专利名称：包含基于甲基乙烯基醚－马来酸酐共聚物的纳米颗粒的刺激免疫反应的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的纳米颗粒在免疫治疗和疫苗中用作佐剂，任选地所述纳米颗粒含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂。本发明还涉及包含所述纳米颗粒的刺激免疫反应的组合物。
背景技术：
已知，有能够在个体内诱导保护性免疫反应的高度免疫原性的抗原，然而还有其它抗原不诱导所述保护性免疫反应，或者其诱导非常弱的免疫反应。通常，可通过佐剂的联合给药来刺激宿主对弱免疫原性的抗原的免疫反应。
佐剂佐剂是任何提高对与其混合的抗原的免疫反应的物质。佐剂主要通过三种机制发挥作用i)在疫苗施用位点形成抗原或者变应原沉积，生物活性产物将在不同的时间段内从该位点被释放；ii)将抗原或者变应原递送至抗原递呈细胞；以及iii)诱导白介素的分泌。
佐剂的一些典型的例子是铝盐(铝水凝胶)和儿茶酚胺(其增强Th2反应)、革兰氏阴性细菌的脂多糖以及某些CpG序列(其增强Th1反应)。另一方面，许多研究证明某些非生物载体也可以用作佐剂，例如微粒(包被物质的聚合物性质的球状颗粒)或者脂质体(球状小泡，其具有被不同数目生物分子磷脂和胆固醇膜包被的水性中心腔)[Eldridge等人，Infect Immun，59(1991)2978-2986；O′Hagan等人，Vaccine，18(2000)1793-1801；Murillo等人，Vaccine，30(2001)4099-4106]。
以其用途可认为用作佐剂的非生物载体的另一类型是尺寸小于1微米的也被称作纳米颗粒的固体颗粒胶体系统，其被细分为基体纳米球(matrix nanosphere)和泡状纳米胶囊(vesicular nanocapsule)[Orecchioni和Irache，Formes pharmaceutiques pour application locale.Lavoisier Tech and Doc.，Paris，(1996)441-457]。纳米胶囊是由被聚合物膜或壁包围的内腔所形成的泡状体系。纳米球是基体形式的，其通过三维的聚合物网络形成。在两种情况中，生物活性物质的分子都可以被溶解、捕获或者结合在大分子结构中(在纳米球中)，或者被聚合物膜包裹(在纳米胶囊中)，以及其甚至可以被吸附到纳米颗粒的表面。
通常纳米颗粒在生物内的分配依赖于确定其与生物介质相互作用的物理化学特性(主要是尺寸和表面性质)。因此，它们是作为用于抗原和/或变应原的给药的免疫治疗或者抗原佐剂特别令人感兴趣的药物形式。
通常，由这些非生物来源的载体所提供的最重要的能力如下[Couvreur & Puisieux.Adv.Drug Del.Rev.，10(1993)141-162](i)它们被包裹的材料免于在给药和作用位点化学失活、酶失活或者免疫失活；(ii)它们促进生物活性分子向难以到达的位置的转运，并促进生物活性分子渗透入细胞内；(iii)它们延长药物在生物体内的停留时间并控制其释放；(iv)通过在细胞和/或分子目标内的选择性、有效以及规律地浓缩被包裹的材料，提高作用的特异性；以及(v)在药品的制备、运输以及存储过程中，它们提高其所包含的材料的稳定性。
佐剂在疫苗接种中的应用之前，许多研究小组已经评价了乳剂、微粒、ISCOMS或者脂质体形式的颗粒佐剂的应用[综述Singh等人，Int J Parasitology 33(2003)469-478]。
如果抗原与聚合物颗粒结合或者被包含在聚合物颗粒的内部时，则被“抗原递呈细胞”捕获的抗原会增大。多年来，已经在人类和动物中使用生物可降解和生物兼容的聚酯作为抗原控释体系[Okada等人，J Pharm Sci，12(1995)1-99；Putney等人，Nat Biotechnol，16(1998)153-157]。与铝佐剂不同，微粒能有效地诱导小鼠内的细胞免疫反应和细胞毒性免疫反应[Nixon等人，Vaccine 14(1996)1523-1530；Maloy等人，Immunology 81(1994)661-667；Moore等人，Vaccine 13(1995)1741-1749]。与被包裹的抗原相比，在小鼠中以微粒口服免疫在粘膜和系统水平上诱导了有效的免疫反应[Chalacombe等人，Immunology176(1992)164-168；Eldridge等人，J Control Rel 11(1990)205-214；O′Hagan等人，Novel Delivery Systems for Oral Vaccines(1994)175-205]。这种能力是其被粘膜相关淋巴组织的特异性细胞内化的结果[O′Hagan，J Anat，189(1996)477-482]。通过不同颗粒系统的粘膜免疫已经被证明了其对诸如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的不同病原体的有效性[Chaill等人，Vaccine 13(1995)455-462；Jones等人，Vaccine15(1997)814-817；Shahin等人，Infect Immun，63(1995)1195-1200；Conway等人，Vaccine 19(2001)1940-1950]、沙眼衣原体(Chlamidiatrachomatis)[Whittum-Hudson等人，Nat Med 2(1996)1116-1121]、鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)[Allaoui-Attarki等人，Infect Immun65(1997)853-857]和布鲁氏菌(Brucella)[Murillo等人，Vaccine，19(2001)4099-4106]。
佐剂在免疫治疗中的应用变应性疾病是由对本质上无害的大分子的不利免疫反应(超敏反应)所引起的新出现的病状，其中所述大分子被称作变应原。该超敏性影响了全世界大约30％的人口，主要是在工业化国家。其是诸如变应性鼻炎、外源性哮喘、食物变应性以及对药物和昆虫的变应性等许多疾病的原因[Settipane等人，Allergy Proc，15(1994)21-25]。
在西班牙，在4-17岁的人群中，这种类型的疾病的流行程度为13.3％，它们中间6.4％表现为支气管性哮喘，在西班牙由于哮喘所引起的死亡率为居民的1.5/100,000。
变应性疾病病因的机制理论声称可能在激活辅助T细胞(Th1和Th2)后产生的两种基础类型反应之间的平衡被改变，从而出现了所述疾病。存在于细胞外基质中的细胞因子以决定的方式影响未成熟T细胞(Th0)的分化，这样白介素12(IL-12)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素18(IL-18)以及干扰素α(IFN-α)的存在诱导向Th1的分化，其主要以是产生大量的IFN-γ以及较少量的白介素2(IL-2)和干扰素β(IFN-β)为特征。在这种类型的反应中，B细胞的后续激活将导致IgG2a、IgG2b和IgG3的产生。另一方面，如果Th0细胞在白介素4(IL-4)和前列腺素E2(PGE2)占主导的环境中，将被诱导向Th2分化，其特征在于大量IL-4、白介素5(IL-5)和白介素13(IL-13)的合成以及IgG1和IgE的合成，为直接参与触发过程的生物型[Hannah等人，Ann Rev Immunol，21(2003)579-628]。
变应性疾病中Th2变应原特异型反应占主导的重要性已为大量的研究所证实[Romagnani，Ann Rev Immunol，12(1994)227；Bousquet等人，Allergy，53(1998)1-42；Majori等人，Clin Exp Allergy，30(2000)341-347]。在动物模型与人中都证明了具有Th2表型的细胞是唯一能够识别引起变态反应的肽并参与B细胞产生IgE、肥大细胞激活以及产生、嗜曙红细胞的成熟与激活的细胞[Cohn等人，Pharmacology andTherapeutics，88(2000)187-196]。
因此，Th2细胞超过Th1细胞在功能性上占主导将导致变应性反应，而Th1细胞超过Th2细胞在功能性上占主导将抑制变应性反应[Martin等人，Alergol Inmunol Ciln，17(2002)104-110]。
其它研究主张以Th1占主导抑制Th2反应将导致发生自体免疫性疾病，因此，更正确的是通过提高调节T细胞(Tr)和IL-10以及T细胞生长因子β(TGF-β)的量来增强Th1/Th2平衡的免疫调节。这将导致IgG4和IgA抗体(非炎症性反应介质)的合成并导致抑制B细胞产生IgE[Akdis等人，Immunology，103(2001)131-136；Akdis等人，J Clin Invest，102(1998)98-106；Blaser等人，Int Arch Allergy Immunol，117(1998)1-10]。最近的研究再次肯定了IL-10在Th2细胞失活中的重要性[Grunig等人，J Exp Med，185(1997)1089-1099；Adachi等人，Int ArchAllergy Immunol，118(1999)391-394]，并已经发现在体内以IL-10给药在变应性动物中具有有利的结果[Zuany-Amorim等人，J Clin Invest，95(1995)2644-2651；Stampfli等人，Am J Respir Cell Mol Biol，21(1999)586-596；Hall等人，Vaccine，21(2003)549-561]。这使得可推测IL-10在变应性患者特征性的Th2细胞高反应性中发挥了重要的调节作用。
IL-10在消除炎症疾病(克隆氏病(Crohn’s Disease)、类风湿性关节炎、银屑病等)、某些病毒感染(丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)诱导的感染等)或者甚至抑制器官移植副作用中能够具有重要的生理病理应用。因此，直接应用IL-10或者使用刺激产生IL-10的佐剂能够对治疗这些疾病有巨大的影响[Asadullah等人，Pharmacol Rev，55，(2003)241-269]。其目前正被研究用于自体免疫疾病例如类风湿性关节炎的可能疗法[Feldman等人，Annu Rev Immunol(1996)397-440；Katsikis等人，J Exp Med(1994)1517-1527；Chomarat等人，J Immunol(1995)1432-1439]。因此，该细胞因子的抗炎症和调节作用使其在Th1(自体免疫疾病)和Th2(变应性)过多反应中是必需的。
对变应性疾病的治疗可以基本上以三种不同的方式进行(i)避免与变应原的任何接触；(ii)使用抗组胺类药物；和(iii)通过免疫治疗。考虑到有时候不适用前两种方法，因此免疫治疗将是最适当的控制方法。
使用变应原的特异性免疫治疗已经被定义为对患有IgE介导的健康失调患者反复以变应原给药，以达到免于与天然暴露到这些变应原相关的变应性综合症和炎症反应的目的[Jutel，M.，J Inmunol，154(1995)4178-4194]。
这种备选治疗方法旨在增强Th1反应相对于Th2反应的功能性主导，这将抑制变应性症状。这种对Th1的调节也可以用于其它过程中，例如通过针对细菌性细胞内寄生虫(例如布鲁氏菌(Brucella)和沙门氏菌(Salmonella))的疫苗接种的控制。
