作为靶向试剂用于内皮－特异性体内转导的热激蛋白的制作方法

专利名称：作为靶向试剂用于内皮－特异性体内转导的热激蛋白的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明的实施方案涉及使用来源于热激蛋白(HSP)的肽和多肽对信号试剂(例如，造影剂或成像剂)进行送递并使之与治疗剂内化的化合物、组合物和方法。例如，热激蛋白70与氧化的低密度脂蛋白受体(LOX-1或OLR-1)相结合，并向LOX-1受体发出信号，以便对HSP以及内皮上附着的任何部分进行转导。HSP肽类可以直接与成像剂或治疗剂相连接，也可以通过一种连接体进行连接。该组合物还可用于将生物学分子送递到体内具有高浓度LOX-1的位点，包括巨噬细胞和其他炎症细胞。造影剂/成像剂可以根据不同的成像模式进行选择，特别是所述部分可以对容易受到炎症相关斑块如动脉粥样硬化斑影响的位点进行成像。组合物可用于诊断和监测炎症以及炎症起主要作用的疾病，诸如各种心血管疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、易损斑块、冠状动脉疾病和类风湿性关节炎。
2.相关领域说明HSPs(热激蛋白)是存在于从细菌到哺乳动物的生物体的细胞中的高度保守蛋白家族。HSPs是细胞代谢所必须的，即便是在未应激的细胞中也是如此。它们促进蛋白组装的合成、结构、运输和其他方面，诸如帮助新合成的多肽折叠，以防止与其他的蛋白发生过早的相互作用(即作为伴侣蛋白)。HSP的表达反应于生理应激诸如体温升高、pH改变和氧耗竭而增加。这些应激可导致细胞蛋白三维结构的破裂或打开。如果对这种应激不做检查，折叠错误的或者被打开的蛋白会形成聚集物，最终导致细胞死亡。HSPs和受破坏的蛋白相结合，帮助其重新折叠至它们适宜的形状，以及/或者预防破坏的发生。
EP 1046652 A1公开了一种包含哺乳动物氧化的-LDL受体(LOX-1)和一部份IgG的融合多肽，其中融合多肽可以用标记试剂进行标记。由此，融合多肽可用于检测、量化、分离和纯化氧化的LDL。但是EP1046652 A1中的融合多肽不能用于检测或量化LOX-1。
TAT肽序列(YGRKKRRQRRR)和最近报道的Antp内化序列(RQIAWFQNRRNKWKK)证明了体内和体外各种底物的内化活性。但是都没有证明可以靶向特定的受体，用于向内皮上的病变区域送递诊断性造影剂，尽管TAT肽被用于将氧化铁纳米颗粒非特异性送递到细胞中(Wunderbalinger，P，et al.，Bioconjugate Chemistry，2002，13，264-8)。这些方法的一个缺点是肽将造影剂靶向到目标细胞的非特异性。这种造影剂的非特异性送递将阻止目的诊断区域(即粥样硬化病变)与其他的脉管系统的功能区域相区别。
心血管疾病是美国主要的死亡原因，每年导致超过100万的死亡人数。动脉粥样硬化是冠心病的主要原因，并且是西方国家非意外死亡的主要原因。文献记载导致动脉粥样硬化有很多危险因素，诸如高血压、总血清胆固醇升高、高水平的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、低水平的高密度(HDL)胆固醇、糖尿病、重度肥胖症和吸烟。人们做了很多努力来确定该疾病的病原学，以及动脉粥样硬化的方法和后果，包括心肌梗塞、心绞痛、器官衰竭和中风的可能的治疗。迄今为止，动脉粥样硬化的治疗主要着眼于降低胆固醇水平和调节脂质。然而，最近的研究显示，40％的由冠状疾病引起的死亡发生在胆固醇水平低于220mg/dl的人身上。现在还有很多问题无法解决，包括粥样硬化病变是如何并在何时变成易损且具生命威胁性的？最佳介入点？如何检测和监测损伤的进展？一些介入性的和非介入性的技术已经被用于对动脉粥样硬化进行成像，和评估疾病的进展和稳定化情况。这些包括冠状动脉造影术、血管内超声血管镜检查、血管内核磁共振成像和使用红外导管的斑热成像法。这些技术已经成功的用于鉴定易损的斑，但通常都是介入性的(例如，需要手术或插入探针或照相机)。在患有不稳定性心绞痛的患者中发现了可溶性标记物，诸如P-选择蛋白、von Willebrand因子、血管紧张素转换酶(C146)、C-反应性蛋白，D-二聚体(Ikeda et al.，Am.J.Cardiol.，1990，65，1693-1696)和活化的循环炎症细胞，但是这些物质的存在不能找出所涉及的病变的所在。导管中所含的温度敏感性元素用于对斑定位，理论依据是炎症过程和细胞增殖过程是放热的过程，并且描述在例如美国专利No.4,986,671和美国专利No.4,752,141之中。血管造影照片反映了腔直径，并且提供了具有极好分辨率的狭窄的测量方法，但是，它并不能对血管壁或者各种不同的组织病理学成分进行成像。
现行的技术可典型地鉴定出动脉粥样硬化的某些形态学和/或功能参数，并且可提供与疾病相关的危险的定性或半定量评估。然而，这些诊断方法是介入性的，并且只能产生很少的关于基础病理生理，如斑的细胞组成，和斑中的每种成分在分子学水平上的生物学特征的信息。
氧化的LDL(oxLDL)与动脉粥样硬化的病理生物学关系密切。人们怀疑动脉粥样硬化斑块中的脂质集合是由于摄取了oxLDL而不是天然的LDL而造成的。OxLDL可以被巨噬细胞上的清除剂受体所识别；巨噬细胞摄取大量的oxLDL可导致泡沫细胞增加，泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块的重要成分。LOX-1或凝集素样氧化LDL受体最近被鉴别为内皮细胞上的oxLDL受体。它介导内皮细胞引起的oxLDL内化，并且与巨噬细胞清除剂受体，诸如那些描述于WO 02/06771，(Sawamura，T.Nature 1997 38673-77)中的受体不同。LOX-1的氨基酸序列示于图3中。LOX-1同样在巨噬细胞中表达，并且在oxLDL识别/内化在这些细胞中的过程中起主要作用(Yoshida，H.et al.，Biochem.J.19983349-13)。LOX-1在健康人类主动脉样品中几乎不可测得，但是在动脉粥样硬化斑块中可以测到，特别是用其他方法不能测到的早期病变中(Kataoka，H.et al.，Circulation 1999 993110-3117)可以测到。最近的工作显示，oxLDL被LOX-1的识别是内皮细胞粘附受体表达的一个关键的早期步骤。这些受体被认为对吸引单核细胞到早期动脉粥样硬化斑中起重要的作用。LOX-1抗体被描述为可通过防止oxLDL结合于LOX-1而治疗动脉粥样硬化(WO 01/64862)。
目前的成像剂和模型主要用于提供解剖学信息。这些信息典型的通过某种形式的可以提供高分辨率的造影剂而获得。然而，基础疾病状况涉及生物化学过程，其使得疾病的进程远远超过表现出的物理症状。具有了对生化途径或者途径中的特异性标记(生物标记)成像的能力，在疾病早期过程中可提供有效的信息。因此我们需要一种非介入性的诊断或监测各种心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、易损斑块、冠状动脉疾病、肾病、血栓形成、由凝血、中风、心肌梗塞、器官移植、器官衰竭和高胆固醇血症)的方法。非介入性的方法可获得斑块的基础病理学信息，诸如斑块的细胞组成和斑块内每种成分在分子学水平上的生物学特征。
发明概述本发明公开了HSP或其与LOX-1结合的片段的用途，它们用于将试剂包括但不限于治疗剂和产生信号的试剂内化到细胞中。在另一实施方案中，HSP的LOX-1结合部分提供了有效的鉴定体内炎症并且对其进行定位的方法，所述炎症包括动脉粥样硬化相关炎症。本发明的实施方案还提供了使用HSP(LOX-1肽结合序列)以辅助诊断程序的方法。更具体地，化合物和组合物可用于检测斑块形成的方法中。本发明的实施方案还提供使用LOX-1肽结合序列监测人类和/或其他动物疾病的治疗方法，所述疾病由LOX-1的超量表达或提高的表达而导致。
本发明还提供了能够体内结合LOX-1的成像剂/分子，以使得能够检测LOX-1蛋白的表达，并因此能够对LOX-1蛋白的表达进行定量。
除了成像的目的，化合物和组合物也可用作送递生物学分子的机制，这对于具有高浓度LOX-1的区域诸如巨噬细胞或其他炎症细胞是很有意义的。
本发明还提供了监测治疗炎性疾病诸如动脉粥样硬化的效力的方法。在另一实施方案中，本发明提供了一种确定LOX-1在疑似患有由LOX-1表达导致的疾病或病症的哺乳动物中的表达水平的方法。
附图简述

图1是HSP-70的N-末端同系物的氨基酸序列。
图2是HSP-70的C-末端同系物的氨基酸序列。
图3是人LOX-1的氨基酸序列。
图4是式(I)化合物的L和SIG变异的图示。
图5是HSP-70的N-末端同系物的三级结构图。
图6是HSP-70的C-末端同系物的三级结构图。
优选实施方案详述在一项优选的实施方案中，本发明提供了式I化合物(I)Y-(L)n-E，
其中Y是SIG或TA，其中SIG是信号部分，其提供可在体内或体外被检测到的信号，TA是治疗剂；L是连接Y和E的连接基团；E是结合部分，包括热激蛋白或其与LOX-1结合的片段或变体；且n是0或1。
定义结合部分(E).
