肠抑胃肽(gip)抗原阵列及其用途的制作方法

专利名称：：肠抑胃肽(gip)抗原阵列及其用途的制作方法肠抑胃肽(GIP)抗原阵列及其用途发明背景发明领域本发明涉及医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供一种包含病毒样颗粒(VLP)和至少一种抗原的组合物，其中所述抗原是分别与VLP连接的GIP蛋白或GIP片段。本发明也提供一种制备上述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备特别是用于特别通过诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答预防和/或治疗肥胖症的疫苗。而且，本发明的组合物特别可用于在特定环境内有效诱导自身特异性免疫应答。相关4支术葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP,也称为肠抑胃肽)是在进食过程中由排列于肠壁的内分泌K细胞释放的一种胃肠激素。释放到血液中的GIP的量主要取决于进食量，并且主要由摄入的脂肪、葡萄糖或氨基酸的吸收所诱导(Elliott，R.M等人，(1993)，J.Endocrinol.138，159-166，Lardinois,C.K.等人,(1988)，JAmCollNutr,7(3)，241-7)。GIP快速作用于胰P-细胞，刺激胰岛素的释放，从而确保胰岛素介导的葡萄糖向组织内的快速摄入(Dupr6J.等人,(1973)J.Clin.Endocrinol.Metab.37，826-828)。GIP通过结合(3-细胞上表达的一种七跨膜G蛋白偶联受体实现这一效应。一旦被GIP结合，这些受体就激活腺苷酰环化酶和其他信号传导途径，最终导致细胞内Ca"浓度升高和胰岛素胞吐作用(Lu,M.等人，(1993)，Encocrinology133，2861-2870)。除了脂肪和葡萄糖摄入外，碳水化合物的摄取也刺激GIP释放(Elliott，R.M:等人，(1993)，J.Endocrinol.138，159-166)。GIP被认为是肠-胰岛轴的一种主要的肠降血糖素因子。已经描述了抗-GIP抗体阻断了GIP对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的作用(Ebert等人，Endocrinology(1982)111:1601)。而且，也推测GIP直接作用于表达GIP受体的脂肪细胞(Yip等人，Endocrinology(1998)139:4004)。由于它的促胰岛素活性，对使用这种激素作为2型糖尿病的潜在治疗已经非常感兴趣(EP171465，WO03/030946)。而且，最近显示GIP受体敲除小鼠(GIPR-/-)在口服葡萄糖负荷后具有较高的血液葡萄糖水平，而初始胰岛素应答被削弱。尽管在GIPR+Z+小鼠中由于代偿性的较高胰岛素分泌，高脂肪饮食没有增加摄入后的血液葡萄糖水平，但是在GIPR-A小鼠中由于缺乏这种增强，摄入后的血液葡萄糖水平明显增加。因此，这种肠-胰岛轴的缺陷可能对糖尿病的发病机制具有贡献(MiyawakiK.等人，(1999)PNAS96:26,14843-14847)。同一研究小组后来表明，用高脂肪饮食饲养的野生型小鼠表现出GIP分泌过多和极度的内脏和皮下脂肪沉积，以及胰岛素耐受性。相反，用高脂肪饮食饲养的缺乏GIP受体的小鼠(GIPR-Z-)避免了发展肥胖和胰岛素耐受性(MiyawakiK.等人，(2002)NatureMedicine8:7，738-742)。然而，几项研究已经观察到，在啮齿类动物中当用GIP受体拮抗剂急性破坏GIP作用时，在营养物摄入后发生胰岛素分泌减弱和高血糖症(Lewis，J.T.等人(2000)，Endocrinology141，3710-3716;Tseng,C.C.等人(1996)J.Clin.Invest.98，2440-2445)。这提示用GIP受体拮抗剂慢性治疗可导致葡萄糖耐受不良，乃至糖尿病(Kieffer,T.J.(2003),TrendsinPharmacologicalSciencesVol.24No.3,110-112)。发明概述现在，我们惊奇地发现本发明的分别包含GIP蛋白或GIP片段的组合物和疫苗能够诱导强免疫应答，特别是强抗体应答，导致抗自身抗原GIP的高抗体效价。而且，我们惊奇地发现，在预防条件和治疗条件下，在用高脂肪饮食伺养的肥胖小鼠中，本发明的分别包含GIP蛋白或GIP片段的组合物和疫苗能够诱导强免疫应答，特别是强抗体应答。分别与未接受本发明的组合物和疫苗的小鼠相比，分别接受本发明的组合物和疫苗的这些肥胖小鼠的体重增加显著减少。这表明本发明的组合物和疫苗分别产生的免疫应答，特别是抗体，能够在体内特异性地识别GIP并且干扰其功能。而且，由于抗体是大分子，不能有效地渗入实体组织，特别是脂肪组织，因此本发明的组合物和疫苗在抑制脂肪存储的建立上有效是非常令人惊奇的。我们进一步惊奇地发现，本发明的组合物和疫苗尽管在体内干扰GIP功能，特别是保护受体动物不增加体重方面有效，但是不干扰血液葡萄糖、血浆甘油三酯和果糖胺的水平，表明本发明的组合物不导致糖尿病。因此，本发明的组合物和疫苗证明可安全地用于预防或治疗月巴胖症。因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，包含(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种GIP蛋白或至少一种GIP片段，其中(a)和(b)通过第一和第二附着位点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的优选实施方案中，适合在本发明中使用的病毒样颗粒包含病毒，优选RNA噬菌体的重组蛋白，优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含GIP片段。GIP片段用于本发明确保了强的和保护性的免疫应答，特别是抗体应答，同时可以减少自身特异性细胞毒性T细胞应答的可能的诱导，并且可以减少本发明的组合物和疫苗的生产成本。在另一个方面，本发明提供一种疫苗组合物。而且，本发明提供一种给人或动物，优选哺乳动物施用疫苗组合物的方法。本发明的疫苗在没有任何佐剂的情况下能够诱导强免疫应答，特别是抗体应答。因此，在一个优选实施方案中，该疫苗不含任何佐剂。避免使用佐剂可以减少不希望的炎性T细胞应答的可能的发生。在另一方面，本发明提供一种包含本发明的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。在另一个方面，本发明提供一种预防、緩解或有效治疗特别是肥胖症的方法。在另一个方面，本发明提供一种治疗动物，优选家猫或狗，或人的肥胖症的方法，包括给相同的动物或人施用本发明的疫苗和VLP-生长素释放肽疫苗。在本发明的一个优选实施方案中，给同一动物或人同时施用本发明的疫苗和VLP-生长素释放肽疫苗。在另一方面，本发明提供一种预防和治疗肥胖症，优选预防人类肥胖症的方法，包括给相同的人施用本发明的疫苗和VLP-尼古丁疫苗。这是为了优选地抵消戒烟后体重的增加。进一步优选地，是为了抵消戒烟过程中及之后食物4聂入的增加。给相同的动物或人施用两种疫苗可以加成地，或优选协同地提高每种疫苗单独施用时的功效。图1在还原性SDS-PAGE凝胶上显示GIP片段与QPVLP的偶联。泳道M是分子量标记；泳道1是衍生的Q(3单体；泳道2是与Q(3单体偶联的GIP片段1-15GC;泳道3是与Q卩单体偶联的GIP片段31-42GC。对应于每个亚单位偶联一个、两个、三个或四个肽的偶联带用箭头指出。图2显示GIP1-15-GC-Q(3或Q(3-CG-GIP31-42疫苗的功效。如实施例6所详细描述的，给C57BL/6小鼠接种与QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC、鼠CG-GIP31-42或仅仅QPVLP。图2A显示在x轴所示的一段时间里这些小鼠的体重增加，图2B显示这些小鼠在第一次免疫142天后的脂肪组成。发明详述抗原此处所用的术语"抗原"指如果被MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。此处所用的术语"抗原，，也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细力包免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或者连接于Th细胞表位，并且包含于佐剂中。一个抗原可能包含一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应指抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。此处所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。抗原性位点术语"抗原性位点"和术语"抗原性表位"在本文中可以互换使用，是指一种多肽的连续或不连续的部分，它可以被抗体或在MHC分子环境内被T细胞受体免疫特异性地结合。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。抗原性位点在对于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。连接的如此处所用的术语"连接的"(或其名词连接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个分子连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-疏键如硫醚或酰亚胺键。第一附着位点此处所用的短语"第一附着位点，，是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或化学反应基如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是氨基酸如赖氨酸的氨基。第一附着位点一般位于VLP的表面上，优选外表面上。多个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键连接。第二附着位点如此处使用的短语"第二附着位点"是指天然存在于或者人工添加到本发明的GIP上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。本发明的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、焚光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯曱基磺酰氟)、或化学反应基例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基。因此术语"具有至少一个第二附着位点的GIP蛋白"、"具有至少一个第二附着位点的GIP片段"或"具有至少一个第二附着位点的本发明的GIP"是指包含本发明的GIP和至少一个第二附着位点的构建体。但是，特别是对于非天然存在于GIP蛋白或GIP片段内的第二附着位点来说，这种构建体典型且优选地还含有"连接体"。在另一个优选的实施方案，第二附着位点与本发明的GIP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键连接。在另外一个优选的实施方案中，通过氨基酸连接体，优选包含半胱氨酸的连接体，通过蛋白质融合，将第二附着位点人工添加到本发明的GIP上。结合如此处所用的术语"结合"是指这样的结合它可以是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语"结合"比诸如"偶联"、"融合"、"包封"、"包装"和"附着"的术语范围更广，并且包括后面这些术语。例如，典型且优选地，聚阴离子大分子如聚谷氨酸可以被VLP包裹或包装，而典型且优选地不存在实际上的共价结合。外壳蛋白本申请中的术语"外壳蛋白"和可交换使用的术语"衣壳蛋白"是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质。典型且优选地，术语"外壳蛋白"是指由病毒，优选RNA噬菌体的基因组或病毒，优选RNA噬菌体的变体的基因组编码的外壳蛋白。更优选地，例如，术语"AP205的外壳蛋白"是指SEQIDN0:14或其中从SEQIDNO:14上切下第一个甲硫氨酸的氨基酸序列。更优选地，例如，术语"Q(3的外壳蛋白"是指SEQIDNO:l("Q卩CP")和SEQIDNO:2(Al),其在N末端含有或不含甲硫氨酸。噬菌体Q|3的衣壳主要由Q卩CP组成，含有少量Al蛋白。本发明的GIP:如这里所用的术语"本发明的GIP"是指如这里定义的至少一种GIP蛋白或至少一种GIP片段。GIP蛋白如这里所用的术语"GIP蛋白"应当包括4壬何包含或可替代地或优选地由以下GIP组成的多肽SEQIDNO:22的人GIP、SEQIDNO:23的小鼠GIP、SEQIDNO:24的大鼠GIP、SEQIDNO:25的牛GIP、SEQIDNO:26的猪GIP、SEQIDNO:63的猫或狗GIP、或来自任何其他动物的任何直向同源物的相应GIP序列。术语"直向同源物，，是指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，它是来自不同物种的多肽的功能对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。另外，如此处所用的术语"GIP蛋白"应当也包括任何包含或者可替代地或优选地由任何天然或基因工程变体组成的多肽，这些变体与SEQIDNO:22的人GIP、SEQIDNO:23的小鼠GIP、SEQIDNO:24的大鼠GIP、SEQIDNO:25的牛GIP、SEQIDNO:26的猪GIP、SEQIDNO:63的猫或狗GIP、或来自任何其他动物的相应直向同源物具有大于70%，优选大于80%,优选大于85%,甚至更优选大于90%，更优选大于95%,最优选大于97%的氨基酸序列同一性。如此处所用的术语"GIP蛋白"应当还包括翻译后修饰，包括但不限于如上定义的GIP蛋白的糖基化、乙酰化、磷酸化。优选地，如这里定义的GIP蛋白由长度最多为200个氨基酸，更优选最多100个氨基酸，更优选最多50个氨基酸组成。典型且优选地，与VLP连接的GIP蛋白应当能够在体内诱导产生能够特异性结合GIP的抗体，这通过例如ELISA来证实。GIP片段在此使用的术语"GIP片段，，应当包括任何包含或可替代地或优选地由这里定义的GIP蛋白的至少4，5，6，7，8，9,10,11或12个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与它们具有65%以上、优选80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选95%以上氨基酸序列同一性的多肽。优选地，这里使用的术语"GIP片段"应当包括任何包含或可替代地或优选地由这里定义的GIP蛋白的至少6个连续氨基酸组成的多肽，以及任何与它们具有80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选95%以上氨基酸序列同一性的多肽。GIP的优选实施方案包括GIP蛋白的截短或内部缺失形式。典型且优选地，与VLP连接的GIP片段应当能够在体内诱导产生能够特异性结合GIP的抗体。多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序的已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序，优选使用Bestfit确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95%相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5%的同源性缺口。上述测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。连接的如此处所用的术语"连接的"(或其名词连接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，如此处所用的术语"连接"应当不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个，优选一个异双功能交联剂连接。连接体如此处所用的"连接体"将第二附着位点与本发明的GIP连接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或由第二附着位点组成。优选地，如此处所用的"连接体"已经包含第二附着位点，典型且优选地一但不是必需地一为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。如此处所用的"连接体"也被称为"氨基酸连接体"，特别是当本发明的连接体含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语"连接体"和"氨基酸连接体"在此可以交换使用。然而，这并不意味着这种连接体仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的连接体是本发明的一个优选的实施方案。连接体的氨基酸残基优选由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物组成。本发明的连接体的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也包括在本发明中。