尽管已经描述了各种非生物载体(例如纳米颗粒)用作免疫治疗或者疫苗中的佐剂以进行抗原和/或变应原给药的应用，但仍需要为这些目前已有佐剂提供可以替换的佐剂，以达到提高供应的可能性以用于制备免疫治疗的疫苗和组合物。有利的是，所述佐剂必须有助于通过口服给药在免疫或者免疫治疗中的应用，而不需要非常高的变应原和抗原剂量。如已知的，尽管有其潜在的优势，但由于免疫原能力的损失造成有益的临床效果所需的免疫原或变应原活性成分的剂量非常高，用于治疗或者预防目的的口服免疫必须克服若干障碍。因此，一般由于变应原或抗原在肠胃道(pH条件以及水解酶的存在)中的低稳定性，因此剂量必须一直比正常通过皮下使用的剂量要高得多[Taudorf等人，J Allergy Clin Immunol(1987)153-161；Creticos等人，J AllergyClin Immunol(1990)165]。而且，肠胃粘膜是阻碍这些大分子吸附的相当不易渗透的屏障。
令人吃惊的是，目前已经发现任选地含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂的基于甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的纳米颗粒，当将其对个体进行给药时具有刺激或者增强免疫反应的能力，这使其能够用在免疫治疗和疫苗中。所述纳米颗粒在口服给药中是稳定的，其具有良好的生物附着特征，并因此能够通过各种给药途径(包括口服途径)用在免疫或者免疫治疗中，而不需要使用现有技术中所述的那些高变应原或抗原剂量。而且，所述纳米颗粒是低毒性的，它们是生物可降解的并且容易制备。
甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物纳米颗粒属于相同申请人的专利申请WO 02/069938公开了甲基乙烯基醚-马来酸酐(PVM/MA)共聚物纳米颗粒、获得它们的方法及其作为药物载体的应用。所述PVM/MA共聚物在结构上由具有不同溶解特性的两种不同官能团疏水酯基和无水基团构成。羧基是增溶剂，因为当其被电离时，其倾向于使该聚合物溶解，酯基是疏水的，因为其阻碍了水进入该聚合物[Heller等人，J Appl Polym Sci，22(1978)1991-2009]。合成的PVM/MA共聚物具有非常不同的应用。GantrezAN被广泛地用作增稠剂和絮凝剂、牙齿粘合剂、口服药片的赋形剂以及透皮贴剂的赋形剂等。另一方面，已经公开了这些共聚物用于控释药物的应用[Heller等人，J Appl Polym Sci，22(1978)1991-2009]，以及以基体(matrix)的形式用于眼部局部释放药物[Finne等人，J Pharm Sci，80(1991)670-673；Finne等人，Int J Pharm，78(1992)237-241]。
基于PVM/MA的纳米颗粒具有生物附着特征[Arbós等人，Int JPharm，(2002)129-136]，这样当它们被口服给药时，其可与含有生物体全部淋巴细胞的20％的派尔结相互作用，并引发针对以水溶液给药的抗原和/或变应原的放大的免疫反应。
基于PVM/MA纳米颗粒是胶体体系，其能够通过以下方式保持生物活性物质(i)溶解或者俘获进大分子结构或者基体的内部，(ii)将药物与共聚物酸酐基团共价连接，以及(iii)通过弱碱介导的吸附过程。由于环状酸酐基团，PVM/MA共聚物的极强反应性也有助于其俘获分子、药物或者其它物质。专利申请WO 02/069938公开了所述PVM/MA共聚物纳米颗粒作为药物(具体为5-氟尿苷、更昔洛韦和反义寡核苷酸ISIS 2922)的载体。
发明概述本发明的目的是提供在个体中刺激免疫反应的组合物，其可用作免疫治疗和疫苗中的佐剂，当口服给药时是稳定的，并且具有良好的生物附着特征以便其与粘膜的相互作用，根据情况，其能携带变应原或抗原和/或免疫刺激剂，并能以受控的方式释放所述产品，因此可以用于通过不同给药途径(包括口服)的免疫或者免疫治疗中。
令人吃惊的是，目前已经发现基于甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的纳米颗粒，其根据情况可以含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂，在以其对个体给药时具有刺激或者增强免疫反应的能力，这使得它们可用在免疫治疗和疫苗中。尤其是已经发现所述纳米颗粒容易制备，具有良好的生物附着特性并且是低毒性和生物可降解的(即一旦它们暴露到pH6-9的生理溶液和25℃至40℃之间的温度时，其在一段时间内溶解或者降解，这段时间是所期望的应用(在本文中为体内治疗)可接受的)。
因此，本发明的一个方面涉及刺激免疫反应的组合物，其包括基于甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的纳米颗粒。所述纳米颗粒还可以进一步含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂，其中变应原或抗原和/或免疫刺激剂可以被包含在所述纳米颗粒的内部和/或至少部分地包被在所述纳米颗粒的表面。如果需要，所述代谢途径也可以含有交联剂。所述组合物可任选地为冻干的形式。
另一方面，本发明涉及疫苗或免疫治疗组合物，其包含所述刺激免疫反应的组合物。在特定的实施方式中，所述免疫治疗疫苗或组合物是适合口服给药的制剂，而在另一特定的实施方式中，所述免疫治疗疫苗或组合物是适合肠胃外给药的制剂。
另一方面，本发明涉及所述刺激免疫反应的组合物在制备疫苗或免疫治疗组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及所述刺激免疫反应的组合物的用途，其用于制备选择性刺激Th1免疫反应的药物组合物，或者制备选择性刺激Th2免疫反应的药物组合物，或者制备平衡刺激Th1和Th2免疫反应的药物组合物。
另一方面，本发明涉及制备刺激免疫反应的组合物的方法，该刺激免疫反应的组合物包含所述基于PVM/MA的纳米颗粒和变应原或抗原和/或免疫刺激剂，所述方法包括在以水醇溶液进行去溶剂化之前，将所述变应原或抗原和/或免疫刺激剂加入到包含所述PVM/MA共聚物的有机溶液中，或者将所述变应原或抗原和/或免疫刺激剂与所述PVM/MA纳米颗粒孵育。所述方法还可以包括另外的除去有机溶剂的步骤和/或纯化步骤以及通过使用交联剂稳定所得到的纳米颗粒的步骤。所述方法可任选地包括另外的冻干步骤。
附图简要说明
图1显示从制剂NP-I、NP-II、NP-III和NP-IV中释放的卵清蛋白(％)随时间(天数)的变化图。
图2显示在以无卵清蛋白(OVA)的溶液、吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)、空纳米颗粒(NP)、NP-I、NP-II、NP-III和NP-IV皮内免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白抗体(IgG1和IgG2a)的水平随时间的变化图。
图3显示在以无卵清蛋白(OVA)的溶液、空纳米颗粒(NP)、NP-I、NP-II、NP-III和NP-IV经口服免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白抗体(IgG1和IgG2a)的水平随时间的变化图。
图4显示在以不同包裹剂量的卵清蛋白(NP-III25和NP-III50)和空纳米颗粒(NP)经口服免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白抗体(IgG1和IgG2a)的水平随时间的变化图。
图5显示在以卵清蛋白(OVA)溶液、吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)、空纳米颗粒(NP)、NP-I、NP-III、NP-V、NP-VI和NP-VII皮内免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白抗体(IgG1)的水平随时间的变化图。
图6显示在以无卵清蛋白(OVA)的溶液、吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)、空纳米颗粒(NP)、NP-I、NP-III、NP-V、NP-VI和NP-VII皮内免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白抗体(IgG2a)的水平随时间的变化图。
图7显示在以无卵清蛋白(OVA)的溶液、吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)、空纳米颗粒(NP)、NP-I、NP-III、NP-V、NP-VI和NP-VII皮内免疫Balb/c小鼠免疫后，IL-10血清浓度随时间的变化图。
图8显示在以吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)、OVASAL和卵清蛋白(OVA)溶液免疫Balb/c小鼠后，特异性抗卵清蛋白(IgG1和IgG2a)的水平随时间的变化图。
图9显示通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离HE提取物以及考马斯蛋白质染色的结果(每孔10μg提取物)。
图10显示被在包裹之前(A)和之后(B)使用来自被感染的鸡的血清混合物对HE提取物的免疫印迹分析的结果。
图11是说明以致死剂量的102集落形成单位(CFU)的肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)3934在Balb/c小鼠内进行的腹膜内保护实验的结果的图。
图12显示以HE提取物再刺激的Balb/c小鼠脾细胞所释放的IFN-γ(A)和IL-4(B)的柱状图。
图13显示与HE提取物相比，采用IgG1和IgG2a抗体对Balb/c小鼠血清的间接ELISA的结果的柱状图。
发明的详细描述令人吃惊的是，目前已经发现任选地含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂的基于甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的纳米颗粒，当以其对个体给药时具有刺激或者增强免疫反应的能力，这使其可用在免疫治疗和疫苗中。
这里所使用的术语“个体”包括任何具有免疫系统的动物，优选为哺乳动物，更优选为人。
在一方面，本发明涉及刺激免疫反应的组合物，在下文中称为本发明的组合物，其包括甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物纳米颗粒。所述纳米颗粒还可包含变应原或抗原和/或免疫刺激剂，其可以被包含在所述纳米颗粒的内部和/或至少部分包被所述纳米颗粒的表面。如果需要，所述纳米颗粒也可以含有交联剂。
在本说明书中所使用的术语“纳米颗粒”用于指固体颗粒型胶体体系，其具有小于1.0微米的尺寸，优选为10至900纳米(nm)的数量级，并且包括基体纳米球和泡状纳米胶囊。在特定的实施方式中，所述纳米颗粒具有等于或小于400nm的平均尺寸。