“结合部分”(E)是哺乳动物，优选人热激蛋白，或其能够与LOX-1结合的片段或变体。与已知的结合LOX-1的部分不同，本发明的结合部分设计为可以在人类体液(体内或体外)存在下以足够的特异性与LOX-1结合，使得可以区分健康组织与超量表达LOX-1的组织(例如，动脉粥样组织)。如此文所使用的，本发明的术语“结合LOX-1的热激蛋白或其片段或变体”也可在整个申请中表示肽、肽序列、HSP肽、LOX-1结合肽或者结合肽。每一术语都可包括它的片段、融合肽、衍生物、变体和同系物。进而，特定的参考诸如HSP-70或序列号1-5可作为示例性的天然物质，同样包括其片段、融合肽、衍生物、变体和同系物，用于特殊的参考。
在每一项实施方案中，热激蛋白(配体)可以是全序列、或全序列的片段或同系物、或它的片段或变体。蛋白和肽的差别在于它们的大小。术语“肽”通常指的是含有少于100个氨基酸，分子量为约10,000Da的物质。优选的HSP肽含有少于30个氨基酸或分子量小于3500Da。与抗体或蛋白相比，此类小肽具有一些优点。例如，它们可承受修饰或连接纳米颗粒时的严酷化学条件；此外，这些颗粒的整体合成可简化，并易于控制。并且小肽也不容易是免疫原性的。此外，小肽通常在基础的生物学过程中比其他类的分子普遍更为重要，并且在很多情况下，小肽与它们的受体的亲和力要显著高于抗体或其片段的亲和力。优选的，热激蛋白是热激蛋白70、或其全序列、片段或变体的片段、同系物。更为优选的，HSP肽结合序列是HSP-70片段。更为优选的，热激蛋白70片段是30聚体或更短。所述片段含有30个或更少的氨基酸以提供更好的特异性、运输和/或清除性质，优选的，含有如下HSP-70的亲水性部分。更优选的，30聚体选自热激蛋白70的第383-640号氨基酸。
在一项实施方案中，HSP-70可整体性使用，HSP-70的某些部分更易于与细胞表面受体相结合。在不变的状态下，HSP-70将具有稳定的三级构象。然而，短链的寡聚物也许无法获得稳定的三级结构，或者无法代表HSP的结合部分。因此，根据本发明的一项实施方案，HSP的亲水性部分可用于制备用于与LOX-1形成复合物的片段。亲水性区域具有两个独特的优点(1)短链寡聚物的亲水性性质可以使其更为稳定；(2)亲水性结构域最有可能负责细胞结合。结合部分可包括，例如·DAAKNQVALN PQNTVFDAKR LIGRKFGDPVVQSDMKHWPF(序列号1)。
·QVINDGDKPK VQVSYKGETK AFY(序列号2)。
·PEEISSM VLTKMKEIAE AYLGYPVT(序列号3)。
·D SQRQATKDAG VIAGLNVLRI INEPTAAAIA YGLDR(序列号4)。
·MGDKSENVQD LLLLDVAPLS LGLETAGGVM(序列号5)。
·KDNNLLGRFE LSGIPPAPGV PQIEVTFDID(序列号6)。
根据另一项实施方案，优选使用序列号1-6的同源片段或序列号1-6的较大片段。
应当认识到，由于HSPs，例如HSP-70的高度保守性质，人们可以使用其他的HSPs。更具体地，优选使用来自与HSP-70的结合区域具有高同源性的其他HSPs的序列。进而，本发明人发现N-末端同源片段优于C-末端同源片段，因为同源结构显示，与C-末端部分相比，N-末端部分具有更多亲水性的结构域。
二级结构分析法显示，N-末端同源片段主要是由α-螺旋组成的，而C-末端同源片段主要是由β-折叠组成的。其他优选的片段可通过3-D建模和表面性质诸如静电学和疏水性确定。
例如，具有实验性确定的结构的同源蛋白从公共结构域中鉴定出来，特别是蛋白结构数据库中鉴定出来，它的序列显示出与LOX-1具有最高的同源性。PBD结构数据库的phi-psi BLAST检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)可用于鉴定同源模板。然后，从蛋白数据库中还可以获得晶体结构。
此外，以下结构信息有助于确定有用的序列和其中的氨基酸取代。以下信息是基于1HJO(人类)的HSP片段的信息，这些在www.pdb.org中由有进一步的描述。
1.β-折叠A氨基酸7-ILE至氨基酸28-ILE氨基酸141-ASN至氨基酸146-VAL氨基酸168-ASN至氨基酸174-ASN2.β-折叠B氨基酸42-VAL至氨基酸51-ILE3.螺旋1氨基酸53-ASP至氨基酸61-LEU4.螺旋2氨基酸63-PRO至氨基酸65-ASN5.螺旋3氨基酸70-ALA至氨基酸73-LEU6.螺旋4氨基酸81-PRO至氨基酸89-HIS7.β-折叠C氨基酸93-GLN至氨基酸115-TYR8.螺旋5氨基酸116-PRO至氨基酸135-LEU
9.螺旋6氨基酸152-ASP至氨基酸164-ILE10.螺旋7氨基酸175-GLU至氨基酸182-ALA11.螺旋8氨基酸230-GLY至氨基酸248-LYS12.β-折叠D氨基酸192-GLU至氨基酸337-VAL13.螺旋9氨基酸257-LYS至氨基酸275-SER14.β-折叠E氨基酸279-GLN至氨基酸298-THR15.螺旋10氨基酸299-ARG至氨基酸323-ASP16.螺旋11氨基酸328-LYS至氨基酸330-GLN17.螺旋12氨基酸339-GLY至氨基酸342-ARG18.螺旋13氨基酸344-PRO至氨基酸353-PHE19.螺旋14氨基酸368-ALA至氨基酸380-LEU。
使用此文中描述的这些参数和方法，可以合成某些HSP片段。其他的变体包括设计成可产生新的糖基化和/或磷酸化位点的那些、或者设计成除去已有糖基化和/或磷酸化位点的那些。变体中在糖基化位点、蛋白水解裂解位点和/或半胱氨酸残基上包括至少一个氨基酸取代。变体同样还包括在连接肽的目标氨基酸序列前后位置的其他氨基酸残基的肽。例如，半胱氨酸残基可加在目标氨基酸序列的氨基或羧基末端上，用于通过形成二硫键而使目标氨基酸序列环化。术语“变体”还包括具有目标氨基酸的那些，其具有至少一个，最多25个侧翼于目标氨基酸的3’或5’末端的额外的氨基酸。
本发明的HSP蛋白和肽可以是天然或合成来源的。天然蛋白和肽可以从动物来源中分离。如此文所用的，“分离”的HSP可指的是从原始环境(例如，材料存在的天然环境)中取出的材料，由此是从天然环境中“经人工改造”。分离的材料可进一步包含分离的HSP肽结合序列，或者特别是HSP70片段结合序列。
术语“片段”指的是由目标氨基酸的连续亚序列组成的肽或多肽，包括诸如剪接变体和由体内蛋白酶活性导致的天然存在产生的片段。所述片段可在氨基末端、羧基末端和/或内部截短(诸如天然剪接)。所述片段可以通过氨基酸末端甲硫氨酸制备也可不通过其制备。适宜的本发明HSP片段含有3-100个氨基酸，优选4-50个氨基酸，更优选的是5-30个氨基酸。
术语“变体”指的是这样的蛋白或多肽其中与目标氨基酸序列相比，存在一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，并且包括天然存在的等位基因变体或可变剪接变体。术语“变体”包括将肽序列中的一个或多个氨基酸用相同或同源氨基酸或不相似氨基酸置换。存在很多可以将氨基酸划分为相似或同源的标准(Gunnar von Heijne，SequenceAnalysis in Molecular Biology，p.123-39(Academic Press，New York，NY 1987.)。优选的变体包括在一个或多个氨基酸位置上的丙氨酸取代。其他优选的取代基包括对蛋白的总体净电荷、极性或疏水性几乎没有作用或者作用很小的保守性取代。保守取代如下表1中所示。
表1保守氨基酸取代基
表2列出了其他的氨基酸取代方案表2原始残基 取代AlaGly；SerArgLysAsnGln；His
AspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAla；ProHisAsn；GlnIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；Tyr；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu其他的变体可由不十分保守的氨基酸取代组成，诸如选择在维持以下方面的作用更显著不同的残基(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性，(c)侧链体积。通常预期对功能具有更为显著的影响的取代基是以下这些，其中(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一取代基取代或缺失或插入；(b)亲水性残基，例如，丝氨酰基或苏氨酰基取代了疏水性残基，或被取代为疏水性残基，疏水性取代基例如是，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基、或丙氨酰基；(c)半胱氨酸残基取代了其他残基或被其他残基取代；(d)具有正电性侧链的残基，例如，赖氨酰基、精氨酰基、或组氨酰基取代了负电性的残基，例如，谷氨酰基或天冬酰基，或被负电性残基取代；或(e)具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代了不具有所述侧链的残基如甘氨酸，或被甘氨酸取代。
多肽及其变体术语“多肽”包括蛋白、肽及其片段(功能性的或非功能性的)，其由HSP核苷酸编码。术语“衍生物”指的是被化学修饰或者天然过程修饰的蛋白或多肽，所述修饰通过天然过程如加工以及其它翻译后修饰，也可以通过化学修饰技术，诸如加入一种或多种聚乙二醇分子、糖、磷酸盐或者其它这类分子，所述分子天然不与如此衍生的野生型氨基酸连接。衍生物包括盐类。所述化学修饰物在教科书、论文、以及大量研究论著中有详细记载，都是本领域公知的技术。可以理解，在蛋白或多肽上可在一些位点上进行相同或不同程度的同样类型的修饰。