可用于本发明的其他连接体有包含Cl-C6烷基、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选包含C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分和其他氨基酸的连接体也可以用作本发明的连接体，并且包括在本发明的范围内。连接体与本发明的GIP优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键连接。有序且重复的抗原阵列如此处所用的术语"有序且重复的抗原阵列"通常是指抗原的重复模式，其特征在于典型且优选地，抗原的空间排列具有与病毒样颗粒有关的高度均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。本发明的某些实施方案，例如RNA噬菌体的VLP,是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优选的实例，其具有严格重复的类结晶抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。包装如此处所用的术语"包装，，是指聚阴离子大分子相对于VLP的状态。如此处所用的术语"包装，，包括结合，结合可以是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。该术语也包括聚阴离子大分子的包封或部分包封。因此，聚阴离子大分子可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式。多肽如此处所用的术语"多肽"是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。病毒样颗粒在此使用的术语"病毒样颗粒"是指病毒的形态学形式。在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具有另外的结构(例如被膜、尾等)。在此使用的病毒样颗粒(VLP)涉及一种非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者涉及一种非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒，优选病毒衣壳的结构。这里使用的术语"非复制性"是指不能复制VLP所含的基因组。这里使用的术语"非传染性"是指不能进入宿主细胞。优选地，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因组已经被物理或化学灭活的病毒颗粒。典型且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体，优选RNA噬菌体的病毒衣壳。术语"病毒衣壳"或"衣壳"是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地，有60,l20，180，240，300,360和360个以上的病毒蛋白亚单位。一^l殳且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成具有固有重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述结构一般是球形或管状。RNA噬菌体的病毒样颗粒如此处使用的术语"RNA谨菌体的病毒样颗粒"是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段或者优选基本由其组成或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的基因，一般也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义应当也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，这样也可产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。在本申请的公开内容中，术语"亚单位"和"单体"在上下文中可互换并且等同地使用。一种或一个术语"一种"或"一个"在本申请中使用时，除非另外说明，是指"至少一种(个)"或"一种(个)或一种(个)以上"。在本申请中，如果抗体与抗原结合的结合亲和力(Ka)为106M"或更高，优选1(^m"或更高，更优选1()8m"或更高，最优选109]^1或更高，则该抗体被定义为特异性结合。本领域技术人员可以容易地测定抗体的亲和力(例如通过Scatchard分析)。本发明提供增强动物或人体中对GIP的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，GIP蛋白或GIP片段与VLP连接，形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在本发明的优选实施方案中，至少30个，更优选至少60个，更优选至少120个，进一步更优选至少180个本发明的GIP与VLP连接。可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本发明的VLP。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA或RNA病毒已经在WO2004/009124的第25页第10-21行，第26页的第11-28行，和第28页的第4行到第31页的第4行公开。这些公开的内容在此引入作为参考。病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中产生和纯化。获得的用于疫苗目的的病毒或病毒样颗粒需要不含毒性。可以通过化学和/或物理灭活，例如紫外线照射、甲醛处理，产生无毒性的病毒或病毒样颗粒。或者，可以通过突变或删除遗传操作病毒基因组，使病毒不能复制。在一个优选实施方案中，VLP是一种重组VLP。这里所述的重组VLP是指通过包括至少一个DNA重组技术步骤的方法获得的VLP。几乎所有公知的病毒都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员能够容易地确定编码外壳蛋白的基因。典型地，可以利用标准方法将外壳蛋白基因克隆到表达载体内，并在适合该载体的宿主内表达。被表达的外壳蛋白自装配获得的VLP可以用本领域公知的方法回收并进一步纯化。WO02/056905中已经7>开了实例，在此引入作为参考。用于病毒样颗粒生产的合适的宿主细胞见第29页第37行至第30页第12行；用于将多核苷酸载体导入宿主细胞的方法见第30页第13-27行；作为生产病毒样颗粒的重组宿主细胞的哺乳动物细胞见第30页第28-35行。在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者由选自下组的病毒的重组蛋白、其突变体或片段组成a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich等人，VirusRes.50:141-182(1998))或其表面蛋白(WO92/11291);d)麻渗病毒(Warnes等人，Gene160:173-178(1995));e)辛德毕斯病毒;f)轮状病毒(US5，071，651和US5,374,426);g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine13:1603-1610，(]995));h)诺沃克病毒(Jiang，X.等人，Science250:1580-1583(1990);Matsui,S.M.等人,J.Clin.Invest.87:1456-1461(1991));i)曱病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO96/30523);k)逆转录转座子Ty，优选蛋白pi;1)人乳头瘤病毒(W098/15631》m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和o)禽兽棚病毒。在一个优选实施方案中，VLP包含或者由重组蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列组成。包含或者由一种以上的氨基酸序列组成的VLP在本申请中被称为嵌合VLP。如此处使用的术语"重组蛋白的片段"或术语"外壳蛋白的片段"被定义为分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70%,优选至少80%，更优选至少90%,更优选至少95%，并且优选地保留形成VLP的能力的多肽。优选地，该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。术语"重组蛋白的片段"或术语"外壳蛋白的片段"还包括与以上定义的"重组蛋白的片段，，或"外壳蛋白的片段"分别具有至少80%，优选90%,更优选95%的氨基酸序列同一性并且优选能够装配为病毒样颗粒的多肽。在本发明中可以交换使用的术语"突变重组蛋白，，或术语"重组蛋白突变体"，或者在本发明中可以交换使用的术语"突变外壳蛋白，，或术语"外壳蛋白突变体"，分别是指具有来源于野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽，其中该氨基酸序列与野生型序列至少80%，优选至少85%，90%，95%，97%或99%相同，并且优选地保留装配为VLP的能力。如本领域技术人员应当知道的，通过在大肠杆菌中表达蛋白质，任选地通过凝胶过滤从细胞裂解物中纯化衣壳，并且用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(EM)分析衣壳的形成，可以检测重组蛋白或外壳蛋白的片段或突变体向VLP的装配(Kozlovska，T.M.等人，Gene137:133-37(1993))。免疫扩散试验和EM可以直接用细胞裂解物进行。在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备已经在WO00/32227、WO01/85208和WO02/056905中公开，所有三篇文献在这里都引用以作参考。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在WO01/056905的第34-39页已经公开。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽中，来介导本发明的GIP与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包含、或由SEQIDNO:20的氨基酸1-144、或1-149、1-185组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。这个修饰将SEQIDNO:20改变为SEQIDNO:21。在进一步优选的实施方案中，SEQIDNO:21的第48和IIO位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1-149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含，或由与SEQIDNO:21至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列组成。在本发明的另一个实施方案中，病毒样颗粒是重组曱病毒，更特别的是重组辛德毕斯病毒。甲病毒是正链RNA病毒，它们在感染的细胞的细胞质中完整复制其基因组RNA，而不需要DNA中间体(Strauss,J.和Strauss,E.，Microbiol.Rev.58:491-562(1994))。曱病毒科的几个成员，辛德毕斯病毒(Schlesinger,S.,TrendsBiotechnol.11:18-22(1993))、西门利启森林病毒(SFV)(Liljestrom，P.和Garoff，H"Bio/Technology9:1356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N丄.等人,Virology171:189-204(1989))，在作为多种不同蛋白质的基于病毒的表达载体(Lundstrom，K.,Curr.Opin.Biotechnol.8:578-582(1997))以及作为疫苗研制的候选物方面已经受到极大关注。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。优选地，该RNA噬菌体选自a)噬菌体Q(3;b)谨菌体R17;c)噬菌体fr;d)噬菌体GA;e)噬菌体SP;f)噬菌体MS2;g)噬菌体M11;h)噬菌体MX1;i)噬菌体NL95;k)噬菌体f2;1)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的氨基酸序列:(a)SEQIDNO:l，涉及Q卩CP;(b)SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的混合物(涉及QPAl蛋白)；(c)SEQIDNO:3;(d)SEQIDNO:4;(e)SEQIDNO:5;(f)SEQIDNO:6;(g)SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的混合物；(h)SEQIDNO:8;(i)SEQIDNO:9;(j)SEQIDNO:10;(k)SEQIDNO:ll;(1)SEQIDNO:12;(m)SEQIDNO:13;和(n)SEQIDNO:14。通常，上述外壳蛋白能够装配为VLP，需要或不需要存在N-末端曱硫氨酸。在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含或者由RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列组成。在一个非常优选的实施方案中，VLP包含或者由RNA噬菌体的r;:;种不同的外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有SEQIDNO:l和SEQIDNO:2，或SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的氨基酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体QP、fr、AP205或GA的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。在一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体Q|3的VLP。Q(3的衣壳或病毒样颗粒显示为二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T=3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(GolmohammadiR.等人，Structure4:543-5554(19%))，使QP衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组QP外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。我们惊奇地发现，高至30%的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Q(3的衣壳或VLP的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。根据本发明进一步优选的RNA噬菌体的，特别是QP和fr的病毒样颗粒，已经在WO02/056905中公开，其公开内容在此引用作为参考。特别地，WO02/056905的实施例18给出了由Q(3制备VLP颗粒的详细描述。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205VLP的能够装配的突变形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，导致本发明的其他优选的实施方案。WO2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP,以及特别是其表达和纯化。WO2004/007538在此引入作为参考。AP205VLP具有高度免疫原性，能够与本发明的GIP连接，典型且优选地产生展示以重复方式定向的本发明的GIP的疫苗构建体。产生针对这样展示的本发明的GIP的高抗体效价，这表明连接的本发明的GIP容易与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的VLP包含或者由病毒，优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP包含或者由病毒，优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在一个非常优选的实施方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体QP的突变外壳蛋白，其中已经通过置换或通过删除除去了至少一个或至少两个赖氨酸残基。在一个可替代的非常优选的实施方案中，突变外壳蛋白是RNA噬菌体Q|3的突变外壳蛋白，其中已经通过置换或通过插入添加了至少一个或至少两个赖氨酸残基。