存在于本发明的组合物中的纳米颗粒包括甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物，其也被称作聚(甲基乙烯基醚-共(co)马来酸酐)或者PVM/MA。所述PVM/MA共聚物是已知的产品，其可以通过传统的方法获得，例如通过将乙炔与马来酸酐进行聚合，或者其可以在市场上获得。在这方面，International Specialty Products(ISP)公司生产了具有不同的分子量的PVM/MA共聚物，其以商品名Gantrez销售。通常，为了实施本发明，所述PVM/MA共聚物的分子量可以在非常宽的范围内变化，优选在100至2,400kDa之间，更优选在200至2,000kDa之间。在本发明的变体中，优选分子量在180至250kDa之间的PVM/MA共聚物。
已知所述PVM/MA共聚物由于其低毒性(LD 50＝8-9g/kg，口服)和其良好的生物相容性而被广泛用于药物技术，则使用该PVM/MA共聚物是非常有利的。而且，其容易获得并由于其官能团而能够与其它亲水物质相互作用，不需要借助具有较大毒性的常用有机试剂(戊二醛和碳二亚胺衍生物)[Arbós等人，J.Controlled Rel.，83(2002)321-330]。PVM/MA共聚物不溶于水介质中，但其中存在的酸酐基团会水解，产生了羧基。该溶解过程缓慢并依赖于其所产生的条件。由于PVM/MA中官能团的可用性，与带有诸如羟基或胺的分子的共价结合可以通过在水介质中的简单孵育而发生。所述PVM/MA纳米颗粒还具有生物附着特性[Arbós等人，Int J Pharm，(2002)129-136]，因此在口服给药的时候，它们能够与含有生物体全部淋巴细胞的20％的派尔结相互作用，并引发针对以水溶液给药的抗原和/或变应原的放大的免疫反应。
在特定的实施方式中，本发明的组合物包括缺少抗原或变应原以及免疫刺激剂的基于PVM/MA的纳米颗粒。在本说明书中所述纳米颗粒被称作“空”纳米颗粒并可以通过例如在专利申请WO 02/069938的方法而容易地获得，此处引入WO 02/069938的全部内容作为参考。作为说明，所述空纳米颗粒可以通过使用水醇相对PVM/MA共聚物的丙酮溶液去溶剂化(desolvation)而容易地获得。所形成的纳米颗粒能够保留在稳定的水悬浮液中，或者它们能够被冻干。根据情况可以加入交联剂。实际上能够使用含有一个或者多个能够与PVM/MA共聚物的酸酐基团反应的任何交联剂，有利的是聚胺或碳水化合物，例如氨基酸、蛋白质、糖类(-ose)、糖苷(-oside)等，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、水溶性蛋白质、多聚-L-赖氨酸、多聚-L-精氨酸等，优选1，3-二氨基丙烷。
当与分别含有抗原或变应原的疫苗或者用于免疫治疗的组合物(免疫治疗组合物)共同给药时，所述空纳米颗粒可以作为疫苗接种或者免疫治疗中的佐剂，在以疫苗或者免疫治疗组合物以及空纳米颗粒给药之后其产生刺激免疫反应的作用。图12表示空纳米颗粒的给药如何诱导显著量的IFN-γ的分泌。疫苗或者免疫治疗组合物与空纳米颗粒的联合给药可以同时或者在不同时间以任何顺序依次进行，即可以首先以疫苗或免疫治疗组合物给药，接着以该纳米颗粒给药，或者反过来。或者，所述疫苗或免疫治疗组合物与所述纳米颗粒可以同时给药。所述疫苗或免疫治疗组合物和纳米颗粒也可以在相同组合物或者不同组合物中给药。带给药的空纳米颗粒剂量可以在宽范围内变化，例如在约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重之间，优选在0.1mg/kg体重至2mg/kg体重之间。
在另一
具体实施例方式
中，本发明的组合物包含负载变应原或抗原和/或负载免疫刺激剂的基于PVM/MA的纳米颗粒。
在本发明的一个变体中，本发明的该组合物包含负载变应原或抗原的基于PVM/MA的纳米颗粒，其中所述基于PVM/MA的纳米颗粒包含变应原或抗原。
当用在本说明书中，术语“变应原”是指个体对其敏感并引起免疫反应的物质，例如引起变态反应的花粉提取物、引起变态反应的昆虫提取物、引起变态反应的食物或食品提取物、唾液中存在的组分、诱导个体中致敏反应的昆虫螯或者刺、诱导个体中致敏反应的存在于植物中的组分等。因此可以使用例如花粉蛋白提取物，诸如草花粉(多年生黑麦草(Lolium perenne)、草地早熟禾(Poa pratense)、梯牧草(Phleum pratense)、狗牙根(Cynodon dactylon)、羊茅(Festuca pratensis)、鸭茅(Dactylis glomerata)、黑麦(Secale cereale)、大麦(Hordeumvulgare)、燕麦(Avena sativa)和Triticum sativa)、其它草类的提取物(例如艾蒿(Artemisa vulgaris)、灰菜(Chenopodium album)、长叶蒲公英(Plantago lanceolata)、蒲公英(Taraxacum vulgare)、犹大墙草(Parietariajudaica)、猪毛菜(Salsola kali)和荨蔴(Urtica dioica))或者树花粉(例如油橄榄(Olea europea)，悬铃木(Platanus sp.)和柏(Cupressus sp.))等。也可以使用昆虫蛋白提取物，例如尘螨提取物(例如屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、粗足粉螨(Acarus siro)、热带无爪螨(Blomia tropicalis)、埋内欧螨(Euroglyphus maynei)、甘恙螨(Glyciphagus domesticus)、害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)和腐食酪螨(TYrophagus putrescentiae))等。其它的变应原提取物可以从真菌以及动物上皮(互隔交链孢霉(Alternariaalternata)、草本芽枝霉(Cladosporium herbarum)、狗上皮、猫上皮、马上皮、羽毛混合物和点青霉(Penicillium notatum)等)得到，以及来自食物组分等。事实上，任何变应原都可以用于制备本发明组合物的负载变应原的纳米颗粒；然而，在特定实施方式中，所述变应原是卵清蛋白(OVA)，一种广泛用作实验上引起变态反应的模型的蛋白质。
当用在本说明书中，术语“抗原”是指天然或者重组的引起免疫反应的产品，其从高级生物体或者从诸如细菌、病毒、寄生虫、原生动物以及真菌等的微生物中获得，含有一种或者多种抗原决定簇，例如所述生物体的结构组分；毒素，例如外毒素等。事实上，任何抗原都可以用于制备本发明组合物的负载抗原的纳米颗粒；然而，在特定实施方式中所述抗原是肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的HE提取物。
已知，肠炎沙门氏菌是食物中毒中最经常检测到的人胃肠炎的致病病原体(在60％的病例中可以分离到这种病原体)。家禽以及家禽副产品被认为是沙门氏菌(Salmonella)的主要储存处，以及人类中肠炎沙门氏菌感染的最重要来源。该感染是通过摄入被污染的食物或水所传播的动物传染病，目前为大流行病。为了控制沙门氏菌病，世界卫生组织(WHO)以及欧盟都已经建立了监控和清除家禽中肠炎沙门氏菌感染的指南，因为这对人群的利益是明显的。抗生素、竞争性排除(competitive exclusion)、鸟类和疫苗的遗传选择以及改进的家禽饲养农场的卫生条件都已经被用于家禽的沙门氏菌控制。在这些措施中，被广泛接受的最实用的措施是疫苗接种，因为其是最容易应用以及成本最低的措施。尽管减毒的活疫苗和死疫苗(死菌苗)在目前都被使用，但在家禽农场(鸡以及其它家禽物种)中都是相当低效的[Zhang-Barber等人，Vaccine，17(1999)2538-2545]。除了它们非常低的效率外，活疫苗的最大缺点是它们在免疫抑制的动物中的潜在毒性以及它们可能回复成入侵型状态。而且，它们必须通过肠胃外给药，并且它们干扰传统的血清学诊断测试。灭活的(死菌苗)细菌没有残余毒性的风险，但它们不会诱导细胞免疫反应。需要以有效的佐剂给药，并需要多倍的激发剂量。或者使用亚细胞疫苗，其能够刺激针对由肠炎沙门氏菌引起的感染的适当免疫反应。尽管已经描述了这些疫苗(例如死菌苗)在实验水平上的高程度保护，但是它们仍需要多倍的激发剂量以得到可以接受的保护水平[Powell，Pharm Res，13(1996)1777-1785]。另一方面，如果它们被口服给药，则它们经历在胃肠道的变性和降解[Langer等人，Adv Drug Deliv.Rev，28(1997)97-119]，所以这种类型的疫苗必须要肠胃外给药，这就意味着后续的后勤和经济上的障碍。肠炎沙门氏菌抗原可以被包裹在如前所述的PVM/MA纳米颗粒内，以解决这些缺陷。
存在于本发明的组合物的这种变体中的变应原或抗原可至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。在特定的实施方式中，所述变应原或者抗原包被所述纳米颗粒表面的全部或部分。该实施方式可以用于选择性刺激个体中的Th2反应。在另一特定实施方式中，所述变应原或抗原被包裹进所述PVM/MA纳米颗粒的内部。该实施方式可以用于刺激平衡的Th1和Th2反应，或者使Th1反应占主导。
可以通过类似于专利申请WO 02/069938的方法容易地获得负载变应原或抗原的PVM/MA纳米颗粒。作为说明，可以通过使用液相(例如水醇相，例如由乙醇和水形成的液相)对PVM/MA共聚物在有机溶剂(例如极性有机溶剂，例如丙酮)中的溶液去溶剂化而容易地获得所述负载变应原或抗原的PVM/MA纳米颗粒。所形成的纳米颗粒留在水悬浮液中或者被冻干。根据所加入的变应原或抗原的时机，将获得不同的制剂，变应原或抗原的排列不同(参见实施例1和6中被称作NP I、NP II、NP III、NP IV和NP HE 3934的制剂)。作为说明，当期望变应原或抗原包被全部或者部分纳米颗粒表面时，则将所述变应原或所述抗原在蒸发有机溶剂后进行孵育。类似地，当期望变应原或抗原被包裹进所述纳米颗粒内部时，则在添加用于对PVM/MA共聚物溶液去溶剂化的所述液相之前，将变应原或者所述抗原进行孵育，其中变应原或抗原被分散在溶剂中，优选的溶剂是PVM/MA共聚物溶液中的溶剂，或者与其互溶的溶剂，例如优选的是极性有机溶剂或者与聚合物溶液的溶剂互溶的溶剂，例如丙酮。如果需要，如之前涉及空纳米颗粒时提到的，可以根据情况加入交联剂。
更具体地，本发明的另一方面涉及生产本发明组合物的方法，该组合物包含负载变应原或者负载抗原的PVM/MA共聚物纳米颗粒，其中所述PVM/MA共聚物纳米颗粒包含变应原或抗原，所述方法包括以下步骤a)以水醇溶液对PVM/MA共聚物溶解在有机溶剂中所形成的有机溶液去溶剂化；b)去除有机溶剂以获得纳米颗粒；以及c)在对所述PVM/MA共聚物有机溶液去溶剂化之前，将所述变应原或抗原加入到所述PVM/MA共聚物有机溶液中，或者使所述变应原或者所述抗原与步骤b)中所得到的纳米颗粒孵育。
溶解PVM/MA共聚物的溶剂可以是所述共聚物能够溶解在其中的任何溶剂，通常是极性溶剂，例如酮类，如丙酮。用于所述去溶剂化的液相可以是任何水醇溶液，其含有醇和水，例如乙醇和水，例如醇和药用级的水(根据应用，经过纯化的水或者注射用水)。有利的是，共聚物溶液∶醇水溶液比例为1∶1至1∶10，优选为1∶4。接着，通过任何传统方法去除有机溶剂，例如通过在减压下进行蒸发，在出现稳定的乳状水溶液时，立即在介质中形成纳米颗粒。