此外，给定蛋白或多肽可含有多种类型的修饰。修饰可以替代蛋白和多肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链、以及氨基或羧基末端。修饰包括，例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、亚铁血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化、硒基化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白的添加，诸如精氨酰化和遍在蛋白化。PROTEINS--STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)and Wold，F.，Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 in PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins，H.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182626-646(1990)andRattan et al.，Protein SynthesisPosttranslational Modifications andAging，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62(1992)。术语“衍生物”还包括导致蛋白或多肽成为支链或含支链或不含支链的环状化合物的化学修饰型。环状、支链的和支链环状的蛋白或者多肽可从天然的翻译后加工步骤中得到，也可以通过完全合成的方法获得。
术语“同系物”指的是和目标氨基酸序列相比，至少60％的氨基酸序列是相同的蛋白，可以通过通常用于比较两种多肽的氨基酸位置的相似性的常用标准方法来确定。两种蛋白之间的相似性或同一性程度可以通过已知方法方便地计算出来，包括但不限于以下文献所描述的那些COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo H.and Lipman，D.，SIAM，J.Applied Math.，481073(1988)。优选的确定同一性的方法设计为提供测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法编制在公众可获得的计算机程序中。
优选的确定两种序列之间的同一性和相似度的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA，Atschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLAST X程序可以从NCBI和其它来源获得(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。例如，通过使用一种计算机算法诸如GAP(Genetic ComputerGroup，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，对要确定序列同一性百分比的两种蛋白或多肽进行比对，以得到它们各自氨基酸的最优匹配(“匹配跨度”，通过算法确定)。
与算法结合使用空位开放罚分(计算方式是3×(乘)平均对角线；″平均对角线″是使用的比较矩阵的对角线平均值；″对角线″指的是通过特定比较矩阵给每个完美氨基酸匹配赋予的评分或数目)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62。算法也可以使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff et al.Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919)。然后可通过算法计算出同一性百分比。与比较目标氨基酸相比，同系物典型具有一个或多个氨基酸的取代基、缺失和/或插入。
术语“肽模拟物”或“模拟物”指的是模拟肽或蛋白的生物活性的生物活性化合物，但在化学性质上并非是肽，也就是说，它们不含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)。此处的术语肽模拟物是广义的含意，包括在性质上不完全是肽的分子，诸如拟肽、半肽和类肽。广义肽模拟物(肽的一部份被缺乏肽键的结构所替代)的例子如下所述。本发明的完全或部分非肽的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，这些部分非常类似于目标肽中活性基团的三维排列，所述肽模拟物基于所述目标肽。作为该相似活性位点几何学的结果，肽模拟物对生物系统具有作用，该作用与目标肽的生物活性相似。
本发明肽模拟物优选基本上在三维形状和生物学活性上都与此处描述的目标肽相似。本领域公知的结构上修饰肽以制造肽模拟物的方法的例子包括逆转主链上的手性中心以生成D-氨基酸残基结构，其(特别是在N-末端上)可促进对抗蛋白水性降解的稳定性，而不会不利地影响活性。提供的一个例子描述于“Tritriated D-ala1-Peptide TBinding”，Smith C.S.et al.，Drug Development Res.，15，pp.371-379(1988)。第二个方法是改变环状结构以获得稳定态，诸如N至C链之间的亚酰胺和内酰胺(Ede et al.in Smith and Rivier(Eds.)“PeptidesChemistry and Biology”，Escom，Leiden(1991)，pp.268-270)。另一个例子是关于构象受到限定的胸腺五肽样化合物，诸如记载于美国专利号4,457,489(1985)之中的那些。第三个方法是通过使用赋予对蛋白水解的抗性的拟肽键取代目标肽中的肽键。
许多拟肽键是被这样描述的，其通常不会影响肽结构和生物活性。该方法的一个例子是取代逆向-反向拟肽键(“Biologically activeretroinverso analogues of thymopentin”，Sisto A.et al in Rivier，J.E.and Marshall，G.R.(eds)“Peptides，Chemistry，Structure and Biology”，Escom，Leiden(1990)，pp.722-773)和Dalpozzo，et al.(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41561-566，在此引入作为参考)。根据此修饰，肽的氨基酸序列可以与目标氨基酸序列的序列一致，除了有一个或多个肽键被逆向-反向拟肽键取代。优选的，大部分的N-末端肽键被取代，因为这种取代可赋予对在N-末端起作用的外肽酶的蛋白水解的抗性。进一步的修饰也可通过用其他具有相似结构的化学基团置换氨基酸的化学基团来实现。其他适宜的已知的可促进对酶裂解的稳定性而不丧失或基本不丧失生物学活性的合适拟肽是减少的等构物拟肽键(Couder，et al.(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41181-184，此处以其整体引入作为参考)。
由此，这些肽的氨基酸序列可以与目标氨基酸的序列相一致，除了一个或多个肽键被等构物拟肽键取代。优选的，大部分N-末端肽键被取代，因为这种取代可以赋予对在N-末端起作用的外肽酶的蛋白水解的抗性。合成具有一个或多个减少的等构物肽键的肽的方法是本领域已知的[Couder，et al.(1993)，如上文的引用]。其他的例子包括导入酮亚甲基或甲基硫化物键以替换肽键。
类肽衍生物代表另一类的肽模拟物，其保留了生物活性的结构簇，但是除去了肽键，因此具有蛋白水解抗性(Simon，et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371在此处以全文引入)。类肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已经描述了一系列的N-烷基，每一个都相应于对应天然氨基酸的侧链(Simon，et al.(1992)，如上文的引用)。目标分子的一些或全部氨基酸都可用相应于取代的氨基酸的N-取代的甘氨酸来取代。
术语“肽模拟物”或“模拟物”也包括反向-D肽和对映异构体。术语“反向-D肽”指的是与目标肽的L-氨基酸序列相比，由反向顺序排列的D-氨基酸组成的生物活性蛋白或肽。术语“对映异构体”指的是目标肽的氨基酸序列中的一个或多个L-氨基酸残基被相应的D-氨基酸残基取代的、具有生物活性的蛋白或肽。
已经分离了各种LOX-1，并且对它们进行了测序，显示出它们在物种之间有显著的不同[Chen，M.，et al.，J.Biochem.，355289-95(2001)]。美国专利号5,962,260和6,197,937公开了人和牛LOX-1的氨基酸序列。使用在这些文献中公开的技术从任何物种分离出LOX-1，可以很容易建立起HSP肽(E)与LOX-1的结合。
由此，结合部分(E)可以通过已知技术(典型的为分离或合成)获得，条件是已知LOX-1多肽的氨基酸序列。只与LOX-1的特定部位相结合的部分(E)同样只能在得到已知和/或预期的抗原决定簇或表位结合位点的条件下合成。
可以有很多方法来筛选或评估不同E基团的亲和力。例如，一个方法包括基于荧光的体外试验。基于细胞的测定可同时提供关于检测所需的产生信号的实体的量，因此需要与结合部分(E)缀合。在所述试验中，荧光染料优选通过柔性连接体与HSP肽的N-末端连接，所述连接体诸如氨基酸序列KKGG(K＝赖氨酸，G＝甘氨酸)。在N-末端与没有其他用于连接染料的功能末端的信号部分连接的情况下，染料也可以通过掺入序列中的K残基(如连接体)的侧链酰胺进行连接。
无论使用的筛选测定(例如，遗传性体外模型)的种类如何，首先需假定LOX-1在基质表面上的量是已知的，无论其为细胞或其他基质。在一个多孔透明平板上，LOX-1(可作为纯的LOX-1蛋白或在细胞上表达)可均匀分布于孔中。然后加入被标记的HSP肽，并以最优的时间量在不同的孔中进行温育。这些孔之后用缓冲液进行充分洗涤，缓冲液可诸如磷酸缓冲盐水(PBS)，然后对平板进行成像，用激光照射以激发和产生所连接的染料的荧光。每一孔中产生的荧光强度，以及不同肽的结合程度都可以定量化。为了获得绝对结合数，通过在结合测定的相似条件下获得已知量的染料缀合的HSP肽的荧光强度而进一步校准信号。如果LOX-1分子的数量是已知的，并且确定了结合的肽的量，用以评价结合亲和力的解离常数也可以计算出来。因此，可以定量筛选不同的HSP肽，得到其结合亲和力。每个细胞中结合的肽的数量也可提供关于参数的信息，所述参数是从缀合于肽的产生信号的实体获得可检测信号所必须的。
