靶向nc的制作方法

专利名称：靶向nc的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学、生理学和医学领域。更具体地，本发明提出了治疗患者的新方法，包括给药靶向由胞内钙激活且由胞内ATP阻断的独特非选择性阳离子通道(NCCa-ATP通道)的治疗化合物。在特定的实施方案中，治疗化合物是激动剂，及其在得益于神经元细胞死亡的治疗如癌症治疗中的用途。在其他特定实施方案中，治疗化合物是拮抗剂，及其在得益于NCCa-ATP通道的阻断和/或抑制的治疗如脑缺血或水肿治疗中的用途。还涉及含有NCCa-ATP通道激动剂和/或拮抗剂的组合物。
背景技术：
I.NCCa-ATP通道最初在天然反应性星形细胞(NRA)中，之后，如在此所述的，在中风或外伤性脑损伤后的神经元和毛细血管内皮细胞中，鉴定出独特的非选择性单价阳离子ATP-敏感性通道(NCCa-ATP通道)(参见，Simard等的国际申请WO03/079987，以及Chen和Simard，2001，各自在此全部引入作为参考)。认为NCCaATP通道是由1型磺酰脲受体(SUR1)调节亚基和孔-形成亚基组成的杂多聚体结构，与胰腺β-细胞中的KATP通道相似(Chen等，2003)。NCCa-ATP通道的孔-形成亚基仍未表征。
SUR赋予对于抗糖尿病的磺酰脲类如格列本脲(glibenclamide)和甲苯磺丁脲(tolbutamide)的敏感性，并负责通过称为“K+通道开放剂”如二氮嗪、吡那地尔(pinacidil)和cromakalin的一组化学上多种多样的试剂的激活(Aguilar-Byran等，1995；Inagaki等，1996；Isomoto等，1996；Nichols等，1996；Shyng等，1997“)。在各种组织中，分子上不同的SUR结合不同的孔-形成亚基来形成具有可区分的生理和药理特征的不同KATP通道。胰腺β-细胞中的KATP通道由连接Kir6.2的SUR1形成，而心肌和平滑肌KATP通道各自由连接Kir6.2和Kir6.1的SUR2A和SUR2B形成(Fujita等，2000)。尽管由截然不同的孔-形成亚基组成，NCCa-ATP通道对磺酰脲化合物也是敏感的。
此外，和KATP通道不一样，NCCa-ATP通道以接近相等的能力传导钠离子、钾离子、铯离子和其他单价阳离子(Chen和Simard，2001)，进一步表明了NCCa-ATP通道的表征及因此对某些化合物的亲和性不同于KATP通道。
已经鉴定出通过胞内Ca2+激活并通过胞内ATP抑制的其他非选择性阳离子通道，但不是在星形细胞中。此外，关于钙敏感性和腺苷酸敏感性，在星形细胞中表达和发现的NCCa-ATP通道在生理上不同于其他通道(Chen等，2001)。
II.神经胶质膜囊(gliotic capsule)脑中围绕“异物”形成的神经胶质膜囊是重要的(虽然被忽视的)生物系统。一方面，神经胶质膜囊表示脑对损伤性刺激的应答--脑试图隔开、分离、处理和以其他方式保护自身免遭异物伤害的努力。另一方面，神经胶质膜囊形成潜在有害的组织块，从其产生引起脑肿胀的水肿液体，并且它的组成细胞经受细胞毒性水肿，这进一步增加了脑肿胀。此外，神经胶质膜囊保护外源细胞免受免疫监视。
涉及神经胶质膜囊形成的必要元素在许多类型的CNS病理学中似乎是一致的，无论创伤性植入的异物、转移性肿瘤、脑脓肿或中风后的梗死坏死组织。首先，小神经胶质细胞和星形细胞在损伤部位附近变得激活，大的星状GFAP-阳性反应性星形细胞形成最主要的应答细胞成分。其次，实体的外源性质受到识别，应答启动来围绕和限制该实体。尽管“异物”的概念包括多种病理状况，在大部分情况中应答彼此间具有很大的相似性。
异物和神经胶质膜囊之间的接触面，称为神经胶质膜囊的内区(inner zone)，似乎在决定对损伤的整体应答中很重要。
尽管整体上是有益的，神经胶质膜囊形成潜在有害的引起脑肿胀和肿块效应的组织块，并可以将外源细胞遮掩起来免受免疫系统的监视。申请人第一个在大鼠和人的多种病理状况中确定了神经胶质膜囊内区中的反应性星形细胞(R1星形细胞)表达新的SUR1-调节的阳离子通道，NCCa-ATP通道，并确定了该通道直接控制细胞生存力打开通道与坏死性细胞死亡相关，而关闭通道与保护免于发生能量(ATP)耗尽诱导的细胞死亡相关。
III.癌症脑转移是癌症患者发病率和死亡率的重要原因。因为这些患者中的大部分死于全身性疾病，主要的治疗目标通常只是提高生活质量。脑转移的常规治疗通常是全脑照射。化疗可以导致化疗敏感性肿瘤中的脑转移消退，但是整体上，包括化疗和免疫治疗的辅助治疗的结果是令人失望的。
认知最广的隔离脑转移的 “屏障”是血脑屏障(BBB)。此外，围绕转移形成的神经胶质膜囊形成了“肿瘤-脑屏障”(TBB)，这也隔离和保护转移性肿瘤。和原发性CNS-衍生的肿瘤如成胶质细胞瘤不一样，脑的转移性癌症诱导显著的星形细胞反应，导致神经胶质膜囊的形成。围绕转移性肿瘤形成的神经胶质膜囊表示脑对损伤性刺激的应答--脑试图隔开、分离、处理和以其他方式保护自身免遭转移性肿瘤的努力。然而，重要地，神经胶质膜囊还起到屏障的作用，保护转移肿瘤免受免疫监视和治疗靶向。
对转移性脑肿瘤成功的免疫治疗和化疗仍然是难以找到的。通常，治疗这些肿瘤的困难归因于血脑屏障(BBB)的存在，认为其阻止了化疗剂和免疫细胞进入到位于脑中的肿瘤中。然而，许多供应给脑中转移性肿瘤的血液源自位于肿瘤周围神经胶质膜囊中的血管和毛细血管，且这些毛细血管，和脑本身中的那些不一样，是有小孔的。围绕肿瘤的神经胶质膜囊自身具有由表达紧密连接蛋白的R1星形细胞定居(populated)的内区，且认为该内区在肿瘤和脑之间形成屏障。将由R1星形细胞形成的屏障称为肿瘤-脑屏障(TBB)。
使用化疗剂的单一疗法不是非常有效，因为常规的化疗剂不能以有效量到达CNS部分，主要是由于血脑屏障(BBB)。例如，足叶乙甙和放线菌素D，两种抑制拓扑异构酶II的常用肿瘤学药剂，不能以有用的量穿过血脑屏障。
如在此所述的，申请人第一个确定了神经胶质膜囊的内区由表达NCCa-ATP通道的R1星形细胞定居，且选择性杀灭表达NCCa-ATP通道的星形细胞破坏TBB，引起白细胞迁移穿过TBB。
从以下为了公开目的而给出的本发明目前的优选实施方案的描述将清楚其他和更多的目的、特征和优势。
发明简述本发明涉及可以在神经元细胞、神经胶质细胞(例如，星形细胞、室管膜细胞、少突神经胶质细胞和小神经胶质细胞)或神经内皮细胞(例如，毛细血管内皮细胞)中表达的通过胞内钙激活并通过胞内ATP阻断的独特非选择性阳离子通道(NCCa-ATP)，其中细胞已经或正暴露于外伤，例如，急性神经元损伤(例如，缺氧、缺血、脑水肿或细胞肿胀)、毒性化合物或代谢物、急性损伤、癌症、脑脓肿等。更具体地，本发明涉及该NCCa-ATP通道的调控和/或调节以及如何可将它的调节用于治疗各种疾病和/或病症，例如过度增殖性疾病和急性神经元损伤(例如，中风、缺血/缺氧损伤)。再者，本发明涉及该NCCa-ATP通道的调控和/或调节及其在维持或破坏神经胶质膜囊完整性中的作用。由给药通道的激活剂或激动剂或通道的拮抗剂或抑制剂引起对通道的调节和/或调控。因此，根据疾病，给药组合物(拮抗剂或抑制剂)来阻断或抑制通道以防止细胞死亡，例如来治疗由于组织外伤或提高的组织压力所致的缺血引起的脑水肿。在这些情况中，将通道阻断来防止或降低或调节细胞的去极化。在癌症或其他过度增殖性疾病的情况中，所期望的是通过给药激动剂或激活剂化合物打开或激活通道来引起细胞去极化，导致癌细胞或过度增殖性细胞的细胞死亡。
本发明的组合物可以以消化道或非肠道传送。消化道给药的实例包括但不限于口服、口含、直肠或舌下。非肠道给药可以包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、静脉内、肿瘤内、动脉内、心室内、腔内、膀胱内、鞘内或胸膜内。其他给药方式还可以包括局部、粘膜、经皮、直接注射至脑实质中。
