专利名称：苯丙氨酸衍生物的稳定剂型的制作方法
技术领域：
本发明涉及改良的和稳定的苯丙氨酸衍生物的药物制剂，和涉及其作为尿激酶抑制剂的用途，特别是用于制备治疗恶性肿瘤和肿瘤转移的用途。
背景技术：
实体瘤扩散和转移至周围组织中的能力与肿瘤细胞周围中的细胞外基质(肿瘤基质(Tumorstroma))的降解或改变相关，或与其渗透入基底膜的能力相关。尽管仍未彻底阐明(病理)生物化学的相互关系，但尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和尿激酶受体(uPAR)起着关键作用。uPA介导纤溶酶原经蛋白水解而被裂解成纤溶酶。另一方面，纤溶酶是具有广谱作用的蛋白酶，其能够直接分解细胞外基质的组分例如血纤蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖的蛋白骨架。此外，纤溶酶还能够激活“潜伏的”金属蛋白酶和uPA的无活性的酶原，pro-uPA。
肿瘤基质的肿瘤细胞和非恶性细胞合成和分泌无酶促活性的酶原pro-uPA。蛋白酶，例如纤溶酶或组织蛋白酶B和L，通过有限蛋白水解作用切割pro-uPA，产生活性的丝氨酸蛋白酶HMW-uPA(HMW＝高分子量)。Pro-uPA和活性蛋白酶HMW-uPA结合细胞表面受体uPAR(CD87)。同样地，纤溶酶(原)也结合肿瘤细胞的质膜上的特异性受体，从而在紧靠肿瘤细胞的周质中聚焦和放大纤溶酶原的活化。因此，侵袭性细胞能够降解细胞外基质而不会通过蛋白水解而避开对于定向运动所需的支持物。
在各种细胞生物学研究中已能够表明，在肿瘤相关的蛋白水解系统的级联型反应途径中，细胞相关的纤溶酶原激活物系统具有非常重要的地位(Wilhelm等人，The Urokinase/Urokinase receptor systemA new target for cancer therapy？InSchmitt M.，Graeff H.，Kindermann G.(Hrsg)Prospects in Diagnosis and Treatment ofCancer.International Congress Series，Excerpta Medica 1050，Amsterdam，Elsevier(1994)pp145-156)。已在人结肠癌细胞的培养物中观察到，其穿过细胞外基质迁移的能力依赖于活性uPA使uPA受体饱和的程度(Hollas等人，Cancer Res.51(1991)3690-3695)。同样，在细胞培养模型中，当uPA的蛋白水解活性被PAI-1(Cajot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)6939-6943)或PAI-2(Baker等人，Cancer Res.50(1990)4676-4684)抑制时，观察到细胞侵袭潜力降低。在通过使用无蛋白水解活性的uPA变体阻断受体来抑制uPA和细胞表面的结合时，获得了相当的效果(Cohen等人，Blood 78(1991)479-487；Kobayashi等人，Br.J.Cancer 67(1993)537-544)。用表达针对uPAR的部分的反义转录物的质粒转染表皮样癌细胞，也可经抑制uPAR合成而导致这些细胞的侵袭性降低(Kook，EMBOJ.13(1994)3983-3991)。针对uPA和PAI-1的抗体在体外减少肺癌细胞的侵袭潜力(Liu等人，Int.J.Cancer 60(1995)501-506)。
还可以在肿瘤动物模型中证明纤溶酶原激活物系统对转移过程的影响。例如，通过加入针对uPA的抗体几乎完全抑制鸡胚胎中的由人癌细胞引起的肺转移形成(Ossowski和Reich，Cell 35(1983)611-619)。用编码无蛋白水解活性但具有uPAR结合性的uPA突变体的表达质粒转染转移性人癌细胞。在小鼠模型中表明，与未转染的细胞相比，在注射后，合成无活性uPA的癌细胞形成数量明显更少的转移(Crowley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)5021-5025)。此外，在施用uPA-反义寡核苷酸后，在裸小鼠中观察到人卵巢癌细胞的腹膜内扩散被抑制(Wilhelm等人，Clin.Exp.Metast.13(1995)296-302)。
近年来，深入研究了纤溶酶原激活物系统的因子(uPA、uPAR、PAI-1和PAI-2)对于患有实体恶性肿瘤的患者的预后的临床重要意义。在这些研究中，证实在各种肿瘤(例如乳房、卵巢、胃、肺、肾等)的情况下uPA抗原含量是无复发存活和死亡的强预报因素(参见例如Schmitt等人，J.Obstet.Cynaecol.21(1995)151-165；Jaenicke等人，Breast Cancer Res.Treat.24(1993)195-208；Kuhn等人，Gynecol.Oncol.55(1994)401-409；Nekarda等人，Lancet343(1994)117；Pedersen等人，Cancer Res.54(1994)4671-4675)。同样地，在肺癌组织(Pedersen等人，同上)和乳腺癌组织(Duggan等人，Int.J.Cancer 61(1995)597-600；Ronne等人，Breast Cancer Res.Treat.33(1995)199-207)中，以及在胃癌的情况下，不仅在肿瘤组织本身中(Heiss等人，J.Clin.Oncol.13(1995)2084-2093)而且在散布入骨髓的肿瘤细胞中(Heiss等人，Nature Medicine 1(1995)1035-1039)，提高的uPAR的浓度也和不良预后相关联。
