用bortezomib和表皮生长因子受体激酶抑制剂的组合治疗的制作方法

专利名称：用bortezomib和表皮生长因子受体激酶抑制剂的组合治疗的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于治疗癌症患者的组合物和方法。具体地，本发明涉及用于制备药物的方法，所述药物包含bortezomib和表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂。
癌症是各种各样的细胞恶性肿瘤的通用名，其特征为生长失控、缺少分化、和能够侵袭局部组织并转移的能力。这些恶性肿瘤以不同的发病率影响体内的每种组织和器官。
在过去的几十年中已经开发了多种用于治疗各种类型癌症的治疗剂。最常用的抗癌剂类型包括DNA烷化剂(例如环磷酰胺，异环磷酰胺)，抗代谢物(例如氨甲蝶呤，叶酸拮抗剂，和5-氟尿嘧啶，嘧啶拮抗剂)，微管破坏剂(例如长春新碱，长春碱，紫杉醇)，DNA插入剂(例如阿霉素，柔红霉素，顺铂)和激素疗法(例如他莫昔芬，氟他胺)。
根据国家癌症协会的信息，在美国肺癌是癌症死亡的单一最大原因，并且在国家中造成近乎30％癌症死亡。根据世界健康组织的信息，每年全世界存在多于一百二十万病例的肺癌和支气管癌，导致每年约一百一十万死亡。NSCLC是肺癌最普遍的形式，占所有病例的约80％。对肺癌的治疗选择方案是外科手术，放射疗法和化学疗法，单独使用或组合使用，这取决于癌症的形式和阶段。对于晚期NSCLC，已经显示有效的药剂包括顺铂(Cisp；如platinol)，卡铂，紫杉醇，多西他赛，托泊替康，伊立替康，长春瑞滨，吉西他滨(例如gemzar)和EGFR激酶抑制剂gefitinib和埃洛替尼(erlotinib)。盐酸埃洛替尼(也称为OSI-774或TarcevaTM)是喹唑啉，其抑制EGFR的酪氨酸激酶活性并诱导细胞凋亡和细胞周期停滞(Moyer，J.D.，等(1997)Cancer Res.574838-4848；Norman P.(2001)Curr.Opin.Investig.Drugs 2298-304)。含顺铂和含卡铂的组合化学疗法方案已经显示产生目标应答率，其比用单一药剂化学疗法获得的要高(Weick，J.K等(1991)J.Clin.Oncol.9(7)1157-1162)。已经报道紫杉醇在IV期患者中具有单一药剂活性，应答率在21％-24％(Murphy W.L.等(1993)J.Natl.Cancer Inst.85(5)384-388)。紫杉醇组合已经显示相对高的应答率，显著的1年存活和肺癌症状的减轻(Johnson D.H.等(1996)J.Clin.Oncol.14(7)2054-2060)。利用紫杉醇加上卡铂疗法，应答率在27％-53％，32％-54％的1年存活率。然而，这种治疗的效力是这样的以致于目前没有特定的疗法可以被认为是标准疗法。
表皮生长因子受体(EGFR)激酶或其配体TGF-α的过表达与许多癌症时常相关，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、直肠结肠癌和头颈癌(SalomonD.S.，等(1995)Crit.Rev.Oncol.Hematol.19183-232；Wells，A.(2000)Signal，14-11)，并且据信其还对这些肿瘤的恶性生长起作用。也已经发现在EGFR基因中的特定缺失-突变增加了细胞致瘤性(Halatsch，M-E.等(2000)J.Neurosurg.92297-305；Archer，G.E.等(1999)Clin.Cancer Res.52646-2652)。EGFR刺激的信号途径的活化促进了多个可能促进癌症的进程，例如增殖，血管生成，细胞迁移和侵袭，减少的细胞凋亡，和诱导药物抗性。将直接抑制EGFR激酶活性的化合物用作抗肿瘤制剂的开发，以及将通过阻断EGFR活化而降低EGFR激酶活性的抗体用作抗肿瘤制剂，是研究的热点(de Bono J.S.和Rowinsky，E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine 8S19-S26；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 292-313)。一些研究已经证实或者公开当与某些其它抗癌剂或者化疗剂或治疗并用的时候，一些EGFR激酶抑制剂可以改善杀伤肿瘤细胞或者瘤。(例如Raben，D.等(2002)Semin.Oncol.2937-46；Herbst，R.S.等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1719-732；Magne，N等(2003)Clin.Can.Res.94735-4732；Magne，N.等(2002)British Journal of Cancer 86819-827；Torrance，C.J.等(2000)Nature Med.61024-1028；Gupta，R.A.和DuBois，R.N.(2000)Nature Med.6974-975；Tortora，等(2003)Clin.CancerRes.91566-1572；Solomon，B.等(2003)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55713-723；Krishnan，S.等(2003)Frontiers in Bioscience 8，el-13；Huang，S等(1999)Cancer Res.591935-1940；Contessa，J.N.等(1999)Clin.CancerRes.5405-411；Li，M.等Clin.(2002)Cancer Res.83570-3578；Ciardiello，F.等(2003)Clin.Cancer Res.91546-1556；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.63739-3747；Grunwald，V.和Hidalgo，M.(2003)J.Nat.CancerInst.95851-867；Seymour L(2003)Current Opin.Investig.Drugs 4(6)658-666；Khalil，M.Y.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3367-380；Bulgaru，A.M.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3269-279；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery 292-313；Kim，E.S.等(2001)Current Opinion Oncol.13506-513；Arteaga，C.L.和Johnson，D.H.(2001)Current Opinion Oncol.13491-498；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.62053-2063；专利公开号US 2003/0108545；US2002/0076408；和US 2003/0157104；以及国际专利公开号WO 99/60023；WO01/12227；WO 02/055106；WO 03/088971；WO 01/34574；WO 01/76586；WO 02/05791；和WO 02/089842)。
另外新的具有针对肺和其它肿瘤细胞的杰出的细胞毒性的化合物是bortezomib(Adams，J.et al.(2003)Drug Discovery Today 8(7)307-315；Lenz，H.J.(2003)Cancer Treat.Rev.29(Suppl.1)41-48)。Bortezomib(也已知为Velcade或PS-341)是小分子蛋白酶体抑制剂，近来被FDA批准治疗难治的多发性骨髓瘤。已经报道了bortezomib在NSCLC细胞系中具有活性，在此发现其诱导浓度和时间依赖性G2/M细胞周期停滞(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。这伴随着关键细胞调节分子(p53，p21)的稳定化，胱天蛋白酶途径的活化和最终细胞凋亡。在体内，已经在NSCLC异种移植物中，以及在人NSCLC异种移植物模型中发现其活性，在I期和II期试验中在具有难控制NSCLC的患者中发现临床活性(Mack，P.C.et al(2003)lung cancer 41(Suppl.1)S89-S96)。正在进行III期随机试验，以比较单独bortezomib相比于bortezomib联合标准多西他赛作为NSCLC二线疗法的功效。
抗瘤药物应该理想地选择性杀伤癌细胞，具有相对于其对非恶性肿瘤细胞毒性而言更为宽泛的治疗指数。即使长时间暴露于该药物，其同样保留针对恶性肿瘤细胞的效力。遗憾的是，没有一种目前的化疗具有这种理想的特性。相反，多数具有非常窄的治疗指数。此外，癌细胞暴露于轻微亚致死浓度的化疗剂通常会形成对该药剂的抗性，形成对一些其它抗瘤制剂的交叉抗性也是很常见的。
因此，需要治疗瘤形成和其它增生疾病的更有效的疗法。用于提高目前药物治疗效力的策略涉及改变它们的给药时间表，以及与其它抗癌剂或者生化调节剂结合使用。众所周知的联合治疗是一种这样的方法其可以产生相对于单独使用每一种治疗性相关剂量的制剂更好的效力和减少的副作用。在一些情况下，药物组合的效力是加成性的(组合的效力基本上等于每种药物单独效力的总和)，但在其他情形中，效力是增效性的(组合的效力大于每种药物单独给药的效力的总和)。
然而，仍急需对NSCLC和其它癌症的改善治疗。本发明提供了抗癌组合疗法，其降低了效力所需的每种组分的剂量，从而降低了与每种药剂相关的副作用，而同时保持或者增加了治疗价值。在此描述的本发明提供了新的药物组合，和使用该药物组合来治疗NSCLC和其它癌症的方法。
发明概述本发明提供制备药物的方法，所述药物用于治疗肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib的组合。优选地，意欲将治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib的组合，结合或不结合另外的药剂或治疗，如其它的抗癌药物或辐射疗法同时或顺序地给药于患者。
本发明还包含药物组合物，其由EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合以及药用载体组成。
可以用于实施本发明的优选的EGFR激酶抑制剂的实例是化合物盐酸埃洛替尼(erlotinib HCl)(也已知为TarcevaTM)。
附图简述

图1NSCLC细胞系对埃洛替尼和bortezomib的敏感性。
图2埃洛替尼和bortezomib对四种人NSCLC细胞系的组合细胞毒性功效(组合Index(CI))。
图3埃洛替尼和bortezomib对H358支气管肺泡细胞系的组合功效。A)针对时间作图的部分细胞计数(fractional cell count)，B)对三个时间周期的细胞凋亡百分比。