在一个进一步优选的实施方案中，RNA嗟菌体QP的突变外壳蛋白具有选自SEQIDNO:15-19中任一个的氨基酸序列。至少一个赖氨酸残基的缺失、置换或添加可以改变偶联程度，即病毒，优选RNA噬菌体的每个VLP亚单位上本发明的GIP的量，特别是，用来匹配和适应疫苗的要求。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.05到4.0的抗原密度。如此处所用的术语"抗原密度"是指VLP，优选RNA噬菌体的VLP的每个亚单位上，优选每个外壳蛋白上连接的本发明200580034234.7说明书第17/60页的GIP的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP，优选RNA噬菌体的VLP的所有亚单位或单体上的平均数。在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由Qf3的外壳蛋白、或其突变体或片段和相应的Al蛋白组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由具有氨基酸序列SEQIDNO:15，16，17，18或19的突变外壳蛋白和相应的Al蛋白组成。在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体QP、AP205、fr或GA的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体Q(3、AP205、fr或GA的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。AP205VLP的能够装配的突变形式，包括在氨基酸5位的脯氨酸被置换成苏氨酸、氨基酸14位的天冬酰胺置换为天冬氨酸的AP205外壳蛋白，也可以用于实施本发明，产生本发明另外的优选实施方案。AP205Pro-5-Thr的克隆和VLP的纯化公开于WO2004/007538中，特别是其实施例1和实施例2中。在此将WO2004/007538，特别是其实施例1和实施例2的公开内容明确地引入作为参考。其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也显示自装配(Kastelein，RA.等人,Gene23:245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.NaukSSSR287:452-455(1986),Adhin，MR.等人，Virology170:238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249:283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，ProteinSci.5:2485-2493(1996),Tars,K等人,J.Mol.Biol.271:759-773(1997))和fr(PushkoP.等人，Prot.Eng.6:883-891(1993),Liljas，L等人.JMol.Biol.244:279-290，(1994))的生物学和生化性质。几种RNA喧菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure4:543-554(1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个24反应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是GIP蛋白或GIP片段。在一个优选实施方案中，该GIP蛋白或GIP片段选自(a)人GIP蛋白或GIP片段；(b)牛GIP蛋白或GIP片段；(c)绵羊GIP蛋白或GIP片段；(d)狗GIP蛋白或GIP片段；(e)猫GIP蛋白或GIP片段；(f)小鼠GIP蛋白或GIP片段；(g)猪GIP蛋白或GIP片段；(h)鸡GIP蛋白或GIP片段；(i)马GIP蛋白或GIP片段；和(g)大鼠GIP蛋白或GIP片段。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是GIP蛋白。在一个进一步优选的实施方案中，所述GIP蛋白包含或者基本由或者由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)SEQIDNO:22;(b)SEQIDNO:23;(c)SEQIDNO:24;(d)SEQIDNO:25;(e)SEQIDNO:26;(f)SEQIDNO:63;(g)来自任何其他动物的GIP相应的直向同源物；和(h)与SEQIDNO:22-26中任一个或与SEQIDNO:63至少80%,或者优选至少85%，更优选至少90%,或者最优选至少95%相同的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，GIP蛋白包含、或者基本由、或者由一种氨基酸序列组成，其中与选自(a)SEQIDNO:22;(b)SEQIDNO:23;(c)SEQIDNO:24;(d)SEQIDNO:25;和(e)SEQIDNO:26的氨基酸序列相比，最多7个，优选6、5、4个，更优选最多3、2、1个氨基酸被删除、插入或置换，优选通过保守置换。在一个优选实施方案中，所述至少一种抗原是GIP片段，其中所述GIP片段包含或者由至少一个抗原性位点组成。测定蛋白质的抗原性位点的方法是本领域技术人员公知的。PCT/EP2005/004980在第26页第1段至第27页第4段已经详述了一些这样的方法，这些具体公开内容在此引入作为参考。应当指出，这些方法通常也适用于其他多肽抗原，因此不限于如PCT/EP2005/004980中公开的IL-23p19。在本发明的一个优选实施方案中，GIP片段包含或者替代地或优选地由这里定义的GIP蛋白的至少5-12个连续氨基酸组成。在一个进一步优选的实施方案中，GIP片段选自GIP的氨基部分。这里使用的GIP的氨基部分是指SEQIDNO:22的GIP的前18个，优选15个氨基酸序列，或来自任何其他动物的相应的直向同源物。在一个优选实施方案中，GIP片4殳包含、或者基本由、或者由以下氨基酸序列组成SEQIDNO:22的氨基酸序列7-10(SEQIDNO:64)，优选4-10(SEQIDNO:67)，优选4-13(SEQIDNO:32),优选1-10(SEQIDNO:29)，优选4-11(SEQIDNO:45)，优选7-15(SEQIDNO:65),更优选4-15(SEQIDNO:66)，甚至更优选1-15(SEQIDNO:27)，或来自任何其他动物的GIP的相应直向同源物。在一个优选实施方案中，GIP片^殳包含、或者基本由、或者由以下氨基酸序列组成SEQIDNO:22的氨基酸序列7-10(SEQIDNO:64)，优选4-10(SEQIDNO:67),优选4-13(SEQIDNO:32),优选1-10(SEQIDNO:29),优选4陽11(SEQIDNO:45)，优选7-15(SEQIDNO:65)，更优选4-15(SEQIDNO:66),甚至更优选1-15(SEQIDNO:27)，或来自任何其他动物的GIP的相应直向同源物，其中7-10序列的一个氨基酸，或者其中4-10、4-13、1-10、4-11、4-15、7-15和1-15氨基酸序列的3个，优选2个，甚至更优选1个氨基酸，已经被突变，优选通过删除、插入和/或置换，更优选通过保守置换突变。如本领域技术人员所理解的，保守置换包括等构置换(isostericsubstitution),该置换中氨基酸的电荷、极性、芳族、脂族或疏水性性质得到保持。典型的保守置换是下组之一内的氨基酸之间的置换Gly，Ala;Val，lie,Leu;Asp,Glu;Asn,Gin;Ser,Thr，Cys;Lys,Arg;Phe和Tyr。在一个进一步优选的实施方案中，GIP片段包含、或者基本由、或者由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)SEQIDNO:27;(b)SEQIDNO:29;(c)SEQIDNO:32;(d)SEQIDNO:45;和(e)与SEQIDNO:27,29,32或45至少80%，或优选至少85%,更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，GIP片段包含、或者基本由、或者由SEQIDNO:22-26或SEQIDNO:63的氨基酸20-23，优选19-25，更优选16-30,或来自任何动物的相应直向同源物的GIP序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，GIP片段包含、或者基本由、或者由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)SEQIDNO:31;(b)SEQIDNO:43;和(e)与SEQIDNO:31或43至少80%,或优选至少85%,更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。在一个进一步优选的实施方案中，GIP片段包含、或者基本由、或者由SEQIDNO:22-26或SEQIDNO:63的氨基酸20-23，优选19-25，更优选16-30，或来自任何动物的相应直向同源物的GIP序列组成，其中20-23序列的一个氨基酸，或者其中19-25，优选16-30氨基酸序列的3个，优选2个，甚至更优选1个氨基酸，已经被突变，优选通过删除、插入和/或置换，更优选通过保守置换突变。在一个优选实施方案中，GIP片段包含、基本由、或由SEQIDNO:22-26或SEQIDNO:63的氨基酸31-34,优选30-34,更优选28-34，更优选30-37，更优选28-37，更优选31-42，更优选28-42或来自任何其他动物的相应直向同源物的GIP序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，GIP片段包含、基本由、或由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)SEQIDNO:28;(b)SEQIDNO:44;(c)SEQIDNO:68;和(d)与SEQIDNO:28,44或68至少80%,或优选至少85%,更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，GIP片孚爻包含、基本由、或由SEQIDNO:22-26或SEQIDNO:63的氨基酸31-34，优选30-34，更优选28-34,更优选26-34，更优选30-37，更优选28-37，更优选26-37，甚至更优选31-42，更优选28-42，更优选26-42，或来自任何其他动物的相应直向同源物的GIP序列组成，其中31-34或30-34序列的一个氨基酸,或其中28-34、30-37、28-37、31-42或28-42序列的优选2个，甚至更优选1个氨基酸已经被突变，优选通过删除、插入和/或置换，更优选通过保守置换突变。在一个优选实施方案中，GIP片段或GIP蛋白进一步包含与如上所述的GIP片段或GIP蛋白融合的亲水性氨基酸段。这里使用的亲水性氨基酸段是指一段氨基酸，其中至少60%,优选至少70%，更优选至少80%,更优选至少90%的氨基酸是亲水性氨基酸。在一个优选实施方案中，所述氨基酸段由最多7个，优选6、5、4个，更优选3个，更优选2个，或1个氨基酸组成。亲水性氨基酸的添加提高了GIP片段或GIP蛋白的溶解度。在一个进一步优选的实施方案中，亲水性氨基酸是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和带电荷的氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，带电荷的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。在一个优选实施方案中，所述氨基酸段包含或者由氨基酸序列DD、KK、RR、DE、ED、EE、KR、RK组成。在一个优选实施方案中，GIP片段包含、基本由、或者由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)在C末端增加了DD或KK的SEQIDNO:22的氨基酸1-12;(b)在C末端增加了DD或KK的SEQIDNO:22的氨基酸1-13;(c)在C末端增加了DD或KK的SEQIDNO:22的氨基酸1-14(SEQIDNO:69和70);(d)在C末端增加了DD或KK的SEQIDNO:22的氨基酸1-15(SEQIDNO:71和72);和(e)在C末端增加了DD或KK的SEQIDNO:22的氨基酸1-11。在一个实施方案中，本发明的至少一种抗原包含至少两个GIP片段，优选两个GIP片段。在一个优选实施方案中，两个GIP片段是两个不同的GIP片段。在一个优选实施方案中，两个GIP片段融合成一个多肽。在一个实施方案中，两个GIP片段直接融合。在另外一个实施方案中，两个GIP片^殳通过间隔序列融合。在本发明的一个优选实施方案中，具有至少一个第一附着位点的VLP与具有至少一个第二附着位点的本发明的GIP通过至少一个肽键连接。编码本发明的GIP，优选GIP片段，更优选不长于50个氨基酸，更优选不到30个氨基酸的片段的基因，符合读框地连接到编码VLP外壳蛋白的基因的内部或优选地N末端或C末端。将本发明的抗原与病毒，优选RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段融合的实施方案已经在WO2004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，在此引入作为参考。融合蛋白优选地保留在表达时装配为VLP的能力，这可以通过电镜检查。可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列赋予额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP亚单位序列时可能的去稳定效应，并且可减少外源表位的存在对装配的干扰。在另一个优选实施方案中，本发明的GIP,优选GIP片段，甚至更优选具有氨基酸序列SEQIDNO:27-32、SEQIDNO:43-45、SEQIDNO:66或68的GIP片段，与RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述融合蛋白还包括间隔区，其中所述间隔区位于AP205的外壳蛋白、其突变体或片段与本发明的GIP之间。在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含或基本由具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒组成，该病毒样颗粒通过至少一个共价键与具有至少一个第二附着位点的至少一个本发明的GIP连接，优选地该共价键是非肽键。在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含，或优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。在本发明另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含或优选是与至少一种抗原连接，优选共价连接的马来酰亚胺基团。在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸的氨基，并且至少一个第二附着位点包含，或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将本发明的GIP与VLP连接。在优选的实施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位点，优选氨基，优选赖氨酸残基的氨基反应的一个官能团，和能够与本发明的GIP固有的或人工添加的优选的第二附着位点，即巯基，优选半胱氨酸残基的巯基反应的另一个官能团，任选地该另一个官能团也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从PierceChemicalCompany获得的，具有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的其它交联剂。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在本发明的GIP与VLP之间引入二碌^建。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含连接体。根据本发明的公开内容，通过连接优选包含适合作为第二附着位点的至少一个氨基酸的连接体，实现向本发明的GIP上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，连接体通过至少一个共价键，优选通过至少一个，通常一个肽键与本发明的GIP连接。优选地，连接体包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，连接体包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸连接体是半胱氨酸残基。连接体的选择取决于本发明的GIP的性质，取决于其生化性质，如pl、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸连接体通常是有利的。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，连接体由氨基酸组成，其中进一步优选地，连接体由最多25个，优选最多20个，更优选最多15个氨基酸组成。