还发现，在2位上用苯基取代的3-脒基苯丙氨酸衍生物是在体内具有活性的选择性uPA抑制剂(EP 1 098 651)。在动物实验中，以水溶液的形式施用这些化合物。
WO 02/074756和WO 03/103644公开了其他基于苯丙氨酸的尿激酶抑制剂的用途，以及3-胍基苯丙氨酸衍生物作为尿激酶抑制剂的用途。
在上述化合物的一期临床试验的过程中发现，以含水的甘露醇例如D-甘露醇的形式(不加入有机溶剂和含有丙二醇/乙醇以及食盐的溶液)进行施用具有缺点。例如，无论是在食盐溶液中还是使用等渗剂甘露醇，都不能产生不易于析出和形成沉积物的稳定且浓缩的活性物质溶液。因此，例如在5％的甘露醇溶液中，在较长时间的贮存后，形成了由加入的活性物质构成的沉淀物。已证明由有机溶剂组成的制剂同样是不太合适的，因为在其中的活性物质不具有所必需的化学稳定性，并且具有分解的倾向。因此，在大约一个半月后，活性物质开始通过酰胺形成而分解产生酯，从而使活性物质溶液不能用了。
WO 2004/011004公开了使以所谓的脂质体，混合的微团(由各种磷脂组成)的形式存在的含有基于苯丙氨酸的尿激酶抑制剂的水溶液稳定的方法。然而，这种稳定形式对于所有应用来说并不足够，特别是在用生理缓冲液重构后，将不再能够充分确保脂质体制剂的化学稳定性。
对于开发新制剂的初步研究显示，活性物质Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid(WX-UK1)在多元醇例如二醇中以及在由多元醇/醇和水组成的混合物中具有非常良好的溶解度(表1)。
这些数据表明，由多元醇和醇例如丙二醇(PG)和乙醇(EtOH)组成的混合物是液体制剂的良好溶剂。另外，两种溶剂都适合于活性物质的肠胃外施用。
各种不同制剂，例如a)WX-UK1 60mg/ml，于PG/EtOH/水40/10/50中b)WX-UK1 50mg/ml，于PG/EtOH/水40/10/50中c)WX-UK1 40mg/ml，于PG/EtOH/水40/10/50中d)WX-UK1 20mg/ml，于PG/EtOH/水10/10/80中e)WX-UK1 4mg/ml，于水中(对照)f)WX-UK1 4mg/ml，于5％D-甘露醇中(对照)在2至8摄氏度(2-8℃)下的贮存已表明，在制剂(e)和(f)中，仅仅在数小时后就形成了针状晶体沉淀物。在2至8摄氏度(2-8℃)下，在4天后，在制剂(d)中也形成了具有相似外观的沉淀物。
在制剂(a)和(b)中，在2至8摄氏度(2-8℃)下，分别在16天和22天的贮存后没有出现沉淀。
在2-8℃、25℃/60％RF(相对空气湿度)和40℃/75％RF的条件下的稳定性研究之中，在40℃的条件下，与研究开始时的大约0.5％的杂质含量相比，制剂(c)在6周后就已经显示大约4％的杂质含量，在8周后显示大约23％的杂质含量，和在12周后显示大约38％的杂质含量。同时，制剂的pH值在12周的时间内从5.1上升至8.7(
图1)。
pH值的升高可能归因于WX-UK1的分解过程。图2显示了在水性介质中活性物质WX-UK1的可能的分解反应第一步，WX-UK1分解成相应的WX-UK1-酰胺，其中释放出氨，然而其以氯化铵的形式被捕获，因为WX-UK1以盐酸盐的形式存在。在第二步分解步骤中，WX-UK1-酰胺和醇反应而释放出其他的氨，从而形成相应的WX-UK1-酯。氨的释放可能是pH值升高的原因。
基于对于分解过程的认识，优选地考虑无水制剂以避免由水产生的活性物质的分解。然而，纯有机的溶剂的相对较高的粘性给粘稠的浓缩物在日常的临床实践中的可操作性造成困难。此外，多元醇的强吸湿性质导致水的吸收，从而使得活性物质的降解过程重新开始。用有机缓冲质例如三乙醇胺/HCl、哌嗪/HCl、丙酸/丙酸盐(并非所有所述缓冲质都是生理学上可接受的)进行缓冲也会变得困难重重。
通过加入表面活性剂例如Pluronic F68或Tween 80，或者稳定剂例如人血清白蛋白来稳定水溶液的努力是无成效的。加入助溶剂例如聚乙二醇，以及在包含胆汁盐甘氨胆酸盐一水合物和磷脂卵-磷脂酰胆碱的混合微团中配制活性物质，同样也不能提供足够的稳定性。
因此，存在开发用于具有脒基和/或胍基的活性物质的新药物制剂的需要，该制剂一方面在物理和化学上是稳定的并且可以一份一份地和/或作为浓缩物被良好地操作和贮存，以在需要时配制稳定的药物制备物，例如具有合适的等渗剂的稳定的生理输注液，所述药物制备物是相容的并且具有高有效性。
发明内容
根据本发明，通过权利要求1的药物制剂来实现这些目的，所述药物制剂包含(i)作为活性物质的脒基-、羟基脒基-、胍基-和/或羟基胍基-苯丙氨酸衍生物，(ii)醇或多元醇或其混合物，和(iii)包含缓冲质的水相。
所用的活性物质优选地是作为丝氨酸蛋白酶抑制剂特别是尿激酶抑制剂起作用的苯丙氨酸衍生物。优选的活性物质是EP-A-1 098651、WO 02/074756和WO 03/103644中公开的脒基苯丙氨酸或胍基苯丙氨酸化合物。羟基脒基苯丙氨酸或羟基胍基苯丙氨酸化合物，如PCT/EP2004/005682中所公开的，同样也是优选的。通式I的衍生自3-脒基苯丙氨酸或3-胍基苯丙氨酸的新尿激酶抑制剂特别适合作为本发明药物制剂的活性物质， 其以外消旋物的形式以及以L-或D-构型的化合物的形式存在，和其中X是脒基或胍基或者羟基脒基或羟基胍基。
