，PFD/PFOB比例8∶2，PFMP的相对含量15％，大豆磷脂浓度2重量％，辅剂相对含量(大豆油/蓖麻油1∶2)为1 5％。批号4。
实施例5乳剂制备方法如实施例1所述，只是加入不同量的卵磷脂。将50ml卵磷脂加入圆底烧瓶中。在旋转蒸发仪中蒸馏乙醇。加入0.6g葵花子油和0.5g常规盐溶液，振摇混合，在150atm下均化。将25mlPFD和25ml PFOB混合制备PFD/PFOB的5∶5混合物。将49.5ml混合物与0.5ml PFTPA混合。加入50ml混合物，清洁后，向均化器中加入0.95l卵磷脂悬浮液。预悬浮液的均化在350atm压力下进行。根据所述规则，将微细分布的乳剂滗出并灭菌。
该乳剂具有以下组成Cv＝5体积％，PFD/PFOB比例5∶5，PFTPA相对含量1％，卵磷脂浓度0.5重量％，辅剂相对含量葵花子油12％。批号5。
实施例6将50ml 10％大豆磷脂的乙醇溶液加入圆底烧瓶中。根据上述方法蒸馏乙醇。加入0.6g大豆油和950ml盐溶液。混合后，在180atm下在均化器中制备分散体。灭菌后，用分散体制备乳剂。将25ml PFD和25ml PFOB混合制备PFD和PFOB的组合物(比例为5∶5)。将0.5mlPFMHP加入49.5ml该混合物中。用50ml乙醇清洁后，将混合物在含有950ml大豆磷脂的均化器中处理。如上所述，均化分两个阶段进行，第一阶段在200atm压力下，第二阶段在500atm压力下。
该乳剂具有以下组成Cv＝5体积％，PFD/PFOB比例5∶5，PFMHP相对含量1％，大豆磷脂浓度0.5重量％，辅剂相对含量(大豆油)为12％。批号6。
实施例7制备大豆磷脂浓度为0.2重量％的悬浮液。此外，向旋转蒸发仪中加入20ml大豆磷脂的乙醇溶液。蒸馏乙醇。向其中加入大豆油和葵花子油比例为1∶1的混合物作为辅剂。如实施例6所述加入980ml常规盐溶液进行分散并灭菌。
将4ml PFD和16ml PFOB(比例为2∶8)混合制备PFD/PFOB的组合物。将1ml PFMHP加入19ml该混合物中。将20ml所得的这三种组分的混合物与980ml悬浮液均化。均化如以上实施例所述进行。根据标准方法进行灭菌和滗出。
所获得的乳剂具有以下组成Cv＝2体积％，PFD/PFOB比例2∶8，PFMHP相对含量5％，大豆磷脂浓度0.2重量％，相对辅剂含量(大豆油/葵花子油1∶1)1％。批号7。
实施例8为制备乳剂，用40重量％的卵磷脂悬浮液制备浓度为5重量％。另外将500ml卵磷脂的乙醇溶液加入烧瓶中。蒸馏乙醇。向其中加入2.5g蓖麻油作为辅剂和600ml常规盐溶液。混合后，在200atm压力下在均化器中进行分散直至获得匀质黄白色介质。如上所述进行灭菌。
将4ml PFD和360ml PFOB(比例为1∶9)混合制备混合物。将40ml PFMHP加入360ml该混合物中。将获得的400ml这三种组分的混合物与600ml卵磷脂悬浮液分两个阶段均化，第一个阶段在250atm压力下，第二个阶段在600atm压力下。根据标准方法滗出并灭菌。
该乳剂具有以下组成Cv＝40体积％，PFD/PFOB比例1∶9，PFMHP相对含量10％，卵磷脂浓度5重量％，相对辅剂含量(蓖麻油)5％。批号8。
实施例9
将40ml PFD和360 PFOB混合制备氟碳相。将40ml PFMHP和40ml有机液体的混合物80ml加入320ml该混合物中。该乳化剂悬浮液含有4.2重量％卵磷脂、4.2重量％大豆磷脂和4.2g含有比例为9∶1蓖麻油和葵花子油的辅剂，即辅剂量为该卵磷脂总含量的5％。