可以给予细胞的NCCa-ATP通道激动剂或拮抗剂的有效量包括约0.0001nM至约2000μM的剂量。更具体地，待给药激动剂的剂量为约0.01nM至约2000μM；约0.01μM至约0.05μM；约0.05μM至约1.0μM；约1.0μM至约1.5μM；约1.5μM至约2.0μM；约2.0μM至约3.0μM；约3.0μM至约4.0μM；约4.0μM至约5.0μM；约5.0μM至约10μM；约10μM至约50μM；约50μM至约100μM；约100μM至约200μM；约200μM至约300μM；约300μM至约500μM；约500μM至约1000μM；约1000μM至约1500μM和约1500μM至约2000μM。当然，所有这些量是示例性的，可以预料到这些点之间的任何量在本发明中也是有用的。
作为治疗的NCCa-ATP通道激动剂和/或拮抗剂或其相关化合物的有效量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。本发明的一实施方案中，NCCa-ATP通道激动剂和/或拮抗剂或其相关化合物的剂量范围为约0.01μg/kg体重至约20,000μg/kg体重。当待治疗的是动物的时候，术语“体重”是适用的。当待治疗的是分离的细胞时，在此所用的“体重”应当理解为意思是“总细胞体重”。术语“总体重”可以适用于分离的细胞和动物治疗。认为在本申请中表示为“体重”或简单表示为“kg”的所有浓度和治疗水平也涵盖了类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而，本领域技术人员将认识到多种剂量范围的效用，例如0.01μg/kg体重至20,000μg/kg体重、0.02μg/kg体重至15,000μg/kg体重、0.03μg/kg体重至10,000μg/kg体重、0.04μg/kg体重至5,000μg/kg体重、0.05μg/kg体重至2,500μg/kg体重、0.06μg/kg体重至1,000μg/kg体重、0.07μg/kg体重至500μg/kg体重、0.08μg/kg体重至400μg/kg体重、0.09μg/kg体重至200μg/kg体重或0.1μg/kg体重至100μg/kg体重。此外，本领域技术人员将认识到各种不同的剂量水平是有用的，例如，0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。当然，所有这些剂量是示例性的，且可以预料这些点之间的任何剂量在本发明中也是有用的。对于NCCa-ATP通道的激动剂和/或拮抗剂或其相关化合物可以使用以上任何的剂量范围或剂量水平。
通过1型磺酰脲受体(SUR1)的拮抗剂阻断和通过SUR1激活剂打开NCCa-ATP通道。更具体地，1型磺酰脲受体(SUR1)的拮抗剂包括KATP通道的阻断剂，SUR1激活剂包括KATP通道的激活剂。更具体地，本发明的NCCa-ATP通道对钾离子(K+)具有20至50pS的单通道电导。NCCa-ATP通道还受到细胞膜胞质侧的生理浓度范围内的Ca2+刺激，其中浓度范围为10-8至10-5M。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内的细胞质ATP抑制，其中浓度范围为10-1至10M。NCCa-ATP通道还能透过以下阳离子K+、Cs+、Li+、Na+；达到任何两种阳离子之间的通透性比例高于0.5且低于2的程度。
本发明的特定实施方案包括治疗过度增殖性疾病的方法，通过将适量的有效激活神经元细胞或神经胶质细胞或神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。通道的激活引起钠离子(Na+)的流入，导致细胞的去极化。Na+的流入改变了渗透梯度，引起水流入细胞中，这导致细胞毒性水肿，最终导致坏死性细胞死亡。
过度增殖性疾病是肿瘤，例如，良性或恶性肿瘤。更具体地，肿瘤是神经瘤或神经胶质瘤。更进一步，肿瘤可以源于原发性脑肿瘤或转移性脑肿瘤。神经胶质瘤可以包括，但不限于，星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、视神经神经胶质瘤和少突神经胶质瘤。肿瘤还可以是胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、脉络丛的乳头状瘤、转移瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、先天性肿瘤、神经肉瘤、神经纤维瘤病、成神经细胞瘤、颅咽管瘤、松果体部位肿瘤或原始性神经外胚层肿瘤。
激活剂化合物或激动剂可以是1型磺酰脲受体激动剂。例如，可以用于本发明中的激动剂包括但不限于SUR1的激动剂，例如，二氮嗪、吡那地尔(pinacidil)、P1075和cromakalin。其他激动剂可以包括但不限于二氮嗪衍生物，例如，3-异丙基氨基-7-甲氧基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(NNC 55-9216)、6，7-二氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 154)、7-氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 73)、6-氯-3-异丙基氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NNC55-0118)4、6-氯-3-(1-甲基环丙基)氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NN414)、3-(3-甲基-2-丁氨基)-4H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 44)、3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(4，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 62)、3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(2，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 79)、2-烷基-3-烷基氨基-2H-苯并-和2-烷基-3-烷基氨基-2H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物、6-氯-3-烷基氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物衍生物、4-N-取代的和未取代的3-烷基-和3-(烷基氨基)-4H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物。此外，其他化合物，包括6-氯-2-甲基喹啉-4(1H)-酮(HEI 713)和LN 533021，以及药物芳氰基胍类是已知的SUR1激活剂或激动剂。可以使用的其他化合物包括已知能激活KATP通道的化合物。
再一实施方案中，方法包括给予患者抗癌治疗联合激活或刺激或打开NCCa-ATP通道的激活剂化合物。抗癌或抗肿瘤治疗是化疗、放疗、免疫治疗、外科手术或其组合。