连接体的优选实施方案选自(a)CGG或CG/GC;(b)N-端yl连接体(例如CGDKTHTSPP，SEQIDNO:48);(c)N-端y3连接体(例如CGGPKPSTPPGSSGGAP,SEQIDNO:59);(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸连接体(例如GCGGGG,SEQIDNO:49);(f)(G)kC(G)n，其中n=0-12，k=0-5;(g)N-端甘氨酸-丝氨酸连接体((GGGGS)n，n=l-3,具有另外一个半胱氨酸(例如SEQIDNO:50，它相当于其中n=l的实施方案)；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n,其中n=0-3，k=0-5,m=0-10,1=0-2(例如SEQIDN0:51，它相当于其中n=l，k=l,1=1且m=l的实施方案)；(i)GGC;(k)GGC-NH2;(l)C端yl连接体(例如DKTHTSPPCG,SEQIDNO:52);(m)C-端y3连接体(例如PKPSTPPGSSGGAPGGCG，SEQIDNO:53);(n)C-端甘氨酸连4妄体(GGGGCG,SEQIDNO:54);(o)(G)nC(G)k，其中n=0-12,k=0-5;(p)C-端甘氨酸-丝氨酸连接体((SGGGG)n，n=l-3，具有另外一个半胱氨酸(例如SEQIDNO:55，它相当于其中n=l的实施方案)；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n=0-3,k=0-5，m=0-10,1=0-2，o=0-8(例如SEQIDNO:56,它相当于其中n=l,k=l，1=1，o=l且m=l的实施方案)。在一个进一步优选的实施方案中，连接体添加到本发明的GIP的N末端。在本发明的另一个优选实施方案中，接连体添加到本发明的GIP的C末端。本发明优选的连接体是还含有半胱氨酸残基作为第二附着位点的甘氨酸连接体(G)n,如N-末端甘氨酸连接体(GCGGGG)和C-末端甘氨酸连接体(GGGGCG)。进一步优选的实施方案是C-末端甘氨酸-赖氨酸连接体(GGKKGC，SEQIDNO:57)和N-末端甘氨酸-赖氨酸连4妄体(CGKKGG，SEQIDNO:58)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2("NH2"代表酰胺化)连接体或位于其N-末端的CGG。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在的空间位阻。在一个优选实施方案中，连接体序列是GC，优选地，GC连接到GIP蛋白或GIP片段的C末端，优选地连接到SEQIDNO:22-27，29，31-32,43或45。在另外一个优选实施方案中，连接体序列是CG,优选地，CG与GIP蛋白或GIP片段的N末端融合，优选地与SEQIDNO:28，44或68融合。本发明的GIP固有的或添加的作为第二附着位点的半胱氨酸残基，必须是还原状态才能在活化的栽体上与异双功能交联剂反应，也就是说，必须具有游离半胱氨酸，或具有游离巯基的半胱氨酸残基。根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接本发明的GIP与VLP，使得本发明的GIP以定向方式与VLP偶联。连接本发明的GIP和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联本发明的GIP和VLP的方法。本发明的GIP也可以首先通过反应，例如与SATA、SATP或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在去保护之后，本发明的GIP可以和VLP如下所述偶联。在分离过量的石危醇化试剂之后，本发明的GIP与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的本发明的GIP能够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(PierceChemicalCompany,Rockford，IL,USA)或含有对VLP的胺基或羧基有反应性的官能团的其它已知同型双功能交联剂，使本发明的GIP与VLP连接。在一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是巯基，更优选天然存在的或人工添加到包含于VLP中或者基本组成VLP的外壳蛋白上的半胱氨酸的巯基。第二附着位点是连接体如MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[|3-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸)的马来酰亚胺基，它与抗原化学结合，优选地与抗原共价结合，更优选地与抗原的氨基共价结合，更优选地通过连接体的NHS-酯基与抗原的N-末端氨基酸的氨基共价结合。在一个优选实施方案中，优选地化学合成至少一种抗原，优选不超过50个，更优选不超过30个氨基酸，甚至更优选SEQIDNO:22-27,29，31-32,43或45的GIP蛋白或GIP片段，并且马来酰亚胺基优选地与N-末端氨基酸的氨基连接。第一附着位点和第二附着位点通过;危醚4建连才妄。在一个替代的优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选天然存在或人工添加到被VLP包含或基本组成VLP的外壳蛋白上的赖氨酸的氨基。第二附着位点是上述段落中详述的连接体的马来酰亚胺基。VLP的氨基用诸如N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸(SATA)或2-亚氨硫醇的异双功能交联剂衍生化为巯基，该巯基对于连接体的马来酰亚胺基具有反应性。含有至少一个马来酰亚胺基的优选的连接体是，例如SMPH、Sulfo画MBS。其他优选的连接体有Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其他例如可从PierceChemicalCompany获得，并且含有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的交联剂。在本发明的其他实施方案中，所述组合物包含或者基本由通过化学相互作用连接到本发明的GIP的病毒样颗粒组成，其中这些化学相互作用中的至少一个不是共价4建。例如，VLP与本发明的GIP的连接可以通过将VLP生物素化并将本发明的GIP表达为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白而实现。其他结合对，如配体-受体、抗原-抗体，也可以按照与生物素-抗生物素蛋白相似的方式用作偶联试剂。US5,698,424描述了一种能够形成衣壳的修饰的噬菌体MS-2外壳蛋白，其中通过向N端发夹区中插入半胱氨酸残基，以及通过将位于N端发夹区外部的每一个半胱氨酸残基置换为非半胱氨酸氨基酸残基，修饰了该外壳蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接连接到欲呈递的期望的分子种类如表位或抗原性蛋白质上。然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可导致衣壳通过形成二硫键而寡聚化。而且，衣壳和抗原性蛋白质之间通过二硫键的连接是不稳定的，特别是对于含有巯基部分的分子不稳定，而且，在血清中例如比石克醚连接的稳定性差(MartinFJ.和PapahadjopoulosD.(1982)IrreversibleCouplingofImmunoglobulinfragmentstoPreformedVesicles.J.Biol.Chem.257:286-288)。因此，在另一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原的连接不包括二硫键。进一步优选的，所述至少一个第二附着位点包含，或优选地是巯基。而且，在本发明一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原的连接不包括硫-硫键。在另一个非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或者不包含半胱氨酸的巯基。在另一个非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含巯基。在本发明的一个优选实施方案中，VLP在宿主中重组产生，并且其中VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸，或者其中VLP基本不含宿主DNA,优选宿主核酸。在一个优选实施方案中，RNA噬菌体的VLP在宿主中重组产生，并且其中RNA噬菌体的VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合，优选包装或包裹于VLP内部的聚阴离子大分子。在一个更优选的实施方案中，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。在一个优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。减少或除去宿主RNA，优选宿主核酸的量，能使不希望的T细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答和其他不希望的副作用，如发热，降至最小或者减少，而同时保持对GIP特异性的强抗体应答。基本不含宿主RNA(或DNA)，优选宿主核酸如此处所用的术语"基本不含宿主RNA(或DNA)，优选宿主核酸"是指VLP所含的宿主RNA(或DNA)，优选宿主核酸的量，其典型且优选地为每mgVLP不到3(Hig，优选不到20(ig，更优选不到10ng,甚至更优选不到8pg，甚至更优选不到6pg,甚至更优选不到4pg,最优选不到2)ig。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主。测定RNA(或DNA)，优选核酸的量的常规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA，优选核酸的量的典型且优选的方法在同一受让人于2005年10月5日提交的PCT/EP2005/055009的实施例17中描述。对于含有QP以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA(或DNA)，优选核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。如此处所用的术语"聚阴离子大分子"是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量分子的单位的多个重复。在一个方面，本发明提供一种含有本发明的组合物的疫苗组合物。在一个优选实施方案中，该疫苗组合物中与VLP连接的本发明的GIP来源于动物，优选哺乳动物或人。在进一步优选的实施方案中，本发明的GIP来源于人、牛、鸡、狗、猫、小鼠、大鼠、猪或马。在一个优选实施方案中，该疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。在此使用的术语"佐剂"是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生一种储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物结合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。例子包括弗氏完全和不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其它佐剂包括无机矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔械血蓝蛋白、二硝基酚，以及潜在的可用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)牙口小才奉;]犬才干菌(Cor;;we6aCen'ww;arvwm)。这些佐剂在本4页i或公杀口。能够与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂免疫调节剂、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如此。而且，不含佐剂使得不希望的炎性T细胞应答的发生减至最少，这是针对自身抗原接种中的一个安全性问题。因此，优选地给患者施用本发明的疫苗组合物而不需在施用该疫苗之前、同时或之后给同一名患者施用至少一种佐剂。在另外一个方面，本发明提供一种组合物在制备治疗人类的GIP相关疾病，特别是肥胖症的药物中的应用，该组合物含有(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种非人的，优选非人脊推动物的本发明的GIP,其中(a)和(b)通过至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接。包含至少一种本发明的非人GIP，如本发明的猫、犬、牛、大鼠或小鼠GIP的这些优选实施方案能够诱导识别人GIP的交叉反应性抗体应答。本发明进一步公开了一种免疫方法，包括给动物或人施用本发明的疫苗。动物优选的是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、狗、大鼠、小鼠，特别是狗和猫，优选家猫。疫苗可以用本领域所知的各种方法给动物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为该疫苗是"药学可接受的"。进而，本发明的疫苗将以"治疗有效量，，(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发明的疫苗可以诱导结合GIP,因而减少其浓度和/或干扰其生理学或病理学功能的抗体。在另一个方面，本发明提供一种包含本发明所述组合物和可接受的药物载体的药物组合物。当给个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、緩沖液、佐剂或其他改善偶联物的效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资料中提供，包括REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(Osol,A，ed，MackPublishingCo,(1990))。在另一方面，本发明提供制备本发明的组合物或本发明的疫苗组合物或本发明的药物组合物的方法，其中该方法包括(a)提供具有至少一个附着位点的VLP;(b)提供至少一种抗原，其中所述抗原是GIP蛋白或GIP片段，具有至少一个第二附着位点；和(c)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接所述VLP和所述至少一种抗原，产生所述组合物。在一个进一步优选的实施方案中，提供具有至少一个附着位点的VLP的步骤进一步包括以下步骤(a)将所述病毒样颗粒解装配为所述病毒，优选RNA噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)将所述纯化的所述病毒，优选RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA(或DNA),优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子，优选聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸的存在下实现。在另一方面，本发明提供可用于预防、治疗和/或緩解其中GIP发挥重要病理学作用的疾病或病症，特别是肥胖症的组合物。另一方面，本发明提供一种包含至少一种第一组合物和至少一种第二组合物的药盒，其中所述第一组合物包含(a)具有至少一个第一附着位点的第一病毒样颗粒(VLP);(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接；并且其中所述第二组合物包含(c)具有至少一个第一附着位点的第二病毒样颗粒(VLP);(d)具有至少一个第二附着位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原包含或者是选自以下的分子(i)生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(ii)尼古丁、可替宁或降烟碱；和(iii)第二GIP蛋白或第二GIP片段，其中所述第二GIP蛋白或第二GIP片段与第一组合物包含的第一GIP蛋白或GIP片段不同；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在一个优选实施方案中，第一组合物是本发明的组合物，第一病毒样颗粒是本发明的病毒样颗粒，第一抗原是本发明的GIP。同样，第二病毒样颗粒是本发明的病毒样颗粒。因此，第一组合物、第一病毒样颗粒和第一抗原的特征、优选实施方案、制备和用途已经在本发明中全部描述和定义。在一个优选实施方案中，第一VLP和第二VLP不同。在一个优选实施方案中，第一VLP和第二VLP相同。