R1(a)是OH或OR4，其中R4是任选地被例如羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基(Oxo)和/或卤素取代的、分枝或不分枝的C1-C8烷基、C3-C8环烷基或芳烷基，例如苯甲基或苯乙基，(b)是下式的基团 其中R5和R6是任何与总体结构相容的残基，其中特别地(i)R5和R6是H，(ii)R5是H，R6是任选地被例如羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的、分枝或不分枝的C1-C8烷基、芳烷基例如苯甲基或苯乙基、或C5-C8环烷基，(iii)R5和R6各自独立地是任选地被例如羟基和/或卤素取代的、不分枝或分枝的C1-C4烷基，或(iv)R5是H，R6是-NH2或特别地被芳基或杂芳基取代的氨基，(v)R5是H或任选地被例如羟基和/或卤素取代的、不分枝或分枝的C1-C4烷基，R6是氨基酸例如α-、β-或ω-氨基羧酸或氨基磺酸的残基、或者长度例如为至多50个氨基酸的肽或长度例如为大于50个氨基酸至1,000个氨基酸的多肽的残基，(c)是下式的基团 其中m表示数字1或2，和其中一个或多个亚甲基任选地被例如羟基、羧基、C1-C4烷基或芳烷基例如苯甲基或苯乙基取代，其中基团(c)是外消旋的或者是D-或L-构型，R7具有(a)、(b)和(f)中的R1的含义，(d)是下式的基团 其中p＝r＝1，p＝1并且r＝2，或p＝2并且r＝1，和其中一个或多个亚甲基任选地被例如羟基、羧基、C1-C4烷基或芳烷基例如苯甲基或苯乙基取代，R7具有(a)、(b)和(f)中的R1的含义，(e)是哌啶基，其任选地在位置2、3和4中的一个位置上被例如C1-C4烷基、C1-C3烷氧基或羟基取代，其中任选地在式(c)、(d)、(e)的杂环脂族环上，其他芳香族或环脂族环，优选苯基或环己基，在相对于杂原子的2，3-位和3，4-位处稠合，(f)是下式的基团
其中R8表示(i)任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的C1-C6烷基，例如乙氧基羰基或芳基，如苯基、对卤代苯基、萘基，(ii)饱和或不饱和的、分枝或不分枝的C1-C6烷氧基，或(iii)任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的苯氧基羰基或苄氧基羰基，(g)是式-COX的酰基，其中X表示(i)H，任选地被例如羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的、不分枝或分枝的烷基，优选C1-C6烷基，特别是甲基，(ii)任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的芳基或杂芳基，例如苯基、对卤代苯基、噻吩基，或(iii)任选地被例如羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的环烷基，优选C3-C10环烷基，(h)是芳烷基，例如苯甲基或苯乙基，其中芳香族残基任选地被例如卤素原子、C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、氰基、羧基、磺酰基或硝基取代，(i)是式-CONR′R″的羧酸酰胺残基、式-CSNR′R″的硫代羧酸酰胺残基或式-CH2-CONR′R″的乙酸酰胺残基，其中(i)R′和R″是H，(ii)R′和R″各自独立地是C1-C4烷基，(iii)R′是H，R″是C1-C4烷基，(iv)R′是H，R″是芳基，例如苯基，或(v)R′和R″与氮原子一起形成具有5-7个环成员的杂环脂族环，其可以具有其他杂原子例如N、O和/或S，(j)是SO2-Y残基，其中Y表示(i)任选地被例如羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的C1-C8烷基，优选甲基、三氟甲基、三氯甲基，(ii)任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的芳基或杂芳基，例如苯基、4-甲基苯基、2，4，6-三甲基苯基、2，4，6-三异丙基苯基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基、2，2-二甲基-6-甲氧基-色满基、2，2，5，7，8-五甲基色满基、蒽醌基、萘基或喹啉基、或者O-芳基优选O-苯基或O-杂芳基，或(iii)-NR′R″，其中R′和R″各自独立地表示H或C1-C3烷基，(k)是具有5至8个碳原子的环脂族环，其任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、卤素、羟基和/或氧代基取代，(1)是任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的杂芳基，例如吡啶基或嘧啶基、或者杂环脂族残基例如N-甲基哌啶基，(m)是式-(CH2)n-X的官能化的烷基，其中所述烷基链是不分枝的或分枝的，n＝1-8，官能性残基X表示(i)羟基，其氢原子任选地被C1-C4烷基、芳烷基例如苯甲基或苯乙基、芳基例如苯基、C1-C4羟基烷基或酰基、CO-烷基(C1-C6)取代，(ii)卤素原子，(iii)式-N(烷基)2的叔氨基，其中所述烷基具有1至3个碳原子并优选地具有相同的含义，所述氮原子任选地属于具有5-7个环成员的杂环脂族环，其可以具有其他杂原子，例如N、O和/或S，R2是任选地被例如C1-C6烷基、C1-C3烷氧基、羟基、羧基、磺酰基、硝基、氰基、氧代基和/或卤素取代的苯基，例如苯基、4-甲基苯基、2，4，6-三甲基苯基、2，4，6-三异丙基苯基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基，R3是H或者分枝或不分枝的C1-C4烷基，n表示0或1，Z是N或CR9，其中R9是H或者分枝或不分枝的C1-C4烷基。
