专利名称：通过四组分的缩合反应来制备大分子共轭物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分子和水溶性聚合物的共轭物的制备方法，且特别涉及通过四组分的缩合反应来制备这样的共轭物。
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背景技术：
亲水性聚合物，如聚乙二醇(PEG)，已经用于修饰各种物质，如多肽、药物和脂质体，以便降低物质的免疫原性和/或提高其血液循环持续时间(Zalipsky & Harris，1997)。例如，肠胃外给药的蛋白质是免疫原性的并具有短的药理学半衰期。一些蛋白质也相对是水不溶性的。因此，难以在患者体内获得治疗上有用的蛋白质血液水平。
已经作为克服这些困难的方法描述了亲水性聚合物尤其是PEG(Zalipsky & Harris，1997)和蛋白质的共轭。例如，Davis等在U.S.专利No.4,179,337中描述了PEG和蛋白质如酶和胰岛素共轭来形成具有较低免疫原性而仍然保持基本部分生理活性的PEG-蛋白质共轭物。Veronese等(Applied Biochem.and Biotech，11141-152(1985))描述了用苯基氯甲酸酯激活聚乙二醇，用于各自共轭到核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等在U.S专利No.4,766,106和4,917,888中描述了通过聚合物共轭来溶解蛋白质。U.S.专利No.4,902,502(Nitecki等)和PCT公开No.WO90/13540(Enzon，Inc)描述了PEG和其他聚合物与重组蛋白质的共轭来降低免疫原性并提高半衰期。
还描述了将PEG用于改进脂质体的血液循环持续时间(U.S.专利No.5,103,556)。将PEG聚合物共价连接脂质的极性头部基团，以便遮掩或屏蔽脂质体以免被网状内皮系统识别和清除。
综述了用于将PEG连接到生物相关分子的各种共轭化学方法(Zalipsky，1995a)。
发明概述本发明提供了制备水溶性聚合物，优选是PEG聚合物与生物活性或生物相关分子尤其是多肽的共轭物的通用方法。通常以位点特异性或位点选择性方式来进行与生物分子的共轭。例如，该方法允许在多肽上选自胺、羧酸或合成引入的醛或酮的官能团连接PEG链。该方法还提供了以组合方式来制备不同的共轭物，如果需要。
一方面中，本发明提供了制备蛋白质或多肽与水溶性聚合物的共轭物的方法，该方法包括使以下的组分(a)-(d)反应(a)RA-C(O)R’(羰基组分)，其中R’是H或低级烷基，优选H或甲基，且更优选H(即，醛)，(b)RN-NH2(胺组分)(c)RC-C(O)OH(羧酸组分)，和(d)R1-NC(异腈组分)，来形成共轭的产物，引入由RA、RN、RC和RI所示各个部分中的至少一个。(a)-(c)中的至少一个是所述的蛋白质或多肽；即，反应包括带有反应性羰基(RA-C(O)R’)的蛋白质或多肽，带有反应性胺(RN-NH2)的蛋白质或多肽，和/或带有反应性羧酸(RC-C(O)OH)的蛋白质或多肽。(a)-(d)中的至少一个是水溶性聚合物；即，反应包括带有反应性羰基(RA-C(O)R’)的水溶性聚合物，带有反应性胺(RN-NH2)的水溶性聚合物，带有反应性羧酸(RC-C(O)OH)的水溶性聚合物，和/或带有反应性异腈(RI-NC)的水溶性聚合物。
一实施方案中，共轭的产物是RINH-C(O)-CR’RA-NRN-C(O)RC的形式，确切地引入组分(a)-(d)各自的一个残基。另一实施方案中，例如，其中组分(a)-(d)中的一个带有多于一个的所示反应性官能度(如带有多个氨基的组分RN-NH2，或带有多个羧酸基团的组分RC-C(O)OH)，共轭产物可以包括共轭至其他组分的附加残基的所述组分。
聚合物，和从其所形成的共轭物，优选在室温和生理pH下是水溶性的。
蛋白质和多肽由选自以上(a)-(c)中的至少一个组分来表示，水溶性聚合物由选自以上(a)-(d)中的至少一个不同组分来表示，和(a)-(d)中的任何剩余组分是稳定的、非干扰化合物，如在此所定义的。优选的实施方案中，蛋白质或多肽是选自(a)-(c)的单个组分，聚合物是选自(a)-(d)的不同组分，且(a)-(d)的剩余组分是稳定、非干扰化合物。
剩余组分可以选自，例如，靶向部分、标记部分和温和的(即，稳定的、非干扰)“占位符”基团。优选，剩余组分是如在此所定义的低分子量化合物。这样的低分子量化合物优选包括其中基团RA、RN、RC或RI(其可以由RX来表示)是具有1-12，优选1-8个碳原子和0-4个选自氧、氮和硫的杂原子的稳定有机部分的那些。基团RA、RN或RC也可以是氢。
优选，RX，当不是氢或甲基时，包括选自烷基、烯基、醚、羟基、羧酸酯、酮和酰胺的连接物。非限制性实例包括低级烷基，环烷基，低级羟烷基，低级烷基酯和低级烷基酰胺。
选定的实施方案中，蛋白质或多肽选自(b)RN-NH2和(c)RC-C(O)OH。进一步选定的实施方案中，水溶性聚合物选自(a)RA-C(O)R’，(b)RN-NH2和(d)RI-NC，或选自(a)RA-C(O)R’，(b)RN-NH2和(c)RC-COOH。仍然进一步的实施方案中，聚合物选自(a)RA-C(O)R’和(b)RN-NH2。以上实施方案中，R’优选是H。另一优选实施方案中，组分(d)RI-NC，是水溶性聚合物。
水溶性聚合物优选是官能化的聚环氧烷(PAO)，如聚环氧丙烷(PPO)，或优选的实施方案中，是聚乙二醇(PEG)。这样的官能化聚环氧烷分子具有可利用的羰基、胺、羧基或异腈官能度(取决于聚合物是否各自是RA-C(O)R’、RN-NH2、RC-COOH或RI-NC)。
具有异腈官能度的PEG或PPO分子，适用于在此所述的共轭方法，自身形成本发明的另一个方面。这样的分子通常具有结构RCAP(OCHR”CH2)n-X-N≡C，其中R”是H或甲基，RCAP是稳定的封端基团，X表示直接的键或稳定的连接部分，且n是10至约2300的整数，使得例如部分-(OCH2CH2)n-，当R”是H时，具有约440至100,000道尔顿的分子量。-(OCH2CH2)n-部分的示例分子量包括，例如，2000、5000、10,000、20,000和40,000道尔顿。
选定的实施方案中，RCAP是酰基、芳基或烷基，例如，甲基。连接物X优选包括选自烷基、芳基、环烷基、醚、酰胺及其结合物的连接。更优选，X包括选自烷基、环烷基、芳基以及烷基和芳基或烷基和环烷基的结合物的连接物。优选连接物至多约十二个原子长。
一实施方案中，组分(a)-(d)的每一个是单种化合物。另一实施方案中，用于共轭物的组合合成中，组分(a)-(d)中的至少一个包括多种化合物。
优选，当体内给药于患者包括人患者时，与未共轭的蛋白质或多肽相比较，蛋白质或多肽与水溶性聚合物的共轭物具有降低的免疫原性和/或提高的循环半衰期。
共轭反应可包括上述组分的多种不同组合。实例包括以下的反应子集，其中由PEG来具体说明水溶性聚合物组分。然而，其他水溶性聚合物，例如PPO，也可以用于这些反应中的任何一个。
第一个反应子集中，(c)是蛋白质，(a)、(b)和(d)中的一个是PEG反应物，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。这些反应中，当(d)是PEG-异腈反应物或(a)是PEG-羰基反应物时，部分(b)优选是低分子量胺，其可以过量提供。当(b)是PEG-胺反应物时，反应物优选是低pKa胺，例如，PEG羟基胺、PEG酰肼、PEG卡巴肼或PEG芳香胺。
相关的反应子集中，用于将两个聚合物链共轭至蛋白质分子上的单个连接位点，(c)是蛋白质，(a)、(b)和(d)中的两个是PEG反应物，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。
第二个反应子集中，(a)是修饰成含有醛或酮基的蛋白质，(b)、(c)和(d)中的一个是PEG反应物，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。这些反应中，当(b)是PEG-胺反应物时，反应物优选是低pKa胺，例如，PEG酰肼、PEG卡巴肼或PEG芳香胺，和(c)优选是过量提供的低分子量羧酸，例如，作为缓冲剂组分或助剂的乙酸盐(acetate)。当(c)是PEG-羧基反应物时，(b)优选是过量提供的低分子量胺。