在本发明的一个优选实施方案中，第一和/或第二病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中优选地所述RNA噬菌体是RNA噬菌体Q(3、fr、GA或AP205。在一个优选实施方案中，第一病毒样颗粒和/或第二病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体的重组蛋白、其突变体或片段组成，其中优选地所述RNA噬菌体是RNA噬菌体Q(3、fr、GA或AP205。在一个进一步优选的实施方案中，第一和第二VLP都是RNA噬菌体，优选RNA噬菌体QP的VLP。在一个优选实施方案中，病毒，优选RNA噬菌体的第一和/或第二VLP在宿主中重组产生，并且第一和/或第二VLP基本不含宿主RNA，优选基本不含宿主核酸。在一个优选实施方案中，生长素释放肽或生长素释放肽的肽选自(a)人生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(b)狗生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(c)猫生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(d)牛生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(e)猪生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(f)绵羊生长素释放肽或生长素释放肽的肽；和(g)小鼠生长素释放肽或生长素释放肽的肽。在一个进一步优选的实施方案中，生长素释放肽或生长素释放肽的肽包含、或者基本由、或者由选自以下序列的氨基酸序列组成(a)SEQIDNO:33;(b)SEQIDNO:35;(c)SEQIDNO:40;(d)SEQIDNO:36;(e)SEQIDNO:37;(f)SEQIDNO:38;(g)SEQIDNO:46(GSSFLSPEHQKLQ);和(h)SEQIDNO:47(GSSFLSPEHQKVQ)。其中所述至少一种第二抗原是生长素释放肽或生长素释放肽的肽的第二组合物的一个优选实施方案的制备和应用已经在专利申请WO2004/009124和W02005/068639中公开，这两个专利申请的全部内容在此引用作为参考。本发明的第二组合物的另外一些优选实施方案在WO2004/009124的权利要求书中，特别是在WO2004/009124的权利要求1-31中，以及WO2005/068639的权利要求书中，特别是权利要求1-29中明确限定，均在此引用作为参考。其中所述至少一种第二抗原包含或者是尼古丁、可替宁或降烟碱的第二组合物的另一个优选实施方案的制备和应用已经在本受让人提交的专利申请WO2004/009116中公开。该专利申请的内容在此引用作为参考。本发明的第二组合物的另外一些优选的实施方案在WO2004/009116的权利要求书中，特别是WO2004/009116的权利要求l-50中明确限定，在此引用作为参考。在一个优选实施方案中，至少一种第二抗原由选自下组的材料构成(a)6-(羧曱基脲基H士)-尼古丁(CMUNic);(b)反式-3'-氨曱基尼古丁琥珀酸酯；(c)0-琥珀酰-3'-羟曱基-尼古丁；(d)反式-4'-羧基可替宁；(e)N-[l-氧代-6-[(25)-2-(3-吡啶基)-l-吡咯烷基]己基]-(3-丙氨酸；(f)4-氧代-4-[[6-[(5S)-2-氧代-5-(3-吡啶基)-l-吡咯烷基]]己基]氨基]-丁酸；(g)(2S)-2-(3-吡啶基)-l-吡咯烷丁酸苯曱酯；(h)(2R)-2-(3-吡啶基)-l-吡咯烷丁酸苯曱酯；(i)可替宁4，-羧酸、N-琥珀酰-6-氨基-(士)-尼古丁；(j)6-(o-氨基癸酰胺基)-(士)-尼古丁；(k)6-(o-氨基癸酰胺基)-(士)-尼古丁；(1)3，-氨甲基尼古丁；(m)4，-氨曱基尼古丁；(n)5'-氨曱基尼古丁；(o)5-氨基尼古丁；(p)6-氨基尼古丁；(q)S-l-(b-氨乙基)尼古丁氯化物；(r)S-l-(b-氨乙基)可替宁氯化物；和(s)N-琥珀酰-6-氨基-(±)-尼古丁。在一个进一步优选的实施方案中，第二组合物包含0-琥珀酰-3'-羟甲基-尼古丁。在一个进一步优选的实施方案中，第二组合物包含0-琥珀酰-反式-3'-羟甲基-尼古丁。在一个进一步优选的实施方案中，第二组合物包含的0-琥珀酰-3'-羟甲基-尼古丁与RNA噬菌体的病毒样颗粒，优选与QP病毒样颗粒偶联，因此优选与包含或者优选由RNA噬菌体QP的外壳蛋白组成的病毒样颗粒偶联。在一个优选的实施方案中，至少一种第二抗原包含或者是O-琥珀酰-3'-羟曱基-尼古丁。在一个进一步优选的实施方案中，第二抗原包含或者优选是0-琥珀酰-反式-3'-羟甲基-尼古丁。在一个优选实施方案中，第二抗原包含或者优选是反式-3'-羟甲基-尼古丁。在一个优选实施方案中，第二组合物包含的第二附着位点含有，或者优选的是选自以下基团的活性基团(a)胺；(b)酰胺；(c)羧基；(d)羰基；(e)巯基；(f)羟基；(g)醛；(h)重氮基；(i)脂环基卤化物；(j)肼；(k)乙烯基；(1)马来酰亚胺；(m)琥珀酰亚胺；和(n)酰肼。在一个优选实施方案中，第一附着位点通过至少一个，优选一个共价鍵与第二附着位点的连接通过所述0-琥珀酰-3'-羟甲基-尼古丁的O-琥珀酰部分与第一附着位点反应而形成。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点通过至少一个，优选一个共价键与第二附着位点的所述连接通过酰胺键形成。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点包含或者优选的是氨基，优选赖氨酸的氨基。在一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点包含，或者优选的是羧基。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点通过至少一个，优选一个共价键与第二附着位点的连接通过所述0-琥珀酰-3'-羟曱基-尼古丁的O-琥珀酰部分与作为第一附着位点的赖氨酸残基的氨基反应而形成。第二组合物优选地由琥珀酸单-(l-曱基-2-吡咬-3-基-吡咯烷-3-基曱基)酯通过琥珀酸的羧基与RNA噬菌体的氨基，优选RNA谨菌体的赖氨酸的氨基反应而形成。进行该反应的一个优选方法是用碳二亚胺，优选EDC，甚至更优选DCC，活化羧基。被活化的羧基或者直接共价连接到RNA噬菌体上，或者通过添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯被转化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS酯或者在与被活化的羧基反应后直接使用，或者先分离，随后与RNA噬菌体反应。用来活化羧基的可替代的试剂包括脲盐，如HATU(2-(7-氮-lH-苯并三唑-l-基)-l,l，3,3-四甲基脲六氟磷酸)或HBTUO(lH-苯并三唑-1-基)-1,1，3，3-四曱基脲六氟磷酸)。琥珀酸单-(l-曱基-2-吡啶-3-基-吡咯烷-3-基曱基)酯将被HATU或HBTA活化，并且相应的活化羧基直4妄与胺反应。在一个优选实施方案中，至少一种第二抗原是GIP蛋白或GIP片段，其中该第二GIP蛋白或GIP片段与第一组合物包含的第一GIP蛋白或GIP片段不同。在一个优选实施方案中，第二GIP蛋白或GIP片段包含或由一种氨基酸序列组成，该氨基酸序列与包含于或组成第一GIP蛋白或GIP片段的相同氨基酸序列具有不同的化学修饰。在一个优选实施方案中，第二GIP蛋白或GIP片段包含或由一种氨基酸序列组成，该氨基酸序列与包含于或组成第一GIP蛋白或GIP片段的氨基酸序列不同。在一个优选实施方案中，第二GIP蛋白或GIP片^殳包含或由与包含于或组成第一GIP蛋白或GIP片段的抗原性位点相比至少一个不同的抗原性位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，第二GIP蛋白或GIP片段包含或由与包含于或组成第一GIP蛋白或GIP片段的抗原性位点相比不同的抗原性位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，第一GIP片段包含或由来自GIP的氨基部分的至少一个抗原性位点组成，第二GIP片段包含或由来自GIP羧基部分的至少一个抗原性位点组成。GIP的羧基部分是指SEQIDNO:22-26或SEQIDNO:63的最后18个，优选15个氨基酸。在一个优选实施方案中，第一GIP片段包含或由SEQIDNO:27的氨基酸序列组成，第二个第一GIP片段包含或由SEQIDNO:28的氨基酸序列组成。不同GIP蛋白或GIP片段的特征、优选实施方案、制备和应用均在本发明中描述和限定。200580034234.7说明书第35/60页在一个优选实施方案中，第二GIP片段包含的氨基酸序列选自(a)SEQIDNO:27;(b)SEQIDNO:29;(c)SEQIDNO:32;(d)SEQIDNO:45;(e)SEQIDNO:28;(!)SEQIDNO:31;(g)SEQIDNO:44;(h)SEQIDNO:68;和(i)与SEQIDNO:27-29,31,32,44，68或45至少80%,优选至少85%，更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。除了第一组合物和第二组合物包含的抗原差异以外，第二组合物的特征和优选实施方案、制备和应用与对于本发明的第一组合物所述和定义的基本相同。在另一方面，本发明提供一种治疗和/或预防动物或人的肥胖症的方法，包括给相同的动物，优选家猫或狗，或人施用药盒中的至少一种第一组合物和至少一种第二组合物。给动物或人施用第二组合物优选在给相同动物或人施用第一组合物之前、同时或之后进^f亍。在一个优选实施方案中，优选地以不超过2周的间隔，优选不超过一周的间隔，更优选不超过三天的间隔，甚至更优选不超过24小时的间隔，给相同患者施用两种组合物。在一个进一步优选的实施方案中，同时给相同的动物或人施用两种组合物。如这里使用的同时是指将两种组合物混合然后给一个动物或人注射，或接连地给相同的动物或人施用两种组合物。这里所用的接连地是指分开但在不超过4小时间隔内，优选不超过2小时，甚至更优选不超过l小时，甚至更优选不超过半小时，再优选不超过IO分钟间隔内，给相同动物或人施用两种组合物。在又一个优选实施方案中，所述第一组合物和所述第二组合物通过相同途径施用，并且其中优选地所述途径为皮下途径。在一个优选实施方案中，第一组合物和第二组合物同时施用。另一方面，本发明提供一种治疗和/或预防动物或人的肥胖症的方法，包括给相同的动物或人施用本发明的疫苗和VLP-生长素释放肽疫苗、VLP-尼古丁疫苗或VLP-第二GIP蛋白或第二GIP片段疫苗。"VLP-生长素释放肽疫苗"包括本发明的第二组合物，其中至少一种抗42原是生长素释放肽或生长素释放肽的肽。在一个优选实施方案中，"VLP-生长素释放肽疫苗"还包括至少一种佐剂。此外，"VLP-尼古丁疫苗"包括本发明的第二组合物，其中至少一种抗原包括尼古丁、可替宁或降烟石威。在一个优选实施方案中，"VLP-第二GIP蛋白或第二GIP片段疫苗"包含本发明的第二组合物，其中至少一种抗原包含或者是第二GIP蛋白或GIP片段，并且其中第二GIP蛋白或GIP片段与第一GIP蛋白或GIP片段不同。为了简便起见，在下文中将本发明的疫苗和VLP-生长素释放肽或VLP-尼古丁或VLP-第二GIP蛋白或第二GIP片段疫苗称为"两种疫苗"。纟会动物或人施用VLP-生长素释》t肽、VLP-尼古丁疫苗或VLP-疫苗之前、同时或之后进行。在一个优选实施方案中，至少一种抗原是GIP蛋白或GIP片段。与只施用一种疫苗相比，给相同的动物或人施用两种疫苗可以加成地，或者优选协同地提高功效。在一个优选实施方案中，包括至少一种第一组合物和至少一种第二组合物分离地放置在药盒中。在另外一个实施方案中，至少一种第一组合物和至少一种第二组合物混合并作为混合物放置在药盒中。因此，在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含(a)至少一种第一病毒样颗粒(VLP)和至少一种第二病毒样颗粒(VLP),均具有至少一个第一附着位点；和(b)至少一种第一抗原和至少一种第二抗原，均具有至少一个第二附着位点，其中所述至少一种第一抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且所述至少一种第二抗原包含或者是选自下组的分子(i)生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(ii)尼古丁、可替宁或降烟碱；和(iii)第二GIP蛋白或第二GIP片段，其中所述第二GIP蛋白或第二GIP片段与第一GIP蛋白或GIP片段不同，并且其中所述至少一种第一病毒样颗粒(VLP)和所述至少一种第一抗原通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述至少一种第二病毒样颗粒(VLP)和所述至少一种第二抗原通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。因此，本发明提供一种包含所述组合物的疫苗组合物。该疫苗组合物还可包含至少一种佐剂。优选地，该疫苗组合物不含佐剂。本发明进一步提供一种免疫方法，包括给动物，优选狗或猫，优选家猫，或人施用所述疫苗组合物。另外，本发明提供一种治疗和/或预防肥胖症的方法，包括给动物，优选家猫或狗或人施用所述疫苗组合物。另外，本发明提供一种包含所述组合物和可接受的药物载体的药物组合物。实施例在该实施例部分使用的术语"现有技术VLP"以及更具体的术语"现有技术QPVLP"、"现有技术AP205VLP"等，是指如WO02/056905、WO04/007538所述，通过从大肠杆菌中重组表达及随后纯化而获得的VLP。实施例1化学合成GIP片段1-15、1-10、4-13、16-30、28-42、31-42和GIP蛋白1-42按照标准程序化学合成小鼠GIP片段1-15、1-10、4-13、16-30和31-42,这些片段包含与GIP片段的N或C末端融合的GC或CG连接序列(SEQIDNO:27、29、32、43、44)。按照标准程序化学合成包含与C末端融合的GC连接序列的GIP蛋白1-42(SEQIDNO:30)和包含与N末端融合的CG连接体的GIP片段28-42。为了提高与现有技术QPVLP偶联的N末端GIP片段的溶解度，可以置换特定GIP片段内的疏水性氨基酸残基。添加极性、亲水性带电荷的氨基酸，如赖氨酸(lys)和天冬氨酸(asp)，或用它们来代替原来的GIP残基。按照标准程序化学合成包含与GIP片段C末端融合的DDC连接序列的GIP片段1-14，或包含与GIP片段C末端融合的KKC连接序列的GIP片段1-14。实施例2GIP1-15-GC、GIP1-10-GC、GIP4-13-GC和CG-GIP-31隱42与现有技术Q(3、fr或HBcAgVLP的偶联2ml2.0mg/ml现有技术Q[3VLP在20mMHepes，150mMNaClpH7.2中的溶液与SMPH(Pierce)溶液(来自溶于DMSO中的50mM贮存溶液)于25。C反应30分钟。反应溶液随后用2L20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2于4。C透析两次2小时。然后用透析后的衍生化QPVLP偶联鼠GIP1-15-GC(SEQIDNo:60)、GIP1-10-GC(SEQIDNO:61)、GIP4-13-GC(SEQIDNo62)或鼠CG-GIP31-42肽。简要地说，lml衍生化的Q(3VLP(浓度为2mg/ml)与286^110mM肽溶液在20mMHepes,150mMNaCl，pH7.2中20°C反应2小时。偶联反应物然后以13000rpm离心5分钟，收集上清液，并用2L20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2于4。C透析1次2小时，然后透析过夜。使用12%Nu-PAGE凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE评价GIP肽1-15和31-42与QPVLP的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明出现了分子量相当于与Qp共价连接的GIP肽的预测分子量的带(图1)。对应于每个亚单位偶联一个、两个、三个或四个肽的偶联带用箭头指示。与单独的衍生化QPVLP相比这些其他带的出现证明GIPCG-l-15和GIP31-42-GC与QPVLP共价偶联。通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE的光密度分析估计偶联效率[即摩尔QP-GIP/摩尔Q(3单体(总计)],为每个QP单体1.8-2.3个GIP片段。对于与QPVLP共价偶联的GIPCG-1-10和GIP4-13-GC获得类似的偶联效率(数据未显示)。GIP片段与frVLP的偶联1ml衍生化的frVLP(浓度为2mg/ml)与286^110mMGIP1-15-GC、GIP1-10-GC、GIP4-13-GC或CG-GIP-31-42在20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2中20。C反应2小时。偶联反应物然后以13000rpm离心5分钟，收集上清液，并用2L20mMHepes，150mMNaCl，pH7.2于4。C透析1次2小时，然后透析过夜。GIP片段与HBcAgl-185-Lys的偶联HBcAgl-185-Lys的构建、其表达和纯化基本在WO03/040164的实施例2-5中描述。