为制备乳剂，将600ml悬浮液与400ml三种组分的混合物加入均化器中。如以上实施例中所述进行均化、滗出和灭菌。
该乳剂具有以下组成Cv＝40体积％，PFD/PFOB比例为1∶9，PFMHP和有机液体相对含量20％，磷脂浓度(卵磷脂和大豆磷脂1∶1)5重量％，相对辅剂含量(蓖麻油和葵花子油9∶1)0.25％。批号9。
表7获得的各批乳剂的组成(实施例1-9)
所有批次的组分均列于表7中。
表8中给出了原样(native)(未稀释)乳剂和水稀释乳剂储存不同时间平均粒径的研究结果。
表8实施例1、3、4、5、8和9的原样碳氟乳剂和水稀释氟碳乳剂的波长指数和平均粒径
根据最小二乘法计算n值。确定n时的平均方差为0.01-0.03。因此确定n的误差＝0.3-1％。参数n是浊度光谱方法中的特征性函数，由至少3-5点计算。对于微细分布的乳剂，n明确地与平均粒径有关[14]。
根据获得的结果，平均参数n和a在储存12个月的情况下几乎没有改变。水稀释作为应激作用对粒径的影响很小。观察到含有大豆磷脂的乳剂在9-12月的晚期内a值有轻微的升高。所有批次的含有磷脂分散体的氟碳乳剂在储存达一年波长指数的变化范围在3.4和2.7之间。这与平均粒径从0.11至0.15-0.195μm的增大相对应。
为研究粒径分布，使用对待测介质进行分级分离的方法。在温和条件(1500rpm)下将乳剂离心，并(精确地)分离为3部分样品体积的上面部分20％、中间部分60％和下面部分20％(

图1)。从图1中可以看出，作为原型的碳乳剂除了具有粒径不同的三个部分以外，由于吸收层与油相间弱的结合以及在吸收层中没有结合的表面活性剂还有含有游离磷脂的较轻部分。测量每个部分的a值和n值。本发明的组合物分级分离乳剂储存1-12个月的所述参数见表9。上面部分和中间部分在储存期间n值和a值没有变化。下面部分随储存时间增长粒径有轻微的增大。这导致粒径分布宽度的扩伸。从而最大分布宽度为0.06-0.19μm。
所得结果表明原样乳剂和水稀释乳剂(应激作用)的平均粒径在12个月内有轻微的增加，但保持在低于0.20μm的可接受的限度。
表9来自实施例1、3、4、5、8、9的乳剂储存12个月中表征粒径分布宽度的参数n和a(离心后的上、中、下＝部分)
发现观察到的粒径分布宽度增加是在具有相对大的颗粒的乳剂中。在储存12个月后乳剂分级分离中，下面部分的粒径从0.12增至0.198μm。总的来说，这一结果与Ostwald分解机理(或分子蒸馏)一致。这种相对较大的颗粒的比例很低(～10％)，并没有破坏平均粒径的增加。应该强调，在乳剂的分级分离中仅观察到均匀颗粒沉降，结果证明即使在储存一年以后还是没有游离磷脂。因此乳剂中的颗粒分布保持着单分子物质(monomodal)。所得结果表明所得乳剂在1-12个月的储存期内保持了一般结构。
颗粒与血清的相互作用指数Kτ见表10，所述血清中通过以1∶1的比例加入5％白蛋白溶液进行改良。
氟碳乳剂与血清的相互作用指数表征乳剂的微结构，表明含有卵磷脂的氟碳乳剂储存12个月该指数有一个轻微的变化范围(血清-乳剂比例1∶0.05和1∶0.1)。当比例增加至1∶0.10时，Kτ和Kτ/2的变化范围也变宽。含有大豆磷脂的氟碳乳剂，Kτ只在储存达6个月内保持较小的变化范围。如上所述，观察到的变化很可能是由于在乳剂的不同储存时间内很难在测试系列中使血清混合物标准化。同时，每批血清和乳剂间的相互作用的变化范围维持在特定较窄的限度内说明在长期储存期间(6-9个月)，颗粒表面性质的变化很小。乳剂中不含磷脂时在储存的末期Kτ发生突然的改变可能是由于颗粒与血清中的大分子之间产生了额外的相互作用。为检验这一假设，分别计算了浊度τ的实验值和计算值，浊度τ是评价氟碳乳剂的结构总体性的另外的独立参数(表11)[13]。