本发明的另一个实施方案包括破坏患者脑中肿瘤周围的肿瘤-脑屏障完整性的方法，包括将有效激活神经元细胞或神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中的NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。该方法可以进一步包括给予患者抗癌治疗，其中抗癌治疗或抗肿瘤治疗是化疗、放疗、免疫治疗、外科手术或其组合。
更进一步，本发明的另一个实施方案包括诱导神经元细胞或神经胶质细胞或神经内皮细胞的细胞死亡的方法，包括将有效激活所述细胞中NCCa-ATP通道的化合物给予细胞。NCCa-ATP通道的激活导致钠离子(Na+)的流入，导致细胞去极化。Na+的流入改变了渗透梯度，导致水流入细胞中，这导致了细胞毒性水肿，最终导致坏死性细胞死亡。
再进一步，本发明的另一个实施方案包括药物组合物，该组合物包括血栓溶解剂(例如，组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿尼普酶(anistreplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase))、抗凝血剂或抗血小板剂(例如，阿司匹林、华法林(warfarin)或香豆定(coumadin)、他汀类药物、利尿剂、血管扩张药、甘露醇、二氮嗪(diazoixde)或刺激或促进缺血前状况(precondition)的类似化合物或其可药用盐和抑制NCCa-ATP通道的化合物或其可药用盐。可以认为该药物组合物是神经保护性的。例如，包括血栓溶解剂和抑制NCCa-ATP通道的化合物的组合的药物组合物是神经保护性的，因为它将用于给药血栓溶解剂的治疗窗增加了几个小时，例如通过共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂可以将用于给药血栓溶解剂的治疗窗增加几个小时(4-8小时)。
通过NCCa-ATP通道的抑制剂、NCCaATP通道阻断剂、1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂、SUR1抑制剂或能够降低通过通道的膜电流大小的化合物可抑制通道。更具体地，SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、美格列奈(meglitinide)、咪格列唑(midaglizole)、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲(glimepiride)、雌激素、雌激素相关化合物(雌二醇、雌酮、雌三醇、染料木黄酮、非甾族雌激素(例如，乙烯雌酚)、植物雌激素(例如，香豆雌酚)、玉米烯酚等)，和已知能抑制或阻断KATP通道的化合物。MgADP也可以用于抑制通道。可以用来阻断或抑制KATP通道的其他化合物包括但不限于甲苯磺丁脲、格列本脲(glyburide)(1[p-2[5-氯-O-茴香酰胺)乙基]苯基]磺酰]-3-环己基-3脲)；氯丙嗪(1-[[(对氯苯基)磺酰]-3-丙基脲；格列吡嗪(glipizide)(1-环己基-3-[[p-[2(5-甲基吡嗪酰胺)乙基]苯基]磺酰]脲)；或妥拉磺脲(tolazamide)(苯磺酰胺-N-[[六氢-1H-氮杂-1基)氨基]羰基]-4-甲基)。
本发明的另一个实施方案包括组合物，该组合物包括源自表达NCCa-ATP通道的神经内皮细胞的膜制剂，其中通过1型磺酰脲受体(SUR1)的拮抗剂阻断和通过SUR1激活剂打开通道。更具体地，通道具有以下特征(a)它是35pS型通道；(b)受浓度范围约10-8至约10-5M的细胞质Ca2+的刺激；(c)当细胞质ATP低于约0.8μM时打开；和(d)能透过单价阳离子K+、Cs+、Li+和Na+。
进一步的实施方案中，可以结合血栓溶解剂(例如，组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿尼普酶、瑞替普酶、替奈普酶)、抗凝血剂或抗血小板剂(例如，阿司匹林、华法林或香豆定)、他汀类药物类、利尿剂、血管扩张药、甘露醇、二氮嗪或激活或促进缺血前状况的类似化合物来给药抑制NCCa-ATP通道的化合物。
更进一步，另一个实施方案包括治疗患者急性脑缺血的方法，包括将适量血栓溶解剂或其可药用盐联合适量的抑制NCCa-ATP通道的化合物或其可药用盐给药于患者。在特定的实施方案中，血栓溶解剂是组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿尼普酶、瑞替普酶、替奈普酶或其任意组合。可以通过任何标准的非肠道或消化道途径给药SUR1拮抗剂，例如可以以推注或以输注或其组合来给药SUR1拮抗剂。
通道在神经元细胞、神经胶质细胞、神经上皮细胞或其组合上表达。抑制剂阻断Na+流入细胞中，因此防止了细胞的去极化。对Na+流入细胞中的抑制由此防止了细胞毒性水肿，并降低了出血转化。因此，这种治疗降低了神经元细胞和/或神经内皮细胞的细胞死亡或坏死性死亡。
特定实施方案中，给药于患者的SUR1拮抗剂的量在约0.0001μg/kg/天至约20mg/kg/天、约0.01μg/kg/天至约100μg/kg/天或约100μg/kg/天至约20mg/kg/天的范围内。再进一步，可以以治疗的形式将SUR1拮抗剂给药于患者，其中治疗可以包括每天(1、2、3、4等)、周(1、2、3、4、5等)、月(1、2、3、4、5等)等给药的SUR1拮抗剂的量或SUR1拮抗剂的剂量。可以给予治疗使得给药于患者的SUR1拮抗剂量在约0.0001μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗、约0.01μg/kg/治疗至约100μg/kg/治疗或约100μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗的范围内。
本发明的另一个实施方案包括降低遭受中风的患者的死亡率的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中的NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。化合物降低了中风大小和减轻了位于梗死周围组织中的水肿。可以消化道(例如，口服、口含、直肠或舌下)或非肠道(例如，静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下、腹膜内、心室内)和/或局部(例如，经皮)、粘膜或通过直接注射至脑实质中来给药化合物。
更进一步，另一个实施方案包括减轻患者梗死周围组织区域中水肿的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中的NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
进一步的实施方案包括治疗处于发生中风风险中的患者的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中的NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
特定实施方案中，患者正在经受心脏病症的治疗，因此该病症提高了患者发生中风的风险。例如，治疗可以包括使用血栓溶解剂来治疗心肌梗塞。更进一步，因为患者遭受房颤或凝血障碍，患者可能处于发生中风的风险中。处于发生中风风险中的其他患者包括处于发生肺栓塞风险的患者、接受外科手术(例如，血管手术或神经外科手术)的患者或接受提高他们发生中风风险的治疗的患者，例如，治疗可以包括脑/血管内治疗、血管造影术或支架放置。