在对所述PVM/MA共聚物有机溶液去溶剂化之前，向PVM/MA共聚物有机溶液中加入变应原或者抗原，可以获得将变应原或抗原被包含在内部的纳米颗粒。有利的是，所述变应原或抗原被加入、溶解或分散在与PVM/MA共聚物有机溶液中的有机溶剂相同或其它与其互溶的有机溶剂中，例如极性有机溶剂(如丙酮)中。或者，所述变应原或者所述抗原与步骤b)中所得到的纳米颗粒孵育使得能够获得变应原或抗原包被纳米颗粒全部或部分外表面的纳米颗粒。在特定的实施方式中，在水介质中进行变应原或抗原与所述纳米颗粒的孵育。
如果需要，如之前提到空纳米颗粒时所描述的，根据情况还可以加入交联剂以提高纳米颗粒的稳定性。
通过传统的方法，可以将所获得的负载变应原或抗原的纳米颗粒进行纯化，例如通过离心、超速离心、切向过滤或者包括使用真空在内的蒸发。
最后，如果需要，可以对负载变应原或抗原的纳米颗粒进行冻干，以便它们的长期贮藏和保藏。可以使用标准防冷冻剂以辅助冻干，优选浓度为相对于总混合物重量的0.1％至10％重量比。
如实施例3-6所显示的，负载变应原或抗原的纳米颗粒可以作为疫苗接种或免疫治疗中的佐剂，并在以其对个体给药后产生刺激免疫反应的效果。
待给药的负载变应原或抗原的纳米颗粒的剂量可以在宽范围内变化，例如约0.01至约10mg/kg体重，优选0.1至2mg/kg体重。
在本发明的另一变体中，本发明的组合物包括负载免疫刺激剂的基于PVM/MA的纳米颗粒，其中所述基于PVM/MA的纳米颗粒包含免疫刺激剂。
当用在本说明书中，术语“免疫刺激剂”或“免疫调节剂”是指能够特异性或者非特异性地增强免疫反应的产品，例如，作为刺激免疫系统应答变应原或抗原的天然佐剂的蛋白质或者肽，细菌脂多糖，革兰氏阳性细菌的细胞壁组分(例如胞壁酰二肽(MDP))，DNA CpG序列，植物提取物，主要皂角苷植物提取物等。事实上，任何免疫刺激剂都可以用于制备本发明组合物的负载免疫刺激剂的纳米颗粒；然而，在特定实施方式中，所述免疫刺激剂是羊布鲁氏菌(Brucella ovis)的粗糙型脂多糖。
所述免疫刺激剂可以至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。在特定实施方式中，所述免疫刺激剂包被所述PVM/MA纳米颗粒的全部或者部分表面，而在另一特定实施方式中，所述免疫刺激剂被包裹进所述PVM/MA纳米颗粒的内部。
可以通过与前面所述制备负载变应原或抗原的PVM/MA纳米颗粒相似的方法，来制备负载免疫刺激剂的PVM/MA纳米颗粒，但是将所述变应原或抗原替换为免疫刺激剂。因此，根据所加入的免疫刺激剂的时机将获得不同的制剂，其排列不同(参见实施例1或4)。作为说明，当期望免疫刺激剂包被全部或者部分纳米颗粒表面时，则在所述免疫刺激剂蒸发有机溶剂后孵育。同样地，当期望免疫刺激剂被包裹进纳米颗粒内部时，则在加入用于对PVM/MA共聚物溶液去溶剂化的所述液相之前，将免疫刺激剂孵育，其中该免疫刺激剂被分散或溶解在溶剂中，有利的是该溶剂是PVM/MA共聚物溶液中的溶剂，或者与所述溶剂互溶的溶剂，例如优选的是极性有机溶剂或者与聚合物溶液的溶剂互溶的溶剂，例如丙酮。如果需要，如之前面涉及空纳米颗粒时所描述的，根据情况可以加入交联剂。
如果需要，如之前涉及空纳米颗粒时所描述的，根据情况还可以加入交联剂以提高纳米颗粒的稳定性。
通过传统的方法，例如之前涉及负载变应原或抗原的纳米颗粒时所描述的，可以对负载免疫刺激剂的纳米颗粒进行纯化。如果需要，可以使用标准防冷冻剂对负载免疫刺激剂的纳米颗粒进行冻干，优选浓度为相对于总混合物重量的0.1％至10％重量比。
负载免疫刺激剂的纳米颗粒可以用作疫苗接种或免疫治疗中的佐剂，在以其对个体给药后产生刺激免疫反应的效果。
待给药的负载免疫刺激剂的纳米颗粒的剂量可以在宽范围内变化，例如约0.01mg/kg至约10mg/kg体重，优选0.1mg/kg体重至2mg/kg体重。
在本发明的另一个变体中，本发明的组合物包含负载变应原或抗原以及免疫刺激剂的基于PVM/MA的纳米颗粒，其中所述PVM/MA纳米颗粒包含变应原或抗原以及免疫刺激剂。
在本发明的组合物的该变体中，变应原或抗原以及免疫刺激剂可以至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。
在特定的实施方式中，所述变应原或抗原包被了所述纳米颗粒的全部或部分表面，而免疫刺激剂被包含在所述纳米颗粒的内部，已经发现这种特定的实施方式可以选择性的刺激个体中的Th2反应。
在另一特定实施方式中，所述变应原或抗原被包裹进所述PVM/MA纳米颗粒内部，而所述免疫刺激剂至少部分地包被所述纳米颗粒的表面。该实施方式对于刺激平衡的Th1和Th2反应，或者Th1刺激占主导的反应特别有意义。
在另一特定实施方式中，变应原或抗原以及免疫刺激剂被包裹进PVM/MA纳米颗粒的内部。
含有变应原或抗原以及免疫刺激剂的PVM/MA纳米颗粒可以通过与之前所描述的方法相似的方法而容易地获得。根据所加入的变应原或抗原以及免疫刺激剂的时机，可以获得不同的制剂，所述产品的排列不同。作为说明，当期望免疫刺激剂包被全部或者部分纳米颗粒表面时，则将所述免疫刺激剂在蒸发有机溶剂后孵育。同样地，当期望免疫刺激剂被包裹进纳米颗粒内部时，则在添加用于对PVM/MA共聚物溶液去溶剂化的所述液相之前，将免疫刺激剂孵育，其中该免疫刺激剂被分散或溶解在溶剂中，有利的是该溶剂是PVM/MA共聚物溶液中的溶剂，或者与所述溶剂互溶的溶剂，例如优选的是极性有机溶剂或者与聚合物溶液的溶剂互溶的溶剂，例如丙酮。类似地，当期望变应原或抗原包被全部或者部分纳米颗粒表面时，则将所述变应原或所述抗原在蒸发有机溶剂后孵育。同样地，当期望变应原或抗原被包裹进纳米颗粒内部时，则在添加用于对PVM/MA共聚物溶液去溶剂化的所述液相之前，将变应原或者所述抗原孵育，其中变应原或抗原被分散在溶剂中，有利的是该溶剂是PVM/MA共聚物溶液中的溶剂，或者与所述互溶的溶剂，例如优选的是极性有机溶剂或者与聚合物溶液的溶剂互溶的溶剂，例如丙酮。类似地，当期望变应原或抗原以及免疫刺激剂被包裹进所述纳米颗粒内部时，则在添加用于对PVM/MA共聚物溶液去溶剂化的所述液相之前，将所述变应原或抗原进行孵育，根据情况可以与所述免疫刺激剂进行混合，所述变应原或抗原被分散或溶解在溶剂中，有利的是该溶剂是PVM/MA共聚物溶液中的溶剂，或者与所述互溶的溶剂，例如优选的是极性有机溶剂或者与聚合物溶液的溶剂互溶的溶剂，例如丙酮。在任何情况下，如果需要，如之前涉及空纳米颗粒时描述的，根据情况可以加入交联剂以提高其稳定性。
更具体地，本发明的另一方面涉及用于生产本发明组合物的方法，该组合物包含负载变应原或者抗原和免疫刺激剂的PVM/MA共聚物纳米颗粒，其中所述PVM/MA共聚物纳米颗粒包含变应原或抗原以及免疫刺激剂，所述方法包括以下步骤a)以水醇溶液对PVM/MA共聚物溶解在有机溶剂中所形成的有机溶液去溶剂化；b)去除有机溶剂以获得纳米颗粒；以及
c)在对所述PVM/MA共聚物有机溶液去溶剂化之前，将所述变应原或抗原和/或所述免疫刺激剂加入到所述PVM/MA共聚物有机溶液中，或者将所述变应原或者所述抗原或所述免疫刺激剂与步骤b)中所得到的纳米颗粒孵育。
步骤a)和b)通过与前面所提到的生产本发明包含负载了变应原或抗原的PVM/MA共聚物纳米颗粒的组合物相同的方法进行。步骤c)通过与前面所描述的所述过程相似的方式进行，然而进行了相应的修改，在对所述PVM/MA共聚物有机溶剂进行去溶剂化之前，将免疫刺激剂(根据情况可以与变应原或抗原一起)加入到所述PVM/MA共聚物有机溶剂中，或者根据上面所讨论的，将所述免疫刺激剂与步骤b)中所得到的纳米颗粒进行孵育，所述纳米颗粒根据情况可部分地被所述变应原或抗原所包被。
如果需要，根据情况可以加入交联剂以提高所得到纳米颗粒的稳定性。可以通过传统方法对所得到的负载变应原或者抗原以及免疫刺激剂的纳米颗粒进行纯化，例如通过离心、超速离心、切向过滤或者包括使用真空在内的蒸发。
最后，如果需要，可以对负载变应原或者抗原以及免疫刺激剂的纳米颗粒进行冻干以便它们的长期贮藏和保藏。可以使用标准防冷冻剂以辅助冻干，优选浓度为相对于总混合物重量的0.1％至10％重量比。
如实施例3-6所显示的，负载变应原或抗原以及免疫刺激剂的纳米颗粒可以作为疫苗接种或免疫治疗中的佐剂，并在以其对个体给药后产生刺激免疫反应的效果。
待给药的负载变应原或抗原以及免疫刺激剂的纳米颗粒的剂量可以在宽范围内变化，例如约0.01mg/kg至约10mg/kg体重，优选0.1mg/kg至2mg/kg体重。
如果需要，本发明的组合物可以为冻干的形式或者适合其口服或者肠胃外给药的给药形式。任选地在诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘油、乳糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮等传统防冷冻剂的存在下，通过传统的方法进行冻干，所述防冷冻剂浓度优选为组合物总重量的0.1％至10％重量比。为了制备适合其口服或者肠胃外给药的不同给药形式，将使用可以接受的用于制备期望给药药物形式的赋形剂和载体。可以在Galenic药物论文中发现关于所述载体和赋形剂的信息，以及用于口服或者肠胃外给药本发明组合物的所述适当给药形式的信息。
如前面所描述的，本发明的组合物在对个体给药后，产生刺激免疫反应或者增强免疫反应的作用，因此其可以用作疫苗或者免疫治疗中的佐剂。事实上，本发明的组合物具有选择性地刺激两条免疫反应途径(Th1或Th2)之一或者以同时和平衡的方式刺激两条途径的能力，因此其可以根据其待刺激的反应用在疫苗或者免疫治疗制剂中。作为说明，根据抗原起源的生物体的致病机理(细胞内或细胞外、依赖毒素、依赖鞭毛等)，疫苗制剂通常需要刺激Th1反应(细胞内，如在布鲁氏菌(Brucella)、沙门氏菌(Salmonella)等的情况中)，或者Th2反应(细胞外，如在葡萄球菌属(Staphylococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产肠毒素细菌等的情况中)。类似地，作为说明，免疫治疗制剂需要通过出现两种反应类型而实现的耐受诱导，即以平衡的方式诱导Th1和Th2反应。通常，为了刺激选择性的Th2反应，制剂将含有完全或者部分地被变应原或者抗原包被的PVM/MA纳米颗粒，而为了以平衡的方式或者以Th1反应为主导而刺激Th1和Th2反应，所述制剂将含有变应原或者抗原被包裹其内的PVM/MA纳米颗粒，并且有利的是所述纳米颗粒包括交联剂。在前面所提到的任何情况下，如果需要，所述纳米颗粒可以含有免疫刺激剂。
因此，另一方面，本发明涉及疫苗或免疫治疗组合物，其包含治疗有效量的刺激免疫反应的组合物(本发明的组合物)以及药物上可接受的载体或赋形剂。所述疫苗或者免疫治疗组合物可以为任何药物给药形式通过任何途径进行给药，例如口服、肠胃外、经直肠等途径。在特定的实施方式中，所述疫苗或免疫治疗组合物为口服给药的药物形式，而在另一特定实施方式中，所述疫苗或免疫治疗组合物为肠胃外给药的药物形式，例如肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、腹腔内(i.p.)、皮内(i.d.)等。可在参考书“Tratado de Farmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，1stEdition，1993，Luzán 5，S.A.de Ediciones中可以得到关于通常各种给药剂型及其制备方法的综述。
存在于本发明所提供的所述免疫治疗疫苗或者组合物中的本发明的组合物包含PVM/MA纳米颗粒。所述纳米颗粒还可以含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂，其可以被包含在纳米颗粒的内部和/或至少部分地包被在所述纳米颗粒的表面。类似地，所述纳米颗粒可以根据情况含有交联剂。