表10在+4℃温度下不同储存时间乳剂与血清的相互作用指数
从物理的角度而言，τ是指不存在共同作用和多种分散体的情况下，只含有一些颗粒的分散系统中光线输出降低量的总和。未稀释乳剂与水稀释乳剂的τ的计算值和实验值的一致证明颗粒与血清大分子之间的相互作用即使在+4℃下储存9-12月后也几乎未发生改变。因此Kτ的突然变化可能与全氟碳/磷脂的另外超分子结构在水分散体中出现有关，氟碳与磷脂的比例与在乳剂中相同。
表11不同储存时间的乳剂的浊度实验值和计算值
在讨论本发明的氟碳化合物的组成和制备方法的优点之前，应该强调乳剂在血流中流动时实现气体运输功能的主要条件是维持颗粒的微粒性质，且不产生反应原性。从胶体化学和生物物理的角度，乳剂进入血流中可以视为一种应激作用，其可能导致分散体性质的变化。这一作用可能产生以下现象，即乳剂的稀释和分散体中有机乳化剂浓度的降低(快速期)。这一过程结果导致表面活性剂与颗粒表面分子结合的减弱(缓慢期)。表面活性剂与氟碳化合物之间结合的这一减弱在颗粒与血浆大分子之间的接触和相互作用的影响下被进一步削弱。这导致吸收层组分或颗粒破坏现象的改变。以上描述的过程发生的顺序是很简化的代表。
在这一方面的测试中，用水稀释乳剂模拟第一阶段，即乳剂的稀释和颗粒周围游离乳化剂浓度的降低。对于所获得乳剂与血浆的相互作用的实验模拟第二阶段，即血浆大分子接触对于颗粒表面性质的影响。已发现即使在储存一年之后，乳剂颗粒仍保持着它们的微结构，用水稀释没有影响粒径，结果证实了表面活性剂吸收层与颗粒核全氟碳化合物之间的强力结合。乳剂颗粒与血清的相互作用指数(在测量误差的限度内)也没有发生改变，维持了颗粒的表面性质。τ的计算值(分级分离之后)与实验值(分级分离之前)一致证明了储存一年后颗粒保持其性质(颗粒结构)以及乳剂中不含游离磷脂。
所采用的方法显著增加了预测乳剂进入血流后稳定性的准确性。对于具有相同组成的几批乳剂的稳定性和反应原性指数(Ip)的平行研究结果证明了上述内容。指数Ip根据方法[3]确定。
实施例10制备具有实施例2所述组成的四批相同乳剂氟碳基础9±1体积％，PFD与PFOB比例9∶1，有机液体补充剂20％，卵磷脂1重量％，辅剂(蓖麻油和大豆油1∶1)，为卵磷脂浓度的8％。
在下表12中列出了不同储存时间的这些批乳剂的n和a值。
表12具有相同组成PFD/PFOB/Fl/卵-p的乳剂不同储存时间的波长指数n和平均粒径
表13通过将具有相同组成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳剂离心进行分级分离中，表征粒径分布宽度的波长指数n和平均粒径a
根据获得的数据，在所有情况下原样乳剂和水稀释乳剂的平均粒径在6个月的储存期内保持不变，都在0.06-0.17μm的范围内。具有所示组成的原样乳剂和水稀释乳剂的粒径分布宽度在所述的研究期间内几乎完全没有变化(表13)。所获得的乳剂与改良血清之间的相互作用指数Kτ的相对测量误差(±10％)在较窄的限度内变化(见下表14)。
表14具有相同组成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳剂与白蛋白改良血清(80％)之间的相互作用指数Kτ