发明详述术语“癌”在动物中指的是存在这样的细胞，该细胞具有致癌细胞的典型特性，例如增殖失控，永生化，转移潜能，快速生长和增殖率，和某些形态学特性。通常，癌细胞的形式是肿瘤，但是这样的细胞可以单独存在于动物中，或者作为独立的细胞在血流中循环，如白血病细胞。
除非其它指明，本发明使用的“不正常细胞生长”指的是细胞生长独立于正常的调控机制(例如丧失接触抑制)。其包括下列情况的不正常生长(1)肿瘤细胞(肿瘤)，其通过表达突变的酪氨酸激酶或者过表达酪氨酸激酶受体而增殖；(2)其它增殖疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常的酪氨酸激酶活化；(4)任何通过受体酪氨酸激酶而增殖的肿瘤；(5)任何通过异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化而增殖的肿瘤；和(6)其它增殖疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常的丝氨酸/苏氨酸激酶活化。
除非其它指明，本发明使用的术语“治疗”表示在患者中部分或者全部逆转、减轻、抑制进程、或者预防肿瘤生长、肿瘤转移或者其它致癌细胞或致肿瘤细胞。本发明使用的术语“治疗”，除非其它指明，指的是治疗的行为。
当短语“治疗方法”或其等效语应用于例如癌症时，其指的这样的行动的步骤或者过程，该行动经过设计以在动物中降低或者消除癌细胞的数量，或者缓解癌症的症状。癌症或者其它增殖疾病的“治疗方法”不必定意味着所述的癌细胞或者其它疾病事实上会被消除了；所述细胞的数量或者疾病事实上会被降低；或者癌症或者其它疾病的症状事实上会被缓解。通常，即使成功可能性很小，也会进行癌症的治疗方法，然而考虑到动物的用药史和预计的生存期，所述方法就其总体的作用过程来说对该动物是有益的。
术语“治疗有效的药剂”指的是这样的组合物，其将会诱导被研究者、兽医、医生或者其它临床医师所研究的组织、系统、动物或者人的生物或者医学应答。
术语“制备药物的方法”涉及制备用于如本文所述的适应症、特别是用于肿瘤、肿瘤转移或通常的癌症的药物。该术语涉及在指定的适应症中的所谓的“瑞士类型”的权利要求形式。
术语“治疗有效量”或者“有效量”指的是将会诱导被研究者、兽医、医生或者其它临床医师所研究的组织、系统、动物或者人的生物或者医学应答的受试化合物或者组合的量。
本发明使用的术语“EGFR激酶抑制剂”指的是任何目前在本领域熟知的或者将来会被鉴定的EGFR激酶抑制剂，并且包括任何在给药于患者时导致患者中与EGF受体活化相关的生物活性抑制的化学个体，其包括任何另外产生自其天然配体结合EGFR的下游生物学效应。这样的EGFR激酶抑制剂包括任何可以阻断EGFR活化的试剂或者任何与在患者中治疗癌症相关的EGFR活化的下游生物学效应。这样的抑制剂可以通过直接结合到受体的细胞内结构域和抑制其激酶活性而发挥作用。或者，这样的抑制剂可以通过占据EGFR受体的配体结合位点或者部分、从而使得受体难以接近其天然配体从而阻止或者降低了其正常生物学活性而发挥作用。或者，该抑制剂可以通过调节EGFR多肽的二聚化、EGFR多肽与其它蛋白质的相互作用、或者增强EGFR的泛化作用和细胞内降解而起作用。EGFR激酶抑制剂包括但不限于低分子量抑制剂、抗体或者抗体片段、反义构建体、小抑制性RNAs(即dsRNA的RNA干扰；RNAi)，和核酶。在一个优选的实施方案中，EGFR激酶抑制剂是特异结合到人EGFR的小的有机分子或者抗体。
本发明使用的术语“EGFR激酶抑制剂”指的是任何目前在本领域熟知的或者将来会被鉴定的EGFR激酶抑制剂，并且包括任何在给药于患者时导致患者中与EGF受体活化相关的生物活性抑制的化学个体，其包括任何另外产生自其天然配体结合EGFR的下游生物学效应。这样的EGFR激酶抑制剂包括任何可以阻断EGFR活化的试剂或者任何与在患者中治疗癌症相关的EGFR活化的下游生物学效应。这样的抑制剂可以通过直接结合到受体的细胞内结构域和抑制其激酶活性而发挥作用。或者，这样的抑制剂可以通过占据EGFR受体的配体结合位点或者部分、从而使得受体难以接近其天然配体从而阻止或者降低了其正常生物学活性而发挥作用。或者，该抑制剂可以通过调节EGFR多肽的二聚化、EGFR多肽与其它蛋白质的相互作用、或者增强EGFR的泛化作用和细胞内降解而起作用。EGFR激酶抑制剂包括但不限于低分子量抑制剂、抗体或者抗体片段、反义构建体、小抑制性RNAs(即dsRNA的RNA干扰；RNAi)，和核酶。在一个优选的实施方案中，EGFR激酶抑制剂是特异结合到人EGFR的小的有机分子或者抗体。
EGFR激酶抑制剂包括例如喹唑啉EGFR激酶抑制剂，吡啶并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，嘧啶并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡咯并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，吡唑并-嘧啶EGFR激酶抑制剂，苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂，羟吲哚EGFR激酶抑制剂，吲哚并咔唑EGFR激酶抑制剂，酞嗪EGFR激酶抑制剂，异黄酮EGFR激酶抑制剂，quinalone EGFR激酶抑制剂和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，如描述在下述专利出版物中的那些，和它们的所有药用盐和溶剂化物国际专利公开号WO 96/33980，WO96/30347，WO 97/30034，WO 97/30044，WO 97/38994，WO 97/49688，WO 98/02434，WO 97/38983，WO 95/19774，WO 95/19970，WO 97/13771，WO 98/02437，WO 98/02438，WO 97/32881，WO 98/33798，WO 97/32880，WO 97/3288，WO 97/02266，WO 97/27199，WO 98/07726，WO 97/34895，WO 96/31510，WO 98/14449，WO 98/14450，WO 98/14451，WO 95/09847，WO 97/19065，WO 98/17662，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 99/07701，和WO 92/20642；欧洲专利申请号EP 520722，EP 566226，EP 787772，EP 837063，和EP 682027；美国专利号5,747,498，5,789,427，5,650,415，和5,656,643；以及德国专利申请号DE 19629652。其它低分子量EGFR激酶抑制剂的非限制性实例包括Traxler，P.，1998，Exp.Opin.Ther.Patents8(12)1599-1625中描述的那些。
用于本文，“EGFR激酶抑制剂”优选是式1的化合物
其中m是1，2，或3；每个R1独立地选自氢，卤素，羟基，氨基，羟基氨基，羧基，(C1-C4)烷氧基羰基，硝基，胍基，脲基，氨基甲酰基，氰基，三氟甲基，(R6)2N-羰基，和苯基-W-烷基，其中W选自单键，O，S和NH；或每个R1独立选自氰基-(C1-C4)-烷基和R9，其中R9选自R5，R5O，(R6)2N，R7C(＝O)，R5ONH，A和R5Y；R5是(C1-C4)烷基；R6是氢或R5，其中R5相同或不同；R7是R5，R5O或(R6)2N；A选自哌啶子基-，吗啉代，吡咯烷子基和4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，羧基-(C1-C4)-烷基，苯氧基，苯基，苯硫基，(C2-C4)-链烯基，(R6)2-N-羰基-(C1-C4)-烷基；和Y选自S，SO，SO2；(R6)2N中的烷基部分任选地被卤素或R9取代，其中R9如上所定义，R5和R5O中的烷基部分任选地被卤素，R6O或R9取代，其中R9和R6如上所定义，其中得到的基团任选地被卤素或R9所取代，条件是氮，氧或硫原子和其它杂原子不能附于相同的碳原子上，另外的条件是不超过三个″R9″单元可包括R1；或每个R1独立地选自R5-磺酰基氨基，苯二酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧吡咯烷-1-基，2，5-二氧吡咯烷-1-基，和R10-(C2-C4)-烷酰基氨基，其中R10选自卤素，R6O，(C2-C4)-烷酰基氧基，R7C(＝O)，和(R6)2N；其中所述苯甲酰氨基或苯磺酰基氨基或苯基或苯氧基或苯胺基或R1中的苯硫基取代基可任选具有一个或两个卤素，(C1-C4)烷基，氰基，甲磺酰基或(C1-C4)-烷氧基取代基；或任何两个R1与它们所附着的碳原子一起包括5-8元环，所述环包含至少一个或两个杂原子，所述杂原子选自氧，硫或氮；其中烷基和烷氧基或烷基氨基的烷基部分可以是直链的，或如果由至少3个碳组成，可以是支链的或环形的；R2选自氢和任选取代的(C1-C6)-烷基；n是1或2，每个R3独立选自氢，(C1-C6)-烷基，氨基，卤素，羟基；R4是叠氮基或R11-乙炔基，其中R11选自氢，任选取代的(C1-C6)烷基，其中取代基选自氢，氨基，羟基，R5O，R5NH和(R5)2N。
更具体地，依照本发明的EGFR激酶抑制剂涉及式1的化合物，其中m，n，R1和R3如上所定义，R2是氢和R4是R11-乙炔基，其中R11选自氢，任选取代的(C1-C6)-烷基，其中取代基选自氢，氨基，羟基，R5O，R5NH和(R5)2N或R4是叠氮基。
依照本发明的EGFR激酶抑制剂还涉及式1的化合物，其中n如上所定义，m是1或2，每个R1独立选自氢，羟基，氨基，羟基氨基，羧基，硝基，氨基甲酰基，脲基；R6O，(C2-C4)-烷酰基氧基，HOC(＝O)，A和(R6)2N，R6OKO，R6OKNH，CN和苯基；R5NH任选取代的卤素，(C2-C4)-烷酰基氧基，R6O，R7C(＝O)，(R6)2N，A，R6OKO，R6OKNH，C6H5Y，CN；(R6)2N(C＝O)，R5ONH，R5S，(C1-C4)-烷基磺酰基氨基，苯二酰亚氨基-(C1-C4)-烷基磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧吡咯烷-1-基，2，5-二氧吡咯烷-1-基，卤素-(C2-C4)-烷酰基氨基，羟基-(C2-C4)-烷酰基氨基，(C2-C4)-烷酰基氧基-(C2-C4)-烷酰基氨基，(C1-C4)-烷氧基-(C2-C4)-烷酰基氨基，羧基-(C2-C4)-烷酰基氨基，(C1-C4)-烷氧基羰基-(C2-C4)-烷酰基氨基，氨基甲酰基-(C2-C4)-烷酰基氨基，N-(C1-C4)lkyl氨基甲酰基-(C2-C4)-烷酰基氨基，N，N-二-[(C1-C4)-烷基]氨基甲酰基-(C2-C4)-烷酰基氨基，氨基-(C2-C4)-烷酰基氨基，(C1-C4)-烷基-氨基-(C2-C4)-烷酰基氨基，二-(C1-C4)-烷基-氨基-(C2-C4)-烷酰基氨基，和其中R1中的所述苯基或苯氧基或苯胺基取代基可任选具有1或2个卤素，(C1-C4)-烷基或(C1-C4)烷氧基取代基；或任何两个R1与它们所附着的碳一起包括5-8元环，所述环包含至少一个或两个杂原子，所述杂原子选自氧，硫或氮；其中烷基和烷氧基或烷基氨基的烷基部分可以是直链的，或如果由至少3个碳组成，可以是支链的或环形的；每个R3独立选自氢，甲基，乙基，氨基，卤素和羟基；R4是R11-乙炔基，其中R11是氢。