相关的反应子集中，用于将两个聚合物链共轭至蛋白质分子上的单个位点，(a)是修饰成含有反应性羰基例如醛基的蛋白质，(b)、(c)和(d)中的两个是PEG反应物，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。这种情况中，当(b)是PEG-胺反应物且(d)是PEG-异腈反应物、PEG-胺反应物时，胺反应物优选是低pKa胺，例如，PEG酰肼、PEG卡巴肼或PEG芳香胺，且(c)优选是过量提供的低分子量羧酸，例如乙酸盐(acetate)。
第三个反应子集中，(b)是蛋白质，(a)、(c)和(d)中的一个是PEG反应物，且剩余的(a)、(c)和(d)中的两个是稳定的、非干扰化合物。这些反应中，当(d)是PEG-异腈反应物时，(c)优选是过量提供的低分子量羧酸。
相关的反应子集中，用于将两个聚合物共轭至蛋白质分子，(b)是蛋白质，(a)、(c)和(d)中的两个是PEG反应物，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。这些反应中，当(a)是PEG-羰基反应物且(d)是PEG-异腈反应物时，(c)优选是过量提供的低分子量羧酸。
另一方面中，本发明提供了制备药物组合物的方法，该组合物在药物载体中包括生物活性或相关分子与生物相容性优选水溶性聚合物的共轭物，该方法包括(i)使以下的组分(a)-(d)反应(a)RA-C(O)R’，其中R’是H或低级烷基，优选H或Me，且更优选H，(b)RN_NH2(c)RC_C(O)OH，和(d)RI-NC，来形成共轭的产物，引入由RA、RN、RC和RI所示的每个部分中的至少一个。一实施方案中，如上所述，共轭物是RINH-C(O)-CRAR’-NRN-C(O)RC的形式，确切引入由RA、RN、RC和RI所示每个部分中的一个。其他实施方案中，例如，其中组分(a)-(d)之一带有多于一个所示的反应性官能度(如带有多个氨基的组分RN-NH2，或带有多个羧酸基团的组分RC-C(O)OH)，共轭产物可以包括共轭其他组分多个残基的所述组分。参见，例如，以下实施例16的透明质酸共轭物。
组分(a)-(d)中的至少一个是生物活性或相关分子，且组分(a)-(d)中的至少一个是生物相容的，优选水溶性聚合物；和(ii)将共轭物或其药物学上可接受的盐配制于药物载体中，优选含水载体。所形成的共轭物优选在室温和生理pH下是水溶性的。
在共轭物RINH-C(O)-CRAR’-NRN-C(O)RC形成中，由选自以上(a)-(d)的至少一个组分来表示生物活性分子，且优选选自(a)-(c)；由选自以上(a)-(d)的至少一个不同组分来表示聚合物，和(a)-(d)中的任何剩余组分选自标记部分内、靶向部分和其他稳定的、非干扰部分。优选实施方案中，分子是选自(a)-(c)的一个组分，聚合物是选自(a)-(d)的不同组分，且(a)-(d)的剩余组分选自标记部分、靶向部分和其他稳定、非干扰化合物。通常，剩余的组分是低分子量化合物，如在此所定义的。
优选实施方案中，生物活性分子选自(a)RA-C(O)R’，(b)RN-NH2和(c)RC-C(O)OH，更优选选自(b)RN-NH2和(c)RC-C(O)OH。选定的实施方案中，分子是蛋白质或多肽。
进一步选定的实施方案中，聚合物选自(a)RA-C(O)R’，(b)RN-NH2和(d)RI-NC，或选自(a)RA-C(O)R’，(b)RN-NH2和(c)RC-COOH。仍然进一步的实施方案中，聚合物选自(a)RA-C(O)R’和(b)RN-NH2。聚合物优选是官能化的聚环氧烷(PAO)，如聚环氧丙烷(PPO)，或优选，聚乙二醇(PEG)例如，具有可利用羰基、胺或异腈官能度的PEG分子。一特定实施方案中，聚合物是如在此所述的PEG异腈。
步骤(i)的共轭反应包括上述组分的各种不同组合，包括上述第一个至第三个以及相关的反应子集。这些反应中的蛋白质可以由另一种生物活性分子替代，如多糖、多核苷酸或小分子药物化合物。
优选，当体内给予患者包括人患者时，与未共轭的生物活性分子相比较，生物活性分子和聚合物的共轭物具有降低的免疫原性，降低的降解，和/或提高的循环半衰期。
进一步的方面中，本发明提供了RINH-C(O)-CRAR’-NRN-C(O)RC形式的水溶性共轭物，其中RA、RN和RC中的至少一个是蛋白质或多肽，RI、RA、RN和RC中的至少一个，优选RI，是聚环氧烷，优选聚乙二醇(PEG)；和剩余部分RI、RA、RN和RC独立地选自标记部分、靶向部分和R，其中R是具有1-12优选1-8个碳原子和0-4个选自氧、氮和硫杂原子的稳定有机部分。其中R是RA、RN或RC的实施方案，R还可以是氢。R’优选是H或低级烷基，例如CH3，且更优选是H。
优选，R不是氢或甲基时，包括选自烷基、烯基、醚、羟基、羧酸酯、酮和酰胺的连接。实例包括低级烷基、环烷基、低级羟烷基、低级烷基酯和低级烷基酰胺。
共轭物优选在室温和在生理pH下是水溶性。
在水溶性共轭物RINH-C(O)-CRAR’-NRN-C(O)RC中，表示蛋白质或多肽的部分RN或RC可以连接其他组分的更多残基，如果所述的部分RN或RC包括多个存在的所示官能团(例如，带有多个氨基的多肽RN-NH2，或带有多个羧酸基团的多肽RC-C(O)OH)，如上所述。一实施方案中，所述部分没有连接剩余组分的其他残基；即，共轭物正好包括每个残基RI、RA、RN和RC中的一个。这样另外残基的存在不存在可以受到反应条件的控制；例如，通过存在组分的摩尔比。
本发明包括具有上述组分各种组合的共轭物，在上述给定的规定内。通常，共轭物包括与一个或两个PAO分子优选PEG分子共轭的单个蛋白质或多肽分子。这样的组合包括共轭物，其中RC是蛋白质，RI是PEG，且RA和RN独立地选自标记部分、靶向部分和R；RC是蛋白质，RN是PEG，且RA和RI独立地选自标记部分、靶向部分和R；RC是蛋白质，RA是PEG，且RI和RN独立地选自标记部分、靶向部分和R；RC是蛋白质，RN和RA各自是PEG，且RI是标记部分、靶向部分或R；RC是蛋白质，RN和RI各自是PEG，且RA是标记部分、靶向部分或R；RA是蛋白质，RN是PEG，且RC和RI独立地选自标记部分、靶向部分和R；RA是蛋白质，RN是PEG，RI是PEG，且RC是标记部分，靶向部分或R；RA是蛋白质，RC是PEG，且RI和RN独立地选自标记部分，靶向部分和R；
RN是蛋白质，RI是PEG，且RA和RC独立地选自标记部分、靶向部分和R；RN是蛋白质，RA是PEG，RI是PEG，且RC是标记部分、靶向部分或R；RN是蛋白质，RC是PEG，且RI和RC独立地选自标记部分、靶向部分和R；或RN是蛋白质，RC是PEG，RI是PEG，且RA是标记部分、靶向部分或R。
上述组合的选定实施方案中，R的实施方案是非蛋白质、非PAO组分。另一实施方案中，一种这样的非蛋白质、非PAO组分是标记或靶向部分。
当结合附图阅读以下的本发明详述时，本发明的这些和其他目的和特征将变得更全面清楚。
附图简述
图1显示了对于四组分的缩合反应通常可接受的机理，在此描述了其中特异性的实施方案。
图2显示了共轭略图，说明了PEG和多肽上位点特异性产生的羰基的连接，在乙酸盐缓冲剂(acetate buffer)中进行(即，RC＝CH3)，根据本发明的一个实施方案。这种情况中，例如，RI可以是另一种PAO链，标记或小的温和残基。
发明详述I.定义如在此所用的“多肽”是氨基酸的聚合物，不限于特定的长度。因此，例如，术语肽、寡肽、蛋白质和酶包括于多肽的定义内。该术语还包括多肽表达后的修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。
在此所用的术语“聚合物”指的是亲水性，优选水溶性聚合物，如PEG，将其与生物活性分子共轭，即使后者自身可以是聚合的。