可以通过使用激光共焦显微镜或成像仪来获得测定中的图像。例如，可以按照以下步骤，用激光共焦显微镜获得与细胞结合的肽的图像HCAE细胞可以在高质量硅酸硼8-隔室载玻片(ElectronMicroscopy Sciences，Fort Washington，PA)上生长。然后，向细胞中加入约为10μL的1mg/ml的标记肽的水溶液，温育1小时。然后，优选用HBSS缓冲液洗涤细胞3次。然后细胞用4％甲醛溶液固定10分钟。在最后一次用缓冲液洗涤后，对载玻片进行成像。优选使用OLYMPUS激光扫描共焦显微镜、型号Fluoview 300，使用氩-离子激光(选择488nm光线)和510-nm长径滤光器获得图像。可通过两种通道获得图像反射光和荧光模式通道，或者两种都采用。进一步，可以使用，例如共焦显微镜来研究内化水平。共焦显微镜具有三维扫描能力，由此可探测到细胞内部以及跨细胞-表面的平面。由此，可以检测到荧光剂是否被内化到细胞中。
为了进行更高流通量的筛选，可以扩展上述方法用96-孔板替代8-孔载玻片，并且用Biorad成像仪，型号FX Proplus替换共焦显微镜。例如，荧光素标记的与细胞结合的HSP的图像可以使用成像仪获得，其中的HCAE细胞可以在标准商业96-孔板(Becton-Dickenson，Franklin Lakes，NJ)上铺板并生长。然后，向细胞中加入约10μL的1mg/ml的标记的HSP水溶液，并温育1小时。然后，优选用PBS缓冲液洗涤细胞3次。在最后一次使用缓冲液洗涤之后，载玻片使用Biorad成像仪进行成像，其选择“荧光素”作为荧光团。
信号部分(SIG)“信号部分”SIG提供可在体内或体外被检测到的信号。SIG可以通过自身或者通过与另一种物质反应而成像，并且可以通过检测装置在体内或体外被检测到。适宜的信号部分(SIG)包括发光染料、放射性核素、近红外染料、磁活性同位素、超顺磁颗粒、Z值大于50的金属离子、包封的物质诸如胶束、脂质体、聚核糖体、气体填充的微泡以及它们的组合。任何信号部分/来源都可使用，只要其能与结合部分(E)相结合并不会破坏E和LOX-1的结合，同时能产生可检测的信号。
适宜体内成像的SIG部分包括·作为用于单光子发射计算体层摄影(SPECT)成像的γ发射体的放射性核素；·作为用于正电子发射体层摄影(PET)的正电子发射体的放射性核素；·染料，其可以是用于光学成像的荧光或化学发光染料；·含高-Z元素，优选碘或铋的分子，用于X-射线成像、计算机体层摄影(CT)；·用于超声检查法的气体填充的微泡、氟碳化合物填充的胶束；·用于核磁共振成像(MRI)的顺磁离子，诸如螯合的Gd+++，或超顺磁颗粒，诸如超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIO)；或者·纳米颗粒级超顺磁颗粒，优选含有氧化铁和铁元素中至少一种的纳米颗粒。
优选的SIG基团适宜体内成像。所述SIG基团可以在哺乳动物体外检测，或者通过使用专为体内使用设计的检测器，例如血管内辐射或光学检测器诸如内窥镜检测，或者使用设计用于手术中使用的辐射探测器而进行检测。优选的体内SIG基团是那些可以在体内给予之后以非介入性方式进行外部检测的基团。最优选的适于体内成像的SIG基团是放射性的、特别是放射性金属离子、发射γ射线的放射性卤素和发射正电子的放射性非金属，特别是那些适于使用SPECT或PET成像的基团。
适于体内成像的SIG最优选地选自(i)放射性金属离子；(ii)顺磁金属离子；(iii)发射γ射线的放射性卤素；(iv)发射正电子的放射性非金属；(v)超极化的NMR-活性原子核；(vi)适于体内光学成像的报道物；(vii)适于血管内检测的β-发射体。
当SIG是放射性金属离子，也即射电金属时，适宜的射电金属可以是正电子发射体诸如64Cu、48V、52Fe、55Co、94mTc或68Ga；或者是γ-发射体诸如99mTc、111In、113mIn或67Ga。优选的射电金属是99mTc、64Cu、68Ga和111In。最优选的射电金属是γ-发射体，特别是99mTc。
当SIG是顺磁金属离子时，适宜的所述金属离子包括Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)或Dy(III)。优选的顺磁金属离子是Gd(III)、Mn(II)和Fe(III)，特别优选的是Gd(III)。
当SIG是发射γ射线的放射性卤素时，放射性卤素适宜选自123I、131I或77Br。优选的发射γ射线的放射性卤素是123I。
当SIG是发射正电子的放射性非金属时，所述适宜的正电子发射体包括11C、13N、15O、17F、18F、75Br、76Br或124I。优选的发射正电子的放射性非金属是11C、13N、18F和124I，特别优选的是11C和18F，最优选的是18F。
当SIG是超极化NMR-活性原子核时，所述NMR-活性原子核具有非-零核自旋，且包括13C、15N、19F、29Si和31P。其中优选的是13C。术语“超极化”指的增强NMR-活性原子核的极化程度，超过其平衡极化。在超极化之前，13C(相对于12C)的天然丰度约为1％，适宜的13C-标记化合物适宜地富集至丰度至少为5％，优选至少50％，最优选至少90％。式(I)化合物的至少一个碳原子适宜地富含13C，其随后进行超极化。
当SIG是适于体内光学成像的报道物时，此报道物可以是任何可直接或间接在光学成像过程中被检测到的部分。报道物可以是光散射体(例如，有色或无色颗粒)、光吸收剂或光发射体。更为优选地，报道物是一种诸如发色团或荧光化合物的染料。该染料可以是任何的可干扰波长从紫外线到近红外线的电磁谱中的光的染料。最优选地，报道物具有荧光性质。
优选的有机发色报道物和荧光报道物包括具有广泛非定域电子系统，如花青、部花青、靛青、酞青、naphthalocyanines、三苯基次甲基染料、卟啉、pyrilium染料、thiapyriliup染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、indoanilines、benzophenoxazinium染料、benzothiaphenothiazinium染料、蒽醌、萘醌、阴丹士林、phthaloylacridones、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料复合物、芳庚酮、四嗪、二(dithiolene)复合物、二(苯-二硫醇盐)复合物、iodoaniline染料、二(S，O-dithiolene)复合物。也可以使用荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)和GFP的修饰形式具有不同的吸收/发射性质。在某些上下文中，某些稀土金属(例如，铕、钐、铽或镝)的复合物可作为荧光纳米晶体使用(量子点)。
所使用的发色团的特定的例子包括荧光素、磺基若丹明101(Texas Red)、若丹明B、若丹明6G、若丹明19、靛氰绿、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green88、Oregon Green 514、tetramethylrhodamine、和Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750。
特别优选的是在400nm和3μm之间，特别是600和1300nm之间的可见光和近红外区域具有最大吸收值的染料。
光学成像模式和测定技术包括但不限于发光成像；内窥镜检查；荧光内窥镜检查；光学相干体层摄影；透射成像；时间分辨透射成像；共焦成像；非线性显微镜检查法；光声成像；声光成像；光谱法；反射光谱法；干涉测量法；相干干涉测量法；漫射光学体层摄影术和荧光介导的漫射光学体层摄影术(连续波长、时间域和频率域系统)以及光散射、吸收、极化、发光、荧光时间、量子产量和猝灭的测量。
当成像部分是适于血管内检测的β-发射体时，适宜的所述β-发射体包括射电金属67Cu、89Sr、90Y、153Sm、186Re、188Re或192Ir和非金属32P、33P、38S、38Cl、39Cl、82Br和83Br。
特别优选的信号部分包括荧光素、11C、18F、52Fe，62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd和175Lu、超顺磁氧化铁纳米颗粒、重金属离子、气体填充的微泡、光学染料、卟啉、texaphyrins、它们的高度碘化的有机化合物螯合物、含有前述至少一种成分的聚合物、含有至少一种前述成分的endoedral fullerenes，以及它们的混合物。甚至更优选的，信号部分对于PET是18F；对于MRI是超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIO)或螯合的Gd、对于X-射线CT是碘，对于SPECT是99mTc。在体内成像的一个特别优选的实施方案中，SIG是选自18F、11C、68Ga和64Cu(用于PET)的发射正电子的放射性同位素，或者是选自123I和99mTc(用于SPECT)的γ发射放射性同位素。最优选的，信号部分对于PET是18F。
可通过本领域公知的方法导入SIG。放射性SIG基团可通过对适宜前体进行放射性标记而很容易地导入。“前体”适宜地含有结合部分E的非放射性衍生物，其设计使得与所需的非金属放射性同位素的方便的化学形式的化学反应可以通过寥寥几步便可实施(理想状态只需一步)，而不需要显著的纯化(理想状态不需要进一步的纯化)以获得所需的放射性产物。所述前体是合成的并且可以便利地以良好的化学纯度获得。“前体”可任选含有用于HSP肽的某些官能团的保护基团(PGP)。适宜的前体描述于Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)。