表15具有相同组成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳剂的反应原性指数(测试中使用卵磷脂分散体)
所得结果证明本发明的乳剂和制备方法能够得到高质量的乳剂微结构，在非冷冻状态下储存以及随后的体外应激作用(水稀释、与富集白蛋白的血清相互作用)都没有破坏其微结构。相同乳剂模式的反应原性测试的结果完全证实了模拟测试的结果。研究中任何一点反应原性都没有超过临界值3(见表15)。
实施例11具有5体积％低氟碳含量的乳剂的结构的完整性和对乳剂反应原性的研究该乳剂具有以下组成PFD/PFOB 1∶1，PFMHP 1％，大豆磷脂0.5％，大豆油为辅剂12％，粒径分布宽度0.03-0.12μm，起始反应原性1.61。研究了四批相同的原样乳剂和水稀释乳剂的平均粒径变化(见表16)以及储存6个月后的反应原性(见表17)。从所示数据可以看出，所使用的制剂中粒径的增大和本发明的制备方法确保了获得较低的反应原性。
表16具有相同组成PFD/PFOB/Fl/大豆磷脂的原样乳剂和水稀释乳剂的波长指数n和平均粒径a
表17低氟碳含量的乳剂在非冷冻状态储存6个月后的反应原性Ip
实施例12乳剂在18个月内的长期储存，其含有10体积％的氟碳化合物，PFD/PFOB比例8∶2，有机液体20％，卵磷脂2％，蓖麻油作为辅剂10％。不同储存时间和水稀释剂的平均粒径的研究结果见表18。乳剂与富集达到50％白蛋白的血清之间的相互作用情况见表19。
表18原样和水稀释乳剂PFD/PFOB/Fl/卵磷脂以非冷冻状态在不同储存时间的波长指数n和平均粒径a
表19不同储存时间的乳剂PFD/PFOB/Fl/卵磷脂与白蛋白改良血清(50％)之间的相互作用Kτ
从以上数据可以看出，所得得乳剂保持着可测量的理化性质。结果乳剂储存18个月后反应原性为1.5。
实施例13将原型Oxygent AF 0104(生产商Alliance Therapeutic，USA)与根据本发明方法制备的乳剂就质量方面进行比较。该比较以水稀释的波长指数和平均粒径的变化的函数来进行。
在待比较的具有不同绝对氟碳含量的乳剂中，保持氟碳化合物与磷脂的比例相同。所述乳剂的制备方法不同。结果乳剂PFOB-2(根据本发明方法制备)在离心后不含有游离磷脂相(见图16)，Oxygent和原型PFO-1在吸收层中含有未结合的游离磷脂，其在离心时很容易漂浮(见图1A)。基于这一原因，用水稀释Oxygent时，该乳剂的粒径降至0.35-0.15，磷脂聚集，并且乳剂颗粒发生分解。
在原型乳剂(PFOB-1)中，很清楚没有这些粗糙的聚集物。但是它们的存在除了影响离心结果之外，还使根据原样乳剂和稀释乳剂的相加规则确定的计算和实验浊度参数之间有较大差异。对于根据本发明方法制备的乳剂，观察到的实验和计算浊度值几乎完全一致(见表21)。应该注意，从物理的角度而言，待测的参数是指不存在共同作用和多种散射物的情况下，单个颗粒光线能量降低量的总和。Oxygent和原型的实验和计算浊度值不一致证明其不符合相加规则，即在上述分散系统中颗粒与光通量之间发生了另外的相互作用。这种相互作用可以在Oxygent和原型的水稀释中清楚地检测到，结果没有实现颗粒类型的均一性，而是除氟碳乳剂之外，产生不同的磷脂胶束结构。对于乳剂PFOB-2和PFD/PFOB(批号5-03)，颗粒与光通量之间的相互作用即使在非冷冻状态下储存1个月之后仍符合相加规则。