在特定的实施方式中，存在于本发明所提供的所述疫苗或者免疫治疗组合物中的本发明的组合物包含空PVM/MA纳米颗粒，根据情况所述空PVM/MA纳米颗粒含有交联剂。在这种情况下，本发明的组合物以与分别含有抗原或者变应原的疫苗或免疫治疗组合物联合给药，在以所述疫苗或免疫治疗组合物和空纳米颗粒给药之后产生刺激免疫反应的效果。所述疫苗或免疫治疗组合物与空纳米颗粒的联合给药可以同时或者在不同时间以任何顺序依次进行，即可首先以疫苗或免疫治疗组合物给药，接着以该空纳米颗粒给药，或者反过来。或者，所述疫苗或免疫治疗组合物与所述的空纳米颗粒可以同时给药。在这种情况下，所述疫苗或免疫治疗组合物和所述空纳米颗粒可以在相同组合物或者不同组合物中给药。
在另一特定实施方式中，存在于本发明所提供的所述免疫治疗疫苗或者组合物中的本发明的组合物中包含PVM/MA纳米颗粒，其中所述PVM/MA纳米颗粒还包含变应原或抗原，如果需要还包含交联剂。
在另一特定实施方式中，存在于本发明所提供的所述免疫治疗疫苗或者组合物中的本发明的组合物包含PVM/MA纳米颗粒，其中所述PVM/MA纳米颗粒还包含免疫刺激剂，以及如果期望的话还包含交联剂。
在另一特定实施方式中，存在于本发明所提供的所述免疫治疗疫苗或者组合物中的本发明的组合物包含PVM/MA纳米颗粒，其中所述PVM/MA纳米颗粒还包含变应原或抗原和免疫刺激剂，以及如果期望的话还包含交联剂。
本发明所提供的免疫治疗疫苗或组合物包含治疗有效量的本发明的组合物，有效量即适于增强或刺激免疫反应的量。因此，存在于本发明所提供的疫苗或免疫治疗组合物中的本发明的组合物的量可以在宽范围内变化，这取决于许多因素，其中包括纳米颗粒的类型(空的或者负载变应原或抗原和免疫刺激剂的)等。然而，在特定的实施方式中，本发明提供了一种疫苗或者免疫治疗组合物，其包含组分 相对于总重量的％重量比PVM/MA纳米颗粒 84-99.998％交联剂 0.001-1％变应原或抗原 0.001-15％。
根据情况，所述免疫治疗疫苗或组合物可以含有充分量的防冷冻剂，以在冻干过程中保护纳米颗粒。
在特定的实施方式中，所述变应原包括引起变态反应的花粉提取物、引起变态反应的昆虫提取物、或者引起变态反应的食品提取物。
在另一特定的实施方式中，所述抗原包括来自生物体的产生免疫反应的提取物，例如沙门氏菌属细菌(Salmonella spp)的膜提取物。
如前面所提到的，本发明的组合物具有在以其对个体给药后产生刺激或增强免疫反应效果的能力，因此其可以用作疫苗或者免疫治疗中的佐剂，更具体地，其具有选择性地刺激两条免疫反应途径(Th1或者Th2)之一或者甚至以同时和平衡的方式刺激二者的能力。
因此，另一方面，本发明涉及本发明的组合物在制备疫苗或免疫治疗组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及本发明的组合物在制备用于选择性或者主要刺激或增强Th1免疫反应的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及本发明的组合物在用于选择性或者主要刺激或增强Th2免疫反应的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及本发明的组合物在用于平衡刺激或增强Th1和Th2免疫反应的药物组合物中的用途。
本发明的组合物在疫苗接种和免疫治疗中的用途具有一些优点，其包括-采用这样的药物形式，即其在生物体的正常状况下可生物降解，并且由药物和医学实践中所接受的聚合物和材料所制成；-以基于纳米颗粒的免疫治疗和疫苗接种制剂给药，使包裹进的变应原或抗原免于其过早失活；-基于使用纳米颗粒制备免疫治疗和疫苗制剂，其表现出随时间的持续释放；发生可控释放的时间段将依赖属于给药位点的微环境情况；-以基于纳米颗粒的纳米微粒佐剂给药，由于它们的特征(无害、可生物降解、无毒)，可以适合通过不同的给药途径为免疫治疗和疫苗接种的目的用于人类和动物；以及-以基于纳米颗粒的纳米微粒佐剂给药，由于它们在胃肠道内的生物附着能力使口服给药成为可能的给药途径。
下面的实施例对本发明进行说明，但不应被认为是对本发明的限制。
实施例下面的实施例描述了制备不同类型的基于PVM/MA的纳米颗粒，根据情况，其含有变应原或者抗原和/或免疫刺激剂，并且它们证明了所述纳米颗粒作为免疫治疗或者疫苗接种中的佐剂的能力。
一般的纳米颗粒制备方法一般的PVM/MA基纳米颗粒制备方法包括将所述共聚物溶解在丙酮中，接着加入乙醇。向所得到的溶液中加入约相同体积的水，这样在出现乳状悬浮液时，在中部立即形成纳米颗粒。接着，通过在减压下蒸发去除有机溶剂(乙醇和丙酮)，而颗粒则保留在稳定的水悬浮液中[Arbos等人，J Control Rel，83(2002)321-330]。根据所加入的变应原或者抗原(在适当时还有免疫刺激剂)的时机，将得到不同的制剂，其排列不同(参见实施例1、5和6)。例如A.为了获得含有包裹在纳米颗粒内部的变应原或抗原的制剂(制剂NP I和NP VI)在有机溶剂蒸发后，与待被包裹的变应原或抗原进行孵育。
B.为了获得含有完全或者部分地包被在纳米颗粒外表面的免疫原或抗原的制剂(制剂NP II、NP III、NP IV、NP V、NP VII、OVASAL和NP HE)在加入乙醇和水之前将免疫原或抗原孵育分散在丙酮中。
下一步由向制剂NP III、NP V、NP VII、OVASAL、NP HE(它们中均为5μg/mg的聚合物)和NP IV(10μg/mg聚合物)添加交联剂组成，在这种情况下交联剂是1，3-二氨基丙烷。
制剂NP-V、NP-VI和NP-VII含有免疫刺激剂，所述免疫刺激剂由羊布鲁氏菌粗糙型脂多糖(R-LPS)构成。简单的讲，为了加入免疫刺激剂，在制剂NP V的情况下，在已经将有机溶剂蒸发之后进行与所述免疫刺激剂的孵育，而在制剂NP VI和NP VII的情况下，在加入乙醇和水之前将R-LPS进行孵育(参见实施例1.4.2、1.4.3和1.4.4)。
通过超离心进行纳米颗粒的纯化。最后，将所纯化的纳米颗粒进行冻干以便于它们的长期储存和保存。
纳米颗粒的鉴定在Zetamaster(Malvem Instruments/Optilas，Spain)中确定纳米颗粒的尺寸和ζ电势。
通过微量二辛可宁酸(microbicinchoninic acid)蛋白质测定(MicroBCA，Pierce，USA)确定了所包裹的蛋白含量(活性成分)。
吸附的或者被包裹进纳米颗粒内的粗糙型羊布鲁氏菌脂多糖(R-LPS)是通过检测其独特的标志物之一KDO(3-脱氧-D-甘露糖-辛-2-酮糖酸)(3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid)进行间接定量的，通过硫代巴比土酸法进行[Warren，J Biol Chem，243(1959)1971-1975]。
确定抗-OVA、细胞因子和IL-10的抗体通过利用抗-IgG1和抗Ig-G2a偶联物(Sigma-Aldrich Chemie，Germany)的ELISA分析血清抗-OVA抗体。简单的讲，为了进行该测定，使用96孔板(EB，Thermo Labsystems，Vantaa，Finland)，4℃下将96孔板的每个孔中的1μg卵清蛋白固定15小时，接着进行5次1分钟的清洗，每次都在ELISA清洗仪(Thermo Labsystems，Vantaa，Finland)上进行，将血清以系列稀释的方式加入，从1∶40开始，将它们在37℃下孵育4小时，随后进行5次1分钟的清洗；接着将偶联物与过氧化物酶孵育2小时，再进行5次1分钟的清洗，加入底物[ABTS(2，2’-连氮-双(3-乙基苯-噻唑啉-6-磺酸)(Sigma-Aldrich Chemie，Germany)]，室温下孵育30分钟后在读板仪(iEMS Reader MF，Labsystems，Vantaa，Finland)中在405nm处进行读数。
通过ELISA试剂盒(Biosource，USA)分析来自脾细胞再刺激先前经免疫的小鼠的上清中的细胞因子(IFN-γ，IL-4)。
使用ELISA试剂盒(Biosource，USA)分析来自先前经800xg离心10分钟的血的血清中的IL-10。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)通过SDS-PAGE确定样品的蛋白质分布[Laemmli，Nature，227(1970)680-685]，其中125mM Tris-HCl(pH 6.8)中含有15％浓度的37.5∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺(Biorad)，在凝胶中含有0.1％的SDS。所使用的电极缓冲液含有30mM Tris-HCl(pH 8.3)，192mM甘氨酸和0.1％SDS。在100℃下在62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)、10％甘油、2％SDS、5％β-巯基乙醇和0.002％溴酚蓝中处理样品10分钟。在15mA/凝胶的稳定强度的8×7cm的凝胶中进行电泳。使用考马斯兰对凝胶进行染色[King，Anal Biochem，71(1976)223-230]。为此将它们孵育在3％的三氯乙酸水溶液中1小时以将它们进行固定。使用在50％甲醇和10％乙酸中的0.25％考马斯兰溶液进行染色1小时，并在50％甲醇和20％乙酸中进行脱色直到样品变得可见。通过将样品组分的电泳迁移率与标准分子量标记物相比，确定它们的表观分子量，其中所述标准分子量标记物含有肌球蛋白(220kDa)、磷酸化酶b(97kDa)、牛血清蛋白(66kDa)、卵清蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、胰蛋白酶抑制剂(20.1kDa)和溶菌酶(14.3kDa)(Rainbow，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。
免疫印迹根据之前描述的方案进行免疫印迹[Towbin & Staehelin，Proc NatlAcad Sci USA，76(1979)4350-4354]。简单地讲，在将样品进行SDS-PAGE之后，将凝胶转移至孔尺寸为0.45μm的硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)。使用Trans-BlotSD，Semy-Dry转细胞系统(Bio-Rad，Richmond，USA)通过半干法在200mA，5V下，在转移缓冲液(25mM Tris-HCl(pH 8.3)，192mM甘氨酸和10％甲醇)中进行该转移30分钟。
实施例1免疫治疗制备和鉴定卵清蛋白基于甲基乙烯基醚-马来酸酐(PVM/MA)共聚物的纳米颗粒所选择的蛋白质是卵清蛋白(OVA)，因为其目前被广泛地用作引起变应的实验模型。
卵清蛋白占蛋清中蛋白质成分的50％以上。其是分子量为43至45kDa、具有385个氨基酸的单体磷酸化糖蛋白[Johnsen和Elsayed，MolImmunol，27(1990)821]。卵清蛋白是具有最强引起变应的能力的卵蛋白，其立即诱导由IgE所介导的I型超敏反应。
下面所描述的方法能用有效制备可用于免疫治疗的纳米颗粒型胶体剂型。