所述化合物也可以以盐的形式存在，优选生理学上可接受的酸盐，例如无机酸的盐，特别优选盐酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐，或者合适的有机酸的盐。
在上位权利要求中所定义的化合物之中，特别重要的化合物是这样的化合物，在该化合物中，R1对应于式(b)、(d)和(f)的基团，R2表示被烷基单、二或三取代的苯基，特别是2，4，6-取代的苯基，例如2，4，6-三异丙基苯基，n＝0。进一步优选的化合物是其中Z是CH或N的化合物。
式(I)的化合物特别优选地为Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-脒基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid、Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-胍基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid或其L-对映体，或者这些化合物的药学上可接受的盐。
如上所述，脒基-和胍基-苯丙氨酸衍生物的对应的羟基化合物也适合用作活性物质，例如在PCT/EP2004/005682中公开的化合物，特别是通式II和/或III的化合物
其中E表示选自下列的基团 B表示-SO2-或-CO-，X表示-NR1或-CHR1，Z表示-R4，-OR4或-NH-R4，Y表示-OR2或-NHR2，R1各自独立地表示-H、-C1-C6烷基、-C2-C6链烯基或-C2-C6炔基，其为未取代或取代的，R2表示-H、-OR1、-COR1、-COOR1或-CON(R1)2，R3表示-H、-C1-C6烷基、-C2-C6链烯基或-C2-C6炔基，其为未取代或取代的，或-COR6或-COOR6，或具有例如2-50个-C2-C4烯氧基例如乙烯氧基的寡聚或多聚烯氧基残基，R4表示-H、-C1-C6烷基、-C2-C6链烯基或-C2-C6炔基，其为未取代或取代的，或环状残基，R5表示-OR6、-N(R6)2、-C1-C6烷基、-C2-C6链烯基或-C2-C6炔基，其为未取代或取代的，和R6表示-H、-C1-C6烷基、-C2-C6链烯基或-C2-C6炔基，其为未取代或取代的，或环状残基，其中各个环状残基可以具有一个或多个例如选自-C1-C3烷基、-OR6(例如-OH或-C1-C3烷氧基)、卤素、＝O、-NO2、-CN、-COOR6、-N(R6)2、-NR6COR6、-NR6CON(R6)2和-OCOR6的取代基，和其中各个烷基、链烯基和炔基可以是直链的或分枝的，并可以具有一个或多个例如选自卤素(F、Cl、Br、I)、-OR6、-OCOR6，-N(R6)2、-NR6COR6、COOR6、-NR6COR6或环状残基的取代基，或者这些化合物的盐以及任选地药学上常规的载体、稀释剂和/或助剂。
优选的化合物是通式IV的化合物 其中X、R1、R3、R4和R6如上所定义，或其盐。
基团E在化合物I和II中优选地位于苯环的对位。特别优选的化合物是其中E为Am的通式I的化合物。
本发明的化合物具有经修饰的脒基或胍基官能团E，优选羟基胍基或羟基脒基官能团。已知这样的修饰物在制备胍基或脒基类型的尿激酶抑制剂中仅作为合成中间产物。迄今未推测过药物有效性。
所述化合物可以以盐的形式存在，优选生理学上可接受的酸盐，例如无机酸的盐，特别优选盐酸盐或硫酸氢盐，或者合适的有机酸的盐，例如有机羧酸或磺酸的盐，如酒石酸盐、甲磺酸盐或苯磺酸盐。硫酸氢盐是特别优选的。所述化合物可以以光学纯的化合物形式或以对映体和/或非对映体的混合物形式存在。
环状残基可以包含一个或多个饱和的、不饱和的或芳香族的环。环状残基的优选实例是环烷基、芳基、杂芳基和二环残基。单环或二环残基是特别优选的。环状残基优选地包含4至30个，特别是5至10个碳原子和杂原子作为环原子，以及任选地一个或多个前述取代基。杂环系统优选地包含一个或多个O、S和/或N原子。优选的二环环系统是具有-CO-残基的那些。
烷基、链烯基和炔基优选地包含至多4个碳原子。R1优选地是H或任选地经取代的C1-C4烷基，例如-CH3或C1-C6烷基芳基，从而-CO-X-NR1可以表示例如甘氨酰基、丙氨酰基、苯丙氨酰基或高苯丙氨酰基。R2特别优选地是H或C1-C3烷基，从而Y可以表示例如OH或O-C1-C3烷基。R3特别优选地是H。在化合物I中，R5优选地表示-NHR6，特别优选-NH(C1-C5)烷基，其是未取代或取代的，例如-NHC2H5，或者-OR6，特别优选-O(C1-C3)烷基，其是未取代或取代的，例如乙氧基或苄氧基，或者-O-芳基，例如苯氧基。在化合物II和III中，R6优选地是-H或C1-C3烷基。
优选的化合物是这样的化合物，在该化合物中，结构元件Z表示R4，其中R4表示具有环状取代基的烷基，所述环状取代基例如为任选地经取代的苯基或二环残基，例如 特别优选的化合物是这样的化合物，在该化合物中，R4表示取代或未取代的C1-C3烷基芳基，例如苄基，其任选地在间位或对位上可被卤素和/或-NO2取代，其中卤素选自F、Cl、Br和I，特别优选Cl和Br。
最优选的化合物是