图1制备方法使得氟碳乳剂分离为不同部分A根据原型(乳剂含有游离磷脂)，B根据本发明的方法(乳剂仅含有不同粒径的颗粒)。1、2、3是指上面、中间和下面部分。1a是指上面部分中的游离磷脂。
表20不同氟碳乳剂的组成，未稀释乳剂和水稀释乳剂(1∶1)的波长指数n和平均粒径a
表21根据相加规则实验和计算浊度值之间的一致
因此所述实施例表明了根据本发明的乳剂的所述组成以及所述制备方法和与本发明最接近的原型和乳剂相比的完整的一系列优点。因为以下的协同作用这是可能的。
1.选择PFD和PFOB作为主要组分是因为根据它们的生物学性质和理化性质证明这些全氟碳化合物是生物学可接受的，并已证明它们从生物体中快速清除，即从沉积氟碳颗粒的网状内皮系统的细胞中快速清除。
2.以有效的比例共同使用PFD和PFOB得到混合油相，其性质从中心向外周逐渐改变。这使得在蒸气压相当较低的成分(见表1)中使用亲脂性差和没有亲脂性的叔胺成为可能，并因此降低亲脂性分子PFD和PFOB向水相中扩散。这降低了乳剂分解主要机制Ostwald熟化的速率，并增加氟碳乳剂中所选成分的稳定性。
3.将PFOB引入乳剂成分中增强了它们具有相同氟碳含量时的氧吸收能力，有助于增加另外的x射线对比性质。
4.PFOB/PFD和叔胺混合物由于颗粒周围表面活性剂吸收层的更强结合而有助于降低最终形式的粘度，结果使在乳剂的水相中排除游离胶束形式的磷脂成为可能。
5.使用除磷脂以外的理化性质不同的油促进以较少量的磷脂在颗粒周围形成更紧密的膜样吸收层，并防止不含氟碳化合物的胶束结构的形成。
6.所使用的水盐介质的性质保证颗粒表面带有负电荷，结果防止颗粒在储存和运输期间聚结。
7.除了保证制备高标准(calibrated)乳剂(粒径分布窄)的加工技术方法之外，上述方法还减少分子蒸馏，并提高乳剂稳定性。
8.没有颗粒聚集物和胶束形式磷脂保证了乳剂的吸收性质和乳剂激活血流中补体的性质，结果产生低反应原性，增加了根据本发明组分的乳剂的生物相容性。
III以下说明本发明的乳剂的生物医学用途测试。
测试1对于该乳剂作为大量血液替代物的用途，用体重为250-300g(n＝20)的健康Wistar大鼠对根据实施例1(第二部分)的方法制备的氟碳乳剂进行容积替代，大鼠用戊巴比妥钠麻醉。测定大量血液替代后的存活能力，并在等同失血后获得肝线粒体(见方法[16])。为保证大量血液替代后的胶体渗透压，在灌流之前将乳剂与20％人白蛋白以1部分白蛋白比6部分乳剂的比例混合，使白蛋白终浓度为3.5％(相对于乳剂中含有10体积％的氟碳化合物这一事实)。在血液替代期间，大鼠在透明的Plexiglas罩中呼吸氧气富集率达到FiO2＝0.5的空气。罩盖住动物头，动物仰卧固定。从静脉窦(右侧前庭)取3.5ml血液，将3.5ml乳剂注射至静脉窦中。10分钟后，取出3.5ml血液，并注入等量乳剂。重复这一步骤直至取出的血量平均至少是动物体重的3.5％；例如，对于体重250g，取出的血量和注入的乳剂量分别是8.8ml。在血液替代之前和之后，测定外周血液中的血红蛋白、动脉血和静脉血中的氧分压和pH值。在这一测试系列中，血液替代后的血红蛋白浓度平均降低1.9。在对照组(n＝20)中，注射0.15mol氯化钠和3.5％白蛋白溶液代替乳剂。用核磁共振光谱测定外周血液中氟碳含量。血液替代后，将动物置于氧气富集率达到FiO2＝0.5的小室中。