本发明的另一个实施方案包括治疗处于发生脑水肿风险中的患者的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中的NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。处于风险中的患者可能患有动脉-静脉畸形或肿块占位性病损(例如，血肿)或可涉及具有提高的脑外伤风险的活动。
再进一步，本发明的另一个实施方案包括维持患者脑脓肿周围的神经胶质膜囊完整性的方法，包括将有效抑制和/或阻断神经元细胞或神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
更进一步，本发明的另一个方法包括诊断脑中神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；测量患者脑中标记SUR1拮抗剂的水平，其中标记SUR1拮抗剂的存在表明脑中的神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤。
本发明的另一个方法包括测定脑肿瘤的边界，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中标记SUR1拮抗剂的存在表明脑肿瘤例如转移性肿瘤的边界。特定实施方案中，使用正电子发射断层(PET)扫描来进行显现的步骤。
进一步的实施方案中，方法可以包括测定中风后半影的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中标记SUR1拮抗剂的存在表示半影。
再进一步，本发明包括监测中风神经疾病的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中标记SUR1拮抗剂的存在表明疾病的进展。特定实施方案中，每日进行显现步骤来监测中风的进展。
另一个实施方案包括神经保护性输液药盒，包括抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物和IV溶液。化合物和溶液包含于相同的容器内或不同的容器内。更具体地，将化合物包含于溶液的容器内。
输液药盒可以进一步包括神经保护性推注药盒，其中推注药盒包括预先装载抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物的注射器。
更进一步，另一个实施方案包括神经保护性药盒，包括抑制神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物和血栓溶解剂(例如，tPA)、抗凝血剂(例如，华法林或香豆定)、抗血小板剂(例如，阿司匹林)、利尿剂(例如，甘露醇)、他汀类药物或血管扩张剂(例如，硝酸甘油)。
之前已经相当宽泛地列出了本发明的特征和技术优势，以便可以更好地理解以下本发明的详述。下文中将描述本发明的其他特征和优势，其形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员可以认识到公开的概念和特定的实施方案可以容易地用作改进或设计其他用于实施本发明相同目的的构造的基础。本领域技术人员还可以认识到这样的等同构建不脱离所附权利要求中列出的本发明的精神和范围。结合附图考虑时，从以下的描述可以更好地理解认为是本发明特征性的新特征，关于其组成及操作方法，以及更多的目的和优势。然而，要清楚地理解各附图只是为说明和描述的目的而提供的，并不旨在作为本发明限定的定义。
附图简述为了更全面理解本发明，现在参照以下结合附图的描述，其中

图1显示了外源磷脂酰肌醇-4，5-双磷酸(PIP2)的加入引起了NCCa-ATP通道的激活，尽管浴槽液(bathsolution)中存在ATP。最初，在来自R1星形细胞的内面向外式膜片中记录通道活性，使用含有1μM Ca2+和10μM ATP的浴槽液，其足以阻断通道活性。50μM PIP2的加入导致通道激活，反映出通道对ATP的亲和性明显降低。
图2显示了R1星形细胞中的NCCa-ATP通道受到雌激素的抑制。记录的最初部分显示出许多叠加通道的活跃活性，记录于从雌性获得的R1星形细胞的细胞附着的膜片中。将10nM雌激素加入浴槽中迅速地引起对通道活性的强烈抑制。认为所涉及的机理与雌激素受体介导的磷脂酶C(PLC)激活相关，导致膜PIP2耗尽，并反映出对ATP亲和性的显著提高。
图3A-3B显示了蛋白质印迹，证明了来自雄性和雌性的R1星形细胞都表达雌激素受体和SUR1，SUR1是NCCa-ATP通道的标志。从雄性(M)和雌性(F)的明胶海绵植入物获得细胞裂解物并在两个稀释度(4x和1x)研究，将来自子宫的裂解物用作对照。图3A使用对抗雌激素受体(ER)的抗体显影，证明了在来自两个性别的星形细胞中都表达ERα和ERβ。蛋白质印迹显示出来自两性的细胞也表达SUR1，将胰腺组织用作对照(图3B)。
图4显示了雄性R1星形细胞中的NCCa-ATP通道受到雌激素的抑制。记录的最初部分显示出来自许多叠加通道的活跃活性，记录于从雄性获得的R1星形细胞的细胞附着的膜片中。将10nM雌激素加入浴槽中迅速地引起对通道活性的强烈抑制。
图5A-5D显示了神经胶质膜囊。图5A显示了通过大的明胶海绵的植入部位切割的大鼠脑的冠状切片；海绵(最里面的暗区)由神经胶质膜囊(亮区)包裹，发现其外部是血管性水肿区域(外部暗区)，通过死亡前(pre-mortem)给予亚甲蓝来鉴定。图5B和5C各自显示了GFAP免疫标记的神经胶质膜囊的低放大率和高放大率视图。图5D显示了明胶海绵植入物内部的GFAP标记细胞的高放大率视图。
图6A-6H显示了免疫标记的星形细胞。图6A、6C、6E显示了新鲜分离的GFAP(图6C)和波形蛋白(图6E)免疫标记的大的相亮(phase-bright)R1星形细胞。图6B、D、F显示了新鲜分离的GFAP(图6D)和波形蛋白(图6F)免疫标记的小的相暗(phase-dark)R2星形细胞。图6G显示了从神经胶质膜囊分离的星形细胞的原代培养物，R1星形细胞发展成大的多角形细胞(图6Gb)，R2星形细胞发展成小的双极细胞(图6Ga)。图6H显示了R2星形细胞，但不是R1星形细胞，标记了荧光素标记的源自蝎子Leiurus quinquestriatus的氯毒素(chlorotoxin)。
图7A-7D显示了神经胶质膜囊的内区表达SUR1而不是SUR2。对SUR1的免疫标记(图7A)显示出明胶海绵(gf)附近细胞中的明显表达，而对SUR2的免疫标记显示出没有表达(图7B)。显示了从明胶海绵植入物酶解分离并对SUR1免疫标记的单个细胞(图7C)。图7D显示了对照胰岛素瘤细胞(泳道2)和分离的R1星形细胞(泳道3)中的SUR1的RT-PCR，和对照心肌细胞(泳道4)中的SUR2的RT-PCR(但不在分离的R1星形细胞中(泳道5))。
图8A-8I显示了神经胶质膜囊的各种特征。神经胶质膜囊的特征在于几个细胞层厚的GFAP-阳性细胞(图8A)。只有神经胶质膜囊的内区是缺氧的，如通过哌莫硝唑标记(图8B)和通过对HIF1α的免疫标记(图8C)所证明的。此外，只内区免疫标记了SUR1(图8D)和紧密连接蛋白ZO-1(图8E)和闭合蛋白(图8F)。图8G-I显示了哌莫硝唑、HIFα、闭合蛋白全部定位于形成神经胶质膜囊内区的GFAP-阳性星形细胞。
图9A-B显示了NCCa-ATP通道抑制(图9A)和NCCa-ATP通道激活(图9B)对神经胶质膜囊的作用。用格列本脲输注(图9A)或二氮嗪输注(图9B)治疗具有明胶海绵植入物的动物，通过渗透迷你泵将化合物直接传送至明胶海绵部位中。对GFAP的免疫标记显示了使用格列本脲的通道抑制导致轮廓分明的神经胶质膜囊的形成(图9A)，而由于二氮嗪诱导的内区细胞的坏死形死亡，使用二氮嗪的通道激活导致较宽的轮廓不清楚(ill-defined)的膜囊的形成(图9B)。