“PEG”指的是聚乙二醇，具有重复单元(CH2CH2O)n的聚合物，其中n优选为约10至约2300，其对应于约440道尔顿至约100,000道尔顿的分子量。聚合物在基本上整个分子量范围内是水溶性的。对于与多肽的共轭，PEG的优选分子量范围为约2,000至约50,000道尔顿，更优选为约2,000至约40,000道尔顿。PEG可以用不干扰在此所述共轭反应的任何基团来封端，例如，羟基、酯、酰胺、硫醚、烷氧基或各种用合适保护部分阻断的反应性基团。常用的封端PEG是甲氧基PEG(mPEG)。尽管优选PEG均聚物，术语还包括PEG和另一种单体的共聚物。例如，这可以是另一种醚形成单体，如丙二醇。
“生物活性”分子指的是已知具有生物活性和/或确定用于治疗或诊断用途的分子，尤其是期望具有治疗活性分子。这样的分子也可以称为“生物相关”。
对于在此所述共轭反应的反应组分，“稳定的”和/或“非干扰”，意思是除了在共轭反应中起预期的作用外，反应组分在共轭条件下没有经受任何化学反应，并在所得到的共轭物上提供稳定的、生物温和取代基。
在此所用的“低分子量”，通常涉及非干扰反应组分，通常意思是约500道尔顿或更低，优选350或更低，且更优选200或更低。
在此对组分可以由RA-C(O)R’来表示，其中R’是H或低级烷基，优选H或甲基，且更优选H(即，其中羰基部分是醛)，且RA是在此所定义的生物活性分子(例如，蛋白质或多肽)、水溶性聚合物或稳定的、非干扰化合物的残基。
“烷基”指的是含有碳和氢的全饱和无环单价基团，其可以是直链的或支链的。烷基的实例是甲基、乙基、n-丁基、t-丁基、n-庚基和异丙基。“环烷基”指的是含有碳和氢的全饱和环状单价基团，优选具有三至七个，更优选五至六个环碳原子，其可以由烷基进一步取代。环烷基的实例包括环丙基、甲基环丙基、环丁基、环戊基、乙基环戊基和环己基。
“低级烷基”指的是一至六个碳原子的烷基，如甲基、乙基、n-丁基、i-丁基、t-丁基、异戊基(isoamyl)、n-戊基和异戊基(isopentyl)。选定的实施方案中，“低级烷基”具有一至四个碳原子。
“酰基”指的是连接羰基的烷基，其可以是低级烷基，即，R-(C＝O)-。
“烃基”包括由碳和氢构成的基团；即，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和非杂环芳基。
“芳基”指的是具有单环(例如，苯基)、两个缩合环(例如，萘基)或三个缩合环(例如，蒽基或菲基)的取代或非取代的单价芳香族基团。通常优选单环基团。该术语通常包括杂芳基，其是环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的芳香族环基，如呋喃基、吡咯、吡啶基和吲哚。“取代的”意思是芳基中的一个或多个环氢由卤素如氟、氯或溴；含有一个或两个碳原子的低级烷基；或硝基、氨基、甲氨基、二甲氨基、甲氧基、卤代甲氧基、卤代甲基或卤代乙基来取代。优选的取代基，当存在时，包括氟、氯、甲基、乙基和甲氧基。
术语“药物学上可接受的盐”包括，例如，具有有机或无机平衡离子的羧酸盐，如碱或碱土金属阳离子(例如，锂、钠、钾、镁、钡和钙)；铵或有机阳离子，例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟乙基铵、双(2-羟乙基)铵、苯基乙基苄基铵等。其他阳离子包括碱性氨基酸如甘氨酸、鸟氨酸、组氨酸、苯基甘氨酸、赖氨酸和精氨酸的质子化形式。
术语还包括碱性基团的盐，如胺，具有源自有机或无机酸的平衡离子。这样的平衡离子包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、棕榈酸盐、胆酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、酒石酸盐、硬脂酸盐、水杨酸盐、甲基磺酸盐、苯磺酸盐、山梨酸盐、苦味酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐等。
“药物学上可接受的载体”是适于随药物制剂将共轭物给药于患者包括人患者的载体。载体通常是含水载体，如含水的盐、葡萄糖、甘油或乙醇。制剂中可以包括非活性成分，如缓冲剂、稳定剂等。在此所用的“含水载体”含有水作为其主要部分，但可以包括溶质，正如所述的。还可以存在助溶剂如醇类或甘油。
也可以使用固体制剂，其通常包括非活性赋形剂，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素或纤维素醚、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。也可以将共轭物配制成脂质或磷脂中的悬浮液，在脂质体制剂中，或经皮或吸入制剂，根据本领域已知的方法。
II.大分子共轭物根据本发明的特定方面，提供了大分子共轭物，包括共轭至少一种水溶性聚合物的至少一种生物活性分子，及其制备方法。
通过四组分的缩合(4CC)方案来制备共轭物，使用羧酸组分、胺组分、异腈组分和醛或酮组分，如图1中所示(其中描述了醛组分)。四组分反应的机理首先由Ugi等描述(Ugi等，1959)，且最近进行了评述(Domling和Ugi，2000)。
根据本发明，选择上述四个组分使得至少一个选自羧酸组分、胺组分和反应性羰基(例如，醛)组分的组分存在于生物活性分子或大分子，优选多肽上，和至少一个选自羧酸组分、胺组分、异腈组分和羰基组分的不同组分存在于亲水性聚合物优选聚醚如PEG上。亲水性聚合物优选在含水介质中是可溶的，并因此优选非交联的。
通常作为稳定的、稳定的、非干扰化合物，优选低分子量化合物来提供不预期为生物活性分子或亲水性聚合物的任何剩余组分。例如，甲酸或乙酸可以用作羧酸组分，或叔-丁基或环己基异腈可以用作异腈组分。这些组分可以形成共轭产物连接部分上实质上惰性的取代基(例如，甲基或其他烷基)。
这些剩余组分还可以向共轭物提供标记部分或靶向部分。例如，生物素，香豆素-4-乙酸，7-氨基香豆素、萤光黄(Licifer-Yellow)CH、叶酸和螯合剂，如DTPA。可以潜在地用于这样的目的。
优选，剩余组分的分子量使得它们不能在空间上影响共轭物的形成。优选的分子量范围低于500，更优选低于350，且最优选低于200道尔顿。
使组分反应来形成共轭物，引入由RA、RN、RC和RI所示各个部分中的至少一个。一实施方案中，如上所示，共轭物是以下的形式 其中RI源自异腈组分，RA源自反应性羰基(例如R’＝H时，醛)组分，RN源自胺组分，且RC源自羧酸组分。图1中显示了用于反应的通常可接受的机理。
另一实施方案中，例如，其中组分(a)-(d)中的一个带有多于一个所示的反应性官能度(如带有多个氨基的组分RN-NH2，或带有多个羧酸基团的组分RC-C(O)OH)，共轭产物可以包括共轭至其他组分多个残基的所述组分。参见，例如，以下实施例16的透明质酸共轭物。这样另外残基的存在、不存在和/或数量可以受到反应条件的控制，如存在组分的摩尔比。
可以以“单罐”反应来进行反应。在一些情况中可以提高共轭效率，如图1中所示的，通过首先缩合胺和羰基组分，因此产生第一个中间产物，并随后将该中间产物与剩余组分反应(参见以下的实施例7和16)。
A.生物活性分子生物活性剂通常是治疗或诊断剂。生物活性剂包括选自聚合或寡聚生物分子的药物，例如蛋白质，多糖或核酸，或小分子化合物。“小分子”化合物可以广泛定义为不是聚合物或寡聚物的有机、无机或有机金属化合物。通常，这样的化合物具有1000道尔顿或更小的分子量，或在一实施方案中，500道尔顿或更小。
生物活性分子通常是在此所述反应中的胺或羧酸组分。这样的官能团在生物活性分子例如多肽或各种小分子药物中是常见的。
如上所述，当生物活性分子包括多个所示官能团时(例如，带有多个氨基的多肽RN-NH2，或带有多个羧酸基团的多肽RC-C(O)OH)，共轭物中的分子残基可以连接剩余组分的其他残基。参见，例如，以下实施例16的透明质酸共轭物。这样另外残基的存在不存在可以受到反应条件的控制，例如，通过存在组分的摩尔比控制。
当生物活性分子中存在多于一个不同组分官能团时，优选选择反应条件偏向一个而超过其他。例如，为了促进分子如蛋白质中的胺基反应超过羧酸基团，可以在高pH(例如，7-8.5)和/或在高浓度乙酸盐缓冲剂存在下进行反应，使得乙酸盐有效地与分子上作为反应的羧基组分的羧酸盐基团竞争。或者，为了促进分子中的羧酸反应超过胺，可以在低pH进行反应。例如，在pH4-6，多肽中的胺得到很大程度的质子化。为了进一步抑制蛋白质氨基的反应性，反应混合物还可以包括过量的低分子量优选低pKa的胺，如酰肼或芳香族胺，或含有胺的缓冲剂，如TRIS或甘氨酰胺。