在测试组中(进行血液替代)，所有的动物都存活下来，血红蛋白、红细胞和白细胞在5天之内恢复至正常值。在对照组中，3只动物死亡。5天后，经戊巴比妥钠麻醉处死所有动物，从肝脏中分离线粒体。在恒温密闭的操作小室中以偏振测定方法记录肝线粒体在27℃下的呼吸。发现活性状态(有ATP合成)的呼吸速率和由3-羟基丁酸对NAD依赖性底物的氧化而产生的ATP合成平均降低了1.5，琥珀酸的氧化激活了20％。这些数据证明存在严重的缺血性损伤。在血液替代5天后分离的肝线粒体中，观察到呼吸速率和ATP合成都平均激活25％，结果在回忆中存在严重缺氧状态。
测试2所有处理均如前述实施例中所述进行，只是使用20％的氟碳乳剂。血红蛋白含量与起始值相比降低了三倍，平均65-70体积％的血液被替代。对于体重为250g，取出的血液体积和注入的血液替代剂的体积分别为12.25ml。在测试组中，所有的动物都存活下来，对照组中有5只动物死亡。
测试3所有处理均如前述实施例1中所述进行。但是血液替代后6小时、1天和3天后将每组中5只动物处死。分离肝线粒体，记录磷酸化呼吸。在对照组中，观察到对呼吸速率和NAD依赖性底物氧化磷酸化和琥珀酸氧化磷酸化的迅速抑制，抑制水平平均在50％以上，这表明线粒体严重缺血性损伤。在测试组中，血液替代后6小时观察到磷酸化呼吸被激活40％，这一激活保持1天，血液替代后第三天最高为25％。这些变化是被保存的、缺氧而不是缺血的肝线粒体的特征。
测试4本测试涉及失血性休克后保存狗的肾脏。通过向两肾都切除的动物中移植肾以后进行肾复苏(试验在得到卫生部伦理委员会的特殊许可之后进行)，以及通过在血液替代后1小时评价肾中的腺嘌呤核苷酸含量和乳酸和丙酮酸含量而确定肾的保存。测试在10只狗中进行，每组5只。
测试步骤在插管麻醉控制呼吸的情况下，从体重为20kg的狗股动脉中取出400ml血液，结果血压迅速降低(达到50-60mmQS)，发生心脏双重收缩，血浆中乳酸浓度升高达到20mmol。取出血液1小时后，向测试组的动物提供体积超出失血量15体积％的血液替代剂，即根据实施例1的含有达到3.5％白蛋白补充剂的10％碳乳剂(如实施例14中所述)，向对照组的动物提供血浆扩张剂polyglucine。再过1小时，将动物处死，切除肾脏。将一个用于移植，另一个用于检测肾组织的能量交换。
在对照组中，ATP与ADP的比例降低了三倍，能荷([ATP]+1/2[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])降至0.45。在测试组(用氟碳乳剂替代血液)中，ATP与ADP的比例降低了至多两倍，能荷降低至0.65-0.70。肾组织中乳酸与丙酮酸的比例在对照组中升高至25-30，在测试组中至多升高至6。
在所有情况下，在具有用氟碳化合物处理的那些狗的移植肾脏的接受动物中，在移植物的内含物进入血流之后立即观察到排尿。在对照组中，5只动物中有2只发生再灌注损伤并有快速的组织水肿和完全的血流停止(肾病)。对照组中有3只动物移植肾中血流重建。仅在几个小时后观察到排尿。
这些数据表明用本发明的氟碳乳剂在狗中治疗失血性休克确保了对器官更好的保护，使之免于发生缺血和后续的再灌注损伤。
测试5该测试涉及根据实施例制备的氟碳乳剂用于保存灌流的兔心脏的用途。使用前(1-2小时)，将400ml氟碳乳剂与200mlKrebs-Henseleit等渗溶液以2∶1比例混合。将80ml20％血清白蛋白溶液加入600ml该混合物中。用于对比测试的对照组合物含有600ml盐溶液以及7.2g甘露糖醇和80ml 20％白蛋白溶液作为补充剂。将这些组合物用作保存兔心脏的灌流介质。在37℃下进行循环方式的Langendorff灌流。记录维持心脏收缩的频率和幅度的时间。对照组和测试组分别使用8只心脏。在使用基于氟碳化合物的灌流液体中，将离体兔心脏的收缩能力至少保持了6-8小时。但是用对照组合物灌流中，却观察到心脏收缩频率和幅度的大幅下降直至心脏停搏。