术语“保护基团”(PGP)指的是一种抑制或阻抑不希望的化学反应的基团，但是又设计为在不会引起分子其他部分发生改变的温和条件下能从目的官能团脱去的基团。在脱保护基后可获得所需的产物。保护基团是本领域中公知的，并且对于胺基团，可以适宜地选自Boc(Boc是叔-丁氧羰基)、Fmoc(Fmoc是芴基甲氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环亚己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰)；对于羰基，保护基团适宜地选自甲基酯、叔-丁基酯或苄基酯。对于羟基而言，适宜的保护基团是甲基、乙基或叔-丁基；烷氧基甲基或烷氧基乙基；苄基；乙酰基；苯甲酰基；三苯甲基(Trt)或三烷基甲硅烷基诸如四丁基二甲基甲硅烷基。对于巯基而言，适宜的保护基团是三苯甲基和4-甲氧苄基。其他保护基团的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis’，Theorodora W.Greene and Peter G.M.Wuts，(Third Edition，John Wiley & Sons，1999)。
用非金属放射性同位素进行放射性标记的优选前体是包括衍生物的那些，所述衍生物进行亲电或亲核卤化反应；用选自卤代烷基或卤代氟化烷基、甲苯磺酸盐/酯、triflate(如三氟甲磺酸盐/酯)或甲磺酸盐/酯进行温和烷基化；使硫醇部分烷基化，以形成硫醚键；或者与标记的醛或酮进行缩合。第一类所述物质的例子是(a)有机金属衍生物诸如三烷基锡烷(例如，三甲基锡烷基或三丁基锡烷基)、或者三烷基硅烷(例如，三甲基甲硅烷基)；(b)用于卤素交换的非放射性碘代烷基或溴代烷基和用于亲核卤化反应的甲苯磺酸烷酯、甲磺酸烷酯或三氟甲磺酸烷酯；(c)向亲电卤化反应活化的芳环(例如，酚类)和向亲核卤化反应活化的芳环(例如，芳基碘，芳基重氮、芳基三烷基铵盐或硝基芳基衍生物)。
温和烷基化的优选的衍生物是醇、酚或胺基团，特别是酚和空间无位阻的伯胺或仲胺。
使含有硫醇的放射性同位素反应试剂烷基化的优选衍生物是N-卤代乙酰基基团，尤其是N-氯乙酰基和N-溴乙酰基衍生物。
“前体”可任选共价结合于固体支持基质。通过这种方式，所需成像剂产品在溶液中形成，其中起始原料和杂质仍结合在固体相中。用18F-氟化物进行固相亲电氟化作用的前体描述于WO 03/002489中。用18F-氟化物进行固相亲核氟化作用的前体描述于WO 03/002157。
当SIG是放射性卤素诸如碘时，前体适宜地包括非放射性卤素原子诸如碘代芳基或溴代芳基(以进行放射性碘交换)；活化的前体芳环(如酚基团)；有机金属化合物(例如，三烷基锡或三烷基甲硅烷基)；或有机前体诸如三氮烯或亲核取代的良好离去基团，诸如碘盐。导入放射性卤素(包括123I和18F)的方法记载于Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]。适宜的与放射性卤素，特别是碘连接的前体芳基的例子如下所示 它们都含有可允许放射性碘温和取代到芳环上的取代基。另外可选的含有放射性碘的取代基可以通过放射性卤素交换而直接碘化合成，例如 当SIG是碘的放射性同位素时，放射性碘原子优选通过直接共价键连接到芳环诸如苯环或乙烯基上，因为人们公知碘原子易于在体内代谢中连接到饱和脂族系统上，由此丧失了放射性碘。
当SIG是氟的放射性同位素时，放射性氟原子可以形成氟代烷基或氟代烷氧基的一部份，因为氟代烷基可抵抗体内代谢。另外，放射性氟原子可通过直接共价键连接到芳环诸如苯环上。放射性氟化作用可通过直接标记法进行，其中采用了18F-氟化物与适宜的具有良好离去基团诸如溴代烷基、甲磺酸烷酯或甲苯磺酸烷酯的前体的反应。18F也可通过用烷化剂诸如18F(CH2)3OMs(其中Ms是甲磺酸盐/酯)对胺前体进行N-烷基化得到N-(CH2)318F，或用18F(CH2)3Oms或18F(CH2)3Br对羟基进行O-烷基化而导入的。18F还可通过用18F(CH2)3OH试剂对N-卤乙酰基基团进行烷基化以获得-NH(CO)CH2O(CH2)318F衍生物而导入。对于芳基体系，从芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐进行18F-氟化物亲核置换是芳基-18F衍生物的适宜途径。
含有伯胺基团的前体也可用18F标记，所述标记是通过使用18F-C6H4-CHO而进行还原胺化而实施，如Kahn et al[J.Lab.Comp.Radiopharm.45，1045-1053(2002)]and Borch et al[J.Am.Chem.Soc.93，2897(1971)]所记载的。该方法同样对于芳基伯胺也适用，诸如含有苯基-NH2或苯基-CH2NH2基团的化合物。
18F-标记的优选的方法是使用肽的氨氧基衍生物作为前体，如Poethko et al[J.Nuc.Med.，45，892-902(2004)]所教导的。所述前体之后与18F-C6H4-CHO在酸性条件下(例如，pH2-4)进行缩合，通过肟醚键得到所需的18F-标记的成像剂。肟醚相对于亚胺具有的优点是对水解的抵抗力更强。
含胺的前体也可通过与18F-标记的活性酯的反应用18F标记，以获得酰胺键产物，所述酯诸如 所示的N-羟基琥珀酰亚胺酯以及其用于标记肽的用途记载于Vaidyanathan et al[Nucl.Med.Biol.，19(3)，275-281(1992)]andJohnstrom et al[Clin.Sci.，103(Suppl.48)，45-85(2002)]。18F-标记的衍生物的合成途径的进一步的详细说明描述于Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)。
当SIG包含金属离子时，金属离子以金属复合物的形式存在。术语“金属复合物”指的是具有一个或多个配体的金属离子的配位复合物。特别优选的，金属复合物是“抗反式螯合”的，也即不容易与金属配位位点的其他潜在竞争性配体进行配体交换。潜在竞争性的配体包括HSP肽本身加上体外制备的赋形剂(例如，制备时所使用的辐射防护剂或抗菌防腐剂)，或者体内的内源性化合物(例如，谷胱甘肽、运铁蛋白或血浆蛋白)。
从前体衍生的金属复合物是缀合物(也即，缀合的金属配体)，其中的配体与E或其他的连接基团L(如果存在)共价键合。
本发明中用于形成对反式螯合具有抵抗作用的金属复合物的适宜的配体包括螯合剂，其中的2-6个优选2-4个金属供体原子的排列使得能获得5-或6-元螯合环(通过具有任一碳原子的非配位主链或连接金属供体原子的非配位杂原子)；或者含有与金属离子强结合的供体原子的单齿配体，诸如异腈、膦或diazenides。与金属结合良好、作为螯合剂的一部分的供体原子类型的例子是胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成所述强金属复合物，使得甚至单齿或二齿膦形成适宜的金属复合物。异腈和diazenides的线性几何学使得它们不会被轻易掺入螯合剂中，由此典型地可作为单齿配体使用。适宜的异腈的例子包括简单烷基异腈诸如叔-丁基异腈和醚取代的异腈诸如mibi(也即，1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。适宜的膦的例子包括Tetrofosmin、和单齿膦，诸如三(3-甲氧丙基)膦。适宜的diazenides的例子包括HYNIC系列的配体，也即肼-取代的吡啶或烟酰胺。
形成抗反式螯合的金属复合物的、用于锝的适宜螯合剂的例子包括但不限于(i)下式的二胺二肟 其中的E1-E6各自独立地表示R′基团；每一R′是H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10氟代烷基、C2-10羧基烷基或C1-10氨基烷基，或者两个或多个R′基团与它们连接的原子一同形成碳环、杂环、饱和的或不饱和的环，其中一个或多个R′基团与式(I)中的-(L)nE缀合；Q是式-(J)f-的桥连基；其中的f是3、4或5，且每个J独立为-O-、-NR′-或-C(R′)2-，条件是-(J)f-包含的J基团中最多只有一个是-O-或-NR′-。
优选的Q基团如下所示Q＝-(CH2)(CHR′)(CH2)-也即丙二胺肟或PnAO衍生物；Q＝-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-也即戊二胺肟或PentAO衍生物；Q＝-(CH2)2NR′(CH2)2-。
E1至E6优选地选自C1-3烷基、烷基芳基、烷氧基烷基、羟基烷基、氟代烷基、羧基烷基或氨基烷基。最优选地，每一E1至E6基团是CH3。
缀合优选在E1或E6R′基团中存在，或者在Q部分的R′基团中存在。更优选地，HSP肽与Q部分的R′基团缀合。当HSP肽与Q部分的R′基团缀合时，R′基团优选位于桥头的位置。在此情况下，Q优选是-(CH2)(CHR′)(CH2)-、-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-或-(CH2)2NR′(CH2)2-，最优选是-(CH2)2(CHR′)(CH2)2-。特别优选的双功能二胺二肟螯合剂具有下式 (螯合剂1)以使HSP肽可通过桥头的-CH2CH2NH2基团缀合。
(ii)具有诸如MAG3(巯基乙酰基三甘氨酸)的硫醇三酰胺供体组的N3S配体和相关配体；或者具有诸如Pica的二酰胺吡啶硫醇供体组的N3S配体；
(iii)具有诸如BAT或ECD(也即，双半胱乙酯)的二胺二硫醇供体组、或诸如MAMA的酰胺胺二硫醇供体的N2S2配体；(iv)N4配体，其是具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供体组，诸如cyclam、monoxocyclam或dioxocyclam的开链或大环配体。
(v)具有二胺二苯酚供体组的N2O2配体。
上述配体特别适于复合锝，例如，94mTc或99mTc，这些配体更为详细地描述记载于Jurisson et al[Chem.Rev.，99，2205-2218(1999)]。所述配体也适于其他的金属，诸如铜(64Cu或67Cu)、钒(例如，48V)、铁(例如，52Fe)或钴(例如，55Co)。其他适宜的配体记载于Sandoz的WO91/01144，其中包括特别适于铟、钇和钆的配体，特别是大环氨基羧酸盐和氨基磷酸配体。形成非离子的(即中性的)钆金属复合物的配体是已知的并且记载于US 4885363。放射性金属离子是锝时，配体优选的时一种四齿螯合剂。优选的用于锝的螯合剂是二胺二肟，或上述具有N2S2或N3S的供体组的那些。