1ml书t生化的HBcAgl-185-LysVLP(浓度为2mg/ml)与286jal10mMGIP1-15画GC、GIPl-10-GC、GIP4-13-GC或CG-GIP-31-42在20mMHepes,150mMNaCl,pH7.2中20。C反应2小时。偶联反应物然后以13000rpm离心5分钟，收集上清液，并用2L20mMHepes，150mMNaCl，pH7.2于4。C透析1次2小时，然后透析过夜。实施例3GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIPl-14-KKC、GIP1誦14-DDC和GIPl-42-GC与现有技术Q(3VLP的偶联2ml2.0mg/mlQf3VLP在20mMHepes,150mMNaClpH7.2中的溶液与114.4^1SMPH(Pierce)溶液(来自溶于DMSO中的50mM存溶液)于25。C反应30分钟。反应溶液随后用2L20mMHepes，150mMNaCl，pH7.2于4。C透析两次2小时。然后用透析后的衍生化QPVLP偶联鼠GIP蛋白(SEQIDNO:30)、鼠CG-GIP28-42、鼠GIP16-30-GC、GIP1-14-KKC或GIPl-14-DDC。简要地说，1ml衍生化的Q|3VLP(浓度为2mg/ml)与286jli110mM肽溶液在20mMHepes，150mMNaCl，pH7.2中20。C反应2小时。偶联反应物然后以13OOOrpm离心5分钟，收集上清液，并用2L20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2于4。C透析1次2小时，然后透析过夜。然后使用12%Nu-PAGE(Invitrogen)凝胶通过SDS-PAGE分析偶联产物。然后通过考马斯亮蓝染色凝胶显示偶联产物。实施例4用与现有技术Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC、GIPl-10-GC、GIP4画13-GC或CG-GIP31-42免疫小鼠给成年雄性C57BL/6小鼠(每组5只)接种与现有技术Q(3VLP偶联的鼠GIPl-15-GC、鼠GIPl-10-GC、鼠GIP4-13-GC或鼠CG-GIP31-42(在实施例2中获得)。来自每一样品的100pg透析后的疫苗在PBS中稀释为200fil的体积，于第0、14、28、42天皮下注射(100|ul，腹部两侧)。疫苗施用时不加佐剂。作为对照，一组小鼠注射PBS或VLPQP。小鼠在第0、15、28、43、56、71、91、105天眼眶后放血，如实施例5所述通过ELISA分析其血清。表1显示GIP1-15-特异性、GIP1-10-特异性或GIP31-42-特异性抗体的平均效价。结果显示每组IO只小鼠的平均值。ELISA效价表示为在ELISA测定中达到半数最大OD的血清稀释度。在用GIP1-15-GC-Q(3、GIPl-10-GC-QP或Q(3-CG-GIP31-42免疫的小鼠中，到第56天分别达到大约1:300000，1:330000和1:82000的平均效价(表1)。用GIP4-13-GC-QP免疫的小鼠的GIP特异性效价比GIP1-15-特异性效价大约低10倍(数据未显示)。免疫前血清或来自注射PBS或Qf3VLP的小鼠的血清对任一种GIP肽都不显示任何反应性。半数最大OD值低于100，这被认为低于该试验的截止值。这清楚地证明，GIP-VLP偶联物能够诱导抗GIP片段的高抗体效价，尽管GIP片段是自身蛋白。测定的抗与RNAse偶联的GIP片段的抗体效价类似于用GIP蛋白获得的抗体效价(数据未显示)。这表明用GIP片段产生的抗体能够识别GIP蛋白。说明书第41/60页表1第0、14、28、42天分别用GIPl-15-GC-QP、GIPl-10-GC-Q(3或QP-CG-GIP31-42免疫的小鼠中的平均抗GIP特异性IgG抗体效价(表示为稀释倍数)<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>实施例5GIP-特异性和生长素释放肽-特异性抗体的ELISA检测首先，如下段所述，将鼠GIP1-15-GC或鼠GC-GIP31-42与RNase(SIGMA)-SPDP(SIGMA)偶联。5mg/mlRNase和0.2mMSPDP(终浓度)在室温下温育1小时。RNase-SPDP溶液用PD10柱(Amersham)纯化。纯化后，将10mMEDTA和lmM肽加入到RNase-SPDP溶液中。通过测定343nm下的OD值确定偶联效率。ELISA板(96孑LMAXIsorp)用在包被緩沖液(O.lMNaHC03，pH9.6)中浓度为10fag/ml的RNase-偶联的鼠GIP1-15-GC或鼠CG-GIP31-42于4°C包被过夜。或者，ELISA板用2.5jig/ml猪GIP蛋白(Bachem)包被。用洗涤緩冲液(PBS-0.05。/。Tween)洗板后，ELISA板用封闭緩沖液(2%BSA-PBS-Tween20溶液)在37°C封闭2小时，然后再次洗涤，与系列稀释的小鼠血清一起温育。作为对照，也检测相同小鼠的免疫前血清。ELISA板在室温下温育2小时。进一步洗涤后，用HRPO-标记的Fc特异性山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测结合的抗体，室温温育1小时。进一步洗涤后，ELISA板用OPD溶液(l片OPD片，25nlOPD緩沖液和8|1111202)显色6分钟，用5%H2S04溶液终止反应。用ELISA读板器(BioradBenchmark)在450nm处读板。ELISA效价表示为在ELISA测定中达到半数最大OD的血清稀释度。为了测定用与Q|3VLP偶联的生长素释放肽24-31GC免疫的小鼠血清中的生长素释放肽-特异性抗体，使用类似于以上所述的一种方法。唯一的不同是ELISA板用20pg/m生长素释放肽蛋白(Bachem)包被。实施例6与现有技术QPVLP偶联的GIP1-15-GC-Q(3、GIP1-10-GC-QP或QP-CG-GIP31-42在饮食诱导的肥胖动物模型中的有效性实验如实施例4所述给具有相当的初始体重(22,7-23.1g)的成年雄性C57BL/6小鼠(每组5只)接种实施例2获得的与QPVLP偶联的鼠GIP1-15-GC、GIP1-10-GC或鼠CG-GIP3卜42。作为对照，给小鼠注射QPVLP。所有小鼠都在第一次注射后给予高脂肪饮食(35%重量的脂肪，60%作为能量)，以促使其发展饮食诱导的肥胖症。食物和水随意给予。在第一次注射后大约4个月的时期内以定期监测每只动物的体重。如图2A所示，用与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠在实验过程中比注射QPVLP的对照小鼠的体重增加减少。实际上，第一次免疫后112天，对照动物的体重增加了大约110%，而GIPl-15-GC-Q(3和GC-GIP31-42-QpVLP免疫的小鼠的体重只分别增加了80°/。和82%。因此，两个4妄种組与对照组相比表现明显减少的体重增加。使用GIP-1-10-GC-Q(3获得的结果(数据未显示)与使用GIP-1-I5-GC-QPVLP荻得的结果相当。为了进一步评价针对GIP接种的效果，通过双能X射线吸收仪扫描(DEXA)测量体脂肪量的改变。DEXA分析用超高分辨率的PIXIMUS系列光密度计(0.18x0.18mm像素，GEMedicalSystems)进行。第一次注射后142天，进行DEXA分析。与QPVLP对照动物相比，用与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠显示体脂肪量分别减少大约26%和22%(图2B)。用与Q(3VLP偶联的GIPl-10-GC获得类似的结杲(数据未显示)。在接种组和对照组之间没有观察到瘦体重的不同，清楚地表明体重的减少是由于体脂肪的减少。总之，这些结果清楚地证明GIP-VLP偶联物能够减少体重增加和体脂肪积累。实施例7与现有技术QPVLP偶联的GIP1-15-GC-Q|3、GIPl-10-GC-Q(3或QP-CG-GIP31-42在饮食诱导的肥胖动物模型中的安全性实验为了评价针对GIP接种的可能的副作用，测定了接种的动物中血液葡萄糖、果糖胺和甘油三酯的水平。简要地说，如实施例4所述给成年雄性C57BL/6小鼠(每组5只)接种实施例2获得的与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42。作为对照，给小鼠注射PBS或QPVLP。在第一次免疫后92天至102天之间，在4天的时间里，间隔两天，小鼠在早晨(9.00h)采血两次，在晚上(15.00h)采血两次，使用Glucotrend血糖仪(Roche)测定血液葡萄糖水平。在这期间，小鼠自由获取水和食物。表4中分别显示了早晨和晚上的读数的平均值。在接种的动物和注射PBS的动物之间没有观察到血液葡萄糖水平的显著性差异。在用GIPl-10-GC-QP接种的小鼠中观察到类似的结果(数据未显示)。在相同动物中，在第一次注射后120天测定血浆甘油三酯水平。简要地说，在12个小时的禁食期后，从与QPVLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠和注射PBS的对照小鼠中采集血液样品。然后通过酶试验利用OlympusAU400自动实验室工作站测定血浆样品中的甘油三酯水平。每一组的平均值和标准差(11=5)显示在表4中。在接种的动物和对照动物之间没有观察到显著性差异。此外，在免疫后以不同的时间间隔测定相同动物的果糖胺水平。果糖胺水平反映循环中的糖基化蛋白质的总量，如果果糖胺水平升高，则表明血糖增多。因为循环果糖胺的寿命为3周，果糖胺测定提供了回顾性的血糖图(glycemicpicture)。简言之，在12个小时的禁食期后，以不同的时间间隔从与QPVLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠和注射PBS或Q(3VLP的对照小鼠中采集血液样品。然后测定血浆样品中的果糖胺水平。每一组的平均值和标准差(11=5)显示在表5中。总体上，在接种的动物和对照动物之间没有观察到显著性差异。尽管GIPl-15-GC-Q(3或CG-GIP31-42-Q卩接种组有两个显著不同的时间点(分别是，第55天和69天，第27天和69天)，但是总值落入大约200-400nmol/L的正常果糖胺范围内。果糖胺水平超过400fimol/L被认为具有发展糖尿病的危险。因此，在用与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠中针对GIP接种不会诱导高血糖状态。结论是，在接种组(与QPVLP偶联的GIPl-15-GC或CG-GIP31-42)和对照组(注射PBS或Q(3VLP的动物)之间没有观察到血液葡萄糖水平、空腹甘油三酯和果糖胺水平的显著性差异，尽管在接种的小鼠中存在抗GIP抗体(表2和3)。表2用GIPl-15-GC-QP或Q(3-CG-GIP31-42免疫的每组5只小鼠的平均早晨和晚上血液葡萄糖水平和空腹甘油三酯水平。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表3用GIP1画15-GC-QP或QP-CG-GIP31-42免疫的每组5只小鼠的平均空腹果糖胺水平免疫果糖胺水平±SEM(pimol/L)第13天第27天第41天第55天第69天第84天第2S3天Qb-GIPl-15GIP31-42QbPBS238±10252±13237±6330±18352±12308±30206±13261±15296±12252±17311±19347±35280±19196±12251±6243±13248±15260±6289±6279±7207±3246±5230±5259±4256±10282±7262±13184±9实施例8用与现有技术Q(3VLP偶联的GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC和GIP蛋白1-42-GC免疫小鼠给成年雌性或雄性C57BL/6小鼠接种实施例3获得的与Q(3VLP偶联的鼠GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC或GIP蛋白l-42-GC。简要地说，来自每个样品的lOOjng透析后的疫苗用PBS稀释为200pi的体积，于第0、14、28、42天皮下注射(100|Lll,腹部两侧)，以后在需要时注射。疫苗施用时加或不加佐剂。作为对照，一组小鼠用VLPQP免疫或注射PBS,其中使用或不使用佐剂。小鼠在第O、14、28、42天眼眶后采血，然后定期采血。然后如实施例5所述通过ELISA定量GIP特异性抗体。实施例9与Q(3VLP偶联的GIP4誦13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC和GIP蛋白1-42-GC在饮食诱导的肥胖动物模型中的有效性实验如实施例8所述给具有相当的初始体重的成年雄性或雌性C57BL/6小鼠接种实施例3获得的与QPVLP偶联的鼠GIP4-13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC或GIP蛋白l-42-GC。作为对照，小鼠用单独的QPVLP免疫或者注射PBS。如果在实验过程中GIP-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。所有小鼠都置于高脂肪饮食(35%重量的脂肪，60%作为能量)下，以促使其发展饮食诱导的肥胖症。食物和水随意给予。定期监测体重。另外，如实施例7所述，以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯和果糖胺水平。实施例10与现有技术Q(3VLP偶联的鼠GIP1画15-GC、GIP1隱10-GC、GIP4画13-GC、GIP16画30-GC、CG匿GIP28-42、GIPl-14-KKC、GIPl-14-DDC和GIP蛋白1-42-GC在遗传性肥胖动物冲莫型中的有效性实验如实施例8所述给成年雄性或雌性C57BL/6小鼠接种实施例2或3获得的与现有技术Qf3VLP偶联的鼠GIPl-15-GC、GIPl-10-GC、GIP4國13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIPl-14-DDC或GIP蛋白l-42-GC。作为对照，小鼠用QPVLP免疫或者注射PBS。如果在实验过程中GIP-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。小鼠用标准饮食(包括4%-10%重量的脂肪)随意饲养，并可自由获得饮水。定期监测体重。另外，以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯和果糖胺水平(如实施例7所述)。实施例11与QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC、GIP1隱10-GC和CG-GIP31-42在治疗性饮食诱导的肥胖动物模型中的有效性实验成年雄性C57BL/6小鼠(每组10只)用高脂肪饮食随意饲养大约14周，直到变为肥胖(体重>42g)。然后分成两个具有相似平均初始体重的实验组。两组的平均值在实验开始时仅相差〈0.1g。分组后，如实施例4所述给小鼠(每组10只)接种实施例2获得的与现有技术QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC、GIPl-10-GC或CG-GIP31-42。作为对照，小鼠用QPVLP免疫。如果在实验过程中GIP-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。小鼠在第O、14、28、42、56天眼眶后采血，之后每月一次采血。如实施例5所述通过GIP-特异性ELISA分析血清中的GIP特异性抗体。与现有技术Q(3VLP偶联的鼠GIP1-15-GC、GIP1-10-GC或CG-GIP31-42接种诱导的GIP-特异性抗体效价与表1所示的相当。定期监测体重。另外，如实施例7所述以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯水平。如表4所示，用与QPVLP偶联的鼠GIP1-15-GC、GIP1-10-GC或CG-GIP31-42免疫的小鼠在实验过程中比注射QPVLP的对照动物的体重增加减少。到第一次免疫后的第98天，对照动物的体重增加了大约8.6克(20%)，而GIPl-15-GC-Qf3、GIPI-IO-GC画QP和GC-GIP31-42-QPVLP免疫的小鼠体重分别降低了0.5g(-3.0%)、0.6g(-3.0%)和0.2g(-0.5%)。因此，清楚地证明在治疗条件下所有接种组都比对照组的体重增加减少。表4用GIP1-15-GC-Q(3、GIPl-10-GC-Qp或Q(3-CG-GIP31-42免疫的每组10只小鼠在98天里的平均体重改变(用百分比表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>实施例12与Q(3VLP偶联的鼠GIP4-13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC和GIP蛋白1-42-GC在治疗性饮食诱导的肥胖动物模型中的有效性实验成年雄性或雌性C57BL/6小鼠用高脂肪饮食随意饲养大约17-24周，或者直到变为肥胖(体重〉45g)为止。然后将小鼠分组，使得所有各组的初始体重分布和平均初始体重相似。如实施例8所述给小鼠接种实施例3获得的与Q(3VLP偶联的鼠GIP4匿13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIPl-14-KKC、GIP1-14-DDC或GIP蛋白l-42-GC。