图10A-B显示了将二氮嗪输注至明胶海绵周围的区域中导致多形核白细胞(PMN)的严重浸润。用DAPI标记核显示出明胶海绵附近密集的小细胞(图10A)，使用PMN特异性标记MMP-8来免疫标记，证明了这些细胞是PMN(图10B)。认为由浸润PMN代表的强烈炎症应答是由于脑和异物(明胶海绵)之间通常由神经胶质膜囊的内区形成的屏障的破坏而引起的。
图11A-11L显示了神经胶质膜囊内区中的R1星形细胞通常表达SUR1，SUR1是NCCa-ATP通道的一种标志。显示了具有明胶海绵植入物的大鼠(图11A-11C)、患有脑脓肿的大鼠(图11D-11F)和患有转移性肿瘤的人(图11J-11L)的神经胶质膜囊内区。还显示了由大脑中动脉闭塞引起的大鼠中风(图11G-11I)附近的反应性光泽(gloss)区域。在所有情况中，如所示的，将一个视野的细胞对GFAP进行了标记和对SUR1进行了共同标记。还显示了每个条件下高放大率的单个细胞的实例。
图12A-12C显示了中风边缘附近的星状星形细胞上调了SUR1(图12A)，SUR1是NCCa-ATP通道的一种标志。在中风的中间，还将具有改变的形态包括起泡的细胞对SUR1进行了免疫标记(图12B、12C)。
图13A-13C显示了格列本脲保护免受叠氮化钠诱导的通道打开和坏死性细胞死亡。图13A显示了各自在30分钟的过程中观察的4个不同新鲜分离的R1星形细胞的相差图像。只暴露于载体溶液的细胞保持相亮，没有病理性恶化(对照)。通过暴露于叠氮化钠(1mM)耗尽ATP的细胞产生了与细胞毒性水肿一致的进行性起泡。相似地，暴露于NCCa-ATP通道开放剂二氮嗪的细胞产生了与细胞毒性水肿一致的进行性起泡。在格列本脲存在下暴露于叠氮化钠的细胞保持了相亮，没有病理性恶化。图13B和13C显示了通过体外ATP耗尽诱导了分离的R1星形细胞的细胞死亡。在对照条件下，暴露于叠氮化钠(1mM)后，或在格列本脲(1μM)存在下暴露于叠氮化钠后，对于坏死性死亡，用碘化丙锭(PI)标记新鲜分离的R1星形细胞(图13B)，或对于凋亡性死亡，使用膜联蛋白V标记(图13C)。暴露于叠氮化钠通常导致坏死性死亡，其很大程度上由格列本脲阻止。
图14A-14L显示了SUR1在MCA中风中受到上调。通过死亡前给予伊文思蓝和死亡后灌输印度墨汁(图14)、通过TTC染色(图14B)和通过对SUR1的免疫荧光成像(图14C)来鉴定MCA中风后8-16小时时3个不同动物中MCA-ACA之间的分界区。免疫荧光图像显示了3小时时中风核心中细胞中的SUR1(图14D)，对神经元标记NeuN双标记(图14E)，并显示了8小时时梗死周围区域中细胞中的SUR1(图14G，14J)，对星形细胞标记GFAP(图14H)和内皮细胞标记vonWillebrand因子(图14K)双标记。显示了双标记视野的叠加图像(图14F、14I和14L)。
图15A-15G显示了在MCA中风中SUR1(但不是Kir6.1或Kir6.2)转录上调。MCA中风后不同时间(图15A)和不同位置(图15B)对SUR1(≈180kDa)的蛋白质印迹，在(图15A)中裂解物全部来自累及半球的TTC(+)梗死周围区域，在所示的时间获得；(图15B)中，所有裂解物在MCA中风后8小时从所示的部位获得；a和b中的每个单独泳道来自单个动物。分别定量来自(图15A)和(图15B)的数据，结合对于Kir6.1和Kir6.2的比较数据；对于每个单独的印迹，将数据相对于β-肌动蛋白的值和用于该印迹的对照数据标准化并分开分析；**，p＜0.01。在对SUR1的原位杂交中，MCA中风后3小时；石蜡切片显示出缺血区中大的神经元样细胞(图15E)和毛细血管(图15F)被标记，而来自对照侧相同区域的组织没有(图15G)。
图16A-16D显示了中风中神经元样细胞中NCCa-ATP通道的膜片钳记录。图16A显示了MCAO后3小时从缺血部位酶解分离的大的神经元样细胞的相差图像。图16B显示了内面向外式膜片的记录，使用Cs+作为电荷载体；通过格列本脲阻断了通道活性，如所示给出的(箭头)；a和b显示了所示部分扩大的记录。图16C显示了内面向外式膜片在所示电位的记录，使用K+作为电荷载体；通过格列本脲阻断了通道活性。图16D显示了在不同电压的单通道振幅的曲线，显示出34pS的单通道斜率电导。
图17A-17E显示格列本脲降低了MCA中风中的死亡率、水肿和中风大小。图17A中，在MCA中风[具有恶性脑水肿(MCE)的双闭塞模型]后的7天过程中评估了两个处理组中的死亡率，每组包括19只雌性和10只雄性大鼠，用盐水(空心符号)或格列本脲(实心符号)处理；7天时的死亡率显著不同。对雄性和雌性的分组分析显示出相似的结果。图17B中，在MCA中风(MCE模型)后8小时评估了两个处理组中的水肿，每组包括6只雄性大鼠，用盐水或格列本脲处理；首先在测定湿/干重之前，用TTC处理组织来分成累及半球和对侧半球的TTC(+)和TTC(-)部分；TTC(+)区域中的值在统计学上不同。图17C-17E中，在MCA中风[血栓栓塞(TE)模型]后48小时测定了两个处理组中的中风大小，每组包括10只雄性大鼠，用盐水或格列本脲处理；用盐水处理的动物(图17C)和另一用格列本脲处理的动物(图17D)在MCA中风(TE模型)后TTC-染色的冠状切片的图像，表明了皮层防护(Cortical sparing)通常与格列本脲处理相关；中风大小的值，表示为半球体积的百分比(图17E)。
图18A-D显示了MCA中风中BODIPY-格列本脲的组织分布。a-c，MCA中风(MCE模型)并给药BODIPY-格列本脲后6小时动物中脑切片的荧光图像；来自缺血部位的细胞、微血管(图18A)和毛细血管(图18C)中的荧光标记是明显的，但不在对侧半球中(图18B)；(图18A、18B)中的图像来自相同的动物，采用了相同的暴露时间；(图18C)中，单层核证实了通过BODIPY-格列本脲明亮标记的结构是毛细血管。图18D中，用抗SUR1抗体标记的MCA中风(MCE模型)后6小时动物的脑切片的免疫荧光图像显示了毛细血管和邻近神经元样细胞中强烈的标记。
图19A-19H显示了格列本脲降低了出血转化。图19A-19D来自用盐水共同处理的动物；图19E-19H来自用格列本脲共同处理的动物。冠状切片图像的左列显示了(只在1-2排中)脑室内出血，加上缺血皮层/皮层下部位(图像右侧的红色区域；箭头)中的大面积出血转化。来自相同动物的TTC处理切片的图像右列显示了梗死部位。
图20A-20B显示酶谱法(zymography)，显示出中风中基质金属蛋白酶(MMP)的明胶酶活性，且不存在格列本脲对MMP的直接抑制。图20A显示了与对照相比较，中风组织中MMP-9 & MMP-2的激活；左侧显示了重组MMP-9 & MMP-2的活性。图20B显示了对照条件(CTR)下，格列本脲(10μM)存在下，和MMP抑制剂II(300nM；Calbiochem)存在下，重组酶和中风组织的明胶酶活性。
图21显示了在为膜片钳做准备的酶清洗后，从正常脑新鲜分离的大脑毛细血管的相差显微照片。
图22A-22F显示了在电生理学上容易区分新鲜分离的大脑内皮细胞和平滑肌细胞。图22A和22B显示了在200ms去极化脉冲过程中记录的内皮细胞(图22A)和伸长的平滑肌细胞(图22B)中的叠加宏观电流，该脉冲过程以20mV逐步地从-120mV至+120mV；保持电位，-60mV；制霉菌素穿孔的膜片技术；浴槽液，含有2mM Ca2+的标准Krebs；移液管溶液(pipette solution)，145mM K+。图22C和22D显示了从在200-ms测试脉冲最后在9个内皮细胞(图22C)和7个平滑肌细胞(图22D)中记录的平均(平均值±SE)电流计算的电流-电压曲线；与图22A和22B中相同的保持电位、技术和溶液。图22E和22F显示了内皮细胞(图22E)和平滑肌细胞(图22F)中斜线脉冲过程中(0.45mV/ms，保持电位，-60mV)记录的电流电压曲线；与图22A和22B相同的保持电位、技术和浴槽液，但使用含有145mM Cs+替代K+的移液管溶液。