更具体地，依照本发明的EGFR激酶抑制剂涉及式1的化合物，其中m，n，R1，R2和R3如上所定义，和每个R1独立选自氢，羟基，氨基，羟基氨基，硝基，氨基甲酰基，脲基，R5任选被卤素，R6O，HOC(＝O)，H2NC(＝O)取代；R5O任选被卤素，R6O，(C2-C4)-烷酰基氧基，HOC(＝O)，(R6)2N，A，苯基取代；R5NH，(R5)2N，R5NH2，(R5)2NH，R5NHC(＝O)，(R5)2NC(＝O)，R5S，苯基-(C2-C4)-烷氧基，和其中在R1中的所述苯基取代基可任选具有一个或两个卤素，R5或R5O取代基；或任何两个R1与它们所附着的碳一起包括5-8元环，所述环包含至少一个或两个杂原子，所述杂原子选自氧，硫或氮；和其中烷基和烷氧基或烷基氨基中的烷基部分可以是直链的，或如果由至少3个碳组成，可以是支链的或环形的。
可以依照本发明使用的低分子量EGFR激酶抑制剂的具体优选实例包括[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(也叫作OSI-774，埃洛替尼，或者TarcevaTM(盐酸埃洛替尼)；OSIPharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专利号5,747,498；国际专利公开号WO 01/34574，和Moyer，J.D.等(1997)Cancer Res.574838-4848)；CI-1033(先前已知为PD183805；Pfizer)(Sherwood等，1999，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40723)；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University ofCalifornia)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(也叫作GW-572016或者lapatinib ditosylate；GSK)；和gefitinib(也叫作ZD1839或者IressaTM；Astrazeneca)(Woodburn等，1997，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38633)。可以依照本发明使用的特别优选的低分子量EGFR激酶抑制剂是[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即埃洛替尼)，其盐酸盐(即盐酸埃洛替尼，TarcevaTM)，或者其它盐形式(例如甲磺酸埃洛替尼)。
最优选的，依照本发明的EGFR激酶抑制剂涉及化合物盐酸埃洛替尼(也已知为TarcevaTM)。
优选的基于抗体的EGFR激酶抑制剂包括任何能够部分或者全部阻断EGFR被其天然配体活化的抗EGFR抗体或者抗体片段。基于抗体的EGFR激酶抑制剂的非限制性实例包括在Modjtahedi，H.，等，1993，Br.J.Cancer67247-253；Teramoto，T.，等，1996，Cancer 77639-645；Goldstein等，1995，Clin.Cancer Res.11311-1318；Huang，S.M.，等，1999，Cancer Res.1559(8)1935-40；和Yang，X.，等，1999，Cancer Res.591236-1243.中描述的那些。因此EGFR激酶抑制剂可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang，X.D.等(1999)Cancer Res.591236-43)，或者Mab C225(ATCC登记号HB-8508)，或者其具有结合特异性的抗体或者抗体片段。合适的单克隆抗体EGFR激酶抑制剂包括但不限于，IMC-C225(也叫作cetuximab或者ErbituxTM；Imclone Systems)，ABX-EGF(Abgenix)，EMD 72000(MerckKgaA，Darmstadt)，RH3(York Medical Bioscience Inc.)，和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。
额外的基于抗体的EGFR激酶抑制剂可以通过将适当抗原或者表位施用于宿主动物而根据已知的方法而产生，所述的宿主动物选自例如猪，牛，马，兔，山羊，绵羊，和小鼠及其他。各种本领域已知的佐剂可以被用于提高抗体生产。
尽管实施本发明的有用抗体可以是多克隆的，优选单克隆抗体。针对EGFR的单克隆抗体可以使用任何技术制备和分离，所述的技术通过连续细胞系培养提供抗体分子制备。用于制备和分离的技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein(Nature，1975，256495-497)描述的杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today 472；Cote等，1983，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 802026-2030)；和EBV杂交瘤技术(Cole et al，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
或者，描述单链抗体生产的技术(见例如美国专利号4,946,778)可以被修改来生产抗EGFR单链抗体。在实施本发明中有用的基于抗体的EGFR激酶抑制剂还包括抗EGFR抗体片段，包括但不限于F(ab′)2片段，其是由胃蛋白酶消化完整的抗体分子产生的，和Fab片段，其是通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生的。或者可以构建Fab和/或scFv表达文库(见例如，Huse等，1989，Science 2461275-1281)以容许快速鉴定对EGFR具有所需特异性的片段。
用于制备和分离单克隆抗体和抗体片段的技术在本领域为人熟知，并且描述在Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，和在J.W.Goding，1986，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，London.中。人源化抗EGFR抗体和抗体片段也可以通过已知的技术制备，所述技术如那些描述在Vaughn，T.J.等，1998，Nature Biotech.16535-539及其引用的文献中的那些，并且这些抗体或其片段在本发明实施中同样有用。
本发明使用的EGFR激酶抑制剂可备选地基于反义寡核苷酸构建体。包括反义RNA分子和反义DNA分子的反义寡核苷酸可以通过结合其上来直接阻断EGFR mRNA的翻译，并从而防止蛋白翻译或者增加mRNA降解，因而减少了EGFR激酶蛋白质水平，和因此减少其在细胞内的活性。例如可以通过如常规的磷酸二酯技术合成至少约15个碱基的反义寡核苷酸，其互补于编码EGFR的mRNA转录序列的独特区域，通过例如静脉内注射或者输液给药。使用反义技术用来特异抑制其序列已知的基因的基因表达的技术为本领域熟知。(例如见美国专利号6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。
小抑制性RNAs(siRNAs)也可以作为EGFR激酶抑制剂用于本发明。EGFR基因表达可以通过用小双链RNA(dsRNA)、或者引起小双链RNA产生的载体或构建体来接触肿瘤、受试者或者细胞而降低，从而EGFR的表达被特异地抑制(即RNA干扰或者RNAi)。对于序列已知的基因，选择合适dsRNA或者dsRNA-编码载体的方法在本领域为人熟知。(例如见Tuschi，T.，等(1999)Genes Dev.13(24)3191-3197；Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411494-498；Hannon，G.J.(2002)Nature 418244-251；McManus，M.T.和Sharp，P.A.(2002)Nature Reviews Genetics 3737-747；Bremmelkamp，T.R.等(2002)Science 296550-553；美国专利号6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号WO 01/36646，WO 99/32619，和WO01/68836)。
核酶也可以作为EGFR激酶抑制剂用于本发明。核酶是能够催化RNA特异切割的酶RNA分子。核酶作用的机理涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，而后被核酸内解切割。特异并有效地催化EGFR mRNA序列的核酸内解切割的工程化的锤头基序核酶分子因此在本发明的范围内有用。任何可能RNA靶中的特异核酶切割位点通过扫描靶分子找寻核酶切割位点而被最初鉴定，其通常包括下列序列GUA，GUU，和GUC。一旦鉴定出来后，可以评价相应于含有切割位点的靶基因区域的大约15-20个核糖核苷酸的短RNA序列的预测结构特征，例如二级结构，这可以导致寡核苷酸序列不合适。也可以通过测试其与互补寡核苷酸的杂交可接近性来评价候选靶的合适性，例如使用核酶保护测试。
可以通过已知的方法来制备用作EGFR激酶抑制剂的反义寡核苷酸和核酶。这些包括用于化学合成的技术例如诸如固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外或者体内转录编码RNA分子的DNA序列来产生反义RNA分子。这样的DNA序列可以被整合到各种各样的载体内，所述载体整合合适RNA聚合酶启动子如T7或者SP6聚合酶启动子。作为一种增加细胞内稳定性和半衰期的手段，可以引入对本发明寡核苷酸的多种修饰。可能的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的侧翼序列加到所述分子的5’和/或3’末端，或者在寡核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者2′-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
在下文实施例中显示的数据证实共给药bortezomib和EGFR激酶抑制剂对治疗患有晚期癌症，如NSCLC，结肠直肠癌或胰腺癌是有效的。因此，本发明提供了制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合。