连接剂L包括任何能够将Y，也即信号部分SIG或治疗剂TA连接于结合部分(E)的部分。在每一所述实施方案中，L可以进行独立的选择。例如，连接剂可以是至少为2价的有机基团、结合至少一个金属阳离子的金属螯合剂，或它们的组合。在很多情况下，优选包括L，以连接SIG至E，或者连接TA至E。也即，在式(I)中的n是1。如上文所述，当SIG是金属时，L可任选含有金属-配位配体或螯合剂。
至少为2价的有机部分可用作L，包括小分子有机部分诸如苯甲酸酯或丙酸酯(图4)。有机基团可以通过共价或离子结合到E和Y上。作为连接剂使用的适宜的有机部分典型的具有约1-10000个碳原子，并可以包括选自下组的有机基团亚烷基、亚芳基、环亚烷基、氨基亚烷基、氨基亚芳基、氨基环亚烷基、硫代亚烷基、硫代亚芳基、硫代环亚烷基、氧化亚烷基、氧化亚芳基、氧化环亚烷基、酰基亚烷基、酰基亚芳基、酰基环亚烷基单元，及它们的组合。特别优选的酰基亚芳基单元是具有如下结构的4-酰基亚苯基
其他适宜的连接剂包括金属螯合剂，诸如以下一个或多个DTPA、1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N’，N”-三乙酸(NOTA)、对-溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮杂环癸烷四乙酸(DOTA)、EDTA和CHXa。优选的金属螯合剂可与至少一种选自52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、154- 158Gd、和175Lu的阳离子的金属相结合。
如本领域技术人员所知的，各种连接剂都与某些信号部分一同使用。例如，金属信号发生部分，诸如64Cu，典型地需要一个连接配体，而18F不需要。此外，标记的辅基诸如18F-氟代丙酸酯或18F-氟代苯甲酸酯(图4)可以使用，一旦制备后，它们可以通过活性酯缀合而与肽缀合。
L优选为式-(A)z-基团，其中每一A独立地为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-，-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、C5-12亚芳基、或C3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或者单分散聚乙二醇(PEG)单元；R则独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；Z是0-10的整数；且式(I)的连接基团(L)的功能是将信号部分与HSP肽的活性位点相分割。当SIG相对较大(例如，金属复合物)时，这是特别重要的，这样抑制剂到LOX-1的结合就不会收到损害。这可以通过组合柔性(例如，简单的烷基链)来获得，这样大的基团可以具有使其离开活性位点的自由度，和/或可以通过组合刚性来获得，如使金属复合物离开活性位点的环烷基或芳基间隔基。
连接基团的性质也可用于调节成像剂的生物分布。由此，例如，在连接体中导入醚基团可有助于减少血浆蛋白结合。当L包括有聚乙二醇(PEG)单元或肽链(适宜地含有1-10个氨基酸残基)时，连接基团可用于调节成像剂的体内药物动力学和血浆清除率。所述“生物调节剂”连接基团可加速成像剂从背景组织，诸如肌肉或肝脏和/或血液中的清除率，由此因为背景干扰减少，可获得更好的诊断图像。生物调节连接基团也可有助于特定的排泄途径，例如，通过肾脏排泄，而不是通过肝脏。
当L含有1-10个氨基酸残基的肽链时，氨基酸残基优选地选自甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L-含有PEG部分时，其优选含有从式IIA或IIB的单分散PEG样结构的低聚衍生的单元 (17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸)其中的p是1-10的整数，其中的C-末端单元(*)与信号部分相连接。或者，可以使用以式IIB的丙酸衍生物为基础的PEG样结构 其中的p如式IIA所定义，q是3-15的整数。
在式IIB中，p优选的是1或2，q优选的是5-12。
当连接基团不包括PEG或肽链时，优选的-(A)n-基团具有连接的原子组成的主链，所述原子构成了2-10个原子，优选2-5个原子，特别优选2或3个原子组成的-(A)n-部分。2个原子组成的最小连接基团主链具有的优点是，成像部分可以很好地与HSP肽分开，这样可以将任何的相互作用最小化。
非肽连接基团，诸如亚烷基或亚芳基的优点是，不会与缀合的HSP肽发生显著的氢键相互作用，这样连接体就不会缠绕在一起。优选的亚烷基间隔基是-(CH2)d-，其中的d是2至5。优选的亚芳基间隔基具有如下的通式 其中a和b独立地是0、1或2。
连接基团-(A)n-优选含有二甘醇酸部分、马来酰亚胺部分、戊二酸、琥珀酸、赖氨酸-甘氨酸衍生物诸如KKGG、基于聚乙二醇的单元或者式IIA或IIB的PEG样单元。
在某些情况下，诸如产生信号的试剂，如18F或11C的情况下，连接体可能不需要连接产生信号的试剂或治疗剂。相似地，放射性同位素可直接通过共价键连接在E上。在这种情况下，HSP肽可简单地使用放射性同位素进行标记。术语“标记”指的是官能团含有SIG，或SIG作为附加物进行连接。当官能团中含有SIG时，表示‘信号部分’形成化学结构的一部份，放射性同位素以显著高于所述同位素的天然丰度的水平存在。所述提高了的或者富集了的同位素水平可适宜地是考虑的同位素的天然丰度水平的至少5倍，优选至少10倍，更优选至少20倍；理想地是至少50倍，或者以使考虑的同位素的富集水平是90％至100％的水平存在。所述官能团的例子包括具有水平升高的11C的CH3基团和具有水平升高的18F的氟代烷基基团，这样SIG就是化学结构内同位素标记的11C或18F原子。放射性同位素3H和14C并不是适宜的体内成像部分。
在此文中描述了合成用于标记部分(E)的、识别LOX-1的肽配体连接体(L)的方法，以及直接标记结合LOX-1的结合试剂的方法。
肽合成HSP肽可使用N□-Fmoc-保护的氨基酸的标准固相技术合成，其中在25微摩尔的规模(Fmoc＝芴基甲氧羰基)上使用2，4-二甲氧基二苯甲基胺树脂(Rink Amide AM)。肽可使用Rainin/Protein TechnologySymphony固相肽合成仪(Woburn，MA)合成。在任何化学过程之前，树脂在二氯甲烷中溶胀1小时，然后与DMF(二甲基甲酰胺)进行交换半小时或更长的时间。每个偶联反应都在室温下，在含有5当量的氨基酸的DMF中进行。反应时间典型的为45分钟，对于预期难以偶联的残基是1小时(例如，将异亮氨酸I以IPP序列偶联到脯氨酸P上)。所使用的偶联试剂是HBTU(O-苯并三唑基-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)，碱为NMM(N-甲基吗啉)。在每一步骤中，偶联试剂以相对于所估计的树脂容量的5倍当量的规模提供，反应在2.5ml 0.4MNMM的DMF溶液中进行。反应不会干扰氨基酸的侧链，如果存在反应性基团，氨基酸侧链已经典型地被对酸敏感的基团保护起来。通常，酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸侧链可以相应的叔-丁醚形式保护。谷氨酸侧链可以相应的叔-丁醚形式进行保护。赖氨酸和鸟氨酸侧链用Boc进行保护。谷氨酰胺侧链以γ-三苯甲基衍生物形式进行保护，精氨酸侧链则以2，2，5，7，8-五甲基-色满-6-磺酰衍生物形式进行保护。
在每个偶联反应之后，N-末端Fmoc-保护的胺使用20％哌啶的DMF溶液在室温下脱保护两次，约15分钟。在加入最后的残基后，用DMF和二氯甲烷彻底冲洗仍然留在肽合成仪上的树脂。
本发明使用了一种由1mL的TFA、2.5％TSP(三异丙基硅烷)和2.5％的水组成的混合物以使肽从树脂中分离。树脂和混合物在室温下搅拌约3至4小时。使用玻璃纤维使树脂珠滤出，然后用2-3ml的TFA冲洗。肽用40ml冰冷的醚沉淀，并在3000-4000rpm转速下离心直至在离心管底部形成沉淀物。倾倒出醚，沉淀物重新在冷醚(40mL)中混悬，并再次离心；重复该操作2至3次。在最后一次冲洗时，向30ml的冷醚中加入10ml的Millipore水，再次离心混合物。倾倒出醚。含有粗肽的水层转移到圆底烧瓶中进行冷冻干燥。
肽的合成可通过质谱进行验证，使用的是飞行时间基质辅助的激光解吸光谱法(MALDI-TOF)。也可使用初步的LC/MS技术在粗合成混合物中表征纯产品。
连接体的合成在荧光素染料、5(6)-羧基荧光素与合成肽的N-末端的偶联过程中，优选包括以与上述氨基酸相同的方式向树脂中加入染料、HBTU和NMM。在反应后，优选用DMF和二氯甲烷彻底洗涤树脂，并在氮气流干燥。含有1mL TFA、2.5％TSP(三异丙基硅烷)和2.5％水的混合物可用于使肽从树脂中分离。树脂和混合物优选在室温下搅拌约3至4小时。然后使用玻璃纤维将树脂珠滤出，随后使用2-3ml的TFA冲洗。然后优选用冰冷的醚(40mL)对肽进行沉淀并离心(例如，在3000-4000rpm转速下)，直至在离心管底部形成沉淀。可以倾倒出醚，然后将沉淀重新混悬在冷醚(40mL)中，并再次离心—该操作可重复2至3次。在最后的洗涤中，优选向30ml的冷醚中加入10ml的Millipore水，然后再次离心混合物。然后倾倒出醚，含有粗肽的水层可以转移到圆底烧瓶中用于冷冻干燥。肽合成的粗产率通常为90％。典型地没有观察到未标记的肽。
优选地，肽可使用反相半制备或制备HPLC进行纯化，使用的柱子是C4-二氧化硅柱(Vydac，Hesperia，CA)。肽的色谱图可以在220nm下监测，该波长与酰胺发色团的吸收值相对应。在495nm下监测同样可以观察，并保证肽上荧光素染料的存在。优选使用包括CH3CN/TFA(乙腈/三氟乙酸；100∶0.01)和H2O/TFA(水/三氟乙酸；100∶0.01)洗脱液的溶剂体系，半制备和制备色谱的洗脱液的流速分别为3ml/min和10ml/min。对于半制备和制备色谱，溶解在Millipore水中的粗肽可以1.5mg和5-10mg肽的规模注入。分析色谱图表以确保良好的分辨率和峰形。所有肽的梯度条件典型为30分钟内5至50％的CH3CN/TFA(100∶0.01)。纯化的肽可以通过基质辅助的激光解吸飞行时间质谱法进行确认。