1.1制备空纳米颗粒(NP)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在5mL丙酮中。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至10mL。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该溶液进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持其所有性质完好。
所得到的空纳米颗粒(NP)具有小于200nm的平均尺寸和-45.1mV的净表面电荷(参见表1)。
1.2制备卵清蛋白包被的纳米颗粒(NP I)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在5mL丙酮中。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至5mL。将该溶液在室温下与含有10mg蛋白质的5ml卵清蛋白水溶液孵育1小时。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该溶液进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持所有性质完好。
所得到的纳米颗粒(NP I)具有小于300nm的平均尺寸，-61.3mV的净表面电荷以及54.7μg/mg聚合物的卵清蛋白含量(参见表1)。
1.3制备包裹进卵清蛋白的纳米颗粒(NP II、NP III和NP IV)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在4mL丙酮中，而另一方面通过伴随冷却的超声降解(MicrosonTM)或者超声浴1分钟将5mg卵清蛋白分散在1mL丙酮中。将该卵清蛋白分散液加入到聚合物悬浮液中并在室温下搅拌30分钟。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至10mL。所得到的纳米颗粒具有被包裹的OVA(NP II)。对于制剂NP III和NPIV，此时可以加入交联剂分别为0.05mL和0.1mL的1，3-二氨基丙烷溶液。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该溶液进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持所有性质完好。
所得到的纳米颗粒具有小于300nm的平均尺寸，净表面电荷对于NP-II为-41.4mV，对于NP-III为-50.8mV，对于NP IV为-57.5mV，卵清蛋白含量接近30μg/mg聚合物(参见表1)。
1.4制备具有卵清蛋白和羊布鲁氏菌粗糙型脂多糖的纳米颗粒(NP V、NP VI和NP VII)1.4.1提取和鉴定羊布鲁氏菌粗糙型脂多糖复合物所使用的提取物是羊布鲁氏菌粗糙型脂多糖(R-LPS)。通过先前所描述的方法获得R-LPS(Galanos等人，Eur.J.Biochem.(1969)，245-249)。在培养细菌布鲁氏菌之后，在密闭的容器中4℃下搅拌过夜，将它们重悬浮在无水乙醇中。接着将这些细胞进行离心(6,000xg，20分钟，4℃)，并在密闭的容器中4℃下搅拌12小时，重悬浮在丙酮中。随后，通过离心(6,000xg，20分钟，4℃)收集细胞，将其重悬浮在乙醚中，并在磁力搅拌下将其保持在室温下3至4小时。接着，再对其进行离心(6,000xg，20分钟，4℃)并被蒸发至干燥。为了进行提取，将细胞与石油-氯仿-苯酚醚混合直到均一化，其中石油-氯仿-苯酚醚的比例分别为8∶5∶2。将该混合物进行离心(8,000xg，15分钟，室温)，并收集上清。在相同的条件下再将沉淀进行两次重提取。合并所有的上清，并在旋转蒸发仪中将石油和氯仿醚蒸发。使用蒸馏水使酚残余物沉淀并离心(8,000xg，30分钟，室温)。接着使用苯酚再对其清洗两次，以及使用乙醚对其进行清洗两次。在最后的离心之后，在真空下去除乙醚残余物，将沉淀重悬浮在去离子水中，并对其进行透析。最后，将透析袋的内容物进行离心(100,000xg，6小时，4℃)，将沉淀重悬浮在去离子水中，并对其进行冻干。
利用硫代巴比土酸法，通过检测其独特的标志物之一KDO来间接确定R-LPS的量。
1.4.2具有被包裹的卵清蛋白和在表面上的羊布鲁氏菌R-LPS的纳米颗粒(NP V)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在4mL丙酮中，而在另一方面通过伴随冷却的超声降解(MicrosonTM)或者超声浴1分钟将5mg卵清蛋白分散在1mL丙酮中。将该卵清蛋白分散液加入到聚合物悬浮液中并在室温下搅拌30分钟。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至9mL。在室温下将该溶液与含有1mg羊布鲁氏菌R-LPS的1ml水分散液(之前被超声处理1分钟)孵育1小时。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该溶液进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持所有性质完好。
所得到的纳米颗粒(NP V)具有小于300nm的平均尺寸，-46.1mV的净表面电荷，64.1μg/mg聚合物的卵清蛋白含量，以及15.2μg/mg聚合物的R-LPS含量(参见表1)。
1.4.3具有被包裹的羊布鲁氏菌R-LPS和表面上卵清蛋白的纳米颗粒(NP VI)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在4mL丙酮中，而另一方面通过伴随冷却的超声降解(MicrosonTM)或者超声浴1分钟将1mg羊布鲁氏菌R-LPS分散在1mL丙酮中。将该R-LPS分散液加入到共聚物悬浮液中，并在室温下搅拌30分钟。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至5mL。在室温下将该溶液与含有5mg卵清蛋白的5ml水溶液孵育1小时。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该混合物进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持所有性质完好。
所得到的纳米颗粒(NP VI)具有小于300nm的平均尺寸，-56.9mV的净表面电荷，68.5μg/mg聚合物的卵清蛋白含量，以及12.1μg/mg聚合物的R-LPS含量(参见表1)。
1.4.4具有被包裹的卵清蛋白和羊布鲁氏菌R-LPS的纳米颗粒(NPVII)将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物[GantrezAN 119]溶解在3mL丙酮中，而另一方面通过伴随冷却的超声降解(MicrosonTM)或者超声浴1分钟将5mg卵清蛋白分散在1ml丙酮中，并也通过伴随冷却的超声降解将1mg羊布鲁氏菌R-LPS分散在1mL丙酮中。将卵清蛋白分散液加入到R-LPS分散液中，将该混合物加到共聚物悬浮液中并在室温下搅拌30分钟。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物进行均匀化5分钟。接着在低压下将纳米颗粒悬浮液进行蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至10mL。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该混合物进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在水中或者5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，这使得其能保持所有性质完好。
所得到的纳米颗粒(NP VII)具有小于300nm的平均尺寸，-46.1mV的净表面电荷，54.7μg/mg聚合物的卵清蛋白含量以及13.8μg/mg聚合物的R-LPS含量(参见表1)。
1.5纳米颗粒的特征表1中表示了各种制剂的物理化学特征。
根据所收集的结果，发现如果纳米颗粒被卵清蛋白包被(NP I和NP VI)，则尺寸增大，ζ电势会变得更负，然而，如果卵清蛋白主要在纳米颗粒的内部(NP II、NP III、NP IV、NP V和NP VII)，与空纳米颗粒(NP)相比，尺寸和ζ电势将不会变化。
另一方面，发现纳米颗粒的尺寸随着所加入交联剂的量的提高而提高，而卵清蛋白的量会稍微减少。
在纳米颗粒表面存在R-LPS会使所包裹的卵清蛋白的量提高(NPV对比NP II)，而如果R-LPS主要在纳米颗粒的内部，则所吸附的卵清蛋白的量不会变化(NP VI对比NP I)。
表1不同制剂的物理化学特征(数据表示为平均值±标准偏差，n＝10)
纳米颗粒的产率为约70％。
实施例2体外测试卵清蛋白从纳米颗粒的释放为了评估体外卵清蛋白的释放，将纳米颗粒在“eppendorf”管中以大约8mg/mL的浓度孵育在1mL PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中。在旋转下，将管在37℃的烘箱中孵育，并在预定的时间间隔将样品以26,500xg离心20分钟，收集上清以进行后续分析。通过二辛可宁酸法检测所释放的卵清蛋白。
图1中表示所获得的卵清蛋白释放曲线；观察到卵清蛋白在制剂NP I中比在表现出相似释放曲线的制剂NP II、NP III和NP IV中要快。这是因为在制剂NP I中，卵清蛋白被吸附在纳米颗粒的外表面上，因此起始释放(突发)比部分卵清蛋白被包裹的其它制剂(NP II、III和IV)要更显著。另一方面，在NP II、NP III和NP IV的释放曲线中，可以看到随着交联剂的量的提高，所释放卵清蛋白的百分比微微降低。
实施例3在BALB/c小鼠中以卵清蛋白免疫后所产生的抗-OVA抗体的定量对65只BALB/c小鼠进行免疫，根据给药方法将它们分成13组。
所使用的对照是不含卵清蛋白的溶液(OVA)(皮内给药10μg，口服25μg)和空纳米颗粒(NP)(皮内和口服给药)，以及吸附到铝水凝胶的卵清蛋白(OVA-Alum)(10μg皮内给药)作为诱导Th2反应的阳性对照，其特征在于高IgG1效价[Faquim-Mauro等人，Int Immunol，12(2000)1733-1740]。
将剩余的组通过皮内(10μg OVA)或者口服(25μg OVA)进行接种，各种处理是a)皮内接种卵清蛋白(OVA)溶液b)口服接种卵清蛋白(OVA)溶液c)皮内接种吸附到铝水凝胶上的卵清蛋白(OVA-Alum)d)皮内接种空纳米颗粒(NP)e)口服接种空纳米颗粒(NP)f)皮内接种卵清蛋白包被的纳米颗粒(NP I)g)口服接种卵清蛋白包被的纳米颗粒(NP I)h)皮内接种具有被包裹的卵清蛋白的纳米颗粒(NP II)i)口服接种具有被包裹的卵清蛋白的纳米颗粒(NP II)j)皮内接种具有被包裹的卵清蛋白并被1，3-二氨基丙烷交联的纳米颗粒(NP III和NP IV)k)口服接种具有被包裹的卵清蛋白并被1，3-二氨基丙烷交联的纳米颗粒(NP III和NP IV)在免疫后第7、14、28和35天，进行连续血液提取。合并每组的血清并冷冻在-80℃，以用于它们的后续分析。