优选的实施方案中，生物活性分子，如多肽或糖肽，是反应中的羰基，例如醛组分。尽管醛在生物活性分子例如多肽中比胺或羧酸少出现，存在各种方法用于将反应性羰基合成引入这样的分子中。例如，Rodrigues等，(J.Org.Chem.639614，1998)和Marcaurelle等(Org.Lett.33691-94，2001)描述了可以将酮氨基酸的引入肽中的合成。糖蛋白上的1，2-顺式二醇或1，2-氨基醇部分的高碘酸盐氧化是用于在这些化合物中产生醛基的公知方法(参见，例如，Wilchek，1987；O’Shannessy，1987；Morehead，1991)。吡喃半乳糖苷或N-乙酰基吡喃半乳糖苷残基上位置6的半乳糖氧化酶介导的氧化是在糖蛋白上产生反应性醛的另一种公知方法(Wilchek，1987)。在含有丝氨酸或苏氨酸的肽上引入醛官能可以通过各自将这些氨基酸残基的羟基的DMSO/碳化二亚胺介导的氧化形成反应性醛和酮基(Di Bello等，1972)。还可以通过多肽上的胺和合适的杂双官能试剂例如4-甲酰基苯甲酸NHS酯的反应将醛引入多肽中，如King等所述的(1996)。肽或氨基糖的氨基可以转化成N-乙酰醛(levulinoyl)残基，例如通过Yarema等的方法(1998)。
上述方法中的许多，如糖蛋白的高碘酸盐氧化(O′Shannessy等；Wilchek等)，提供了多肽上反应性羰基的位点特异性产生，因此根据本发明的方法使聚合物位点选择性共轭。其他途径包括含N-端丝氨酸或苏氨酸的肽的高碘酸盐介导的氧化，其将它们转化成反应性N-咪唑基残基(Dixon，1987；Geoghegan等，1992)。肽的N-端转氨基作用是另一种以位点特异性方式产生反应性羰基的常规方法(综述于Dixon，1984)。
以这种方式产生的反应性羰基之前已经用于生物分子和各种酰肼和羟基胺化合物的共轭，各自形成腙和肟连接的生物共轭物(Gaerthner等，1992；Zalipsky等，1995c；Zalipsky和Menon-Rudolph，1997；Wei等，U.S.专利No.6,077,939)。然而，这些连接在酸性pH中是不稳定的，尤其是在竞争性羟基胺或肼衍生物的存在下。根据在此公开的方法制得的生物共轭物给予更高的稳定性。
B.聚合物待共轭至生物活性分子的聚合物可以是任何生物相容聚合物，其含有或可以修饰来含有选自胺、羧酸、醛或酮或异腈的反应性基团。优选，聚合物是非免疫原性的亲水性聚合物。优选聚合物是水溶性的；因此，聚合物应当是未交联的。优选，聚合物在室温和生理pH下可溶于水中。实例亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟丙基噁唑啉，聚羟丙基-甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基-丙烯酰胺，聚羟丙基甲基丙烯酸酯，聚羟乙基丙烯酸酯，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚乙二醇(PEG)，聚环氧丙烷(PPO)，聚天冬酰胺，和上述聚合物的共聚物，例如聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物。这些聚合物的许多特征和反应描述于U.S.专利No.5,395,619和5,631,018中。优选实施方案中，聚合物是聚(烯化氧)，如PPO或PEG，且更优选是PEG(聚乙二醇)聚合物。(注意到术语聚烯化“氧化物”(polyalkylene“oxide”)和聚烯化“乙二醇”(polyalkylene“glycol”)是等价的)。
以下的实施例1-4描述了制备含有胺、异腈、羧基或羰基的PEG聚合物的方法；还参见Zalipsky(1995b)和Zalipsky & Harris(1997)。其他类型的亲水性聚合物，如上述的那些，可以相似地官能化，使用实施例1-4用于含羟基聚合物的方法来修饰，或根据本领域技术人员可利用的合成方法。
此前PEG-异腈和PPO-异腈衍生物是未知的。这样的衍生物中，优选的PEG分子量范围是约2,000至约50,000道尔顿，更优选约2,000至约40,000道尔顿。可以在非异腈端用不与异腈反应或干扰在此所述共轭反应的任何稳定封端基团将PEG封端，例如，酯，酰胺，硫醚，羟基，烷氧基，或用合适保护部分阻断的各种反应性基团。常用的封端PEG是甲氧基PEG(mPEG)。尽管优选PEG均聚物，但术语还可以包括PEG和另一种单体的共聚物。这可以是，例如，另一种醚形成单体，如丙二醇。
如在此所提供的PAO-异腈化合物通常具有结构RCAP(OCHR″CH2)n-X-N≡C，其中RCAP是稳定的封端基团；R”是H或甲基，优选H；X表示直接的键或稳定的连接部分；且n是10至约2300的整数，使得部分-(OCH2CH2)n-具有约440至100,000道尔顿的分子量。选定的实施方案中，RCAP是酰基，芳基或烷基，例如，甲基。
连接物X，当不是直接的键时，优选包括选自直链或支链烷基、芳基、环烷基、醚、酰胺及其结合物的连接物。更优选，X包括选自低级烷基、环烷基、芳基以及低级烷基和芳基或低级烷基和环烷基结合物的连接物。芳基优选是单环的，例如，苯基，且环烷基优选是环戊基或环己基。连接物优选最多约十二个原子长，更优选最多约八个原子。实例连接物包括环己基和低级烷基，例如，-(CH2)n-，其中n是1至4。
以下实施例1中提供了制备PEG-异腈的实例方法。该方法使用甲酰胺中间产物的脱水，其随后通过将PEG胺与甲酸乙酯反应来制备。这条途径适用于制备含有稳定连接物如烷基或环烷基连接物的PEG异腈。
将聚合的胺组分用于共轭到多肽时，优选聚合物上的胺官能度具有比多肽上氨基低的pKa。如此，如下所述，可以在pH4-7进行与多肽的共轭，其中在此多肽上的氨基(主要是赖氨酸侧链，其具有约10的pKa)被质子化并因此是非反应性的，同时较少碱性的聚合胺未被质子化并因此是反应性的。PEG卡巴肼或酰肼，具有约3的pKa，或共轭至芳香族胺的PEG，通常具有约4的pKa，对于该目的是合适的反应物。
在此所述的共轭反应的一实施方案中，作为官能化聚合反应物提供两种反应性组分；例如，可以通过其羧基使多肽或多糖与预先形成的C＝N连接的二-PEG加合物反应，该加合物通过PEG-胺和PEG-羰基组分之间的反应形成(例如，以下表1中的第4项；实施例7)。或者，PEG-异腈和PEG-羰基(例如，以下表1中的第10项)可以用于获得两个PEG链的单位点连接。因此，本发明的反应提供了具有连接到一个氨基酸或糖残基的两个连接的PEG链的多肽共轭物(表1的第4，5，7和10项)。之前已经描述了多臂PEG反应物的一些优势以及通过可替换化学物质制得的其共轭物(Monfardini等，1995；US专利5,932,462)。
C.其他反应组分总的说来，共轭反应使用包括四种所需官能团之一的亲水性聚合物和包括四种所需官能团另一种的生物活性分子。还可以产生包括两个或甚至三个亲水性聚合物(或生物活性分子)的共轭物，通过选择两种或三种不同的聚合物(或分子)，每种包括四种所需官能团中不同的一种。
作为稳定的、非干扰，优选低分子量化合物来提供剩余组分(如果有的话，通常为一种或两种)。“稳定的”意思是在共轭条件下没有经受任何化学反应的组分，除了在共轭反应中起预期的作用外，并在所得到的共轭物上提供稳定的、生物上温和的取代基。“低分子量”意思是约500道尔顿或更低，优选低于350道尔顿，且更优选低于200道尔顿。实例是具有1-12个碳原子和至多约4个杂原子的化合物。这些添加剂中的RN、RC、RA和/或RI(总地称为RX)的性质不是关键的，只要RX没有不利地干扰所需的共轭反应或所得到共轭物的活性或存储稳定性。
RX可以提供靶向或标记部分。实例包括荧光团，如香豆素、荧光素，和靶向或结合部分，如生物素、叶酸盐或吡哆醛。其他靶向部分包括共有U.S.专利No.6,660,525中所述的那些，在此将其引入作为参考。