优选地，这样的组合用于对患者同时或顺序给药。在该方法中，在患者中存在的癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一种，包括NSCLC，结肠直肠癌或胰腺癌。在优选的实施方案中，当顺序给药化合物时，将bortezomib在EGFR激酶抑制剂之前给药。在一个实施方案中，被治疗的肿瘤或肿瘤转移是结肠直肠肿瘤或肿瘤转移。
在本发明的任一个方法中，同时给药药剂可以通过同时分开给药药剂或作为固定的组合来一起给药来实现。另外，在本发明的任一个方法中，可以以任何顺序来顺序给药药剂。
另外，优选地，使用一种或多种其它的细胞毒性剂、化疗剂或抗癌剂，或增强这些药剂功效的化合物。
在本发明的上下文中，额外的其它的细胞毒性剂、化疗剂或抗癌剂，或增强这些药剂功效的化合物包括，例如烷化剂或者具有烷化作用的制剂如环磷酰胺(CTX；如cytoxan)，苯丁酸氮芥(CHL；如leukeran)，顺铂(Cisp；如platinol)，白消安(如myleran)，美法仑，卡莫昔汀(BCNU)，链脲霉素，曲他胺(TEM)，丝裂霉素C等；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤(MTX)，依托泊苷(VP16；如vepesid)，6-巯嘌呤(6MP)，6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)，阿糖胞苷(Ara-C)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，卡培他滨(如Xeloda)，达卡巴嗪(DTIC)，等等；抗生素类例如放线菌素D，多柔比星(DXR；如adriamycin)，柔红霉素(daunomycin)，博来霉素，普卡霉素等等；生物碱类，例如长春花生物碱类例如长春新碱(VCR)，长春碱，等等；和其它抗肿瘤药剂例如紫杉醇(如taxol)和紫杉醇衍生物，细胞增殖抑制剂(cytostatic agents)，糖皮质激素如地塞米松(DEX；如decadron)和皮质甾类例如波尼松，核苷酶抑制剂例如羟基脲，氨基酸耗竭酶(amino acid depleting enzymes)例如天冬酰胺酶，甲酰四氢叶酸(leucovorin)，亚叶酸(folinic acid)，雷替曲塞(raltitrexed)，和其它叶酸衍生物，和类似的不同的抗肿瘤剂。还可以将下列药剂用作附加药剂arnifostine(如ethyol)，放线菌素D，二氯甲二乙胺(氮芥)，链佐星，环磷酰胺，lornustine(CCNU)，多柔比星脂(如doxil)，柔红霉素脂(如daunoxome)，丙卡巴肼，丝裂霉素，多西他赛(如taxotere)，阿地白介素，卡铂，克拉屈滨，喜树碱，CPT11(伊立替康)，10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)，氟尿苷，氟达拉滨，异环磷酰胺，伊达比星，美钠，干扰素α，干扰素β，米托蒽醌，托泊替康，亮丙立德，甲地孕酮，美法仑，巯嘌呤，普卡霉素，米托坦，培门冬酶，喷司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，长春瑞滨，苯丁酸氮芥。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，并且用于同时或顺序给药于患者，其中另外，使用一种或多种抗激素药剂。如本文所用，术语“抗-激素剂”包括天然的或者合成的有机或者肽化合物，其调节或者抑制激素对肿瘤的作用。
抗激素剂包括例如类固醇受体拮抗剂，抗雌激素类例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，其它芳香酶抑制剂，42-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene，LY 117018，奥那斯酮，和托瑞米芬(如Fareston)；抗雄激素类例如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及上述任何制剂的药用盐、酸或者衍生物；糖蛋白激素的激动剂和/或拮抗剂例如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)和LHRH(促黄体激素释放激素)；LHRH激动剂戈舍瑞林醋酸酯，可作为Zoladex(AstraZeneca)商购；LHRH拮抗剂D-丙氨酰胺N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-L-赖氨酰-N6-(3-吡啶基羰基)-D-赖氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酸(如Antide，Ares-Serono)；LHRH拮抗剂醋酸加尼瑞克；甾体抗雄激素类醋酸环丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，可以作为Megace(Bristol-Myers Oncology)商购；非甾体抗雄激素氟他胺(2-甲基-N-[4，20-硝基-3-(三氟甲基)苯丙酰胺]，可以作为Eulexin(Schering Corp.)商购；非甾体抗雄激素尼鲁米特，(5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4′-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮]；和其它非许可受体的拮抗剂，例如RAR，RXR，TR，VDR等等的拮抗剂。
化疗方案中使用上述细胞毒性和其它抗癌剂在癌症治疗领域已经被很好的表征，并且其在这里的应用也要考虑对耐药性和效果的监测以及考虑对给药途径和剂量的控制，进行一定程度的调节。例如，细胞毒性剂的实际剂量可以是变化的，这要取决于通过使用组织培养方法确定的患者的培养细胞应答。通常，相比于在没有额外其它制剂时使用的量，所述的剂量将减少。
有效细胞毒性制剂的典型的剂量可以在制备商推荐的范围内，并且当通过体外应答或者动物模型中的应答表明时，其可以被降低达大约一个数量级的浓度或者量。因此，实际的剂量将取决于医师的判断，患者的情况，和治疗方法的效果，所述的治疗方法基于初级培养的恶性肿瘤细胞或者组织培养的组织样品的体外应答，或者在适当动物模型中观察到的应答。
在本发明的上下文中，在上述的另外其它细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂中，选自吉西他滨，顺铂和卡铂的化合物的任一种或组合是优选的。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于，使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于同时或顺序对患者给药，其中另外使用一种或多种血管生成抑制剂。
抗血管生成制剂包括例如VEGFR抑制剂如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.of South San Francisco，Calif.，USA)，或者如这里所描述的例如国际申请号WO 99/24440，WO 99/62890，WO 95/21613，WO 99/61422，WO 98/50356，WO 99/10349，WO 97/32856，WO 97/22596，WO 98/54093，WO 98/02438，WO 99/16755，和WO 98/02437，和美国专利号5,883,113，5,886,020，5,792,783，5,834,504和6,235,764；VEGF抑制剂例如IM862(Cytran Inc.of Kirkland，Wash.，USA)；angiozyme，一种来自核酶的合成的核酶(Boulder，Colo.)；和VEGF的抗体，例如贝伐单抗(如AvastinTMGenentech，South San Francisco，CA)，VEGF的重组人源化抗体；整合蛋白受体拮抗剂和整合蛋白拮抗剂，例如αvβ3，αvβ5和αvβ6整合蛋白，及其亚型，例如西仑吉肽(EMD 121974)，或者抗整合蛋白抗体例如诸如αvβ3特异的人源化抗体(如Vitaxin)；因子如IFN-α(美国专利号41530,901，4,503,035，和5,231,176)；血管抑素(angiostatin)和纤维蛋白溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle 5，kringle 1-3(O’Reilly，M.S.等(1994)Cell 79315-328；Cao等(1996)J.Biol.Chem.27129461-29467；Cao等(1997)J.Biol.Chem.27222924-22928)；内皮他丁(O’Reilly，M.S.等(1997)Cell 88277；和国际专利公开号.WO 97/15666)；血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier，(1991)Curr.Opin.Cell Biol.3792)；血小板因子4(PF4)；纤维蛋白溶酶原激活剂/尿激酶抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；肝素酶；烟曲霉素类似物如TNP-4701；苏拉明和苏拉明类似物；血管抑素类固醇；bFGF拮抗剂；flk-1和flt-1拮抗剂；抗血管生成剂如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂和MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述在国际专利公开号WO 96/33172，WO96/27583，WO 98/07697，WO 98/03516，WO 98/34918，WO 98/34915，WO98/33768，WO 98/30566，WO 90/05719，WO 99/52910，WO 99/52889，WO99/29667，和WO 99/07675，欧洲专利公开号818,442，780,386，1,004,578，606,046，和931,788；英国专利公开号9912961，和美国专利号5,863,949和5,861,510中。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有很少或者没有MMP-1抑制活性的那些。更优选地，是相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1，MMP-3，MMP-4，MMP-5，MMP-6，MMP-7，MMP-8，MMP-10，MMP-11，MMP-12，和MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用一种或多种肿瘤细胞促凋亡剂或者凋亡刺激制剂。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用一种或多种信号转导抑制剂。