总之，应提及本发明的乳剂和与本发明最接近的原型和乳剂相比，其优点如下。
本发明的氟碳乳剂制剂和制备方法确保得到微细分布、规定粒径范围在0.06至0.195μm之间的高标准乳剂，其含有2-40体积％的氟碳化合物，并用于生物学可接受的水盐溶液中的磷脂分散体进行稳定化。已证明以非冷冻状态储存18个月所述氟碳乳剂仍具有高的细度和微结构，使获得高度的生物相容性成为可能，其表现为低的反应原性。所研制的乳剂可应用于生物医学目的，即用于大量失血的替代物，用于治疗失血性休克，用于预防缺血性再灌注损伤，用于制备移植器官和用于灌流保存离体器官。所研制的乳剂具有非常显著的氧运输和流变学性质，确保预防和消除氧依赖性线粒体功能的缺血损伤，以及支持组织在血液替代和治疗失血性休克中的有氧能量交换。
参考文献1.Periodical of the Russian Mendeleyev Chemistry Association，1985，volume 30，no.4，p.387-394.
2.J.G.Rieses et al.Physiological Activity of fluorine-containingCompounds(Tests and Clinical Examinations)，collection of scientificworks，Puschtschino，1995，p.73-90.
3.M.B.Berkos，abridged dissertation...doctorate in medicalscience，Leningrad，1991，24 pages4.J.G.Rieses，Chem.Rev.，2001，V.101，no.9，p.2797-2914.
5.RU Patent 2162692，C1.7 A61K31/02，9/10，19996.RU Patent 2199311，C1.7 A61K9/107，31/02，20017.US Patent no.3 778 381，19738.US Patent no.6113919，20009.US Patent no.4866096，A61K31/025，1989
10.US Patent no.5374624，A61K31/025，199411.RU Patent no.2088217，6 A61K9/10，31/02，199712.Biophysics，1998，volume 33，no.1，p.126-12913.I.N.Kusnezowa，abridged dissertation...doctorate in biologicalscience，St.Petersburg，1999，38 pages14.Chemical-Pharmaceutical Periodical，1987，no.12，p.1498-150315.Periodical for Physical Chemistry，1993，volume 67，no.9，p.1884-188816.E.I.Majewskij，abridged dissertation...doctorate med.science，Moscow，1998，36 pages.