N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid(WX-671)，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基脒基-(D)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基脒基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid(WX-683)，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(D)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氨基羰基piperazid(WX-685)，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(D)-苯丙氨酸-4-乙氨基羰基piperazid，N-α-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-羟基胍基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氨基羰基piperazid，苄基磺酰基-(D)-Ser-Gly-(4-羟基胍基苄基)酰胺(WX-678)，4-氯苄基磺酰基-(D)-Ser-N-Me-Ala-(4-羟基胍基苄基)酰胺，4-氯苄基磺酰基-(D)-Ser-Gly-(4-羟基胍基苄基)酰胺，苄基磺酰基-(D)-Ser-N-Me-Gly-(4-羟基胍基苄基)酰胺，4-氯苄基磺酰基-(D)-Ser-Ala-(4-羟基胍基苄基)酰胺及其盐，例如硫酸氢盐，例如WX-671·HSO4。
本发明的制剂单独地或者以其混合物或组合的形式包含治疗有效量的基于苯丙氨酸衍生物的活性物质、生理学可接受量的醇和/或多元醇、具有缓冲质成分的水相以及任选地等渗剂和其他助剂。
本发明的制剂所含有的活性物质的重量份额有利地为0.5-10％，优选1-9％，特别优选2-5％，相对于制剂的总重量。
活性物质优选地以至多100mg/ml、优选地至多80mg/ml、优选地至多60mg/ml、优选地至多50mg/ml、更优选地至多40mg/ml、更加优选地大约30mg/ml、更加优选地大约20mg/ml、更加优选地大约10mg/ml、更加优选地大约4mg/ml、更加优选地至多大约1mg/ml、优选地至多大约0.1mg/ml的浓度存在。使用前，任选地可进一步对制剂进行稀释。
在本发明的范围内使用的醇或多元醇包括生理学上可接受的一和多羟基醇。此处所用的多元醇是指多羟基醇。特别地，其可以是二羟基醇(二元醇)或三羟基醇(三元醇)，或者也可以是多羟基醇。
例如，作为一羟基醇，乙醇是优选的。然而，也可使用其他生理学上可接受的醇。
作为多元醇，可特别考虑生理学上可接受的二元醇和三元醇，作为三元醇优选的是例如丙三醇。根据本发明，二醇也是合适的。二醇的实例是乙二醇、丙二醇、聚乙二醇。
醇和/或多元醇优选地以这样的量存在于本发明的药物制剂中，即这些组分，相对于整个制剂的体积，构成大约20-60％、优选地40-60％、更优选地45-55％、最优选地大约50％。
多元醇和醇的混合物是特别优选的。在此，多元醇∶醇的比例优选地是2∶1至10∶1，更优选地3∶1至8∶1，更加优选地4∶1至6∶1和最优选地4∶1。
所述混合物优选地为二醇和乙醇的混合物。丙二醇和乙醇的混合物以及聚乙二醇和乙醇的混合物是特别优选的。
包含缓冲质的水相优选地选自生理学上可接受的缓冲液，特别是醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等。缓冲质组分优选地为醋酸钠缓冲质。然而，其他醋酸盐缓冲质也是合适的，例如醋酸钾缓冲质、醋酸钙缓冲质。本领域技术人员能够从生理学上可接受的缓冲质特别是醋酸盐缓冲质中选择合适的缓冲质。
相对于整个制剂的体积，水相优选地以至多70％、优选地至多60％、更优选地至多大约50％的量存在。不言而喻，如果需要，可在使用前对药物制剂进行稀释。优选地，在即将使用前对制剂进行稀释，优选地用等渗剂或等渗液体进行稀释，从而优选地产生适合于输注或注射的等渗溶液。
缓冲质优选地以至多1000mM、优选地至多500mM、更优选地至多250mM、更优选地至多200mM、更加优选地大约100mM的浓度存在。
本发明的制剂还可以包含本领域技术人员所熟知的等渗剂和/或其他助剂。
等渗剂优选地是糖，或优选地选自，例如，葡萄糖、核糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、右旋糖、海藻糖、甘油及其混合物。等渗剂优选地以溶液的形式存在。作为等渗剂，优选地使用大约1-10％、优选地2-7％、特别优选地5％的溶液。葡萄糖溶液是特别优选的。
本发明的制剂还可进一步包含本领域技术人员可容易地确定的助剂。
此外，优选的是，本发明的制剂(至少其水性组分)具有在3.5至9.0范围内的pH值、优选地在4至7范围内的pH值、和特别优选地在4.5至5.5范围内的pH值。
本发明的制剂可用于各种施用途径，例如作为液体制剂，可用于肠胃外施用，作为输注液，可用于肌内、静脉内、皮下施用等。优选地通过静脉内或肌内途径施用制剂。本领域技术人员可以容易地确定适合于此的助剂。
任选地可将本发明的制剂与其他活性物质组合使用，所述活性物质例如为细胞抑制性或细胞毒性试剂，例如多柔比星、顺铂、5-氟尿嘧啶或抗体和肽。