信号传导抑制剂包括如erbB2受体抑制剂，例如有机分子，或者结合到erbB2受体的抗体如曲妥单抗(如Herceptin)；其它蛋白酪氨酸激酶抑制剂如imitinib(如Gleevec)；ras抑制剂；raf抑制剂；MEK抑制剂；mTOR抑制剂；细胞周蛋白依赖性激酶抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；和PDK-1抑制剂(见Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery 292-313，描述了这些抑制剂的一些实例，和它们在治疗癌症的临床试验中的应用)。
ErbB2受体抑制剂包括例如ErbB2受体抑制剂诸如GW-282974(GlaxoWellcome plc)，单克隆抗体例如AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.ofThe Woodlands，Tex.，USA)，和描述在以下国际公开号中的erbB2抑制剂WO 98/02434，WO 99/35146，WO 99/35132，WO 98/02437，WO97/13760，和WO 95/19970，以及美国专利号5,587,458，5,877,305，6,465,449和6,541,481。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用抗-HER2抗体或其免疫治疗性活性片段。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用一种或多种抗增殖剂。
额外的抗增殖剂包括例如酶法呢基(farnesyl)蛋白转移酶的抑制剂和受体酪氨酸激酶PDGFR的抑制剂，包括在美国专利号6,080,769，6,194,438，6,258,824，6,586,447，6,071,935，6,495,564，6,150,377，6,596,735和6,479,513，以及国际专利公开WO01/40217中公开和要求保护的那些。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用COX II(环加氧酶II)抑制剂。有用的COX-II抑制剂的实例包括alecoxib(如CelebrexTM)，伐地考昔，和罗非考昔。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外进行有效量的电离辐射的治疗，和/或使用放射性药物。
辐射源对被治疗患者来说可以是外部或者内部的。当辐射源对患者是外部的时候，该治疗被称为外部光束放射疗法(EBRT)。当辐射源对患者是内部时，该治疗被称为近距放射治疗法(BT)。在本发明上下文中使用的放射性原子可以选自包含但不仅限于下列物质的组镭，铯-137，铱-192，镅-241，金-198，钴-57，铜-67，锝-99，碘-123，碘-131，和铟-111。当本发明的EGFR激酶抑制剂为抗体时，用这样的放射性同位素标记该抗体也是可能的。
放射疗法是用于控制无法切除或者不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。当将放疗与化疗联合时已经观察到了改善的结果。放疗基于这样的原理将高剂量的放射递送到靶区域会导致肿瘤和正常组织中繁殖细胞的死亡。放射剂量方案通常以放射吸收剂量(Gy)、时间和分级来定义，并且必须由肿瘤学家仔细定义。患者接受的放射量取决于不同的考虑，但是最重要的两个考虑是肿瘤相对于其它身体重要结构和器官的位置，和肿瘤扩展的程度。患者所要经历的放射治疗的典型疗程为在1周-6周时间的治疗计划，给药的患者全部剂量为10-80Gy，每一天为约1.8-2.0Gy的单一部分，一周5天。在本发明的优选实施方案中，当用本发明的治疗与放射治疗联合治疗人类患者的肿瘤的时候，会产生协同效果。换句话说，当联合放射疗法，任选另外联合化学或抗癌剂，通过含有本发明组合的药剂增强了对肿瘤生长的抑制。辅助放射治疗的参数在，例如，国际专利公开WO99/60023中。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，其中另外使用一种或多种能增强抗肿瘤免疫应答的药剂。
能够增强抗肿瘤免疫应答的药剂包括例如CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体(如MDX-CTLA4)，和其它能够阻断CTLA4的药剂。具体能应用于本发明的CTLA4抗体包括美国专利号6,682,736中描述的那些。
本发明还提供制备药物的方法，所述药物用于减少由治疗肿瘤或肿瘤转移所引起的副作用，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂或bortezomib组合，用于对患者同时或顺序给药，所述的量对于产生加成的，或超加成的或协同的抗肿瘤功效是有效的，并且对于抑制肿瘤的生长也是有效的。
本发明还提供了治疗癌症的方法，包括给药需要这种治疗的受试者以(i).第一个有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii).第二个有效量的bortezomib。在该方法中，癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一种，包括肺癌和NSCLC。
本发明还提供了治疗癌症的方法，包括给药需要这种治疗的受试者以(i).第一个低于治疗量(sub-therapeutic first amount)的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii).第二个低于治疗量(sub-therapeutic second amount)的bortezomib。在该方法中，癌症可以是下文涉及的那些癌症的任何一种，包括肺癌和NSCLC。
在前述方法中，第一和第二量的给药顺序可以是同时的或顺序的，即可以在给药EGFR激酶抑制剂之前、给药EGFR抑制剂之后或给药EGFR激酶抑制剂同时来给药bortezomib。在优选的实施方案中，在给药EGFR激酶抑制剂之前给药bortezomib。
另外，本发明提供药物组合物，其在药用载体中包含EGFR抑制剂和bortezomib。
本发明还提供药物组合物，特别用于癌症，其包含(i)第一有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二有效量的bortezomib。该组合物任选包含药用载体和/或赋形剂。
本发明还提供药物组合物，特别用于癌症，其包含(i)第一低于治疗量的EGFR激酶抑制剂埃洛替尼，或其药用盐；(ii)第二低于治疗量的bortezomib。该组合物任选包括药用载体和/或赋形剂。
优选地，EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
本发明使用的术语“患者”优选指的是因任何目的需要EGFR激酶抑制剂治疗的人，更优选需要该治疗来治疗癌症、或者癌前状态或者损伤的人。但是，该术语“患者”也可以指非人动物，其中，优选哺乳动物如狗，猫，马，牛，猪，绵羊，以及非人灵长类动物，这些动物需要EGFR激酶抑制剂治疗。
在优选的实施方案中，患者是需要治疗癌症，或者前癌病症或损伤的人。所述的癌症优选是任何可通过给予EGFR激酶抑制剂部分或者全部治疗的癌症。所述的癌症可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或者眼球内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌(biliary cancer)，慢性或者急性白血病，淋巴细胞淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)瘤，脊椎瘤，脑干胶质瘤，多形性成神经胶质细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜细胞瘤，成神经管细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，包括任何上述癌症的顽疾，或一种或者多种上述癌症的组合。癌前病症或者损伤包括例如由下列组成的组口腔白斑，光化性角化病(日光性角化病)，结肠或者直肠的癌前息肉，胃上皮发育不良，腺瘤发育不良，遗传性息肉结肠癌综合征(HNPCC)，巴雷特食管，膀胱发育不良，和前癌颈病(precancerous cervicalconditions)。优选地，所述的癌症是结肠癌，并且最优选为结肠直肠癌。还优选地，所述癌症是肺癌，最优选非小细胞肺癌(NSCL)。还优选地，所述癌症是胰腺癌。
在本发明中“共同给药”和“共同施用”bortezomib和EGFR激酶抑制剂(此后将这两种组分称为“两种活性剂”)指的是当将所述两种活性剂作为被设计以获得组合治疗疗效的合适剂量方案的一部分，上述两种活性剂分开或者一起地任一种地给予。因此，可以将这两种活性剂或者作为相同药物组合物的部分或者作为分开的药物组合物给予。bortezomib可以先于、同时或者后于EGFR激酶抑制剂的给予，或者以其某种组合给予。当以重复的间隔将EGFR激酶抑制剂给予患者时，例如在一个标准疗程中，可以将bortezomib先于、同时、或者后于EGFR激酶抑制剂的每次给予，或者以其某种组合，或者以相对于EGFR激酶抑制剂治疗的不同间隔，或者以单一剂量先于、在期间的任何时间、或者后于EGFR激酶抑制剂疗程给予。
通常将EGFR激酶抑制剂以这样的剂量方案给予患者，该方案提供了对待治疗患者最有效的癌症的治疗(同时从效力和安全角度考虑)，如本领域已知的和例如国际专利公开号WO01/34574所公开。在进行本发明治疗方法的时候，EGFR激酶抑制剂可以以任何本领域已知的有效方式进行给予，例如经口，局部，静脉内，腹膜内，肌肉内，关节内，皮下，鼻内，眼内，阴道，直肠或者真皮内途径，这取决于所要治疗癌症的种类，所使用EGFR激酶抑制剂的类型(例如小分子，抗体，RNAi，或者反义构建体)，处方医生的医学判断依据，如基于，例如，已经公开的临床研究结果。
给予的EGFR激酶抑制剂的量和给予EGFR激酶抑制剂的时机取决于被治疗患者的类型(种类，性别，年龄，重量，等等)和状态，被治疗疾病或者病症的严重度，和给药途径。例如，可以以剂量范围0.001-100mg/kg体重每天或者每周以单独或者分开的剂量，或者通过连续输液将小分子EGFR激酶抑制剂给予患者(见例如国际专利公开号WO01/34574)。特别是，可以以5-200mg每天或者100-1600mg每周的单独或者分开的剂量范围，或者通过连续输液将盐酸埃洛替尼给予患者。优选剂量是150mg/天。可以以0.1-100mg/kg体重每天/或者每周的单独或者分开的剂量范围，或者通过连续输液将基于抗体EGFR激酶抑制剂，或者反义、RNAi或者核酶构建体给予患者。在一些情况下，低于前述剂量范围下限的剂量水平可以是足够的，而在另一些情况下，可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用，条件是这些更大的剂量在全天给予前首先被分成几个小剂量。
EGFR激酶抑制剂和bortezomib可以分别或者同时以相同或者不同的路径、以广泛种类的各种剂型给予。例如EGFR激酶抑制剂优选口服或者肠胃外给予，而bortezomib优选肠胃外给予。当EGFR激酶抑制剂是盐酸埃洛替尼(TarcevaTM)的时候，优选口服给予。