或者，RX是非活性的、生物上温和的“占位符”基团，其可以由R来表示。优选，R具有1-12个碳原子并可以含有最多约4个杂原子。更优选，R具有1-8或1-6个碳原子。当R是RA、RN或RC的实施方案时，R还可以是氢。R内的任何官能团在共轭反应条件下应当是稳定的。(可以理解一些标记或靶向部分也落入在此所定义的R的定义内)。
R可以包括芳基，如上所述。优选，R是非芳香族的，且不是氢或甲基时，包括选自烷基、烯基、醚、羟基、羧酸酯和酰胺的连接物。R的实例包括低级烷基，如甲基、乙基、异丙基或叔-丁基，环烷基如环己基，低级羟烷基、低级烷基酯、低级烷基酮和低级烷基酰胺。可以使用通常用作溶剂或缓冲剂的化合物。这样化合物的特别实例对于RN-NH2，包括TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)或甘氨酰胺(H2NCH2C(O)NH2)，对于RC-COOH为乙酸，对于RA-CHO为乙醛，和对于RI-NC为叔丁基异腈，乙基异氰基乙酸盐(C＝NCH2C(O)OEt)或乙基异氰基丙酸盐(C＝NCH2CH2CO2Et)。后者的异腈对于所得到共轭物的表征是有利的，因为其将一个β-丙氨酸等价物引入每个产物共轭物中。标准氨基酸分析可以用来测定因此所形成连接的数目。
当选择用于共轭的组分时，应当考虑空间构象。因此，如果使用大的分子和/或聚合物，或如果使用这些实体中的多于一种，剩余组分优选是小的、低分子量化合物，如低级烷基衍生物。
II.反应条件反应通常在极性有机溶剂中进行，如例如，甲醇、三氟乙醇或DMF，尽管文献中存在含水介质中进行的4CC反应的有限实例(de Nouy，2000；Vredblad，1973；Goldstein，1993)。
可以调节反应条件来产生正好具有由RA、RC、RI和RN所示每个残基之一的共轭物，或(当这些组分中的一种或多种是多官能的时候，如上所讨论的)来具有多个选定的残基，例如，通过选择组分的摩尔比。
还可以将反应条件调节至有利于组分上选定官能团的反应，该组分含有多于一个的上述官能团，如含有胺和羧酸官能团的蛋白质。可以将反应条件调节来抑制蛋白质上的羧酸或胺的反应，各自通过包括过量的低分子量羧酸(例如，乙酸盐缓冲剂)作为羧基组分和/或低分子量胺(例如，肼)作为胺组分。
还可以通过在pH4-7进行反应来抑制蛋白质侧链胺的反应，其中该侧链胺(主要是赖氨酸侧链，其具有约10的pKa)被质子化并因此是非反应性的。这种情况下，反应所需的胺组分优选是低pKa胺。例如，当PEG-胺组分用于共轭至蛋白质(或具有反应性氨基的其他生物分子)时，优选PEG-胺官能度具有比蛋白质上氨基低的pKa。如此，在蛋白质侧链胺被质子化的pH范围内，PEG胺未得到质子化，并因此是反应性的。对于该目的，具有约3的pKa的PEG卡巴肼或酰肼，或通常具有约4的pKa的PEG-芳香族胺反应物，是合适的反应物。
为了提高共轭效率，一些情况中，有利的是首先将胺和羰基组分缩合，因此产生4CC反应的第一个中间产物，且然后将剩余组分加入用于完成共轭(参见以下的实施例7)。
共轭反应还可以用于同时或在平行的反应中产生多个共轭物，改变四个组分中的一种或反应条件，因此产生各种分子多样性程度的混合物。以这种方式产生的各种生物共轭物可以快速筛选各种化学和/或生物性能，例如，分子量、聚合物含量、受体结合或细胞增殖。例如，通过使用不同聚合物作为组分中的一种(例如，RI-NC的各种实施方案，其中RI表示不同聚合物)，可以形成具有连接分子上相同位置的不同聚合物的多个共轭物。或者，通过使用特定分子来表示多于一种组分(例如，R-X的不同实施方案，其中R是待共轭的聚合物或分子，和X表示选自胺、羧酸、醛或酮和异腈的多个基团)，可以形成共轭物中具有通过不同键连接的聚合物和/或生物活性分子的多个共轭物。
III.实例四组分缩合(4CC)共轭情况下表呈现了各种共轭情况的非限制性实例，为了说明的目的，使用待共轭的蛋白质和PEG分子。
表1.实例共轭反应情况
情况1-5中，蛋白质的羧基是PEG化(PEGylated)的，因为蛋白质是羧基组分，且至少一种其他组分是PEG反应物。情况4和5中，每个蛋白质连接两个PEG链。
在1-8的每个情况中，其中胺组分不是蛋白质，可以采用如上所述的方法，来有利于所需胺组分RN的反应超过蛋白质侧链，例如，通过在低pH(4-6)工作。此外，当PEG是胺组分时(如情况2和4-7中)，可以使用低pKa胺，如PEG-酰肼，PEG-卡巴肼，或PEG-羟基胺。当PEG不是胺组分时(即，情况1、3和8)，可以使用过量的低分子量胺，如TRIS(H2NC(CH2OH)3)；还可以过量提供低pKa胺(例如，甘氨酰胺，乙酰酰肼)。
情况6-8中，在蛋白质或糖蛋白上合成引入的羰基是PEG化的。图2中说明了这种情况。图2所示的略图中，RI表示小的温和残基、标记部分或另一种PEG链。如上所述，这样的反应特别有吸引力，因为与蛋白质上多个氨基或羧基的随机PEG化相比较，它们可以提供提高的连接位点特异性(图2)。
情况9-12中，蛋白质上的氨基是PEG化的，因为蛋白质是氨基组分，且至少一种其他组分是PEG反应物。情况10和12中，通过氨基或羧基，每个蛋白质连接两个PEG链。反应9和10中，其中蛋白质上只有氨基是待反应的，过量低分子量羧基组分，如所示的乙酸，可以用于抑制蛋白质上羧基的反应。
一实施方案中，如所示的，异腈组分是乙基氰基丙酸酯(C＝NCH2CH2C(O)OEt)。如从图1中所示机理可以认知，共轭物中的该组分转化成β-丙氨酸部分(-NHCH2CH2CO2Et)，其可以通过共轭的蛋白质产物的氨基酸分析来检测。这样的分析提供了测定共轭物组成和/或探测共轭产物形成完成性的方便方法(参见实施例5，7，10和11)。
实施例以下的实施例是用于说明但非限制本发明。
实施例1-4说明了制备共轭反应每个组分的示范性方法，作为亲水性聚合物，这些实施例中通过PEG来举例说明。
实施例5-16说明了示范性的共轭方法，如以上表1中概述的。这些中的每个是单罐方法，提供了生物分子和亲水性聚合物的共轭物，这些实施例中通过PEG来举例说明。实施例16说明了引入特定组分多个残基的共轭物。
实施例中的生物分子包括源自层粘连蛋白的合成粘着肽，牛血清白蛋白(BSA)，促红细胞生成素(EPO)和透明质酸(HA)，用于处理结缔组织疾病的粘多糖。
实施例1.PEG-胩(异腈)衍生物的制备以下对于分子量为2000Da的mPEG(mPEG2K)所述的将mPEG-OH转化成mPEG-异腈的常规方法，同样适用于其他分子量的PEG。
A.mPEG2K-NH3+CH3SO3-的制备(mPEG铵甲磺酸盐(mesylate))将mPEG2K甲磺酸盐(Harris等，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22341(1984))(20g，9.62mmol)溶解于塑料瓶中的含水氢氧化铵中(200ml)，并在60℃搅拌48h。将溶液冷却至室温，且通过蒸发从混合物中除去氨。将剩余物冻干24h并使用异丙醇重结晶。将所获得的产物在真空通过P2O5干燥。铵盐的产量为91％(18.43g)。1H-NMR(DMSO-d6)2.30(s，3H)，2.97(t，2H)，3.23(s，3H)，3.50(bs，180)，7.63(bs，3H)。
B.mPEG2K-NH-CHO(mPEG甲酰胺)的制备将如上制备的mPEG2K铵甲磺酸盐(0.5g，0.238mmol)溶解于60℃的甲酸乙酯(10ml)中。向该溶液中加入三乙胺(0.133ml，0.954mmol)并将反应混合物在60℃加热24h，此后TLC表明反应完成。通过蒸发除去过量的甲酸乙酯，并通过异丙醇沉淀来纯化剩余物。将产物在真空下通过P2O5来干燥。产量为88％(0.425g)。1H-NMR(DMSO-d6)3.19-3.25(m，5H)，3.5-3.53(m，176H)，3.68(t，2H)，8.0(s，1H)，8.03(bs，1H，用D2O交换)。