通过ELISA确定各种血清中抗OVA抗体(IgG1和IgG2a)的水平，并得到了在图2和3中所显示的数据。观察到含有卵清蛋白(无论是包被纳米颗粒还是被包裹进纳米颗粒内)的纳米颗粒(NP I、NP II、NP III和NP IV)相对于溶液中卵清蛋白提高了免疫反应。在给药后第14天，所述纳米颗粒制剂根据其类型能够提高小鼠血清中的IgG1效价3个对数单位或者6个对数单位。另一方面，以OVA-Alum给药的小鼠在整个实验过程中没有出现血清IgG2a抗体，然而以NP III给药的小鼠在给药后的第35天达到了5120的效价。
这说明，整体上所述NP制剂(NP I、NP II、NP III和NP IV)能够增强Th1和Th2的抗体效价特征，但特别是制剂NP III是免疫原性最强的。
另一方面，如果将NP III组小鼠的效价与NP IV组的效价进行比较，能够发现存在最佳交联(实施例2，最后一段)，因为尽管它们具有相似的IgG1曲线，但是NP III的IgG2a效价比NP IV的要稍高。
关于在进行口服给药的小鼠中所得到的结果，观察到只有NP III制剂诱导了可计量水平的IgG1和IgG2a抗体(图3)。
在确认这些实验条件下制剂NP III是最有效的之后，通过改变NPIII的给药剂量进行了相似的研究。在这种情况下，以下列制剂对动物给药(口服)a)空纳米颗粒(NP)b)被1，3-二氨基丙烷交联的具有被包裹的卵清蛋白的纳米颗粒，25μg被包裹的卵清蛋白(NP III-25)c)被1，3-二氨基丙烷交联的具有被包裹的卵清蛋白的纳米颗粒，50μg被包裹的卵清蛋白(NP III-50)。
在这种情况中，所得到的结果(图4)表示当剂量为50μg时，血清中抗-OVA抗体IgG2a的水平显著地更高。
实施例4在以具有羊布鲁氏菌脂多糖的卵清蛋白纳米颗粒给药后，所产生抗-OVA抗体和白介素10(IL-10)的定量对40只BALB/c小鼠进行免疫，根据给药形式将它们分成8组。对所有组进行皮内给药的处理(10μg卵清蛋白)。这次各种处理是a)卵清蛋白(OVA)溶液
b)吸附到铝水凝胶上的卵清蛋白(OVA-Alum)c)空纳米颗粒(NP)d)卵清蛋白包被的纳米颗粒(NP I)e)具有被包裹的卵清蛋白并被1，3-二氨基丙烷交联的纳米颗粒(NP II)f)被1，3-二氨基丙烷交联的、具有被包裹的卵清蛋白并被羊布鲁氏菌R-LPS包被的纳米颗粒(NP V)g)具有被包裹的羊布鲁氏菌R-LPS并被卵清蛋白包被的纳米颗粒(NP VI)h)被1，3-二氨基丙烷交联并具有被包裹卵清蛋白和羊布鲁氏菌R-LPS的纳米颗粒(NP VII)。
采用经皮内以吸附到铝水凝胶上的卵清蛋白(OVA-Alum)给药的组作为本实验的阳性对照。
在免疫后第7、14、28、35、42和49天，进行连续血液提取。对样品进行处理(参见实施例3)，图5和6中包括所得到的结果。
IgG1反应(图5)NP III、NP V和NP VII以比对照制剂(OVA-Alum)快得多和更强烈的方式诱导高IgG1水平。仅在给药后49天，基于纳米颗粒的制剂和对照(OVA-Alum)表现出相似的水平。最后，纳米颗粒表面的R-LPS似乎对诱导IgG1水平没有作用。
另一方面，NP I还表现出诱导产生IgG1抗体的强大能力。而且，如同在前面的情况中，这种现象比对照制剂要更快和更强烈。当R-LPS结合在被OVA包被的纳米颗粒内部时，观察到相对于NP I和对照制剂血清IgG1效价显著降低。
IgG2a反应图6显示了小鼠血清IgG2a效价。在这种情况中，对照制剂(OVA，NP，OVA-Alum)都不能诱导抗体效价。然而，具有被包裹的OVA的制剂能够提供高IgG2a效价，特别是在R-LPS被吸附到纳米颗粒的外部(制剂NP V)时。另一方面，NP I似乎比NP VI在以血清IgG2a效价所检测的Th1反应方面更有效。
IL-10图7显示通过ELISA试剂盒(Biosource，Camarillo，USA)测定的血清IL-10水平。在这种情况中，对照不能够诱导血清IL-10的分泌。然而，所有的纳米颗粒制剂以或多或少的水平诱导了这种细胞因子的分泌。卵清蛋白吸附在NP表面的制剂(NP I)能够比其余制剂更快地诱导IL-10达到峰值。然而LPS的结合(NP VI)会显著地延迟(14天)细胞因子的分泌。另一方面，NP III显示为诱导血清IL-10的最有效的制剂，产生两倍于NP I的水平，尽管时间上延迟了1周。R-LPS与包裹的纳米颗粒OVA的结合(NP V和NP VII)能够诱导更加离散的IL-10水平，但其在给药后两周达到最高。这些制剂诱导显著IL-10水平的能力暗示它们可能的治疗某些疾病的应用，这些疾病的特征是由于该细胞因子的调节能力所导致的Th1/Th2平衡的失衡[Zuany-Amorim等人，J Clin Invest，95(1995)2644-2651；Stampfli等人，Am J Respir Cell Mol Biol，21(1999)586-596；Hall等人，Vaccine，21(2003)549-561]。
实施例5具有肠炎沙门氏菌ChE提取物的纳米颗粒的制备、鉴定和给药5.1肠炎沙门氏菌ChE提取物的提取通过之前Altman等人所描述的方案获得细菌提取物ChE(离液提取物(chaotropic extract))(Altman等人，Biochem J.(1982)505-513)。使稳定期的肠炎沙门氏菌接种体在含有400mLBHI培养基(Brain HeartInfusion，Difco Lab.，Detroit，USA)的烧瓶中在37℃和无搅拌条件下培育48小时。接着将这些细胞离心(7,000xg，30分钟)，并以PBS(磷酸盐缓冲液，10mM；pH 7.4)清洗。在磁力搅拌下以3M的KSCN/PBS处理细胞沉淀物(1小时，室温)，然后进行离心(35,000xg，30分钟)，获得了细菌提取物。收集含有ChE提取物的上清，并首先对PBS透析，接着对去离子水透析。最后将其冻干，并在4℃下进行保存直到其以后的应用。
5.2具有卵清蛋白和肠炎沙门氏菌ChE的纳米颗粒(OVASAL)的制备将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(PVM/MA)[GantrezAN 119]溶解在3mL丙酮中，而另一方面，通过伴随冷却的超声降解(MicrosonTM)1分钟将5mg卵清蛋白和5mg ChE提取物分散在2mL丙酮中。将卵清蛋白和ChE分散液加入到聚合物悬浮液中，并将其在室温下搅拌30分钟。接着，在磁力搅拌下向该相中加入10mL乙醇和10mL去离子水。将所得到的混合物均匀化5分钟。接着在减压下使纳米颗粒悬浮液蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至10mL。然后将它们与0.1mL 1％的1，3-二氨基丙烷溶液孵育。
通过超速离心(27,000xg下20分钟)对该混合物进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在5％的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液冻干。
5.3在BALB/c小鼠中以OVASAL免疫后抗-OVA抗体产生的定量以10μg卵清蛋白皮内免疫15只小鼠，并根据所接受的处理将其分为三组a)卵清蛋白溶液(OVA)b)吸附到铝水凝胶上的卵清蛋白(OVA-Alum)c)卵清蛋白纳米颗粒和肠炎沙门氏菌ChE(OVASAL)在以各种制剂给药后，在第7、14、28、35、42和49天，从眼球后血管丛(retroorbital plexus)取血，并根据实施例3中所述的对这些样品进行处理。图8表示了所得到的结果。令人吃惊的是，OVASAL显著地提高了IgG1效价，而IgG2a效价则保持非常低的水平。这说明该制剂只能够增强Th2反应，这也比对照制剂(OVA-Alum)要更快和更强烈。这些结果引导考虑用作疫苗中的佐剂的可能性，其中让人感兴趣的是获得高抗体水平，或者对抗由微生物所分泌的毒素。其还可用于某些自体免疫性疾病，这些疾病的特征在于急性期具有过高的Th1反应。
实施例6具有肠炎沙门氏菌HE提取物的生物可降解纳米颗粒(NP HE 3934)的制备和鉴定6.1肠炎沙门氏菌HE抗原复合物3934的提取和鉴定所使用的抗原是肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)的表面提取物，由于其在盐水介质中通过加热释放该抗原的事实，其被称作HE(热盐水提取物)。这种HE含有磷脂、表面蛋白以及光滑型脂多糖(S-LPS)。通过之前所描述的方法获得HE提取物[Gamazo等人，Infect.Immun.(1989)1419-1426]。在含有胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)的烧瓶中培养肠炎沙门氏菌3934之后，将该细菌在7,000xg下离心30分钟，并使用盐水溶液清洗两次。将活细胞重悬浮在盐水溶液中(100mL中10g湿细胞)，并在流动的蒸汽中在100℃下加热15分钟。离心(12,000xg，10分钟)后，将上清进行以几次更新的去离子水透析5天。将经过透析的材料在60,000xg下超速离心4小时，并将沉淀(HE)重悬浮在去离子水中，冻干并在室温下保存。
鉴定包括确定蛋白质和脂多糖的百分含量。确定蛋白质的量是通过Lowry法进行的。肠炎沙门氏菌抗原提取物3934含有大约31％的蛋白质。LPS的量是通过检测其独特的标志物之一KDO间接确定的，通过硫代巴比土酸法进行。通过该方法得到了0.86％的KDO，其代表65％的S-LPS。
6.2具有肠炎沙门氏菌HE提取物3934的纳米颗粒(NP HE 3934)的生产以及物理化学特征首先，将100mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物溶解在5mL丙酮中；将也重悬浮在1mL丙酮中的抗原提取物HE(4mg)加入到该溶液中，并以磁力搅拌混合。使该溶液在室温下孵育15分钟。接着，向该相中加入10mL乙醇以及最后加入相同体积的水。将所得到的混合物均匀化5分钟。接着在减压下将纳米颗粒悬浮液蒸发，直到两种有机溶剂被除去，并用水将终体积调至10mL。
通过超速离心(35,000xg下10分钟)对该悬浮液进行纯化。去除上清，并将残余物重悬浮在5％(w/v)的蔗糖水溶液中。最后，将所得到的纳米颗粒悬浮液进行冻干，使得其能保持所有性质完好。
在冻干之前，从纳米颗粒悬浮液所得到的配方是
甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(GantrezAN-119) 1.0％w/v抗原提取物0.4％w/v蔗糖 5.0％w/v水f.i.q.s.10mL[f.i.用于注射；q.s.充足量以达到]在冻干处理之前测定纳米颗粒的尺寸和表面电荷。所得到的纳米颗粒具有小于200nm的平均尺寸以及负的净表面电荷(-20.1±3.2mV)。通过确定冻干处理后其重量来获得该生产工艺的产率。从100mg共聚物开始，确定在该工艺的最后所转化为纳米颗粒的量，并表达为相对于起始共聚物质量的百分比。
通过二辛可宁酸法对该提取物进行定量和检测。为此，在加入交联剂之前，取出1份(1mL)纳米颗粒悬浮液。加入0.1N NaOH使该纳米颗粒裂开，并在确认该方法之前，通过二辛可宁酸比色法对该混合物进行蛋白质分析。对溶解在0.1N NaOH中的裂开空纳米颗粒中的提取物进行该确认。将二辛可宁酸溶液以及5％的硫酸铜以100∶2的比例加入到样品中；将该混合物在37℃下保持半小时，接着在562nm处进行分光光度计检测。