EGFR激酶抑制剂可以与多种药用惰性载体以下列形式给予片剂、胶囊、糖锭、锭剂、硬糖、粉末、喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏、酏剂、糖浆等等。这些剂型的给予可以以单一或多个剂量进行。载体包括固体稀释剂或者填充剂，无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等等。口服药物组合物可以是适当甜化和/或者增香化的。
EGFR激酶抑制剂和bortezomib可以连同各种药用惰性载体以下列各种形式结合喷雾剂、乳膏剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏等等。这样的剂型可以以单个或者多个剂量给予。载体包括固体稀释剂或者填充剂，无菌水性介质和各种非毒性有机溶剂等等。
应该对所有含有蛋白EGFR激酶抑制剂的制剂进行选择以避免所述抑制剂变性和/或降解和丧失生物活性。
制备包含EGFR激酶抑制剂的药物组合物的方法在本领域是已知的，并描述在例如国际专利公开号WO01/34574。制备包含bortezomib的药物组合物的方法在本领域也是已知的(例如，Singh，N.P.和Verma，K.B.(2002)Archive Oncol.10(4)279-280)。鉴于本发明的教导，从上述引用的出版物和从其他已知的参考文献的教导，如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第18版(1990)，制备包含EGRF激酶抑制剂和bortezomib的药物组合物的方法是明显的。
对于口服给予EGFR激酶抑制剂，含有一种或者两种所述活性剂的片剂与各种赋形剂中任何一种结合，赋形剂例如微晶纤维素，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙和甘氨酸，以及各种崩解剂例如淀粉(并且优选玉米、马铃薯或者木薯淀粉)，藻酸和某些复合硅酸盐，以及粒化粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明胶和阿拉伯胶。另外，润滑剂例如硬脂酸镁，月桂硫酸钠，和滑石通常对于片剂化目的是有用的。类似类型的固体组合物还可以被用作明胶胶囊的填充剂；在这一点，优选的材料还包括半乳糖或者乳糖以及高分子量的聚乙二醇。当口服给予需要水性悬液和/或酏剂的时候，EGFR激酶抑制剂可以与多种甜化或者增香化制剂，着色物质或者染料结合使用，如果需要，也有乳化和/或悬浮剂，连同稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种可能的组合。
对于肠胃外给予任何一种或者两种所述的活性剂，可以使用芝麻油或者花生油中的溶液，或者使用水性丙二醇中的溶液，以及含有所述活性剂或其相应的水溶性盐的无菌水溶液。该无菌水溶液被优选适当地缓冲并还优选赋予等渗，例如，用充足的盐水或者葡萄糖。这些特别的水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射用。油性溶液适用于关节内、肌肉内和皮下注射用。所有这些溶液在无菌条件下的制备通过本领域技术人员熟知的标准制药技术可以很容易地实现。应该对任何给予蛋白EGFR激酶抑制剂的肠胃外制剂进行选择以避免所述抑制剂变性和丧失生物活性。
另外，依照标准制药实践，可以通过以下方式局部给予一种或者两种所述的活性剂例如乳膏剂、洗剂、胶冻、凝胶、糊剂、油膏、软膏等等。例如，可以制备含有大约0.1％(w/v)-大约5％(w/v)浓度的EGFR激酶抑制剂或者bortezomib的局部制剂。
为兽医用途，可以将所述的活性剂以上述任何形式和任何途径分别或者一起给予动物。在一个优选的实施方案中，以胶囊、丸剂、片剂，浸液的形式通过注射或者作为植入物给予EGFR激酶抑制剂。作为备选，可以将EGFR激酶抑制剂与动物饲料一起给予，为此目的，可以制备浓缩的饲料添加剂或者预混和物以用于正常动物饲养。bortezomib优选通过注射或者作为植入物以浸液(liquid drench)形式给予。依照标准的兽医实践，以常规方法制备这样的制剂。
本发明还提供了含有单一容器的试剂盒，所述容器包含EGFR激酶抑制剂和bortezomib两者。本发明还提供了这样的试剂盒，其含有第一容器和第二容器，所述第一容器包含EGFR激酶抑制剂，所述第二容器含有bortezomib。在优选的实施方案中，所述的试剂盒容器还可以进一步包括药用载体。该试剂盒还可以包含无菌稀释剂，其被优选储存在一个单独的附加容器中。所述试剂盒还可以包括一个包装说明书(package insert)，其包含打印的说明书，用于指导将组合治疗用作治疗癌症的方法。
本发明还包括药物组合物，其由结合了药用载体的EGFR激酶抑制剂和bortezomib组成。
优选地，所述组合物由药用载体和非毒性的治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合组成(包括每种组分的其药用盐)。
而且，在该优选的实施方案中，本发明包括用于治疗疾病的药物组合物，其应用导致赘生性细胞、良性或恶性肿瘤生长的抑制、或转移的抑制，其包含药用载体和非毒性的治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括每种组分的其药用盐)。
术语“药用盐”指的是从药用非毒性的碱或者酸制备出的盐。当本发明的化合物是酸性的时候，其相应的盐可以从药用非毒性碱中方便地制备，包括无机碱和有机碱。从这样的无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜(铜和亚铜)、铁、亚铁、锂、镁、锰(锰和亚锰)、钾、钠、锌等盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药用有机非毒性碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，以及环胺和取代的胺如天然存在的和合成取代的胺的盐。其它可以形成盐的药用有机非毒性碱包括离子交换树例如诸如精氨酸，甜菜碱，咖啡碱，胆碱，N′，N′-二苄乙二胺，二乙胺，2-二乙氨基乙醇，2-二甲氨基乙醇，乙醇胺，乙二胺，N-乙基吗啉，N-乙基哌啶，葡糖胺，氨基葡糖，组氨酸，哈胺(hydrabamine)，异丙胺，赖氨酸，甲基葡糖胺，吗啉，哌嗪，哌啶，聚胺树脂，普鲁卡因，嘌呤，可可碱，triethylameine，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇(tromethamine)等等。
当本发明的化合物是碱性时，其相应的盐可以很方便地从药用非毒性酸来制备，所述酸包括无机和有机酸。这样的酸包括例如乙酸，苯磺酸，安息香酸，樟脑磺酸，柠檬酸，乙磺酸，富马酸，，葡糖酸，谷氨酸，氢溴酸，氢氯酸，羟乙磺酸，乳酸，马来酸，苹果酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，硝酸，pamoic，泛酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸，p-甲苯磺酸等等。特别优选的是柠檬酸，氢溴酸，氢氯酸，马来酸，磷酸，硫酸和酒石酸。
本发明的药物组合物含有作为活性成分的EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)，药用载体，和任选的其它治疗组分或者助剂。其它的治疗剂可以包括如上列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂，或者提高这些药剂的效果的试剂。所述的组合物包括适用于口服、直肠、局部和肠胃外给药(包括皮下、肌肉内和静脉内)的组合物，尽管任何给定情况中最合适的途径将取决于特定的宿主，以及活性成分将被给药针对的疾病的性质和严重程度。所述的药物组合物可以以单位剂型方便地给出，并且以制药领域所熟知的任何方法制备。
在实践中，依照常规药物组合技术，可以将本发明的由EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)代表的化合物作为活性组分与药物载体紧密掺合。该载体可以采取广泛种类的形式，这取决于需要给药的制剂的类型，例如经口或者肠胃外(包括静脉内)。因此，本发明的药物组合物可以呈现为适于口服的离散单位如胶囊，扁囊剂或者片剂，每种都含有预定量的活性成分。此外，所述的组合物可以呈现为粉末、颗粒、溶液、水性液体中的悬液、非水性液体，水包油乳剂，或者油包水液体乳剂。除了上面举出的常规剂型外，EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)还可以通过缓释方式和/或者递送装置给药。可以通过任何一种药学方法制备组合组合物。通常，这样的方法包括将活性成分与组成一种或者多种必需组分的载体相关联的步骤。通常，通过均匀化和紧密掺合活性组分与液体载体或细碎的固体载体或两者来制备所述的组合物。随后可以将产品方便地定型成所需的形式。
因此，本发明的药物组合物可以含有药用载体和EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)。EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)也可以与一种或者多种其它治疗活性化合物被包含在药物组合物中。其它的治疗活性化合物可以包括如上面列出的那些细胞毒性的、化疗的或者抗癌剂，或者增强这些药剂效果的制剂。
因此本发明的一个实施方案中，药物组合物可以含有组合以抗癌剂的EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib，其中所述的抗癌剂是一种选自由下列各项组成的组的成员烷基化药物，抗代谢物，微管抑制剂，鬼臼毒素，抗生素，亚硝基脲，激素治疗，激酶抑制剂，肿瘤细胞凋亡活化剂，和抗血管生成剂。
使用的药物载体可以是例如固体、液体、或者气体。固体的实例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、和硬脂酸。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。
在制备用于口服剂型的组合物中，可以使用任何方便的药物介质。例如水，二元醇，油，醇类，增香剂，防腐剂，着色剂等等可以被用于形成口服液体制剂例如悬液，酏剂和溶液，而载体例如淀粉，糖，微晶纤维素，稀释剂，粒化剂，润滑剂，粘合剂，崩解剂等可以被用于形成口服固体制剂例如粉末、胶囊和片剂。因为其容易给药，片剂和胶囊是优选的口服剂型，从而使用固体药物载体。任选地，片剂可以用标准的水性或者非水性技术包衣。
含有本发明组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压缩片剂可以通过用合适的机器通过压缩制备，其活性组分为自由流动形式如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性成分或者分散剂混和。成型片剂可以通过在合适的机器中成型，粉化化合物的混合物用惰性液体稀释剂湿润。每种片剂优选含有大约0.05mg到大约5g的活性组分，并且每个扁囊剂或者胶囊优选含有大约0.05mg到大约5g的活性组分。