治疗剂本发明的治疗剂(TA)包括但不限于药物化合物或组合物和生物活性组合物，诸如例如，抗生素，镇痛药、疫苗、抗炎药、抗抑郁药、抗病毒剂、抗肿瘤剂、酶抑制剂、含齐多夫定的制剂、大分子多肽、作为抗病毒和抗肿瘤剂的芳族硝基和亚硝基化合物和它们的代谢物、HIV蛋白酶抑制剂、病毒和甾体、促进生长的组合物诸如激素、或者其他刺激生长的试剂、它们的混合物，等等。
生物活性成分可选自任何已知的活性材料，这些材料在内化到细胞中之后，可提供增强了的效力，诸如抗癌剂。活性成分可包括，例如，抗代谢物诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(ARAc)、6-巯嘌呤、甲氨喋呤；烷化剂诸如氮芥、环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂；植物生物碱诸如长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP16)；抗生素诸如丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星；或激素诸如他莫昔芬或氟他胺。
在第二种实施方案中，本发明提供了一种以适于哺乳动物给药的形式存在的含有式I化合物和的生物相容性载体的组合物。对于药物组合物而言，式I的必须特点以及其优选的实施方案如上文第一个实施方案中所述。
“生物相容性载体”是流体，特别是液体，试剂可以混悬或溶解在其中，这样化合物可以是生理可耐受的，也即，可以给予哺乳动物身体而不会导致毒性或过度的不适。生物相容性载体适宜的是可注射的载体液体，诸如无菌的、无热源的注射用水；水溶液，诸如乙醇水溶液或盐水(可有利地进行平衡，以使最终注射产物达到等渗)；一种或多种渗透压调节物质的水溶液(例如，具有生物相容性抗衡离子的血浆阳离子的盐)、糖(例如，葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如，山梨糖醇或甘露醇)、甘醇(例如，甘油)或其他的非离子多元醇(例如，聚乙二醇、丙二醇等等)。优选地，生物相容性载体是不含热源的注射用水或等渗盐水。
所述药物组合物适于在容器中提供，该容器中含有密封装置，适于用皮下针头单次或多次穿刺(例如，皱起的隔膜密封)，同时能保证无菌的完整性。所述容器中可含有单个或多个患者剂量。优选的多剂容器中可含有单个大瓶(例如，10-30cm3体积)，其中含有多个患者剂量，从而单个患者剂量可以在制剂的保质期的不同时间中以各种时间间隔从临床级注射器抽出，以适于临床状况。预填充的注射器设计成含有单个患者剂量，或者“单位剂量”的形式，由此可优选的是一次性的或其他适合临床使用的注射器。当SIG具有放射性时，预填充的注射器可任选具有注射器屏蔽板以保护操作者免受辐射剂量。适宜的所述放射性药物注射屏蔽板是本领域公知的并且优选的含有铅或钨。
当SIG是用于体内成像的放射性核素(也即，放射性药物)时，放射性药物需从试剂盒中制备，如以下第三个实施方案中所述。另外的，放射性药物可以在无菌的制备条件下制备以获得所需的无菌产品。放射性药物也可在无菌条件下制备后，使用例如，γ-辐射、高压灭菌、干热或化学处理(例如，环氧乙烷处理)进行最后的灭菌。优选地，本发明放射性药物从试剂盒中制备。
在第三个实施方案中，本发明提供了一种用于制备第二个实施方案中的药物组合物的试剂盒，其中的SIG包括了放射性同位素或放射性核素。所述试剂盒包括上文所述的“前体”，优选是无菌、无热原形式的，由此与无菌放射性同位素源的反应获得了所需的具有最少操作步骤的放射性药物。所述考虑对于放射性药物而言是非常重要的，因为放射性同位素的半衰期相对较短，并且也是为了便于操作以及减少放射性药物工作者的辐射剂量。由此，所述试剂盒重建所需的反应介质优选的是上文定义的“生物相容性载体”，并最优选是水性的。
适宜的试剂盒容器含有可保持无菌完整性和/或放射性安全的密封容器，并且任选还含有惰性顶部空间气体(例如，氮或氩)，由此可允许溶液通过注射器加入或抽出。优选的所述容器是隔膜密封的管形瓶，其中的气体密闭装置用整体密封装置包被(典型的是铝)。所述容器具有的其他优点是如有需要，可以抵抗真空，例如改变顶部空间气体或脱气体溶液。
非放射性试剂盒可任选进一步含有其他成分，诸如辐射防护剂、抗菌性防腐剂、pH调节剂或填充剂。
术语“辐射防护剂”指的是通过捕获高反应性的自由基诸如从水的射解中得到的含氧自由基来抑制降解反应诸如氧化还原过程的化合物。本发明的辐射防护剂适宜地选自抗坏血酸、对-氨基苯甲酸(也即，4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(也即，2，5-二羟基苯甲酸)及其具有生物相容性阳离子的盐。术语“生物相容性阳离子”指的是可与离子化的、负电荷基团形成盐的正电荷抗衡离子，所述正电荷抗衡离子同样是无毒的并且适于动物体给药，特别是人类给药。适宜的生物相容性阳离子包括碱金属钠或钾、碱土金属钙和镁；以及铵离子。优选的生物相容阳离子是钠和钾，优选的是钠。
术语“抗菌防腐剂”指的是可抑制潜在有害的微生物诸如细菌、酵母和霉菌生长的试剂。抗菌防腐剂也可根据剂量具有某些杀菌性质。本发明的抗菌防腐剂的主要作用是抑制重配后放射性药物组合物中，也即在放射性诊断产品中的任何所述微生物的生长。但是，抗菌性防腐剂可以任选用于在重配前抑制本发明的非放射性试剂盒的一种或多种成分中潜在有害的微生物的生长。适宜的抗菌性防腐剂包括对氨基苯甲酸酯类，即，对氨基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，或者它们的混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和柳硫汞。优选的抗菌性防腐剂是对氨基苯甲酸酯类。
术语“pH调节剂”指的是可保证重配后的试剂盒中的pH值在人或哺乳动物给药可接受的范围(约pH4.0至10.5)之内的化合物或化合物的混合物。适宜的pH调节剂包括药学可接受的缓冲剂，诸如tricine、磷酸盐或TRIS[也即，三(羟甲基)氨基甲烷]和药学可接受的碱，诸如碳酸钠、碳酸氢钠或它们的混合物。当以酸式盐形式使用缀合物时，pH调节剂可任选以独立管形瓶或容器的形式提供，这样试剂盒的使用者可以多步骤程序的一部分来调节pH。
术语“填充剂”指的是药学可接受的用于在生产和冷冻干燥过程中便于材料操作的膨胀剂。适宜的填充剂包括无机盐诸如氯化钠和水溶性糖或糖醇，诸如蔗糖、麦芽糖、甘露醇或海藻糖。
上文描述了试剂盒中使用的“前体”的优选方面。在试剂盒中使用的前体可在无菌操作条件下使用，以获得所需的无菌、无热原的材料。前体也可以在无菌条件下使用，然后用例如γ-辐射、高压灭菌、干热或化学处理(例如，用环氧乙烷)进行最后的灭菌。优选地，前体以无菌、无热原形式使用。更优选地，无菌、无热原的前体在前述密封容器中使用。
试剂盒中的“前体”可任选与上文所述的固体支持物基质共价连接。对于PET放射性药物的制备，试剂盒中可含有一个药筒，其可插在适宜的自动化合成仪上。除了固体支持物结合的前体，药筒中可含有除去不需要的氟离子的柱子，以及连接的适当容器，这样可使得反应混合物蒸发，并且可以根据需要配制产品。合成所需的试剂、溶剂和其他的消耗品都可记载在带软件的光盘中，从而可使得合成者以满足放射性浓度、容积、送递时间等的用户要求的方式操作。方便地，所有的试剂盒中的成分都是一次性的以减少操作之间污染可能性，从而保证无菌和质量。
在第四个实施方案中，本发明提供了一种对组织成像以检测LOX-1的存在和/或量的方法，包括给予哺乳动物式(I)的化合物，其中Y是SIG；任选给予清除剂以除去任何没有与LOX-1结合的式(I)的化合物；并且对哺乳动物进行有效检测SIG产生的信号的成像，以检测LOX-1的存在和/或量。
对于该成像方法，Y是SIG，其他的式(I)的基本特点和优选实施方案在第一个实施方案中有所记载。
术语“清除剂”指的是生物相容的、无毒化合物，其与任何在血流中循环的式(I)化合物相结合以形成易于被肝脏或肾脏排泄的物质，从而从哺乳动物体内除去。
根据特定的与结合部分E相连接的SIG，可使用适宜的成像技术来对靶组织成像。例如，当使用18F作为标记试剂时，进行PET成像。在一个优选的实施方案中，式(I)化合物作为第二个实施方案中的药物组合物给药。
标记的配体可用作诊断剂以辅助疑似过度表达LOX-1的靶组织的成像。该成像方法也可用作诊断性的用途以体内或体外检测人类组织中LOX-1的存在与否，优选体内检测。此外，成像方法可重复数天以获得LOX-1生长或表达程度的定量评估结果。由此，体外成像可以涉及组织或细胞培养物成像，以检测LOX-1的存在和/或量。
在一个优选的方面，哺乳动物以前诊断为患有动脉粥样硬化，并且已经用治疗动脉粥样硬化的治疗剂进行了治疗，所述方法进一步包括在一段时间内重复给药和成像操作至少一次，并检测LOX-1的量的差异。这提供了监测由LOX-1表达导致的疾病或病症的疗效的方法。
由LOX-1的表达导致的疾病或病症包括炎症位点和存在高浓度的LOX-1的区域，诸如巨噬细胞和其他炎症细胞聚集的部位。更优选地，组织是动脉粥样硬化组织，包括动脉粥样硬化斑。
在第五个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物在诊断疑似患有LOX-1表达导致的疾病或病症的哺乳动物的方法中的应用，其中式(I)中Y是SIG。所述疾病在前述第四个实施方案中已经描述过。在此应用中，Y是SIG，SIG优选适于体内成像。其他的式(I)化合物的必要特征和优选的实施方案记载在前述第一个实施方案中。
在此应用中，哺乳动物预先给予了第三个实施方案中的放射性药物组合物。术语“预先给予”指的是临床医生参与的步骤，其中已经将试剂给予患者，例如通过静脉注射。当SIG适于体内成像时，该实施方案中包括本发明第一方面所述的成像剂的优选的实施方案。在一个优选的实施方案中，这还包括了式(I)化合物在制备用于诊断涉及LOX-1的哺乳动物体疾病状况的体内诊断成像的诊断剂中的用途，其中式(I)中Y是SIG。
本发明通过如下非限制性的实施例进行说明。
实施例所有的实施例都是预示性的实施例。
实施例1.