图23显示了实时RT-PCR，显示了中风中SUR1-mRNA的上调。
图24A-24E显示了R1星形细胞中的SUR1击倒(knock down)(SUR1KD)使之免于ATP-耗尽诱导的去极化。图24A和24B显示了R1细胞裂解物的蛋白质印迹(图24A)和蛋白质印迹的定量(图24B)，证实了通过反义击倒了SUR1表达。图24C-24E显示了叠氮化钠引起暴露于SCR-ODN的细胞中大的去极化(图24C、24E)，但在暴露于AS-DON的细胞中很少或没有去极化(图24D、24E)。
图25A-25F显示了中风中的转录因子。ACA和MCA区域之间的皮层下分界区的免疫荧光图像，来自MCAO后8小时身体同侧的梗死周围组织(图25A-D)和来自对侧对照组织(图25E、25F)。梗死周围区域显示了两种转录因子Sp1(图25A、25C)和HIF1α(图25B)在神经元样细胞和毛细血管中的上调，以及毛细血管中的SUR1(图25D)。对照组织显示了很少的Sp1和没有HIF1α(图25E和25F)。
图26A-26C显示了中风中转录因子SP1核定位的增加，以及SP1与SUR1的共同定位。免疫荧光图像显示了MCAO后3小时缺血部位中核SP1标记的增加(图26B)，与对侧相比较(图26A)。图26C大型神经元样细胞的双标记显示了相同细胞中的核SP1(绿色)和细胞质/质膜SUR1(红色)。
图27A-27D显示了通过转录因子HIF1α调节SUR1表达。图27A和27C显示了来自对照(CTR)和HIF1α击倒(KD)的gelfoam植入物模型的R1星形细胞中的HIF1α蛋白的蛋白质印迹分析。图27B和27C显示了相同细胞裂解物中的SUR1蛋白。
发明详述本领域技术人员显而易见的是可以对本申请中公开的本发明形成各种实施方案和改进而没有脱离本发明的范围和精神。
I.定义当词语“一个”或“一种”结合权利要求和/或说明书中的术语“包括/包含”使用时可意味着“一个/种”，但也与“一或多个/种”、“至少一个/种”和“一或多于一个/种”的意思相一致。权利要求中术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确地表示仅仅是指择一或者互相排斥的选择，尽管公开内容支持表示只是择一和“和/或”的定义。
如在此所用的，术语“急性”指的是健康影响的发作，通常该影响是被认为短暂而不是持久的快速发作。
如在此所用的，术语“急性脑缺血”指的是具有快速发作且不是持久的脑缺血事件。术语“急性脑缺血”和“中风”可以交替使用。
如在此所用的，术语“抗癌治疗”或“抗肿瘤”指的是破坏癌细胞和/或肿瘤细胞，或减缓、停止或逆转癌细胞和/或肿瘤细胞生长的任何治疗。抗癌或抗肿瘤治疗包括但不限于放射疗法(放疗)、化疗或这些治疗的组合。
如在此所用的，术语“激动剂”指的是结合细胞上的受体并启动由内源底物结合产生的相同或等同反应或活性的生物或化学剂。本发明中，激动剂联合、结合和/或连接神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞的NCCa-ATP通道，使得NCCa-ATP通道打开(激活)。特定实施方案中，激动剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的调节亚基，特别是SUR1。或者，激动剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的孔-形成亚基，使得NCCa-ATP通道打开(激活)。术语激动剂和/或激活剂可以交替使用。
如在此所用的，术语“拮抗剂”指的是在体内作用来降低另一种化学或生物物质的生理活性的生物或化学剂。在本发明中，拮抗剂阻断、抑制、减少和/或降低神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞(例如，毛细血管内皮细胞)中NCCa-ATP通道的活性。在本发明中，拮抗剂联合、结合、连接神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞(例如毛细血管内皮细胞)的NCCa-ATP通道，使得NCCa-ATP通道关闭(失活)，意味着患病状态中就生物活性而言降低的生物活性。特定实施方案中，拮抗剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的调节亚基，特别是SUR1。或者，拮抗剂联合、结合和/或连接NCCa-ATP通道的孔-形成亚基，使得NCCa-ATP通道关闭(失活)。术语拮抗剂或抑制剂可以交替使用。
如在此所用的，术语“脑脓肿”或“大脑脓肿”指的是通常伴随肿胀的脓性渗出物的局限聚集。
如在此所用的，术语“血脑屏障”或“BBB”指的是脑血管和脑组织之间的屏障，它的作用是限制从血液穿过进入脑中的物质。
如在此所用的，术语“癌症”指的是细胞的过度增殖，它的独特特性—失去正常的控制—导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织入侵和转移。癌症可以包括由肿瘤细胞构成的肿瘤。本领域技术人员理解不是所有的癌症包括肿瘤细胞，例如白血病不包括肿瘤细胞。
如在此所用的，术语“脑缺血”指的是缺乏足够的血液流向某区域，例如缺乏足够的血液流向脑，这可能是血液凝块、血管收缩、出血或由扩大的肿块引起的组织压迫的结果。
如在此所用的，术语“去极化”指的是细胞膜对钠离子通透性的提高，其中降低或消除了跨细胞膜的电位差。
如在此所用的，术语“有效量”或“治疗有效量”可互换并指的是导致疾病或病症的症状改善或缓解的量。本领域技术人员理解有效量可以改善患者或对象的状况，但可能不是疾病和/或病症的完全治愈。
如在此所用的，术语“内皮”指的是衬在体腔、血管和淋巴管内表面或形成毛细血管的一层细胞。
如在此所用的，术语“内皮细胞”指的是内皮的细胞或衬在体腔例如血管或淋巴管或毛细血管表面的细胞。特定实施方案中，术语内皮细胞指的是神经内皮细胞或是神经系统例如中枢神经系统或脑的一部分的内皮细胞。
如在此所用的，术语“过度增殖性疾病”指的是由细胞的过度增殖引起的疾病。示例性的过度增殖性疾病包括但不限于癌症、肿瘤或赘生物。
如在此所用的，术语“神经胶质膜囊”指的是完全或部分围绕异物包括转移性肿瘤、脑脓肿或不通常在脑中发现(除非在病理状况下)的其他肿块的物理屏障。特定实施方案中，神经胶质膜囊包括包含表达NCCa-ATP通道的神经元细胞、神经胶质细胞(例如，星形细胞)和/或内皮细胞的内区。
如在此所用的术语“发病率”是患病的状态。再进一步，发病率还可以指患病率，或患病患者或病例在给定群体中的比例。
如在此所用的术语“死亡率”是死亡或引起死亡的状态。再进一步，死亡率还可以指死亡比率，或死亡数与给定群体的比例。
如在此所用的，术语“神经元细胞”指的是作为神经系统的形态和功能单位的细胞。该细胞包括神经细胞体、树突和轴突。术语神经元(neuron)、神经细胞(nerve cell)、神经元的(neuronal)、神经元(neurone)和神经细胞(neurocyte)可以交替使用。神经元细胞类型可以包括但不限于典型的显示内部结构的神经细胞体、来自大脑皮层的(Cajal)水平细胞；Martinottic细胞、双极细胞、单极细胞、Pukinje细胞和大脑皮层运动区的锥体细胞。
如在此所用的，术语“神经的”指的是与神经系统相关的一切。