例如，用于口服给药于人的制剂可以含有大约0.5mg到5g的活性剂，与合适的和便捷量的、可能从大约5％-大约95％全部组合物变化的载体物质混合。单位剂型通常含有从大约1mg到大约2g的活性组分，通常为25mg，50mg，100mg，200mg，300mg，400mg，500mg，600mg，800mg，或者1000mg。
本发明适用于肠胃外给药的药物组合物可以被制备为在水中的活性化合物的溶液或者悬液。可以包括合适的表面活性剂例如诸如羟丙基纤维素。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其在油中的混和物中来制备。另外，防腐剂可以被加入其中以防止微生物的有害生长。
本发明的适合注射用的药物组合物包括无菌的水性溶液或者分散体。此外，所述的组合物可以以无菌粉末的形式用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散体。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以方便注射。所述的药物组合物必须在制备和储存条件下是稳定的；因此，其优选应该以防止微生物如细菌和真菌的污染作用的方式保存。所述的载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇)，植物油及其适当的混合物。
本发明的药物组合物可以以适用于局部使用的方式存在，例如诸如气溶胶，乳膏剂，油膏，洗剂，撒粉，等。此外，所述的组合物可以是适用于经皮装置的形式。这些制剂可以利用本发明的EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)，经由传统方法制备。作为实例，通过混和亲水物质和水，以及大约5重量％到大约10重量％的所述化合物来制备乳膏剂或者油膏，以制备具有所需稠度的乳膏剂或者油膏。
本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式，其中的载体是固体。优选混和物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其它本领域常用的物质。所述的栓剂可以通过首先将所述组合物与软化的或者融化的载体混和并在模具中冷却和成型来方便地形成。
除了上述的载体组分外，上面描述的药物制剂，如果合适，可以包含一种或者多种另外的载体组分例如稀释剂、缓冲剂，增香剂，粘合剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂，防腐剂(包括抗氧化物)等等。另外，可以包括其它的助剂来使得所述制剂与目的受体的血液等渗。含有EGFR激酶抑制剂化合物和bortezomib组合(包括其每种组分的药用盐)的组合物也可以制备成粉末或者液体浓缩物形式。
本发明组合的化合物剂量水平可以近似地如本文所述，也可以如本领域对这些化合物的描述那样。但是应该理解的是，对于任何具体患者的特定剂量水平将取决于许多因素，包括年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、给药路径、排泄率、药物组合以及受治疗的具体疾病的严重性。
经过以下的实验细节将会更好的理解本发明。但是，本领域的技术人员应该清楚的理解所讨论的具体的方法和结果仅仅是为了阐述本发明，而后附的权利要求会更完全地概括本发明，这些实验细节不能被认为以任何方式限制了本发明。
实验细节介绍在体外利用一组NSCLC细胞系研究了Erltinib和bortezomib组合的功效。该组合的基本原理是这两种药剂每种已经显示临床活性，没有交叉毒性，它们在细胞周期的不同部分具有功效。而且，象IκB的蛋白体降解(Stevenson，J.P.et al.(2004)J.Clin.Oncol.22(14S)7145)，EGFR轴的活化已经显示激活NF-κB途径，我们假定通过抑制上游和下游靶目标，我们能够激活更多的细胞毒性。
材料和方法化学品埃洛替尼由OSI Pharmaceuticals作为盐酸埃洛替尼(TarcevaTM)提供，临床级别的bortezomib获自Montifiore Medical Center，NY，门诊药房。将两种药剂均溶解在DMSO中作为储液，并用PBS稀释到需要的浓度。单克隆抗体获自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)，其它的化学品获自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)。
细胞培养和细胞毒性检测7种非小细胞肺癌细胞系(H322，H358，H661，H460，H522，H1299，A549)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。将所有的细胞培养在补充以10％胎牛血清的RPMI 1640，5％CO2和95％空气的湿润气氛中。
将对数期生长的细胞连续暴露于各种浓度的埃洛替尼HCl和bortezomib达72小时，通过MTT检测评估药物诱导的细胞毒性，如先前所述(Ling，Y-H et al.(1993)Cancer Res.53(7)1583-1589)。
对于组合研究，将细胞暴露于埃洛替尼HCl或bortezomib，以伴随或间隔24小时顺序的方式，或者单独或者组合给药，从第一次暴露于药物起72小时通过MTT检测评估细胞存活。
细胞周期分析以伴随或间隔24小时顺序的方式，或者单独或者组合地用埃洛替尼HCl或bortezomib处理细胞。从第一次暴露于药物开始48小时收获细胞，用75％乙醇在-20℃过夜固定，然后在室温下与5μg/mL碘化丙锭(propidium iodide)和5μg/mL RNase I(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)温育3小时。通过流式细胞仪(Epics Profile Analyzer；Coulter Co.，Miami，FL)测定细胞周期的不同阶段的细胞数和凋亡细胞(sub-G1)。
蛋白印迹分析将细胞从培养物刮除，用PBS洗涤2次，然后于0-4℃悬浮在60-100μL含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，250mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM NaF，1mM苯基甲基磺酰氟，1mM DTT，20μg/mL亮抑酶肽，20μg/mL抑酶肽，0.1％Triton X-100含1％SDS的蛋白印迹裂解缓冲液中15分钟。于0℃，1500x g离心10分钟后，收集上清液，并在10％SDS-PAGE上分离蛋白质。电泳后，将蛋白印迹转移到硝酸纤维素膜上。将膜用5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭，并与相应的初级抗体于4℃过夜温育。用TBST洗涤3次后，将膜在室温下与辣根过氧化物酶-缀合的次级抗体温育1小时，所述次级抗体用TBST稀释(1∶1000)。通过增强的化学发光(cheiluminescence)反应系统(Amersham，Arlington Heights，IL)显现检测的蛋白信号。
统计所有结果是三次独立实验的平均值。将结果表示为平均值+/-标准偏差，并在适当的时候利用斯氏t-检验来比较平均值。
结果NSCLC细胞对埃洛替尼和bortezomib的敏感性在图1中显示埃洛替尼HCl和bortezomib对7种NSCLC细胞系的细胞毒性。检测的7种NSCLC细胞系中仅2种对埃洛替尼敏感，其余的IC50值高出10倍，或是抗性的。在另一方面，bortezomib具有较窄的活性范围，其IC50为10-66nM。我们选择了对埃洛替尼HCl敏感的2个细胞系(H322和H358)，和2个抗性的细胞系(A549和H1299)，以进一步研究两种药剂的组合。
埃洛替尼和bortezomib的合并的细胞毒性功效在图2中显示在人NSCLC细胞中埃洛替尼和bortezomib组合的组合指数。除了结果不明确的H358人支气管肺泡细胞之外，埃洛替尼和bortezomib组合的细胞毒性既不是协同性的，也不是加成性的。由于两种药剂中支气管肺泡细胞癌症患者中的临床活性和来自协同性分析的不明确结果，我们进一步检测在H358支气管肺泡细胞中的组合。细胞计数和凋亡的时程分析证实同时提供的埃洛替尼和bortezomib组合具有比单独任何一种药剂更多的活性。然而，合并的功效不是加成性的(图3)。
埃洛替尼对细胞周期和凋亡的功效我们检测两种药剂对细胞周期和凋亡的功效。埃洛替尼导致细胞周期在G1期停滞，在更敏感的细胞中最显著。该G1细胞周期停滞伴随着敏感细胞而非抗性细胞中的凋亡的增加。在敏感和抗性细胞中关于基线EGFR表达没有差别。埃洛替尼在敏感细胞和抗性细胞中抑制EGF-诱导的EGFR-磷酸化。
bortezomib对细胞周期和凋亡的功效如我们先前所报道，bortezomib诱导细胞周期停滞在G2/M期，并且细胞周期停滞伴随凋亡的时间依赖性增加(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。与先前报道的具有突变p53的H322细胞系相比，bortezomib诱导的G2/M停滞和凋亡的功效在具有野生型的细胞系(A549)或无效p53的细胞系(H358，H1299)中更显著。
埃洛替尼和bortezomib之间的时间表依赖性相互作用我们检验了以24小时间隔顺序给药的两种药物的组合的功效。将对数期生长的细胞暴露于单独的埃洛替尼HCl和bortezomib药物中，或暴露于同时给予或间隔24小时顺序给予的两者组合中，如上所述，在从第一次暴露于药物48小时进行细胞周期分析。用bortezomib，接着用埃洛替尼HCl的顺序疗法具有与单独bortezomib或同时暴露相似的细胞周期功效。然而，预先暴露于埃洛替尼24小时导致G1细胞周期停滞，并废除了bortezomib的G2/M功效。预先暴露于埃洛替尼对这种拮抗效应在敏感细胞系(H322和H358)和抗性细胞(A549和H1299)中均观察到，其中抗性细胞的程度较低，并且这种拮抗效应与由埃洛替尼诱导的G1停滞的程度成比例。这种细胞周期拮抗效应在H1299细胞中最不显著，该细胞对埃洛替尼诱导的G1停滞最具抗性。
我们进一步检验了bortezomib诱导的细胞毒性和凋亡的这种细胞周期效应的结果。与单独埃洛替尼处理相比，预先暴露于埃洛替尼导致增加的细胞存活，和减少的凋亡。再次，埃洛替尼敏感的H358以及抗性A549中均观察到这种效应。不幸地是，与单独bortezomib处理相比，通过伴随暴露或相反的顺序，即先bortezomib，然后接着是埃洛替尼，没有观察到增加的活性。
预暴露于埃洛替尼的拮抗作用独立于p53稳定化p53也是一种应答于细胞应激而介导凋亡的重要的介质。在静态细胞中，p53具有非常短的半衰期，并且被Mdm-2严格地介导。后者结合p53，并且通过其遍在蛋白连接酶功能把p53靶向蛋白酶体降解。细胞应激在p53上导致一系列的磷酸化事件，这由于p53活化导致从Mdm-2解离。p53活化的结果包括细胞周期停滞，DNA修复，和如果DNA修改不成功的话，发生凋亡。