C.mPEG2K-NC(mPEG异腈)的制备将如上制备的mPEG2K-甲酰胺(0.2g，0.1mmol)溶解于二氯甲烷中(2ml)并冷却至0℃。向该溶液中加入四氯化碳(38μL，0.3944mmol)和三乙胺(137μL，0.986mmol)，并将溶液在氮下在0℃搅拌5分钟。然后在0℃加入三丁基膦(98.26μL，0.3944mmol)。将反应混合物在室温搅拌24h，在该时间过程中变成暗棕色。将溶剂蒸发并通过异丙醇沉淀来纯化产物。产量为88％(0.175g)。IR(纯的)2150(NC)，1H-NMR(DMSO-d6)3.23(s，3H)，3.41-3.59(m，178H)，3.68(m，2H)。
为了制备mPEG-环己基胩，首先用羰基二咪唑来激活mPEG-OH，然后与过量的1，4-二氨基环己烷反应，按照E.Ranucci和P.Ferrutti的文献方法(Synth.Commun.202951(1990))。以上述用于mPEG-铵甲磺酸盐的相似方法将所得到的mPEG-环己胺转化成胩。
实施例2.PEG-醛衍生物的制备通过文献方法来制备mPEG-乙醛衍生物(例如，Llanos和Sefton，Macromolecules 246065(1991)；S.M.Chamow等，Bioconjugate Chem.5133(1994))。
通过将mPEG-胺和4-羧基苯甲醛反应来制备芳香族醛mPEG-NHC(O)-C6H4-CHO。
PEG-丙醛衍生物从Nektar Therapeutics，NOF Corpration或SunBioCorpration购买。
实施例3.PEG-氨基衍生物的制备按照各种文献实验方案来制备PEG-氨基衍生物(综述于S.Zalipsky(1995b))。例如，根据Zalipsky等在WO92/16555(1992)中所述的来制备PEG-酰肼。根据Zalipsky & Menon-Rudolph(1997)中所述的来制备PEG-卡巴肼。如Zalipsky等，J.Macromol.Sci.Chem.A21839(1984)中所述的来制备甘氨酸酯衍生物。如D.Rozzell，Meth.Enzymol.136479(1987)；A.Pollak和G.M.Whitesides，J.Amer.Chem.Soc.98289(1976)；或M.Weber和R.Staddler，Polymer 291064(1988)中所述的来制备芳香族胺衍生物。
实施例4.PEG-羧基衍生物的制备根据文献实验方案来制备PEG-羧基衍生物，如S.Zalipsky(1995b)中综述的，或从商业来源获得(Nektar Therapeutics，NOF Corporation或SunBio Corporation)。
实施例5.PEG-BSA的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝CH3，RI＝CH2CH2CO2Et和RC＝BSA(参见表1的情况2)
该反应中，将PEG共轭至牛血清白蛋白(BSA)，其用作羧基组分。使用低pKa胺组分(mPEG20K-卡巴肼)，在pH5，使得有利于其反应来超过蛋白质中氨基侧链的反应。
用≈20倍摩尔过量的mPEG5K-卡巴肼(235mg)，乙醛(乙腈中1M，50μl)，和最后乙基异氰基丙酸盐(乙腈中1M，50μl)来处理调节至pH5的MES缓冲剂(25mM)中的牛血清白蛋白(1mg/ml，2ml)溶液。将所得到的溶液搅拌过夜，然后渗析，并进一步通过离子交换色谱来纯化。通过SDS-PAGE、MS和氨基酸分析来表征产物。
实施例6.PEG接枝的透明质酸(HA)的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝CH3，RI＝CH2CO2Et和RC＝HA(类似于表1的情况4)该反应中，将PEG共轭至透明质酸(HA)，一种羧基化多糖，将其用作羧基组分。
将透明质酸钠(Genzyme，Cambridge，MA，6mg，15μmol羧基)溶解于水中(1.5ml)并用HCl酸化至pH4.5。向该溶液中加入mPEG5K-卡巴肼(25mg，5μmol)，接着加入乙醛和乙基异氰基乙酸盐的乙腈溶液(各自0.1M，50μl，5μmol)。将该反应混合物搅拌过夜，然后对蒸馏水大范围渗滤(MWCO 100kDa)。通过1H-NMR来测定PEG含量，各自在2.0和3.7ppm整合HA和PEG的乙酰氨基和氧乙烯信号。
实施例7.PEG-BSA的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝mPEG5K，RI＝CH2CH2CO2Et，和RC＝BSA(参见表1的情况4)该反应中，将两个PEG分子共轭至牛血清白蛋白(BSA)，将其用作羧基组分。使用低pKa胺组分(mPEG20K-卡巴肼)，在pH5，使得有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
将两种各自带有卡巴肼和醛末端基团的mPEG5K衍生物(250mg＝50μmol各自)，在乙腈溶液(2ml)中缩合来形成(mPEG)2-卡巴腙，四组分缩合反应中的第一个中间产物。通过蒸发除去溶剂，并加入调节至pH5的MES缓冲剂中(25mM)的牛血清白蛋白溶液(BSA，1mg/ml，2ml)，接着加入乙基异氰基丙酸盐(乙腈中1M，50μl)。将反应溶液搅拌过夜，并将产物渗析，然后通过离子交换色谱来进一步纯化。通过SDS-PAGE、MS和氨基酸分析来表征产物。
实施例8.PEG-BSA的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝CH3，RI＝mPEG5K和RC＝BSA(类似于表1的情况5)该反应中，将两个PEG分子共轭至牛血清白蛋白(BSA)，将其用作羧基组分。使用低pKa胺组分(mPEG20K-卡巴肼)，在pH5，使得有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
用≈20倍摩尔过量的mPEG5K-卡巴肼(235mg)，乙醛(乙腈中1M溶液，50μl)，和最后mPEG5K-NC(250mg)来处理调节至pH5的MES缓冲剂(25mM)中的牛血清白蛋白(1mg/ml，2ml)溶液。将所得到的溶液搅拌过夜，然后渗析，并进一步通过离子交换色谱来纯化。通过SDS-PAGE和MS来表征产物。
实施例9.PEG-接枝的透明质酸(HA)的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝CH3，RI＝mPEG5K和RC＝HA(参见表1的情况5)该反应中，将两个PEG分子共轭至透明质酸(HA)，一种羧基化多糖，将其用作羧基组分。
将HA钠盐(6mg，15μmol羧基)溶解于水(1.5ml)中并用HCl酸化至pH4.5。向该溶液中，加入mPEG5K-卡巴肼(25mg，5μmol)，接着加入乙醛的AN乙腈溶液(0.1M，50μl，5μmol)，并最后加入mPEG5K-异腈(30mg)。将反应混合物搅拌过夜，然后对蒸馏水渗析。通过1H-NMR来测定PEG含量，各自在2.0和3.7ppm整合HA和PEG的乙酰氨基和氧乙烯信号。
实施例10.mPEG-YIGSR-NH2共轭物的制备，使用RN＝mPEG20K，RA＝YIGSR-NH2，RI＝CH2CH2CO2Et和RC＝CH3(参见表1的情况6)该反应中，将mPEG共轭至YIGSR(源自层粘连蛋白的合成粘着肽)，已经在其N-端用醛基进行了衍生。
用水中的高碘酸钠(100mM，50μl)新鲜溶液在黑暗中4℃将磷酸盐缓冲剂(10mM，pH7)中的肽TYIGSR-NH2(5mM，0.450ml)处理5分钟，并用亚硫酸钠来猝灭(200mM，50μl)。将所得到的溶液与乙酸盐缓冲剂(0.5M，1ml，pH4.5)中的mPEG-20K卡巴肼(0.45g，22μmol)溶液混合。加入乙腈(250mM，0.1ml，25μmol)中的乙基异氰基丙酸盐(C＝NCH2CH2CO2Et)，将所得到的溶液在室温培养过夜。通过渗析接着离子交换色谱来纯化产物并通过MS来表征。通过测序和氨基酸分析证实N-端共轭。
实施例11.PEG-EPO的制备，使用RN＝mPEG20K，RA＝EPO的聚糖，RI＝CH2CH2CO2Et和RC＝CH3(参见表1的情况6)该反应中，将mPEG共轭至EPO(促红细胞生成素)，其已经用高碘酸盐处理来产生分子的聚糖部分中的羰基官能团。使用低pKa胺组分(mPEG20K-卡巴肼)以有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