本发明的制剂可用于肠胃外施用，例如用于静脉内或肌内注射和/或用于输注。优选地，各自相对于70kg的平均体重，日剂量在皮下或肌内施用的情况下为5-250mg，特别优选地20-120mg，和在静脉内施用的情况下为10-500mg，特别优选地50-250mg。优选地，每天一次至每周一次地进行施用。
本发明的另一个目标涉及由本发明的制剂组成的浓缩物，其中活性物质以至多100mg/ml、优选地至多80mg/ml、更优选地至多50mg/ml、更加优选地大约40mg/ml的浓度存在。缓冲质优选地以至多1000mM、优选地至多500mM、更优选地至多250mM、更加优选地大约100mM的浓度存在。
其中活性物质的浓度为40mg/ml，缓冲质的浓度为100mM的浓缩物是特别优选的。
可较长时间贮存本发明的浓缩物和制剂而无纯度和活性物质的大量损失，一般在2至8(2-8)℃下但也可在升高的温度下例如在40℃下进行贮藏。
所述活性物质化合物适合用于防治与uPA和/或尿激酶-纤溶酶原激活物受体(uPAR)的病理学过量表达相关的疾病。其例如能够高效地抑制恶性肿瘤的生长和/或扩散以及抑制肿瘤的转移。在此，任选地可将uPA抑制剂与其他肿瘤剂或与其他治疗方式例如辐射或外科手术一起使用。此外，所述抑制剂对于其他uPA相关性和/或uPAR相关性疾病也是有效的。
这些化合物能够高效地抑制恶性肿瘤的生长和/或扩散，例如胰腺癌中的肿瘤扩散、乳腺癌的肿瘤生长，以及抑制肿瘤的转移。
此外，本发明的抑制剂对于其他uPA相关疾病也是有效的，例如用于防治疾病例如关节炎、炎症、骨质疏松症、视网膜病例如年龄相关性黄斑变性，在皮肤病寻常天疱疮中防止水疱形成。
施用优选地与外科手术、辐射疗法和/或化学疗法联合进行，例如在治疗前和/或治疗后以及与治疗同时进行。
本发明的另一个目标涉及本发明的浓缩物的用途，即用于通过在合适的等渗剂中进行稀释来制备适合于注射或输注的活性物质溶液，其中优选地使用5％的葡萄糖溶液，和活性物质的浓度优选地为至多1mg/ml。
使用本发明的制剂用于防治尿激酶相关疾病，特别是用于肿瘤防治，例如用于防治乳腺癌和胰腺癌和/或转移形成。
本发明的另一个目标是通过加入合适量的多元醇或醇或其混合物和包含缓冲质的水相来稳定药物制剂的方法，所述药物制剂包含具有脒基、羟基脒基、胍基和/或羟基胍基的化合物，优选脒基-和/或胍基-苯丙氨酸衍生物或其羟基化合物。优选地，额外地加入等渗剂。
醇、多元醇、缓冲质和等渗剂如上所述。
作为活性物质，优选地使用如上所述的作为尿激酶抑制剂起作用的脒基-和/或胍基-苯丙氨酸衍生物。
此外，下文中将示例性地但绝对不是限制性地对本发明进行更详细的解释。
附图描述表1显示WX-UK1在各种溶剂和溶剂混合物中的最大溶解度。
图1显示在40℃下，在PG/EtOH/水(4/1/5)中，WX-UK1的纯度和pH值的变化过程。
图2显示WX-UK1在水溶液中的可能分解机制。
图3显示在48小时内观察到的在60℃下WX-UK1分解的pH依赖性。
图4显示在60℃下，单种WX-UK1制剂的稳定性。
图5显示与未缓冲的溶液相比，缓冲的WX-UK1制剂的稳定性。
图6显示在5个月内在40℃下，WX-UK1制剂的纯度和含量。
实施例实施例1活性物质分解的pH依赖性为了在60℃下加热处理的情况下，在三个不同的pH值上研究活性物质(WX-UK1)分解的pH依赖性，将2.5mg WX-UK1溶解在1ml乙醇/水(1∶1 v/v)中，。将该溶液等分至三个容器中。通过加入20μl 1N盐酸将一个等分试样调节至pH 2，通过加入20μl 2N氢氧化钠溶液将第二个等分试样调节至pH 11，和将第三个等分试样保持在中性pH。温育后，通过指示稳定性的HPLC法在指定的时间点(0、5、12和48小时)上分析溶液。显示出，在所研究的时间内，WX-UK1在酸性pH下保持稳定。然而，在中性或碱性pH下，观察到WX-UK1的中速至快速的分解(图3)。
实施例2多元醇/乙醇制剂中的活性物质的稳定性将0.4ml丙二醇(PG)和0.1ml乙醇相继加至40mg WX-UK1。该溶液用0.3ml水补足并搅拌，直至WX-UK1在溶液中消散和溶液呈现淡淡的乳白色光。然后加入剩余的水(大约0.2ml)。然后将溶液在40℃下贮存，各在2、4、6、8和12周后分析溶液的pH值或纯度。为此，将250μ1 WX-UK1溶液转移至100ml量瓶中，并用水/乙腈(50∶50v/v)补足直至满刻度线(浓度大约0.1mg/ml的WX-UK1)。然后通过指示稳定性的HPLC法分析20μl的该稀释液(参见附件)。在20-25℃下，通过电势滴定法进行WX-UK1溶液的pH值分析。显示出(图1)，溶液的pH值越高，WX-UK1分解得越快。
实施例3可选择的经缓冲的WX-UK1制剂制备下列溶液(a)至(e)各5ml。然后在60℃下贮存所述溶液，在0、12、24、48小时的时间后，分析各溶液的pH值和纯度。为此，将250μl WX-UK1溶液转移至100ml量瓶中，并用水/乙腈(50∶50 v/v)补足直至满刻度线(浓度为大约0.1mg/ml的WX-UK1)。然后通过指示稳定性的HPLC法分析20μl的该WX-UK1溶液稀释液(参见附件)。
a)1mg/ml的在水中的WX-UK1(测量pH值)；b)40mg/ml的在PG/乙醇/水(4∶1∶5)中的WX-UK1(测量pH值)；c)40mg/ml的在无水1，2-丙二醇/乙醇中的WX-UK1；d)40mg/ml的在PG/乙醇/40mM柠檬酸钠(4∶1∶5)中的WX-UK1(调节pH值至溶液(b)的pH值)；e)40mg/ml的在PG/乙醇/40mM醋酸钠缓冲液(4∶1∶5)中的WX-UK1(调节pH值至溶液(b)的pH值)。