作为对照，小鼠用QPVLP免疫或注射PBS。如果GIP-特异性抗体效价开始下降，则对小鼠进行加强免疫。小鼠在第O、14、28、42、56、70天眼眶后采血，然后每月一次采血。定期监测体重。另外，如实施例7所述以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯和果糖胺水平。实施例13在不同聚阴离子大分子存在下通过解装配/重装配制备本发明的QpVLP产生重装配的QPVLP(A)现有技术Q(3VLP的解装配从大肠杆菌裂解物中純化的溶于PBS(20mM磷酸盐，150mMNaCl，pH7.5)中的45mg现有技术Q(3VLP(2.5mg/ml，通过Bradford分析确定)在搅拌条件下于室温用10mMDTT还原15分钟。然后加入氯化镁至0.7M的终浓度，继续在搅拌条件下于室温温育15分钟，导致包裹的宿主细月包RNA沉淀。溶液于4。C以4000rpm离心10分钟(Eppendorf5810R，在下列所有步骤中使用固定角转头A_4_62)，以从溶液中除去沉淀的RNA。含有释放的二聚QP外壳蛋白的上清液用于层析纯化步骤。(B)通过阳离子交换层析和大小排阻层析纯化Q|3外壳蛋白含有二聚体外壳蛋白、宿主细胞蛋白质和残留的宿主细胞RNA的解装配反应上清液用水1:15稀释，以调节电导率低于10mS/cm,并力口才羊至'jSP画SepharoseFF斗主(xk16/20，6ml,AmershamBioscience)上。该柱预先用20mM磷酸钠緩沖液pH7平衡。结合的外壳蛋白的洗脱用20mM磷酸钠/500mM氯化钠的分步梯度来完成，以大约25ml的级分体积收集蛋白质。以5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。在第二步中，分离的Qp外壳蛋白(从阳离子交换柱上洗脱的级分)力口样到(进行两次)用20mM磷酸钠/250mM氯化钠pH6.5平衡的SephacrylS-100HR柱(xk26/60，320ml,AmershamBioscience)上。以2.5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。收集5ml的级分。(CI)通过透析重装配Q(3VLP纯化的Qf3外壳蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸钠pH6.5中)、一种聚阴离子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT(0.5M水溶液)混合至终浓度为1.4mg/ml外壳蛋白，0.14mg/ml各自的聚阴离子大分子，1M尿素和2.5mMDTT。混合物(各1ml)使用3.5kDa截止值的膜在20mMTrisHCl,150mMNaClpH8中5。C透析2天。聚阴离子大分子是聚半乳糖醛酸(25000-50000,Fluka)、疏酸葡聚糖(MW5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW11000和33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW3000,13600和84600,Sigma)和来自面包酵母和小麦胚的tRNA。(C2)通过渗滤重装配Q(3VLP33ml纯化的Q(3外壳蛋白(1.5mg/ml，在20mM磷酸钠pH6.5,250mMNaCl中)与水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW:84600)混合。混合物的体积为50ml，成分的终浓度为1mg/ml外壳蛋白，300mMNaCl,l.OM尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用PelliconXL膜柱(Biomax5K,Millipore)的正切流动过滤装置中，应用10ml/min的冲黄流速和2.5ml/min的渗透流速，用500ml的20mMTrisHClpH8，50mMNaCl在室温下渗滤该混合物。实施例14AP205VLP6勺^夕卜，酉己(A)AP205外壳蛋白的纯化解装配20ml的AP205VLP溶液(1.6mg/ml，在PBS中，从大肠杆菌提取物中纯化)与0.2ml的0.5MDTT混合，于室温温育30分钟。加入5ml的5MNaCl，该混合物然后于60。C温育15分钟，使D丁T-还原的外壳蛋白沉淀。将浑浊的混合物离心(转头SorvallSS34，10000g,10min，20°C),弃去上清液，将沉淀物分散到20ml的1M尿素/20mM柠檬酸钠pH3.2中。于室温搅拌30分钟后，加入1.5MNa2HP04将分散液调节至pH6.5，然后离心(转头SorvallSS34,10000g,10min，20。C)，获得含有二聚体外壳蛋白的上清液。阳离子交换层析上清液(见上)用20ml水稀释，以调节电导率约为5mS/cm。将得到的溶液加至预先用20mM磷酸钠pH6.5緩沖液平4軒的6mlSPSepharoseFF柱(AmershamBioscience)上。力口才羊后，用48ml20mM磷酸钠pH6.5緩沖液洗柱，然后用20倍柱体积上达1MNaCl的线性梯度洗脱结合的外壳蛋白。合并主峰级分，通过SDS-PAGE和UV光谙法分析。根据SDS-PAGE，分离的外壳蛋白是从其他蛋白质污染物中基本纯化的。根据UV光谱法，蛋白质浓度为0.6mg/ml(总量12mg),1个A280单位反映1.01mg/mlAP205夕卜壳蛋白。此外，A280值(0.5999)与A260值(0.291)的比为2,表明该制品基本不含核酸。(B)AP205VLP的装配在不含任何聚阴离子大分子的条件下的装配将上述洗脱的蛋白质级分渗滤并且通过TFF浓缩，至在20mM磷酸钠pH6.5中的蛋白质浓度为1mg/ml。500^1该溶液与50^1的5MNaCl溶液混合，于室温温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示(图5A)。HPLC分析使用用20mM磷酸钠，150mMNaClpH7.2平衡的TSKgelG5000PWXL柱(TosohBioscience)。在聚谷氨酸存在下的装配375pl纯化的AP205外壳蛋白(lmg/ml，在20mM磷酸钠pH6,5中)与50^1的NaCl贮存溶液(5M水溶液)、50|il聚谷氨酸贮存溶液(2mg/ml水溶液，MW:86400,Sigma)和25pl水混合。混合物在室温温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示(图5B)。混合物中的外壳蛋白几乎完全加入到VLP中，表明装配效率高于在不含任何聚阴离子大分子情况下装配的AP205外壳蛋白。实施例15GlP片！史l画lO、4-13、1-15、31-42、16-30、28-42、1画14-KKC、GIP1-14-DDC和GIP蛋白1-42与重装配的Q(3或重装配的AP205VLP的偶联2ml的2.0mg/ml重装配的QpVLP(实施例13中获得)在20mMH印es,150mMNaClpH7.2中的溶液与1SMPH(Pierce)溶液(来自溶于DMSO中的50mM贮存溶液)于25。C反应30分钟。反应溶液随后用2L20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2于4。C透析两次2小时。然后用透析后的衍生化的重装配Q(3VLP偶联鼠GIP1-15-GC、鼠CG-GIP31-42肽、鼠GIPl-10画GC、鼠GIP4-13GC、鼠GIP16-30-GC、鼠CG-GIP28-42、鼠GIP1陽14-KKC、鼠GIP1-14-DDC或鼠GIP蛋白l-42-GC。简要地说，1ml衍生化的重装配VLP(浓度为2mg/ml)与286^110mM肽溶液在20mMHepes,150mMNaCl，pH7.2中20。C反应2小时。偶联反应物然后以13000rpm离心5分钟，收集上清液，并用2L20mMHepes,150mMNaCl,pH7.2于4。C透析1次2小时，然后透析过夜。2ml2.0mg/ml重装配的AP205VLP(实施例14中荻得)在20mMHepes,150mMNaClpH7.2中的溶液首先在与重装配Q(3VLP所述相同或相似的条件下用SMPH衍生化。然后如最后一l殳所述，在类似或相同的条件下，衍生化的重装配AP205VLP与GIP片段反应。实施例16与重装配的或重装配的AP205VLP偶联的鼠GIPI-IO-GC、GIP1-15-GC、GIP4-13-GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIP1-14-KKC、GIP1-14-DDC、CG-GIP31-42和GIP蛋白l-42-GC在治疗性饮食诱导的肥胖动物模型中的免疫和有效性实验成年雄性或雌性C57BL/6小鼠用高脂肪饮食随意饲养大约17-24周，或者直到变为肥胖(体重〉45g)为止。然后将小鼠分组，使得所有各组的初始体重分布和平均初始体重类似。如实施例8所述给小鼠接种实施例15获得的与重装配Q|3VLP偶联的鼠GIP1-10-GC、GIP4-13画GC、GIPl-15画GC、GIP16-30-GC、CG-GIP28-42、GIPl-14-KKC、GIP1-14-DDC、CG-GIP31-42或GIP蛋白l-42-GC。对照小鼠用重装配的Q卩VLP(实施例13获得)免疫或注射PBS。100透析后的疫苗或对照蛋白用200pi体积的PBS稀释，并在第O天皮下注射(IOOpl，腹部两侧)，其中使用或不使用佐剂。在第14、28和42天小鼠用相应的制剂进行加强免疫。如果GIP-特异性抗体效价开始下降，则对小鼠进一步加强免疫。小鼠在第0、14、28、42、56、70天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的GIP特异性抗体。定期监测体重。另外，如实施例7所述以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯和果糖胺水平。检测与GIP片段或GIP蛋白偶联的重装配AP205VLP在小鼠治疗性饮食诱导的肥胖模型中的有效性使用类似的、相似的或相同的条件。200580034234.7说明书第53/60页实施例17生长素释放肽24-31GC与现有技术Qj3VLP的偶联化学合成生长素释放肽-肽生长素释放肽24-31GC(GSSFLSPEGCSEQIDNO:39)，其包含为偶联VLP而添加的C末端半胱氨酸残基，并用于如下所述化学偶联QP。5ml140|aM现有技术Q卩VLP在20mMHepes,150mMNaClpH7.4中的溶液与108pi65mMSMPH(Pierce)水溶液在25。C摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4。C用5L20mMHepes，150mMNaCl，pH7.2透析两次各2小时。100pi透析后的反应混合物然后与28.6pi10mM生长素释》文肽-肽贝i存液(在DMSO中)(肽/QJ3衣壳蛋白比为1:10)反应。偶联反应在15。C水浴中进行2小时。反应混合物随后以13000rpm离心5分钟，收集上清液，在4。C下透析一次2小时，然后用2次5L20mMHepes，150mMNaCl,pH7.2透析过夜。偶联反应用还原性条件下的16。/oSDS-PAGE凝胶分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。实施例18用与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC和与QPVLP偶联的生长素释放肽24-31-GC共同免疫小鼠给成年雄性或雌性C57BL/6同时接种与QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC(实施例2获得)和与QPVLP偶联的鼠生长素释放肽24-3l-GC(实施例17获得)。各100pg透析后的疫苗混合并在PBS中稀释为200pl体积，并在第0、14、28、42天皮下注射(100pl，腹部两侧)，以后根据需要注射。施用两种疫苗的组合时使用或不使用佐剂。作为对照，一组小鼠用单独的QPVLP免疫或者注射PBS,使用或不使用佐剂。小鼠在第0、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的抗GIP和抗生长素释放肽抗体。60使用相似、类似或相同的实验条件，用与重装配QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC和与重装配Qf3VLP偶联的鼠生长素释放肽24-3l-GC同时免疫成年雄性或雌性C57BL/6小鼠。小鼠在第O、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述分别通过GIP-特异性或生长素释放肽-特异性ELISA分析血清中的抗GIP和抗生长素释放肽抗体。实施例19与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC和与QPVLP偶联的生长素释放肽24-31-GC的共施用在饮食诱导的肥胖模型中的有效性实验如实施例18所述给具有相当的初始体重的成年i,性或雌性C57BL/6小鼠接种与现有技术Q|3VLP偶联的鼠GIPl-15-GC或与现有技术QPVLP偶联的重装配的鼠生长素释放肽24-31-GC。作为对照，小鼠用单独的现有技术QpVLP或重装配的QPVLP免疫或者注射PBS。如果在实验过程中GIP-特异性或生长素释放肽-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。所有小鼠都置于高脂肪饮食(35%重量的脂肪，60%作为能量)下，以促使其发展饮食诱导的肥胖症。小鼠在第0、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的抗GIP和抗生长素释》文肽抗体。食物和水随意给予。定期监测体重。另外，如实施例7所述，以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯水平。实施例20与Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC和与QPVLP偶联的生长素释放肽24-31-GC的共施用在遗传性肥胖动物模型中的有效性实验如实施例18所述给成年雄性或雌性C57BL/606/oZ小鼠同时接种与现有技术QPVLP或重装配的QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC或与现有技术QPVLP或重装配的QPVLP偶联的鼠生长素释放肽24-31-GC。作为对照，小鼠用单独的现有技术QPVLP或重装配的QPVLP免疫或者注射PBS。如果在实验过程中GIP-特异性或生长素释放肽-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。小鼠喂以标准々大食。小鼠在第O、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的抗GIP和抗生长素释》文肽抗体。定期监测体重。另外，如实施例7所述，以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯水平。实施例21与Q(3VLP偶联的GIP1-15-GC和与QPVLP偶联的生长素释i丈肽24-31-GC的共施用在治疗性饮食诱导的肥胖动物模型中的有效性实验成年雄性或雌性C57BL/6小鼠用高脂肪饮食随意饲养大约17-24周，或者直到变为肥胖(体重〉45g)为止。然后将小鼠分组，使得所有各组的初始体重分布和平均初始体重类似。如实施例18所述给小鼠接种与现有技术QPVLP或重装配Q|3VLP偶联的鼠GIPl-15-GC和与现有技术QPVLP或重装配Q(3VLP偶联的鼠生长素释放肽24-31-GC。对照小鼠用现有技术Q|3VLP或重装配的QPVLP免疫或注射PBS。如果在实验过程中GIP特异性或生长素释放肽-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。小鼠在第0、14、28、42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的抗GIP和抗生长素释i文肽抗体。免疫后监测各个小鼠中的体重和体脂肪组成。另外，如实施例7所述以不同的间隔监测血液葡萄糖水平和甘油三酯水平。实施例22用与QPVLP偶联的GIPl-15-GC和与QPVLP偶联的CG-GIP31-42共免疫小鼠给成年雄性或雌性C57BL/6小鼠同时接种与QPVLP偶联的鼠GIPl-15-GC和与VLP偶联的鼠CG-GIP31-42(均由实施例2获得)。各100pg透析后的疫苗混合并在PBS中稀释为200iul体积，并在第0、14、28、42天皮下注射(IOOpl，腹部两侧)，以后根据需要注射。施用两种疫苗的组合时使用或不使用佐剂。作为对照，一组小鼠用单独的Q|3VLP免疫或者注射PBS。小鼠在第O、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述，通过向板上包^皮全长小鼠GIP蛋白，使用ELISA分析血清中的抗GIP特异性抗体。GIP-特异性抗体效价与表1所示的相当。实施例23与QPVLP偶联的GIP1-15-GC和与Q(3VLP偶联的CG-GIP31-42的共免疫在饮食诱导的肥胖模型中的有效性实验如实施例22所述给具有相当的初始体重的成年雄性或雌性C57BL/6小鼠接种与Q)3VLP偶联的鼠GIP1-15-GC和与QPVLP偶联的CG-GIP31-42。