我们先前已证实bortezomib抑制p53蛋白的降解，由bortezomib诱导的G2/M停滞可能与遍在蛋白化的p53蛋白积累有关。我们检验了埃洛替尼和bortezomib不同顺序对p53的影响，以阐明通过预先暴露于埃洛替尼所观察到的细胞周期拮抗作用。将具有野生型p53的A549细胞暴露于单独的bortezomib或埃洛替尼中，或伴随地或间隔24小时顺序地暴露于两者的组合中，通过蛋白印迹检验p53的表达。相比于阳性对照紫杉醇，暴露于bortezomib导致遍在蛋白化的p53积累。伴随或顺序暴露于埃洛替尼对bortezomib诱导的遍在蛋白化的p53积累没有影响。该结果，结合我们在p53无效H358细胞中观察到的相似的拮抗结果，证实预先暴露于埃洛替尼的拮抗效应独立于bortezomib诱导的p53稳定化。
预先暴露于埃洛替尼防止bortezomib诱导的胱天蛋白酶3活化我们先前的工作证实bortezomib诱导活性氧类别(ROS)的产生，这对于bortezomib诱导的G2/M停滞和凋亡是必需的。这种ROS产生伴随着线粒体电势改变，细胞色素c释放到细胞溶胶中，和效应物胱天蛋白酶包括胱天蛋白酶3的最终活化。我们检验了bortezomib和埃洛替尼的不同时间表(schedule)对胱天蛋白酶3活化和PARP切割的作用。预先暴露于埃洛替尼24小时抑制bortezomib诱导的胱天蛋白酶3活化和PARP切割。这在A549和H358细胞中均观察到。
结论我们的结果强调在组合临床活性生物药剂前适当地临床前研究的重要性。在具有NSCLC的患者中，埃洛替尼和bortezomib已经显示具有临床活性，并且这些药剂不具有交叉毒性。我们观察到在我们的NSCLC细胞组中，埃洛替尼的细胞毒性是选择性的，而bortezomib具有更窄范围的细胞毒性。在检验的4种细胞系的3种中，埃洛替尼和bortezomib既不是加成性的，也不是协同性的。在H358支气管肺泡细胞中，该组合比单独任何一种药剂更有活性，但效果不是加成性的。
我们证实我们先前的报道，即bortezomib诱导G2/M细胞周期停滞，并且伴随凋亡的时间依赖性增加(Ling，Y-H.et al.(2003)Clin.Cancer Res.9(3)1145-1154)。预先暴露于埃洛替尼导致G1细胞周期停滞，并且废除了bortezomib的活性。埃洛替尼对遍在蛋白化的p53蛋白的稳定性没有影响。然而，通过预先暴露于埃洛替尼抑制了bortezomib对胱天蛋白酶3的活化。在我们研究中观察到的预先暴露于埃洛替尼的时间表依赖性拮抗效应强调了组合活性抗肿瘤药物的治疗时间表的重要性。
总之，本研究的结果证实了埃洛替尼和bortezomib组合比单独任何一种药剂在H358支气管肺泡细胞中更有活性，因此可用于治疗患有癌症的患者的某些NSCLC和其它肿瘤。在结合埃洛替尼和bortezomib时时间表的选择是非常重要的，并且需要进一步的体内研究来进一步评估该组合。
通过参考结合所有的专利、公开的专利申请和本文公开的其它文献都通过参考特别结合于此。
等价物本领域的技术人员使用不过是常规的实验就会认识到或者能够确定，许多于此处具体描述的本发明的具体实施方案的等价物。下面的权利要求的范围意欲将这些等价物包含其中。
权利要求
1.药物组合物，其包含在药用载体中的EGFR激酶抑制剂和bortezomib。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述EGFR激酶抑制剂包括埃洛替尼。
3.权利要求2的药物组合物，其中在所述组合物中的埃洛替尼以盐酸盐的形式存在。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其另外包含一种或多种另外的抗癌剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述另外的抗癌剂是选自下列各项的成员烷基化药物，抗代谢物，微管抑制剂，鬼臼毒素，抗生素，亚硝基脲，激素疗法，激酶抑制剂，肿瘤细胞凋亡的活化剂，和抗血管生成剂。
6.用于制备药物的方法，所述药物用于治疗肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用EGFR激酶抑制剂和bortezomib。
7.权利要求6的方法，其中所述药物用于癌症。
8.权利要求6或7的方法，其中在相同的制剂中将EGFR激酶抑制剂和bortezomib共同给药于患者。
9.权利要求6或7的方法，其中在不同的制剂中将EGFR激酶抑制剂和bortezomib共同给药于患者。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中通过相同的途径将EGFR激酶抑制剂和bortezomib共同给药于患者。
11.权利要求6-9任一项的方法，其中通过不同的途径将EGFR激酶抑制剂和bortezomib共同给药于患者。
12.权利要求6-11任一项的方法，其中通过胃肠外或口服给药将EGFR激酶抑制剂给药于患者。
13.权利要求6-12任一项的方法，其中通过胃肠外给药将bortezomib给药于患者。
14.权利要求6-13任一项的方法，其中被治疗的肿瘤或肿瘤转移选自肺癌，结肠直肠癌，NSCLC，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤黑素瘤，眼球内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌，输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，慢性白血病，急性白血病，淋巴细胞淋巴瘤，CNS瘤，脊椎癌，胶质瘤，脑干胶质瘤，多形性成神经胶质细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜细胞瘤，成神经管细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌和垂体腺瘤肿瘤或肿瘤转移。
15.权利要求6-14任一项的方法，其中所述肿瘤或肿瘤转移是难治的。
16.权利要求6-15任一项的方法，其中所述被治疗的肿瘤或肿瘤转移是肺癌肿瘤或肿瘤转移。
17.权利要求6-16任一项的方法，其中所述EGFR激酶抑制剂包括埃洛替尼。
18.权利要求6-17任一项的方法，其另外包括施用一种或多种其它抗癌剂。
19.权利要求6-18任一项的方法，其中所述其它的抗癌剂选自烷基化剂，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，顺铂，卡铂，奥沙利铂，白消安，美法仑，卡莫司汀，链脲霉素，曲他胺，丝裂霉素C，抗代谢物，甲氨蝶呤，依托泊苷，6-巯嘌呤，6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，卡培他滨，吉西他滨，达卡巴嗪，抗生素，放线菌素D，多柔比星，柔红霉素，博来霉素，普卡霉素，生物碱，长春碱，紫杉醇，多西他赛，长春瑞滨，糖皮质激素，地塞米松，皮质甾类，波尼松，核苷酶抑制剂，羟基脲，氨基酸耗竭酶，天冬酰胺酶，托泊替康，伊立替康，甲酰四氢叶酸和叶酸衍生物。
20.制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于治疗患者中的肿瘤或肿瘤转移，所述方法包括将bortezomib和EGFR激酶抑制剂结合。
21.权利要求20的方法，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
22.权利要求21的方法，其还包括将药用载体与bortezomib和埃洛替尼结合。
23.试剂盒，其包含容器，所述容器包括bortezomib和EGFR激酶抑制剂。
24.权利要求23的试剂盒，其还包含无菌稀释剂。
25.权利要求23或24的试剂盒，其中所述EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
26.权利要求23-25任一项的试剂盒，其还包含包装说明书，所述包装说明书包括打印的说明，以指导患者使用bortezomib和埃洛替尼的组合治疗作为治疗患者中肿瘤、肿瘤转移或其它癌症的方法。
27.权利要求1的组合物，其另外包含一种或多种其它的抗癌剂。
28.权利要求27的组合物，其中所述其它的抗癌剂是选自由下述各项组成的组的成员烷基化药物，抗代谢物，微管抑制剂，鬼臼毒素，抗生素，亚硝基脲，激素疗法，激酶抑制剂，肿瘤细胞凋亡的活化剂和抗血管生成剂。
29.治疗癌症的方法，包括对需要这种治疗的受试者给药(i)第一有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二有效量的bortezomib。
30.治疗癌症的方法，包括对需要这种治疗的受试者给药(i)第一低于治疗量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二低于治疗量的bortezomib。
31.权利要求29或30的治疗癌症的方法，其中EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
32.权利要求6的方法，其中被治疗的肿瘤或肿瘤转移是结肠直肠肿瘤或肿瘤转移。
33.药物组合物，特别用于癌症，所述药物组合物包含(i)第一有效量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二有效量的bortezomib。
34.药物组合物，特别用于癌症，所述药物组合物包含(i)第一低于治疗量的EGFR激酶抑制剂，或其药用盐；和(ii)第二低于治疗量的bortezomib。
35.权利要求33或34的药物组合物，其中所述EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
36.EGFR激酶抑制剂和bortezomib，其用作药物，特别用于癌症。
37.埃洛替尼和bortezomib，其用作药物，特别用于癌症。
38.EGFR激酶抑制剂和bortezomib在制备用于治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。
39.权利要求38的应用，其中所述EGFR激酶抑制剂是埃洛替尼。
40.如此处所述的新的化合物，工艺，药物组合物，方法和用途。
全文摘要
本发明提供制备药物的方法，所述药物用于治疗患者的肿瘤或肿瘤转移，所述方法特征在于使用治疗有效量的EGFR激酶抑制剂和bortezomib，结合或不结合另外的药剂或治疗，如其它的抗癌药物或辐射疗法。本发明还包含药物组合物，其由EGFR激酶抑制剂和bortezomib组合以及药用载体组成。可用于实施本发明的EGFR激酶抑制剂优选的实例是化合物盐酸埃洛替尼(也已知为Tarceva
文档编号A61P35/00GK101043892SQ200580035560
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月18日 优先权日2004年10月18日
发明者比拉勒·皮佩蒂 申请人:比拉勒·皮佩蒂