为了制备80mM(上述pH值)柠檬酸钠缓冲液，将1.68g柠檬酸一水合物溶解在8ml 1N氢氧化钠中，用水补足至100ml。用80nM的氢氧化钠调节pH值。通过1/80的稀释和随后的pH调节而获得1mM的缓冲液。
选择pH 5的醋酸钠和柠檬酸钠作为用于缓冲WX-UK1制剂的肠胃外可接受的系统，相对于未缓冲的制剂和无水制剂，检测化学和物理稳定性。不采用磷酸盐缓冲，因为根据早期的研究已知，在WX-UK1溶液中通过加入磷酸盐缓冲液而形成了沉淀物。在60℃下进行稳定性研究以获得更快速的WX-UK1的分解。在经柠檬酸盐缓冲的WX-UK1溶液中非常快速地产生沉淀物，与溶液的上清液一样，就WX-UK1的纯度对其进行检验。由于经柠檬酸钠缓冲的溶液缺乏物理稳定性和被研究的制剂缺乏化学稳定性，在4天后中断这些制剂的稳定性研究。经醋酸钠缓冲的WX-UK1制剂展示了最高的物理和化学稳定性。利用通过指示稳定性的HPLC法确定的WX-UK1峰面积百分数用于分析(图4)。
实施例4经醋酸钠缓冲的溶液的稳定性基于这些结果，选择pH为5的各种摩尔浓度的醋酸钠作为用于缓冲WX-UK1制剂的肠胃外可接受的系统，另外检测相对于未缓冲的制剂的化学稳定性。在60℃下进行稳定性研究以获得加速的WX-UK1的分解(图5)。利用通过指示稳定性的HPLC法确定的WX-UK1峰面积百分数用于分析。
结果通过对制剂进行缓冲可显著延缓WX-UK1的分解。
实施例5使用经醋酸钠缓冲的制剂的持续几个月的稳定性研究200mM醋酸钠缓冲液的配制将821mg醋酸钠溶解在50ml水中并用浓醋酸将pH调节至pH 5，将制得的缓冲溶液通过Millipore，Millex GV 0.22μm这种注射器过滤器进行过滤。
经100mM醋酸钠缓冲的WX-UK1制剂的配制称取960mg WX-UK1放入容器中，加入9.6ml丙二醇，然后加入2.4ml乙醇。用7ml 200mM醋酸钠缓冲液将该溶液补足并搅拌直至WX-UK1消散在溶液中和溶液显现淡淡的乳白色光。然后加入剩余的醋酸钠缓冲液(5ml)。将溶液分成1ml的等分试样，然后在40℃下贮存。各在2、4、6、8和12周的时间后分析溶液的纯度和WX-UK1的含量。为此，将250μl WX-UK1溶液转移入100ml量瓶中，并用水/乙腈(50∶50 v/v)补足直至满刻度线(浓度大约0.1mg/ml的WX-UK1)。然后通过指示稳定性的HPLC法分析20μl的该WX-UK1溶液稀释液(参见附件)。
相对于两种WX-UK1标准溶液，使用下列公式计算WX-UK1的含量 面积PL＝测试溶液的面积(WX-UK1峰) [mAU*s]面积St1＝标准I的面积(WX-UK1峰) [mAU*s]面积St2＝标准II的面积(WX-UK1峰)[mAU*s]WSt1＝标准I的重量 [mg]WSt2＝标准II的重量 [mg]CSt＝标准的含量[％]VPL＝所使用的注射液的体积 [ml]图6显示了随着时间的流逝，制剂的纯度和WX-UK1含量的变化。很明显，与未缓冲的制剂相反，经缓冲的WX-UK1制剂的纯度和含量均保持非常稳定(图6)。
实施例6使用下列方案制备WX-UK1制剂(40mg/ml)WX-UK1 40mg丙二醇 0.4ml
无水乙醇 0.1ml水加至1ml称取WX-UK1放入容器中，加入丙二醇，然后加入乙醇。用0.3ml水将该溶液补足并搅拌直至WX-UK1消散在溶液中或溶液显现淡淡的乳白色光。然后加入剩余的水。
实施例7使用下列方案制备经醋酸钠缓冲的WX-UK1制剂(40mg/ml)WX-UK140mg丙二醇0.4ml无水乙醇 0.1ml醋酸钠缓冲液(200mM) 加至1ml称取WX-UK1放入容器中，加入丙二醇，然后加入乙醇。用0.3ml200mM醋酸钠将该溶液补足并同时进行搅拌直至WX-UK1完全消散在溶液中或溶液显现淡淡的乳白色光。然后加入剩余的醋酸盐缓冲液。
实施例8用于验证WX-UK1制剂的稳定性的指示稳定性的HPLC法仪器HPLC设备Agilent 1100和 柱类型 LUNA C8(2)5μm，250mm，条件4.6mm ID或Kromasil 100 C18 5μm，250mm，4mm ID检测波长 UV 205nm样品注射器温度 4℃柱温度 40℃注射体积 20μl系统类型 梯度系统流速1ml/分钟进行时间 44分钟流动相A缓冲液pH＝5.00±0.05(25mM磷酸钠)B乙腈梯度
end使用 用于色谱法的水(梯度级)的 用于色谱法的乙腈材料 正磷酸，85％超纯(Suprapur)磷酸氢二钠，分析级(＞99.99％)25mM磷酸钠缓冲液，pH＝5.00±0.05(向3.55g Na2HPO4中加水至1000ml。用H3PO4调节pH至PH＝5.00±0.05)样品制备WX-UK1测试溶液用975μl水/乙腈(50∶50 v/v)稀释25μl WX-UK1(40mg/ml)浓缩物。用900μl水/乙腈(50∶50 v/v)稀释100μl该稀释液(浓度为大约0.1mg/ml WX-UK1)。
实施例9用于鉴定WX-UK1制剂的分解产物的HPLC-MS法仪器HPLC设备 Water Alliance和 2695分离组件；条件 2487UV-VIS检测器MS检测器 Micromass ZQ
单个四极MS检测器柱类型Symmetry C18 3.5μm；2.1×100mm检测波长 UV 215nm样品注射器温度4℃柱温度 35℃注射体积 20μl系统类型梯度系统流速0.5ml/分钟进行时间 16分钟流动相ANH4Ac缓冲液/ACN72/25(v/v)BNH4Ac缓冲液/ACN30/70(v/v)C甲醇梯度