使用本领域公知的标准技术，使热激蛋白基团E通过4-酰基亚苯基(L)与荧光素(SIG)共价结合。用细胞系测试复合物与细胞结合的能力。复合物与细胞一同温育并洗涤。然后使用标准技术对细胞进行成像。此外，通过将染料内化到细胞中而不是位于细胞表面上的操作(已经被荧光成像术证明)，证明HSP片段将信号内化的能力。在内化到细胞中后，立即用pH敏感性染料诸如CypHer(Amersham Biosciences，Pscataway，NJ)对片段进行标记。
实施例2.
通过本领域公知的标准技术，使E通过Lys-Lys-Gly-Gly(L)与18F(SIG)共价结合。然后将复合物通过注射体内送递到5只对照和5只患病的ApoE-/-小鼠中(可获自Jackson Laboratories)。在送递后，使用标准PET技术扫描小鼠。患病小鼠会显示沿着受影响的动脉壁的特异性结合。
在第二阶段，使用复合物进行治疗的过程被重复，以显示成像剂的积累，以得到患病区域的更高分辨率。
实施例3.
通过本领域公知的标准技术，使E通过DTPA(L)与紫杉醇(T)共价结合。使用细胞系来检测复合物结合细胞的能力。复合物与细胞一起温育，然后洗涤。通过将染料内化到细胞中而不是位于细胞表面上的操作(已经被荧光成像术证明)，证明HSP片段将信号内化的能力。
实施例4.
通过本领域公知的标准技术，E通过68Ga(L)共价结合。然后将复合物通过注射体内送递到5只对照和5只患病的ApoE-/-小鼠中。在送递后，使用标准PET技术扫描小鼠。患病小鼠会显示沿着受影响的动脉壁的特异性结合。
在第二阶段，使用复合物进行治疗的过程被重复，以显示成像剂的积累，以得到患病区域的更高分辨率。
实施例5.
通过本领域公知的标准技术，使E通过Lys-Lys-Gly-Gly(L)与18F(SIG)共价连接，并进一步与紫杉醇(TA)共价结合。复合物与细胞结合的能力可通过热激的HeLa细胞系和未应激的正常HeLa细胞来检测。进而复合物与细胞一同温育并洗涤。表达了LOX-1的细胞会显示具有更大的选择性细胞死亡。细胞死亡的选择性将进一步通过细胞成像和信号内化来说明。
实施例6.
作为没有连接体的复合物的实施例，通过本领域公知的标准方法，使E通过68Ga(SIG)共价结合。然后将复合物通过注射体内送递到5只对照和5只患病的ApoE-/-小鼠中。在送递后，使用标准PET技术扫描小鼠。患病小鼠会显示沿着受影响的动脉壁的特异性结合。
在第二阶段，使用复合物进行治疗的过程被重复，以显示成像剂的积累，以得到患病区域的更高分辨率。
序列表<110>SYUD，FaisalZHAO，MingTORRES，Andrew<120>作为靶向试剂用于内皮-特异性体内转导的热激蛋白<130>61765.002015<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>40<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>1Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln Asn Thr Val Phe1 5 10 15Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp Pro Val Val Gln20 25 30Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe35 40<210>2<211>23<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>2Gln Val Ile Asn Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val Ser Tyr Lys1 5 10 15
Gly Glu Thr Lys Ala Phe Tyr20<210>3<211>25<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>3Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Ile Ala1 5 10 15Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pro Val Thr20 25<210>4<211>36<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>4Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu1 5 10 15Ash Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr20 25 30Gly Leu Asp Arg35<210>5<211>30
<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>5Met Gly Asp Lys Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val1 5 10 15Ala Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met20 25 30<210>6<211>29<212>PRT<213>合成序列<220>
<223>合成载体<400>6Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Ile Pro Pro1 5 10 15Ala Pro Gly Val Pro Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp20 2权利要求
1.具有式(I)的化合物；(I) Y-(L)n-E，其中Y是SIG或TA，其中SIG是信号部分，其提供可在体内或体外被检测到的信号，TA是治疗剂；L是连接Y和E的连接基团；E是结合部分，包括热激蛋白或其与LOX-1结合的片段或变体；且n是0或1。
2.权利要求1的化合物，其中Y是SIG。
3.权利要求1或2的化合物，其中SIG选自发光染料；放射性核素；近红外染料；磁活性同位素；超顺磁颗粒；碘化的不透辐射的有机化合物；Z值大于50的不透辐射的金属离子；气体填充的微泡，或它们的组合。
4.权利要求3的化合物，其中SIG是放射性核素。
5.权利要求4的化合物，其中放射性核素选自11C、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd和175Lu。
6.权利要求4或5的化合物，其中放射性核素是正电子发射体。
7.权利要求6的化合物，其中正电子发射体选自18F和11C。
8.权利要求4或5的化合物，其中放射性核素是γ发射体。
9.权利要求3的化合物，其中SIG是近红外染料。
10.权利要求1至9中任一项的化合物，其中L是至少2价的有机基团。
11.权利要求10的化合物，其中有机基团与基团Y和基团E都是共价结合的。
12.权利要求10的化合物，其中有机基团与基团Y和基团E都是离子结合的。
13.权利要求10的化合物，其中有机基团选自亚烷基、亚芳基、环亚烷基、氨基亚烷基、氨基亚芳基、氨基环亚烷基、硫代亚烷基、硫代亚芳基、硫代环亚烷基、氧化亚烷基、氧化亚芳基、氧化环亚烷基、酰基亚烷基、酰基亚芳基、酰基环亚烷基单元，及它们的组合。
14.权利要求13的化合物，其中酰基亚芳基单元是具有如下结构的4-酰基亚苯基
15.权利要求1-10的化合物，其中L包括聚乙二醇(PEG)单元或肽链，从而L可调节式I化合物的体内药物动力学和血液清除率。
16.权利要求14的化合物，其中肽链含有1至10个氨基酸残基。
17.权利要求1-16的化合物，其中SIG包括金属离子，并且SIG或有机基团包括金属螯合剂。
18.权利要求16化合物，其中的金属螯合剂结合至少一种选自52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、154-158Gd和175Lu的阳离子的金属阳离子。
19.权利要求17或18的化合物，其中金属螯合剂选自DTPA、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N’，N”-三乙酸(NOTA)、对-溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)、1，4，7，10-四氮杂环癸烷四乙酸(DOTA)、EDTA、CHXa。
20.权利要求1-19的化合物，其中E是热激蛋白70或其与LOX-1结合的片段。
21.权利要求20的化合物，其中的片段是热激蛋白70的N-末端片段。
22.权利要求20或21的化合物，其中的片段含有至多30个氨基酸。
23.一种以适合哺乳动物给药的形式存在的，含有权利要求1-22的式(I)化合物和生物相容性载体的药物组合物。
24.权利要求23的药物组合物，其中Y是如权利要求2-9所定义的SIG。
25.权利要求24的药物组合物，其中SIG是放射性核素。
26.一种用于制备权利要求25的组合物的试剂盒。
27.一种对哺乳动物中的组织成像以检测LOX-1的存在和/或量的方法，包括给予所述哺乳动物权利要求1-22的式(I)化合物，其中Y是SIG；任选给予清除剂以除去任何没有与LOX-1结合的式(I)化合物；并且对哺乳动物进行有效检测SIG产生的信号的成像，以检测LOX-1的存在和/或量。
28.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物以前诊断为患有动脉粥样硬化，并且已经用治疗动脉粥样硬化的治疗剂进行了治疗，所述方法进一步包括在一段时间内重复给药和成像操作至少一次，以检测LOX-1的量的差异。
29.权利要求27或28的方法，其中式(I)的化合物是权利要求23-25的药物组合物的一部份。
30.权利要求27-29的方法，其中有效检测SIG的成像是正电子发射体层摄影术。
31.权利要求30的方法，其中SIG选自18F和11C。
32.权利要求1-22的式(I)化合物在诊断疑似患有由LOX-1表达导致的疾病或病症的哺乳动物中的应用，其中Y如权利要求3-10所定义。
33.权利要求32的用途，其中的诊断方法包括权利要求27至31的方法。
全文摘要
本发明涉及热激蛋白及其片段作为靶向配体的用途。热激蛋白可与凝集素样氧化低密度脂蛋白(LOX－1)相结合，并且可以用成像剂标记，或者与治疗剂相连接。还涉及可用于诊断或监测疾病的肽和用于使信号部分内化的方法和治疗剂。
文档编号A61K47/48GK101039702SQ200580035134
公开日2007年9月19日 申请日期2005年8月11日 优先权日2004年8月13日
发明者F·休德, M·赵, A·托雷斯 申请人:通用电气公司