用高碘酸钠(80mM，40μl)在黑暗中4℃将乙酸钠缓冲剂(0.2M，pH5.0)中的促红细胞生成素(EPREX，0.76ml，1mg)溶液来处理10分钟。用亚硫酸钠(300mM，20μl)来猝灭过量的高碘酸盐。加入mPEG20K-卡巴肼(20mg，1μmol)，接着是乙腈中的乙基异氰基丙酸盐(20mM，50μl，1μmol)。将所得到的共轭混合物在室温培养24小时。通过离子交换色谱来纯化共轭物并通过MS、氨基酸分析和SDS-PAGE来表征。通过寡糖含量的测定来证实聚糖特异性共轭。
实施例12.mPEG-YIGSR-NH2共轭物的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝YIGSR-NH2，RI＝mPEG5K和RC＝CH3(参见表1的情况7)该反应中，将两个mPEG分子共轭至YIGSR(源自层粘连蛋白的合成粘着肽)，其已经在其N-端用醛基进行了衍生。
用水中的新鲜高碘酸钠溶液(100mM，50μl)在黑暗中4℃将磷酸盐缓冲剂(10mM，pH7)中的肽TYIGSR-NH2(5mM，0.450ml)处理10分钟，然后用亚硫酸钠来猝灭(200mM，50μl)。将所得到的溶液与乙酸盐缓冲剂(0.5M，1ml，pH4.5)中的mPEG5K-卡巴肼(110mg，22μmol)溶液混合。加入实施例1中所述制得的PEG-异腈衍生物(mPEG5K-NC，125mg，25μmol)，将所得到的溶液在室温培养过夜。通过渗析接着离子交换色谱来纯化产物并通过MS来表征。通过测序和氨基酸分析来证实N-端共轭。
实施例13.PEG-EPO的制备，使用RN＝mPEG5K，RA＝EPO聚糖，RI＝mPEG5K和RC＝CH3(参见表1的情况7)该反应中，将两个mPEG分子共轭至EPO(促红细胞生成素)，其已经用高碘酸盐处理来产生分子的聚糖部分中的醛官能团。如上，使用低pKa胺组分(mPEG20K-卡巴肼)以有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
用高碘酸钠(80mM，40μl)在黑暗中4℃将乙酸钠缓冲剂(0.2M，pH5.0)中的促红细胞生成素(EPREX，0.76ml，1mg)溶液处理10分钟。用亚硫酸钠(300mM，20μl)来猝灭过量的高碘酸盐。加入mPEG5K-卡巴肼(100mg，1μmol)，接着mPEG5K-异腈(100mg，1μmol)。将所得到的共轭混合物在室温培养24小时。通过离子交换色谱来纯化共轭物并通过MS和SDS-PAGE来表征。通过寡糖含量的测定来证实聚糖特异性共轭。
实施例14.PEG-BSA的制备，使用RN＝CH3，RA＝H，RI＝mPEG5K和RC＝BSA(类似于表1的情况1)该反应小，将PEG共轭至牛血清白蛋白(BSA)，将其用作羧基组分。使用过量的低分子量胺组分(甲胺)，在pH4.5，以有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
具体地，将6mg BSA(0.09μmol)溶解于860μl的H2O中，并用0.25M HCl(～5μl)将pH调节至4.5。加入甲醛(9μmol，100倍过量)和甲胺(9μmol，100倍过量)，接着加入mPEG5KN≡C(5mg，1μmol，11.11倍过量)。
在5分钟、10分钟、1h、4h、7.5h和24h，总共取出六次25μl样品，且每次立即加入230μl的2M乙酸钠缓冲剂中(pH4.5，约超过BSA2X105倍过量)来停止反应。
通过SDS-PAGE来表征这些每个阶段中产物的组成。PEG-蛋白质共轭产物的量随着时间而增加，且基本上所有起始BSA在7.5h时间点之前消耗。
实施例15.PEG-溶菌酶的制备，使用RN＝CH3，RA＝H，RI＝mPEG5K和RC＝溶菌酶(类似于表1中的情况1)该反应中，将PEG共轭至溶菌酶，将其用作羧基组分。使用过量的低分子量胺组分(甲胺)，在pH4.5，以有利于其反应超过蛋白质中氨基侧链的反应。
具体地，将1.4mg溶菌酶(0.09μmol)溶解于860μl的H2O中，并用0.25M HCl(～5μl)将pH调节至4.5。加入甲醛(9μmol，100倍过量)和甲胺(9μmol，100倍过量)，接着加入mPEG5KN≡C(5mg，1μmol，11.11倍过量)。
在5分钟、10分钟、1h、4h、7.5h和24h，总共取出六次25μl样品，且每次立即加入230μl的2M乙酸钠缓冲剂中(pH4.5，约超过BSA2X105倍过量)来停止反应。
进行两次另外反应，一次使用3.1mg(0.2μmol)，另一次使用7.74mg(0.5μmol)溶酶体。其他反应物的含量和反应条件未改变。
通过用7000 MWCO Mini渗析设备(Slide-A-Lyzer，50单位)对PBS(4L，pH7.4)在4℃渗析纯化样品过夜。通过SDS-PAGE来表征每个样品的产物的组成。
每次反应中PEG-蛋白质共轭产物的含量随着时间而增加，尽管一些蛋白质保持在24小时未反应，存在形成一些蛋白质二聚物和三聚物的证据。
实施例16.PEG-PPO-透明质酸共轭物的制备RN＝PPO，RA＝H，RI＝mPEG2K和RC＝透明质酸(类似于表1的情况5) (a)将水(6ml)加入透明质酸钠(32mg，0.08mmol)中，并将溶液在室温搅拌直至清澈(约30分钟)。将甲醛(6μl，0.08mmol，H2O中37％)加入溶液中，接着加入MeOH(12ml)中氨基官能化的聚环氧内烷(PPO-C6H4-CH(CH3)-NH2，150mg，0.08mmol)。将所得到的溶液用2N HCl(～36μl)来略微酸化以获得3-3.5的pH。加入mPEG异腈(mPEG2000-NC，168.08mg，0.08mmol)，并将反应混合物在室温搅拌50h，得到浅棕色的清澈溶液，然后将其冻干。用CH2Cl2萃取凝胶样的剩余物来除去未反应的PPO和PEG，并将产物过滤和在真空下通过P2O5来干燥。产量36mg(10％)。1H NMR(D2O)δ1.02(br s，CH3(PPO聚合物)，90H)，1.88(s，CH3CONH(HA)，3H)，3.4-3.57(m，PEG+9HA质子峰，189H)，6.95(d，C6H4，2H)，7.3(d，C6H4，2H)。
分析表明共轭物具有每个PPO/PEG约16-17个HA重复单元；即，上述结构中的m+n等于约16-17。因此，该共轭物中，多个残基RA、RI和RN共轭至残基RC，由透明质酸聚合物表示。(上述结构的说明并不意味着PPO/PEG部分必需沿着HA聚合物链均匀地分布。)进行相似的反应，反应条件进行了如下的改变(b)重复上述反应条件，但是搅拌较短的时间段(24h)，产生的共轭物(28mg)具有每个PPO/PEG部分约21-25个HA重复单元。
(c)进一步的反应中，按照(a)的初始条件，不同的是将pH调节至较高的值(4-4.5)。该反应产生每个PPO/PEG部分具有约10-11个HA重复单元的共轭物(18mg)。
(d)进一步的反应中，首先将氨基官能化的聚环氧丙烷(PPO-NH2)和甲醛混合2小时，接着加入透明质酸钠。然后如上述(a)的初始条件进行反应。该反应产生每个PPO/PEG部分具有约11-14个HA重复单元的共轭物(33mg)。
(e)最后，按照(d)的条件，不同的是将pH调节至较高的值(4-4.5)。该反应产生每个PPO/PEG部分具有约1-2个HA重复单元的共轭物(71.6mg)。
上述结果表明在较高的pH产生较高水平的PPO/PEG和HA聚合物共轭的趋势。在加入HA和PEG-异腈之前，将胺和醛组分预反应具有相似的但较不明显的效果。
权利要求