end使用用于色谱法的水(梯度级)的 用于色谱法的乙腈(梯度级)材料 甲醇(HPLC梯度级)冰醋酸(超纯)醋酸铵(HPLC级)50mM NH4Ac向3.85g NH4Ac中加水至1000ml。用冰醋酸将pH调节至5。
权利要求
1.一种药物制剂，其包含(i)作为活性物质的脒基-、羟基脒基-、胍基-和/或羟基胍基-苯丙氨酸衍生物，(ii)醇或多元醇或其混合物，和(iii)包含缓冲质的水相。
2.权利要求1的药物制剂，其中所述缓冲质是醋酸盐缓冲质。
3.权利要求2的药物制剂，其中所述缓冲质是醋酸钠缓冲质。
4.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述缓冲质以至多1000mM的浓度存在。
5.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述醇是乙醇。
6.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述多元醇选自甘油、丙二醇和聚乙二醇。
7.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述醇和/或多元醇以相对于整个制剂大约20-60％的量存在。
8.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中组分(ii)包含由多元醇/醇以2∶1至10∶1的混合比例组成的混合物。
9.前述权利要求中任一项的药物制剂，其还包含等渗剂和/或其他助剂或其组合。
10.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述等渗剂选自葡萄糖、核糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、右旋糖、海藻糖、甘油、甘露醇和其混合物。
11.权利要求10的药物制剂，其中所述等渗剂是1％至10％，特别是5％的溶液。
12.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述制剂在室温下具有大约3.5至大约9.0的pH值，优选地大约4.5至大约5.5的pH值。
13.前述权利要求中任一项的药物制剂，其中所述活性物质选自Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-脒基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid、Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-胍基-(D，L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid、其L-对映体和其药学上可接受的盐。
14.前述权利要求中任一项的药物制剂，其包含作为活性物质的Nα-(2，4，6-三异丙基苯基磺酰基)-3-脒基-(L)-苯丙氨酸-4-乙氧基羰基piperazid、其氯化物、硫酸氢盐和/或硫酸盐。
15.前述权利要求中任一项的药物制剂的浓缩物，其中所述活性物质以至多100mg/ml的浓度存在，缓冲质以至多1000mM的浓度存在。
16.权利要求12的浓缩物，其中所述活性物质以至多40mg/ml的浓度存在，缓冲质以至多100mM的浓度存在。
17.前述权利要求中任一项的制剂或浓缩物，其用于防治尿激酶相关疾病。
18.前述权利要求1至16中任一项的制剂或浓缩物，其用于肿瘤防治、肿瘤预防以及防治和/或预防转移形成。
19.前述权利要求1至16中任一项的制剂或浓缩物，其用于防治和/或预防乳腺癌、胰腺癌和/或转移形成。
20.前述权利要求1至16中任一项的制剂或浓缩物，其用于防治和/或预防关节炎、炎症、骨质疏松症、视网膜病例如年龄相关性黄斑变性、在皮肤病寻常天疱疮中防止水疱形成。
21.前述权利要求中任一项的药物制剂或浓缩物的用途，用于通过将所述药物制剂或浓缩物稀释在合适的等渗剂中来制备适合通过注射或输注进行施用的溶液，其中活性物质的最大浓度为至多1mg/ml。
22.权利要求21的用途，其中所述等渗剂是1％至10％的葡萄糖溶液，特别是5％的葡萄糖溶液。
23.权利要求1至16中任一项的药物制剂或浓缩物用于治疗和/或预防肿瘤疾病的用途。
24.权利要求1至16中任一项的药物制剂或浓缩物用于治疗和/或预防转移形成的用途。
25.权利要求1至16中任一项的药物制剂或浓缩物与细胞抑制性和/或细胞毒性试剂组合的用途。
26.通过加入合适量的多元醇或醇或其混合物和合适量的包含缓冲质的水相来稳定药物制剂的方法，所述药物制剂包含作为活性物质的具有脒基、羟基脒基、胍基和/或羟基胍基的化合物。
27.权利要求26的方法，其中使用醋酸盐缓冲质作为缓冲质。
28.权利要求26或27的方法，其中另外加入等渗剂。
29.权利要求26至28中任一项的方法，其中使用脒基-、羟基脒基-、胍基-和/或羟基胍基-苯丙氨酸衍生物作为活性物质。
30.可通过权利要求26至29中任一项的方法获得的稳定的药物制剂。
全文摘要
本发明涉及改良的和稳定的苯丙氨酸衍生物的药物制剂和其作为尿激酶抑制剂的用途，特别是用于治疗恶性肿瘤和肿瘤转移的用途。
文档编号A61K31/18GK1993144SQ200580025625
公开日2007年7月4日 申请日期2005年9月20日 优先权日2004年9月21日
发明者W·斯克玛丽克斯, M·布戈尔, K·克什 申请人:威丽克斯股份公司