权利要求
1.医用氟碳乳剂，其包含迅速清除的氟碳化合物如全氟萘烷或全氟辛基溴，以及氟碳补充剂和磷脂，其特征在于全氟萘烷和全氟辛基溴的组合物作为迅速清除的组分，其中所述氟碳补充剂代表全氟叔胺混合物，而所述磷脂作为在水盐介质中的分散体使用。
2.根据权利要求1的乳剂，其特征在于其含有2-40体积％的氟碳化合物。
3.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述迅速清除的氟碳化合物的组合物含有比例为10∶1至1∶10的全氟萘烷和全氟辛基溴。
4.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述氟碳补充剂占所述迅速清除的氟碳化合物的组合物总含量的1-50％。
5.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述全氟叔胺混合物含有全氟三丙胺与其副产物即全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的顺式和反式异构体的混合物。
6.根据权利要求1和5的乳剂，其特征在于所述全氟叔胺混合物还含有全氟-N-甲基环己基哌啶及其副产物。
7.根据权利要求1的乳剂，其特征在于其含有浓度为0.2-5重量％的在水盐介质中的磷脂分散体。
8.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述在水盐介质中的磷脂分散体含有卵磷脂或大豆磷脂或这些脂质的混合物。
9.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述在水盐介质中的磷脂分散体含有辅剂植物油，其量为所述磷脂总含量的1-15％。
10.根据权利要求9的乳剂，其特征在于大豆油作为辅剂。
11.根据权利要求9的乳剂，其特征在于葵花子油作为辅剂。
12.根据权利要求9的乳剂，其特征在于蓖麻油作为辅剂。
13.根据权利要求9的乳剂，其特征在于以有效比例的所述油的混合物以两倍或三倍混合物的形式作为辅剂。
14.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述水盐介质的组合物含有氯化物和磷酸盐的钠盐和钾盐，并还含有在注射用水中的单糖甘露糖醇。
15.根据权利要求1的乳剂，其特征在于所述在水盐介质中的组分的浓度具有100-350mosmol/l的渗透压。
16.根据权利要求1-15之任一项的乳剂，其特征在于平均粒径不超过0.2μm，并在0.06-0.2μm的范围内。
17.制备氟碳乳剂的方法，其包括在高压下均化，其特征在于经多步骤进行，所述多步骤即制备在水盐介质中的磷酯分散体的第一步，将氟碳化合物在磷脂分散体中均化的第二步，将制备的乳剂加热灭菌的第三步，以及之后在+4℃下以非冷冻状态储存至少6个月的第四步。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于所述在水盐介质中的磷脂分散体通过在至少100atm的高压下均化，随后加热灭菌来制备。
19.根据权利要求17的方法，其特征在于将所述磷脂分散体中的氟碳化合物在300-650atm压力下均化。
20.根据权利要求17的方法，其特征在于将所述磷脂分散体在100℃下灭菌。
21.根据权利要求17的方法，其特征在于将所述氟碳乳剂在100℃下灭菌。
全文摘要
本发明涉及医学，特别是用于治疗血液丧失、缺氧和缺血病症，用于改善血液氧运输，以及用于保存离体灌流器官和组织的药物。本发明的全氟有机化合物的医用乳剂包含迅速清除的全氟有机化合物如全氟萘烷或全氟辛基溴、全氟叔胺混合物形式的全氟有机补充剂和水盐分散体形式的磷脂。所述全氟萘烷和全氟辛基溴以10∶1至1∶10的比例包含在迅速清除的全氟有机化合物组分中。全氟叔胺混合物是全氟三丙胺与其副产物全氟－1－丙基－3，4－二甲基吡咯烷酮和全氟－1－丙基－4－甲基哌啶顺式和反式异构体的混合物的形式。本发明的制备乳剂的方法在于制备磷脂的水盐分散体，在高压下将其中的全氟有机化合物均化以及将最终乳剂加热灭菌。本发明的乳剂在+4℃下以其非冷冻状态的储存期等于至少6个月，此期间保持了所述乳剂与生物介质(血液、血浆或血清)之间的生物相容性。
文档编号A61P7/00GK101014326SQ200580013930
公开日2007年8月8日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年3月1日
发明者伊琳娜·尼古拉伊夫娜·库兹涅佐娃, 叶夫根尼·伊利希·梅伊夫斯基 申请人:叶夫根尼·帕夫洛维奇·格尔马诺夫, 伊琳娜·尼古拉伊夫娜·库兹涅佐娃, 叶夫根尼·伊利希·梅伊夫斯基