提取物负载被表示为每mg纳米颗粒中以μg表示的提取物的量，并通过总的提取物包裹量与起始量的关系来确定包裹效率。
表2表示纳米颗粒中抗原提取物负载(μg提取物/mg纳米颗粒)以及包裹效率(％)表2负载抗原提取物的GantrezAN 119纳米颗粒的物理化学特征
a包裹效率是指被包裹的HE的百分比，并计算为所包裹的抗原的量乘以100再除以起始的量。
图9反映了肠炎沙门氏菌HE蛋白标准，其中可以区分不同的组分孔道蛋白(porin)(约36kDa)、OmpA(34kDa)和菌毛SEF14(14kDa)以及SEF21(21kDa)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹，确认所包裹的提取物保持了其结构的完整性和抗原性。在图10中，可以观察到包裹前后提取物的抗原特征。
实施例7研究通过腹膜内以NP HE 3934疫苗给药对小鼠所提供的保护使用几组九周龄的BALB/c小鼠，每组由10只动物组成。使用在实施例6中所描述的纳米颗粒疫苗制剂(NP HE 3934)以每只动物30μg提取物的比例进行疫苗接种，还包括作为对照的i)同样量的相应空纳米颗粒；ii)30μg/只动物的游离、未包裹的HE提取物；iii)200μL商品化疫苗Salenvac(Intervet UK Limited，Walton，England)；iv)盐水溶液。
在疫苗接种后10天，对它们进行腹膜内接种致死剂量的102CFU肠炎沙门氏菌3934菌株，并在该接种后记录由于沙门氏菌病而死亡的动物。该保护试验的结果证明基于纳米颗粒的疫苗制剂(NP HE 3934)经皮下保护免受肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)，作用方法非常类似于商品化疫苗Salenvac以及游离给药的HE提取物(HE Se 3934)这些结果表示将HE提取物包裹进纳米颗粒中并不提高小鼠内的保护水平。另一方面，使用空纳米颗粒免疫的小鼠诱导了非特异性的免疫反应，其提供了3周的保护。然而，必须说明的是，游离形式以及包裹形式的HE抗原的给药路线是腹膜内。先前的研究暗示口服或者鼻内以非包裹抗原给药会造成它们在达到与抗原递呈细胞相互作用位点之前被降解。
而且，在疫苗接种10天后，在实验性感染时，对该纳米颗粒所提供的免疫进行了研究，定量了在小鼠脾细胞中IFN-γ和IL-4的产生水平(分别为典型的Th1-型和Th2-型免疫反应)(图12)。还测定了血中IgG2a和IgG1抗体的产生(分别为Th1和Th2)(图13)。
为了研究由游离HE提取物和被包裹的HE提取物在该研究所使用的小鼠中所诱导的Th1/Th2免疫平衡，测定了由被免疫的动物的脾细胞所产生的IFN-γ和IL-4水平(图12)。图A表示所诱导的IFN-γ水平，其说明在被纳米颗粒(NP HE 3934)免疫的小鼠中所述产生的增加。相反，图B表示在被游离HE提取物(HE 3934)免疫的小鼠以及被NPHE 3934纳米颗粒免疫的小鼠中没有显著的IL-4产生的增加。从所得到的结果看，与Th2相比IFN-γ产生的增加反映出，可以确认将HE提取物包裹进纳米颗粒中有利于增强Th1-型反应。
通过间接ELISA研究了在被免疫的小鼠中特异针对肠炎沙门氏菌3934 HE提取物的抗体的产生(图13)。未受免疫的小鼠或者以空纳米颗粒免疫的小鼠(空NP)不产生针对肠炎沙门氏菌3934HE提取物的IgG2a或者IgG1抗体。通过ELISA分析，在所有小鼠血清中，所检测到的IgG2a水平比IgG1水平要高。然而，与被游离HE提取物(HE 3934)免疫的小鼠所表现的反应相比，没有观察到以被包裹的HE提取物(NPHE 3934)免疫的小鼠中的血清反应的提高。
IgG2a是Th1免疫反应中主要的抗体同种型，而IgG1对于Th2免疫反应来说具有该相同的功能，这将证实在IFN-γ和IL-4释放测定中所得到的结果，说明腹腔内以具有肠炎沙门氏菌HE提取物的纳米颗粒给药诱导显著的Th1-型免疫反应。这种给药提供了针对沙门氏菌病的一定程度上的保护，这与在以游离抗体给药时所观察到的相似。然而，如之前所讨论的，通过粘膜应用未包裹的抗原将不会在该实验中观察到这些水平的保护，因为在它们通过动物肠胃通道时会经历酸降解和酶降解。
权利要求
1.刺激免疫反应的组合物，包含基于甲基乙烯基醚和马来酸酐(PVM/MA)共聚物的纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含变应原或抗原。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述变应原或抗原至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含免疫刺激剂。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述免疫刺激剂至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含变应原或抗原以及免疫刺激剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述变应原或抗原以及免疫刺激剂至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒还包含交联剂。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述交联剂包括聚胺或者碳水化合物。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述交联剂是1，3-二氨基丙烷。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒具有等于或者小于1.0微米，优选为10nm至900nm，更优选等于或者小于400nm的平均尺寸。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述PVM/MA共聚物具有100kDa至2,400kDa，优选为200kDa至2,000kDa，更优选为180kDa至250kDa的分子量。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其为冻干的形式。
14.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其为用于口服或者肠胃外给药的适合给药形式。
15.疫苗或者免疫治疗组合物，包括治疗有效剂量的权利要求1至14中任一项所述的刺激免疫反应的组合物以及药物上可接受的载体或赋形剂。
16.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其为冻干的形式或者为用于口服或者肠胃外给药的适合给药形式。
17.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述刺激免疫反应的组合物包含与含有抗原或变应原的疫苗或免疫治疗组合物组合的基于PVM/MA的空纳米颗粒，如果需要，还包含交联剂。
18.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述刺激免疫反应的组合物包含基于PVM/MA的纳米颗粒，如果需要，还包含交联剂，所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含变应原或抗原。
19.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述刺激免疫反应的组合物包含基于PVM/MA的纳米颗粒，如果需要，还包含交联剂，所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含免疫刺激剂。
20.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述刺激免疫反应的组合物包含基于PVM/MA的纳米颗粒，如果需要，还包含交联剂，所述基于PVM/MA的纳米颗粒还包含变应原或抗原以及免疫刺激剂。
21.如权利要求15所述的疫苗或者免疫治疗组合物，包含组分 相对于总量的％重量比PVM/MA纳米颗粒 84-99.998％交联剂 0.001-1％变应原或抗原 0.001-15％。
22.如权利要求21所述的疫苗或者免疫治疗组合物，还包含防冷冻剂。
23.如权利要求21或22所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述变应原包括引起变态反应的花粉提取物、引起变态反应的昆虫提取物、引起变态反应的真菌提取物、引起变态反应的动物上皮提取物或者引起变态反应的食品提取物。
24.如权利要求21或22所述的疫苗或者免疫治疗组合物，其中所述抗原包括来自生物体的免疫原提取物。
25.权利要求1至14中任一项所述的刺激免疫反应的组合物在制备疫苗或者免疫治疗组合物中的用途。
26.权利要求1至14中任一项所述的刺激免疫反应的组合物的用途，其用于制备选择性刺激Th1免疫反应的药物组合物，或者制备选择性刺激Th2免疫反应的药物组合物，或者制备平衡刺激Th1和Th2免疫反应的药物组合物。
27.制备包含变应原或抗原的基于PVM/MA共聚物的纳米颗粒的方法，其中所述变应原或抗原至少部分地包被所述纳米颗粒的表面和/或被包含在所述纳米颗粒的内部，所述方法包括以下步骤a)以水醇溶液对PVM/MA共聚物溶解在有机溶剂中所形成的有机溶液去溶剂化；b)去除所述有机溶剂以获得纳米颗粒；以及c)在对所述PVM/MA共聚物有机溶液去溶剂化之前，将所述变应原或所述抗原加入到所述PVM/MA共聚物有机溶液中，或者将所述变应原或者所述抗原与步骤b)中得到的所述纳米颗粒孵育。
28.如权利要求27所述的方法，进一步包括使从步骤a)得到的产物与免疫刺激剂孵育，或者使步骤b)得到的所述纳米颗粒与免疫刺激剂孵育。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述PVM/MA共聚物溶解在其中的所述有机溶剂是丙酮，所述水醇溶液包含乙醇和水，并且所述共聚物溶液∶水醇溶液的比例为1∶1至1∶10。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述共聚物溶液∶水醇溶液的比例为1∶4。
31.如权利要求27或28所述的方法，包括另外的将所形成的纳米颗粒与交联剂孵育的步骤。
32.如权利要求27或28所述的方法，包括另外的纯化所形成的纳米颗粒的步骤。
33.如权利要求27或28所述的方法，其包括另外的冻干步骤，任选地在防冷冻剂存在下进行。
全文摘要
本发明涉及在患者中刺激免疫反应的组合物，包括基于甲基乙烯基醚－马来酸共聚物的纳米颗粒。所述纳米颗粒还可含有变应原或抗原和/或免疫刺激剂，其可被包含在所述纳米颗粒内部和/或包被在其至少部分表面，并任选地包含交联剂。所述刺激免疫反应的组合物可用作免疫治疗和疫苗中的佐剂。
文档编号A61K39/39GK1976687SQ200580021493
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月28日 优先权日2004年4月29日
发明者胡安马奴埃尔·伊拉切尔贾立塔, 卡洛斯·加马左德拉拉斯拉, 马力亚路易萨·圣拉如加, 马塔·皮尔布加, 布特赫兹·圣朗漫阿贝拉斯度里, 赫斯曼H·A·沙尔曼, 萨拉·戈梅斯马迪内, 加维尔·欧撤尔赫巴哈兹 申请人:纳瓦拉公司科学与技术研究所