如在此所用的，术语“神经胶质”或“神经胶质细胞”指的是作为神经系统非神经元细胞元件的细胞。术语神经胶质、神经胶质细胞(neurogliacyte)和神经胶质细胞(neuroglial cell)可以交替使用。神经胶质细胞可包括但不限于室管膜细胞、星形细胞、少突神经胶质细胞或小神经胶质细胞。
如在此所用的术语“预防”指的是最小化、降低或抑制发生疾病状态的风险或与疾病状态或进展或其他异常或不利状况相关的参数。
如在此所用的，术语“中风”指的是与脑循环损伤相关的任何急性临床事件。术语“急性脑缺血”和“中风”可以交替使用。
如在此所用的，术语“肿瘤”指的是任何肿胀肿大。肿瘤可以和术语“赘生物”互换，赘生物是异常组织生长。肿瘤可以是恶性的或良性的。
如在此所用的，术语“肿瘤-脑屏障”指的是脑中的异物和脑周围组织之间的生化屏障。肿瘤-脑屏障在此可互换地称为TBB。
如在此所用的术语“治疗”指的是将治疗有效量的组合物给药于患者，使得患者具有疾病或病症的改善。改善是任何可观察的或可测量的改善。因此，本领域技术人员认识到治疗可以改善病人的状况，但可能不是疾病的完全治愈。治疗还可以包括治疗处于发生疾病和/或病症风险中的患者。
II.本发明本发明涉及治疗组合物以及使用该治疗组合物的方法。一实施方案中，治疗组合物是神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞的NCCa-ATP通道的激动剂和/或拮抗剂。
特定实施方案中，本发明涉及治疗需要这样治疗的癌症病人的方法，包括给药星形细胞的NCCa-ATP通道的激动剂，其中激动剂激活NCCa-ATP通道。特定实施方案中，激动剂靶向NCCa-ATP通道的SUR1。特定实施方案中，癌症位于脑中，更具体地，包括位于脑中的转移性肿瘤。
特定实施方案中，本发明的激动剂破坏癌症周围的肿瘤-脑屏障的完整性，因此允许否则被阻挡的物质穿过肿瘤-脑屏障。特定实施方案中，结合抗癌治疗来给药激动剂，抗癌治疗包括化疗、放疗和/或免疫治疗。
或者，本发明涉及破坏肿瘤-脑屏障的方法，包括给药星形细胞的NCCa-ATP通道的激动剂，其中激动剂激活所述NCCa-ATP通道。
通过将NCCa-ATP通道的激动剂如二氮嗪输注至星形细胞中，将涉及NCCa-ATP通道激动剂的方法来定向选择性杀灭表达NCCa-ATP通道的神经元细胞、神经胶质细胞(例如，星形细胞)和/或神经内皮细胞。输注可以是直接的或间接的。当治疗涉及神经胶质膜囊的病况如转移性脑肿瘤时，神经元细胞、神经胶质细胞(例如，星形细胞)和/或神经内皮细胞的选择性杀灭是所期望的。激动剂促进唤起免疫应答，或者，提高化疗剂的渗透性。
如在此所述的，磺酰脲受体1(SUR1)作为NCCa-ATP通道一部分在R1星形细胞中表达，这些星形细胞构成脑转移中的肿瘤-脑屏障(TBB)。用激动剂靶向R1星形细胞的SUR1损害了TBB的完整性，因此提供了用于脑中转移性肿瘤的治疗机制。特定的实施方案中，本发明的激动剂破坏异物周围的神经胶质膜囊的完整性，因此允许否则被阻挡的生物和/或内源化合物如白细胞进入神经胶质膜囊中。
特定实施方案中，激动剂包括，例如，能够打开、激活和/或提高表达NCCa-ATP通道的神经元细胞、神经胶质细胞(例如，星形细胞)和/或神经内皮细胞活性的化合物。具体地，激动剂是SUR1激活剂，如二氮嗪等，本领域已知其能打开(激活)K通道。
本发明考虑与化疗、免疫治疗和/或放疗联用。在实体肿瘤(例如，肺、结肠、乳房和脑中的肿瘤)的治疗中，抗癌剂难以穿透肿瘤块阻碍了有效的治疗(Jain，1994)。需要鉴定促进治疗剂传送至癌症部位的手段来提高目前抗癌治疗的效率。为了解决这种需要，在可选的实施方案中，申请人在此提供了通过给药NCCa-ATP通道的拮抗剂用于提高、促进和/或增强抗癌治疗的方法。
对于体外的工作，可以使用各种实体肿瘤模型，如公认的诱导型乳癌模型，可以从其收集肿瘤细胞并重新植入脑中来产生自体“转移性”肿瘤。
除了磺酰脲受体1(SUR1)作为NCCa-ATP通道一部分在星形细胞中表达，本发明进一步描述了该通道的SUR1调节亚基在缺血后的神经元和毛细血管内皮细胞中得到上调，且阻断该受体减小了中风大小、脑水肿和死亡率。因此，NCCa-ATP通道的拮抗剂在防止、缓解、抑制和/或消除细胞毒性和离子性水肿形成中具有重要作用。
其他实施方案中，本发明的治疗化合物包括神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的拮抗剂。考虑将拮抗剂用于治疗导致提高的颅内压和/或中枢神经系统细胞毒性水肿的缺氧和/或缺血相关的不利病症。这样的病症包括外伤，缺血性脑损伤，即继发性神经元损伤，和出血性梗死。拮抗剂保护表达NCCa-ATP通道的细胞，这对于神经胶质膜囊完整性是重要的且必须维持来防止感染播散(如脑脓肿)的临床治疗是有利的。通过抑制NCCa-ATP通道进行保护伴随脑水肿的减轻。
一方面中，NCCa-ATP通道受到阻断、抑制，或以其它方式活性降低。这样的实例中，给药和/或运用NCCa-ATP通道的拮抗剂。拮抗剂调节NCCa-ATP通道，使得通过通道的流量减少、中断、降低和/或停止。对于神经元细胞、神经胶质细胞、内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的活性，拮抗剂可以具有可逆或不可逆的活性。拮抗剂可以防止或减少细胞的去极化，因此减少由细胞去极化引起的渗透性改变而产生的细胞肿胀。因此，对NCCa-ATP通道的抑制可以降低细胞毒性水肿和内皮细胞的死亡。
可以用本发明的治疗组合物治疗的患者包括但不限于遭受导致提高的颅内压和/或中枢神经系统(CNS)的细胞毒性水肿的缺氧和/或缺血相关病症或处于其风险中的患者。这样的病症包括但不限于外伤(例如，外伤性脑损伤(TBI)、震荡)、缺血性脑损伤、出血性梗死、中风、房颤、凝血障碍、肺栓塞、动静脉畸形、肿块占位性病损(例如，血肿)等。再进一步，处于发生这样病症风险的患者可以包括接受提高中风风险治疗的患者，例如外科手术(血管或神经学)、用血栓溶解剂治疗心肌梗塞、脑/血管内治疗、支架放置、血管造影术等。
本发明的另一方面包括NCCa-ATP通道的拮抗剂和血栓溶解剂的共同给药。这两种化合物的共同给药通过降低出血转化增大了血栓溶解剂的治疗窗。通过共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂可以将血栓溶解剂的治疗窗增加几小时(4-8)。
除了血栓溶解剂，可以结合本发明的拮抗剂使用其他药剂，例如但不限于，抗血小板剂、抗凝血剂、血管扩张药、他汀类药物、利尿剂等。
本发明的另一方面包括使用标记的SUR1拮抗剂来诊断、测定或监测中风、脑水肿的阶段或观察肿瘤和/或中风的大小/界限/边界。例如，可以使用标记的SUR1拮抗剂来监测或显现中风后的半影(penumbra)。
再进一步，本发明的组合物可以用于产生神经保护性药盒，用于治疗处于细胞毒性脑水肿相关病症风险中或遭受细胞毒性脑水肿相关病症的患者。
III.NCCa-ATP通道本发明部分基于特定通道NCCa-ATP通道的发现，其在US申请公开No.20030215889中定义为星形细胞上的通道，在此将其全部引入作为参考。更具体地，本发明进一步限定了该通道不仅在星形细胞上表达，还在脑外伤例如缺氧事件、缺血事件或其他与这些事件相关的继发性神经元损伤后的神经元细胞、神经胶质细胞和/或神经内皮细胞上表达。
NCCa-ATP通道受钙离子(Ca2+)激活并对ATP是敏感的。因此，该通道是由胞内Ca2+激活并由胞内ATP阻断的非选择性阳离子通道。通过耗尽胞内ATP打开时，该通道负责由大量Na+流入引起的完全去极化，这形成了Cl-的电梯度和H2O的渗透梯度，导致细胞毒性水肿和细胞死亡。当通道受到阻断或抑制时，不产生大量Na+，因此防止了细胞毒性水肿。