1.制备蛋白质或多肽和水溶性聚合物的共轭物的方法，包括使以下组分(a)-(d)进行反应(a)RA-C(O)R’，其中R’是H或低级烷基，(b)RN-NH2(c)RC-C(O)OH，和(d)RI-NC来形成共轭产物，引入由RA、RN、RC和RI所示各个部分中的至少一个；其中(a)-(c)中的至少一个是蛋白质或多肽，(a)-(d)中的至少一个是水溶性聚合物，且(a)-(d)中的任何剩余组分是稳定的、非干扰化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述共轭产物是RINH-C(O)-R’RA-NRN-C(O)RC形式。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质或多肽选自(a)RA-C(O)R’、(b)RN-NH2和(c)RC-C(O)OH。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是(a)RA-C(O)R’。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物选自(a)RA-C(O)R’、(b)RN-NH2和(c)RC-COOH。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是RI-NC。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是官能化聚乙二醇(PEG)。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合物是PEG异腈化合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质或多肽由选自(a)-(c)的至少一个组分来表示，所述聚合物由选自(a)-(d)的至少一个不同组分来表示，和(a)-(d)中的任何剩余组分选自标记部分、靶向部分和其他稳定的、非干扰化合物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是选自(a)-(c)的一个组分，所述聚合物是选自(a)-(d)的不同组分，且(a)-(d)的剩余组分是稳定的、非干扰化合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中组分(a)-(d)中的至少一个包括多种化合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是选自(a)-(c)的一种组分，所述聚合物由选自(a)-(d)的两种不同组分来表示，且剩余组分是稳定的、非干扰化合物。
13.制备药物组合物的方法，该组合物在药物载体中包括生物活性分子和生物相容聚合物的共轭物，该方法包括(i)使以下的组分(a)-(d)进行反应(a)RA-C(O)R’，其中R’是H或低级烷基，(b)RN-NH2(c)RC-C(O)OH，和(d)RI-NC来形成共轭产物，引入由RA、RN、RC和RI所示的各个部分中的至少一个；其中由RM表示的组分(a)-(d)中的至少一个是生物活性分子，由RP表示的组分(a)-(d)中的至少一个是生物相容聚合物，且组分(a)-(d)中的任何剩余组分是稳定的、非干扰化合物；和(ii)将共轭物或其药物学上可接受的盐配制于药物载体中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述共轭物是RINH-C(O)-CRAR’-NRN-C(O)RC形式。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物活性分子选自(a)RA-C(O)R’、(b)RN-NH2和(c)RC-C(O)OH。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物活性分子是RA-C(O)R’。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述聚合物是水溶性的。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述聚合物是(d)RI-NC。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述聚合物是官能化聚环氧烷(PAO)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述聚合物是异腈官能化的聚乙二醇(PEG)。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述聚合物是具有可利用羰基或氨基官能度的聚乙二醇(PEG)。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述分子由至少一个选自(a)-(d)的组分来表示，所述聚合物由至少一个选自(a)-(d)的不同组分来表示，且(a)-(d)中的任何剩余组分选自标记部分、靶向部分和其他稳定的、非干扰化合物。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述分子是选自(a)-(d)的一个组分，所述聚合物是选自(a)-(d)的不同组分，且(a)-(d)的剩余组分是稳定的、非干扰化合物。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述载体是含水载体。
25.RINH-C(O)-CHRA-NRN-C(O)RC形式的水溶性共轭物，其中RA、RN和RC中的至少一个是蛋白质或多肽，RI、RA、RN和RC中的至少一个是聚环氧烷(PAO)；和RI、RA、RN和RC的剩余成员独立地选自标记部分、靶向部分和R，其中R是氢或具有1-8个碳原子和0-4个选自氧、氮和硫杂原子的稳定有机部分。
26.根据权利要求25所述的共轭物，其中RI、RA、RN和RC的剩余成员独立地是R的实施方案，附加条件为RI不是氢。
27.根据权利要求25所述的共轭物，其中RI是PEG。
28.根据权利要求25所述的共轭物，其中RC是蛋白质，RI是PEG，且RA和RN独立地选自标记部分、靶向部分和R。
29.根据权利要求25所述的共轭物，其中RC是蛋白质，RN是PEG，且RA和RI独立地选自标记部分、靶向部分和R，附加条件为RI不是氢。
30.根据权利要求25所述的共轭物，其中RC是蛋白质，RN和RA各自是PEG，且RI是标记部分、靶向部分或R，附加条件为RI不是氢。
31.根据权利要求25所述的共轭物，其中RC是蛋白质，RN是PEG，RI是PEG，且RA是标记部分、靶向部分或R。
32.根据权利要求25所述的共轭物，其中RA是蛋白质，RN是PEG，且RC和RI独立地选自标记部分、靶向部分和R，附加条件为RI不是氢。
33.根据权利要求25所述的共轭物，其中RA是蛋白质，RN是PEG，RI是PEG，且RC是标记部分、靶向部分或R。
34.具有结构RCAP(OCHR″CH2)n-X-N≡C的化合物，其中RCAP是稳定的封端基团，X表示直接的键或稳定的连接部分，R”是H或甲基，且n是10至约2300之间的整数。
35.根据权利要求34所述的化合物，其中RCAP是烷基、酰基或芳基。
36.根据权利要求35所述的化合物，其中RCAP是甲基。
37.根据权利要求34所述的化合物，其中R”是氢。
38.根据权利要求37所述的化合物，其中-(OCH2CH2)n-部分具有约5000道尔顿的分子量。
39.根据权利要求37所述的化合物，其中-(OCH2CH2)n-部分具有约20000道尔顿的分子量。
40.根据权利要求34所述的化合物，其中X包括选自直链或支链烷基、芳基、环烷基、醚、酰胺及其结合物的连接物。
41.根据权利要求40所述的化合物，其中X包括选自低级烷基、环烷基、芳基以及低级烷基和芳基或低级烷基和环烷基的结合物的连接物。
42.根据权利要求41所述的化合物，其中X是环己基。
全文摘要
通常以位点特异性或选择性方式通过四组分的缩合反应来制备聚合物－生物分子共轭物。将该方法用于制备具有在生物分子上的单个位点连接的两个聚合物分子的共轭物。共轭物通常是水溶性的并具有有益的药理学特征，如降低的免疫原性和提高的循环时间。
文档编号A61K31/785GK1997401SQ200580018834
公开日2007年7月11日 申请日期2005年6月8日 优先权日2004年6月8日
发明者S·扎利普斯基 申请人:阿尔扎公司