作为对照，小鼠用现有技术QPVLP免疫或者注射PBS。如果在实验过程中GIP-特异性抗体效价明显下降，则对小鼠进行加强免疫。所有小鼠都置于高脂肪饮食(35%重量的脂肪，60%作为能量)下，以促使其发展饮食诱导的肥胖症。小鼠在第O、14、28和42天眼眶后采血，然后定期采血。如实施例5所述通过ELISA分析血清中的抗GIP抗体。GIP-特异性抗体效价与表1中所示的相当。食物和水随意给予。定期监测体重。另外，如实施例7所述，以不同的间隔测定体脂肪量、血液葡萄糖水平和血浆甘油三酯和果糖胺水平。共免疫的小鼠的平均体重增加与如表2所示的单次免疫观察到的结果相当。实施例24用与GIP1-15肽C末端融合的AP205免疫小鼠经过三个连续的PCR反应生成编码GIP肽(YAEGTFISDYSIAMD,SEQIDNO:27)的DNA片段。在第一反应中，使用质粒pAP405作为才莫板用含有/位点的oligopl.45(5，-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG画3',SEQIDNO73)和o"gop4,175(5，-AATGAACGTGCCCTCTGCGTATCCGGAACCGCCTCCTGC-3，，SEQIDNO:74)扩增AP205外壳蛋白的基因，从而在质粒pAP405中AP205外壳蛋白基因3，区中编码GTAGGGSG的核苷酸序列的3，处增加编码氨基酸序列YAEGTFI的核普酸序列。然后，使用oligospl.45和p4.176(5，-CATCGCGATCGAGTAATCGGAAA丁GAACGTGCCCTCTGCGTA-3，，SEQIDNO:75)扩增第一反应的PCR产物，由此在第一反应的产物的3'末端增加编码氨基酸序列SDYSIAM的核苷酸序列。在第三反应中，使用oligospl.45和p4.177(5，-ACATGCATTAATCCATCGCGATCGAGTAATC-3',SEQIDNO:76)扩增第二反应的产物，由此向第二PCR产物的3'端增加含有终止密码子和M/W^3/限制性位点的编码其余Asp的核苷酸序列。获得的片段用Wa/和MpW/a/消化，并克隆到载体pAP283(AP205亲本)内的相同限制性位点处，处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制下。获得的构建体是515AP205外壳蛋白-GTAGGGSG—YAEGTFISDYSIAMD。表达的融合蛋白的纯化方法基本如PCT/EP2005/054721的实施例2所公开的相同。PAP405和pAP283的构建和序列分别在PCT/EP2005/054721和WO2004/007538A2中公开。给成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)接种与GIP1-15肽C末端融合的AP205。50pg透析后的疫苗在PBS中稀释为200pl的体积，于第0、14、28、42天皮下注射(100pi,腹部两侧)。疫苗施用时不加佐剂。作为对照，一组小鼠注射单独的PBS或AP205VLP。小鼠在第0、14、28、42、56、70天眼眶后采血，如实施例5所述通过ELISA分析其血清。表5显示GIP特异性抗体的平均效价。结果是每组5只小鼠的平均值。ELISA效价表示为在ELISA测定中达到半数最大OD的血清稀释度。在与GIPl-15肽C末端融合的AP205免疫的小鼠中，到第42天达到大约1:184000的平均效价(表5)。免疫前血清或来自注射PBS或QPVLP的小鼠的血清对任一种GIP肽都不显示任何反应性。半数最大OD值低于100,这被认为低于该试验的截止值。这清楚地证明，GIP-VLP融合蛋白能够诱导抗GIP片段的高抗体效价，尽管GIP片段是自身蛋白。表5在第0、14、28、42天用与GIP1-15肽C末端融合的AP205免疫的小鼠的平均抗GIP特异性IgG抗体效价(表示为稀释倍数)第一次免疫后的天数免疫1428425670AP205-f-GIP7000±9005脂0±16800184477±59000156107±43000106100±22600PBS或AP205100100100100100实施例25与现有技术Q|3VLP偶联的GIP1-15-GC-QP在饮食诱导的肥胖动物模型中对葡萄糖耐受的影响为了评价对葡萄糖耐受的可能的影响，在接种的动物中进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。简要的说，如实施例4所述给成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)接种实施例2获得的与Q|3VLP偶联的GIPl-15-GC。作为对照，给小鼠注射QPVLP。在第122天，即OGTT前20天，给予另一次加强免疫。所有小鼠都在实验期内保持高脂肪饮食。在第142天，并且在16小时禁食期后，通过口饲给予小鼠2g/kgD-葡萄糖溶液。在口服葡萄糖给药后0、15、30、45、60、120和180分钟，小鼠经尾静脉采血。用Accu-check血糖仪(Roche)测定血液葡萄糖水平。在这期间，小鼠继续禁食。血液葡萄糖反应的动力学在表6中显示。在接种动物和对照动物之间没有观察到葡萄糖反应动力学有显著性差异。因此，在与现有技术Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC免疫的小鼠中针对GIP接种不能诱导减弱的葡萄糖耐受。表6用GIPl-15-GC-QP免疫的每组5只小鼠中OGTT的血液葡萄糖水平OGTT的血液葡萄糖水平±SEM免疫0.15'30'45'60'120'180'(b-GIP1-15(5bVLP110±4.2118±8.2322±18.8321±9.9290±27.4245±17.8206±10.7212±5.6181±1.9194±7.713±3.8127±3.197±3.2120±7.1实施例26与现有技术Q(3VLP偶联的GIPl-15-GC-QP在饮食诱导的肥胖动物模型中对胰岛素反应的影响为了评价对胰岛素反应性的可能的影响，在接种的动物中进行胰岛素敏感试验(IST)。简要的说，如实施例4所述给成年雌性C57BL/6小鼠(每组4-5只)接种实施例2获得的与QPVLP偶联的GIPl-15-GC。作为对照，给小鼠注射Q(3VLP。在第122天，即1ST前21天，给予另一次加强免疫。所有小鼠都在实验期内保持高脂肪饮食。在第143天，并且在16小时禁食期后，腹膜内(IP)给予小鼠0.5U/kg猪胰岛素。在胰岛素给药后0、15、30、45、60和90分钟，小鼠经尾静脉采血。用Accu-check血糖仪(Roche)测定血液葡萄糖水平。在这期间，小鼠继续禁食。IPIST后血液葡萄糖反应的动力学在表9中显示。接种GIPl-15-GC-QP的小鼠与接种QPVLP的对照小鼠相比表现出提高的胰岛素敏感性。在胰岛素给药后0、30、45和60分钟时差异是显著性的。因此，在与QPVLP偶联的GIPl-15-GC免疫的小鼠中针对GIP接种提高了胰岛素反应性。表7用GIPl-15-GC-QP免疫的每组4-5只小鼠中IPIST的血液葡萄糖水平<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>权利要求1.一种组合物，包含(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。2.权利要求1的组合物，其中所述GIP蛋白包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:22(b)SEQIDNO:23(c)SEQIDNO:24(d)SEQIDNO:25(e)SEQIDNO:26(f)SEQIDNO:63(g)来自任何其他动物的GIP相应的直向同源物；和(h)与(a)至(f)中任-一个至少80%,优选至少85%，更优选至少90%，或最优选至少95%相同的氨基酸序列。3.权利要求l的组合物，其中所述GIP片段包含与SEQIDNO:22的第7-10位氨基酸残基相同的氨基酸序列(SEQIDNO:64)。4.权利要求1或3的组合物，其中所述GIP片段包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:27;(b)SEQIDNO:29;(c)SEQIDNO:32;(d)SEQIDNO:45;和(e)与SEQIDNO:27、29、32或45至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，或最优选至少95%相同的氨基酸序列。5.权利要求1的组合物，其中所述GIP片段包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:28;(b)SEQIDNO:31;(c)SEQIDNO:43;(d)SEQIDNO:44;(e)SEQIDNO:68;(f)与SEQIDNO:少85%，更优选至少90%，6.前述权利要求中任和28、31、43或44或68至少80%,优选至噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段。7.权利要求6的组合物，其中所述RNA噬菌体是RNA噬菌体QP、fr、GA或AP205。8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个共价键连接，其中优选地所述共价鍵是非肽键。9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一附着位点包含氨基，优选赖氨酸的氨基。10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第二附着位点包含巯基，优选半胱氨酸的巯基。11.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述GIP蛋白或GIP片段与RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。12.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含连接体。13.—种组合物，包含(a)至少一个第一病毒样颗粒(VLP)和至少一个第二病毒样颗粒(VLP)，均具有至少一个第一附着位点；和(b)至少一种第一抗原和至少一种第二抗原，均具有至少一个第二附着位点，其中所述至少一种第一抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且所述至少一种第二抗原包含或者是选自下组的分子(i)生长素释放肽或生长素释i欠肽的肽；(ii)尼古丁、可替宁或降烟^成；和(iii)第二GIP蛋白或第二GIP片段，其中所述第二GIP蛋白或第二GIP片段与第一GIP蛋白或GIP片段不同；且，其中所述至少一个第一病毒样颗粒(VLP)和所述至少一种第一抗原通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述至少一个第二病毒样颗粒(VLP)和所述至少一种第二抗原通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。14.权利要求13的组合物，其中所述第一病毒样颗粒和/或所述第二病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白、其突变体或片段，其中优选地所述RNA噬菌体是Q{3、fr、GA或AP205。15.权利要求13或14的组合物，其中所述第二GIP片段包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:27;(b)SEQIDNO:29;(c)SEQIDNO:32;(d)SEQIDNO:45;(e)SEQIDNO:28;(f)SEQIDNO:31;(g)SEQIDNO:44;(h)SEQIDNO:68;和(i)与SEQIDNO:27-29、31、32、44、68或45至少80%,优选至少85%，更优选至少90%，或最优选至少95%相同的氨基酸序列。16.权利要求13-14中任一项的组合物，其中所述生长素释放肽或生长素释放肽的肽包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:33;0)SEQIDNO:35;(c)SEQIDNO:40;(d)SEQIDNO:36;(e)SEQIDNO:37;(f)SEQIDNO:38;(g)SEQIDNO:46(GSSFLSPEHQKLQ);和(h)SEQIDNO:47(GSSFLSPEHQKVQ)。17.权利要求13-14中任一项的组合物，其中所述第二抗原包含O-琥珀酰-3'-羟曱基-尼古丁。18.—种药盒，包括至少一种第一组合物和至少一种第二组合，其中所述第一组合物包含(a)具有至少一个第一附着位点的第一病毒样颗粒(VLP);(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是GIP蛋白或GIP片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接；并且其中所述第二组合物包含(c)具有至少一个第一附着位点的第二病毒样颗粒(VLP);(d)具有至少一个第二附着位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原包含或者是选自下组的分子(i)生长素释放肽或生长素释放肽的肽；(ii)尼古丁、可替宁或降烟碱；和(iii)第二GIP蛋白或第二GIP片段，其中所述第二GIP蛋白或第二GIP片段与第一组合物中包含的第一GIP蛋白或GIP片段不同；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。19.权利要求18的药盒，其中所述第一病毒样颗粒和/或所述第二病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白、其突变体或片段，其中优选地所述RNA噬菌体是Q(3、fr、GA或AP205。20.权利要求18或19的组合物，其中所述第二GIP片段包含选自以下序列的氨基酸序列(a)SEQIDNO:27;(b)SEQIDNO:29;(c)SEQIDNO:32;(d)SEQIDNO:45;(e)SEQIDNO:28;(f)SEQIDNO:31;(g)SEQIDNO:44;(h)SEQIDNO:68;和(i)与SEQIDNO:27-29、31、32、44、68或45至少80%,优选至少85%，更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。21.权利要求18-19中任一项的药盒，其中所述生长素释放肽或生长素释放肽的肽包含选自以下序列的氨基酸序列(i)SEQIDNO:33;(j)SEQIDNO:35;(k)SEQIDNO:40;(1)SEQIDNO:36;(m)SEQIDNO:37;(n)SEQIDNO:38;(o)SEQIDNO:46(GSSFLSPEHQKLQ);(P)SEQIDNO:47(GSSFLSPEHQKVQ);和(q)与SEQIDNO:33、35-38、40、46或47至少80%，优选至少85%,更优选至少90%,或最优选至少95%相同的氨基酸序列。22.权利要求18-19中任一项的药盒，其中所述第二抗原包含O-琥珀酰-3'-羟曱基-尼古丁。23.—种疫苗组合物，包含权利要求1-12中任一项的组合物或权利要求13-17中任一项的组合物。24.—种免疫方法，包括给动物，优选狗或猫，优选家猫，或给人，施用权利要求23的疫苗组合物。25.—种药物组合物，包含(a)权利要求1-12中任一项的组合物，权利要求13-17中任一项的组合物，和(b)—种可接受的药物载体。26.—种制备权利要求-12中任一项的组合物的方法，包括(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP;(b)提供至少一种抗原，其中所述抗原是具有至少一个第二附着位点的GIP蛋白或GIP片4爻；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，产生所述组合物。27.权利要求1-12中任一项的组合物或权利要求13-17中任一项的组合物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的用途。28.—种治疗和/或预防肥胖症的方法，包括给动物，优选家猫或狗，或人，施用权利要求23的疫苗组合物。29.—种治疗和/或预防动物或人的肥胖症的方法，包4舌给相同的动物，优选家猫或狗，或给相同的人，施用权利要求18-22中任一项的药盒中的至少一种第一组合物和至少一种第二组合物。30.权利要求29的方法，其中所述至少一种第一组合物和所述至少一种第二组合物同时施用。全文摘要本发明涉及医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供一种包含病毒样颗粒(VLP)和至少一种抗原的组合物，其中所述抗原是分别与VLP连接的GIP蛋白或GIP片段。本发明也提供一种制备上述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备特别是用于特别通过诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答预防和/或治疗肥胖症的疫苗。而且，本发明的组合物特别可用于在特定环境内有效诱导自身特异性免疫应答。文档编号A61P3/10GK101119749SQ200580034234公开日2008年2月6日申请日期2005年10月25日优先权日2004年10月25日发明者A·富卢里雅,M·巴克曼,P·索丹申请人:赛托斯生物技术公司