特定的功能特征将NCCa-ATP通道与其它已知离子通道区分开来。这些特征可包括，但不限于1)容易使Na+、K+和其他单价阳离子通过的非选择性阳离子通道；2)通过胞内钙的增加和/或通过胞内ATP的减少来激活；3)受1型磺酰脲受体(SUR1)的调控，此前认为SUR1专门与KATP通道相关，如胰腺β细胞中发现的那些。
更具体地，本发明的NCCa-ATP通道具有20至50pS的钾离子(K+)单通道电导。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内细胞膜胞质侧的Ca2+的刺激，其中浓度范围为10-8至10-5M。NCCa-ATP通道还受到生理浓度范围内的细胞质ATP的抑制，其中浓度范围为10-1至10M。以下离子也能透过NCCa-ATP通道K+、Cs+、Li+、Na+；至任何两种阳离子之间的通透性比例为高于0.5且低于2的程度。
IV.NCCa-ATP通道的调节剂本发明包括所述通道的调节剂，例如通道的激动剂和/或拮抗剂。本发明拮抗剂或激动剂的实例可以包括US申请公开No.20030215889中鉴定的激动剂和/或拮抗剂，在此将其全部引入作为参考。本领域技术人员认识到NCCa-ATP通道由两个亚基构成，调节亚基SUR1和孔形成亚基。
A.SUR1的调节剂特定实施方案中，磺酰脲受体-1(SUR1)的拮抗剂适用于阻断通道。合适的SUR1拮抗剂实例包括但不限于格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素、雌激素相关化合物(雌二醇、雌酮、雌三醇、染料木黄酮、非甾族雌激素(例如，乙烯雌酚)、植物雌激素(例如，香豆雌酚)、玉米烯酚等)及其组合。本发明的优选实施方案中，SUR1拮抗剂选自格列本脲和甲苯磺丁脲。再进一步，另一种拮抗剂可以是MgADP。其他拮抗剂包括KATP通道的拮抗剂，例如但不限于，甲苯磺丁脲、格列本脲(1[p-2[5-氯-O-茴香酰胺)乙基]苯基]磺酰)-3-环己基-3-脲)；氯丙嗪(1-[[(对氯苯基)磺酰]-3-丙基脲；格列吡嗪(1-环己基-3-[[p-[2(5-甲基吡嗪酰胺)乙基]苯基]磺酰]脲)；或妥拉磺脲(苯磺酰胺-N-[[六氢-1H-氮杂-1基)氨基]羰基]-4-甲基)。
可以用于本发明中的激动剂包括但不限于SUR1的激动剂，例如，二氮嗪、吡那地尔、P1075、cromakalin或KATP通道的激活剂。其他激动剂可以包括但不限于二氮嗪衍生物，例如，3-异丙基氨基-7-甲氧基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(NNC 55-9216)、6，7-二氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 154)、7-氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 73)、6-氯-3-异丙基氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NNC 55-0118)4、6-氯-3-(1-甲基环丙基)氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NN414)、3-(3-甲基-2-丁氨基)-4H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 44)、3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(4，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 62)、3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(2，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 79)、2-烷基-3-烷基氨基-2H-苯并-和2-烷基-3-烷基氨基-2H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物、6-氯-3-烷基氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物衍生物、4-N-取代的和未取代的3-烷基-和3-(烷基氨基)-4H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物。此外，其他化合物，包括6-氯-2-甲基喹啉-4(1H)-酮(HEI 713)和LN533021，以及芳氰基胍药物类是已知的SUR1激活剂或激动剂。
B.SUR1转录和/或翻译的调节剂特定实施方案中，调节剂可以是调节SUR1(调节亚基)和/或包括孔形成亚基的分子实体的转录和/或翻译的化合物(蛋白质、核酸、siRNA等)。
1.转录因子转录因子是结合特定DNA序列(例如，启动子和增强子)并调节编码DNA区域转录的调节蛋白。因此，转录因子可以用来调节SUR1的表达。通常，转录因子包括结合DNA的结合结构域(DNA结合结构域)和控制转录的调节结构域。在调节结构域激活转录的情况中，将调节结构域称为激活结构域。在调节结构域抑制转录的情况中，将调节结构域称为抑制结构域。更具体地，转录因子如Sp1和HIF1α可以用来调节SUR1的表达。
2.反义和核酶结合翻译或转录起始位点或剪接点的反义分子是理想的抑制剂。反义、核酶和双链RNA分子靶向特定的序列来获得特定多肽如SUR1的减少或消除。因此，考虑构建反义、核酶和双链RNA以及RNA干扰分子并用于调节SUR1。
a)反义分子反义方法利用了核酸易于与互补序列配对的事实。互补表示多核苷酸是根据标准Watson-Crick互补规则能够碱基配对的那些多核苷酸。即，较大的嘌呤将与较小的嘧啶碱基配对来形成鸟嘌呤和胞嘧啶配对(G:C)以及在DNA的情况中腺嘌呤和胸腺嘧啶配对(A:T)，或在RNA的情况中腺嘌呤和尿嘧啶配对(A:U)的组合。在杂交序列中包括不太常见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤和其它碱基不干扰配对。
用多核苷酸靶向双链(ds)DNA导致三螺旋形成；靶向RNA将导致双螺旋形成。反义多核苷酸在引入目标细胞中时，将特异性地结合它们的目标多核苷酸并干扰转录、RNA加工、转运、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这样反义RNA的DNA，用来在体外或在体内抑制宿主细胞内的基因转录或翻译或两者，如在宿主动物包括人患者体内。
设计反义构建体来结合启动子和其他控制区域、外显子、内含子乃至基因的外显子-内含子边界。考虑最有效的反义构建体可以包括与内含子/外显子剪接点互补的区域。因此，使用具有与内含子-外显子剪接点的50-200个碱基内的区域的互补性的反义构建体。已经观察到一些外显子序列可以包括在构建体内而不严重影响其目标选择性。所包括的外显子材料的量根据所用的特定外显子和内含子序列而改变。简单地通过体外测试构建体来测定正常细胞功能是否受到影响或具有互补序列的相关基因的表达是否受到影响，本领域技术人员易于测试是否包括了太多外显子DNA。
有利的是将基因组DNA的部分组合cDNA或合成序列来产生特定的构建体。例如，在最终构建体中需要内含子的情况中，需要使用基因组克隆。cDNA或合成多核苷酸可以提供更方便的限制位点用于构建体剩余的部分，因此，用于序列的剩余部分。
b)RNA干扰本发明中还考虑了将双链RNA用作干扰分子，例如，RNA干扰(RNAi)。通过简单地将双链RNA分子注射、浸浴或饲喂给目标生物体，将RNA干扰用于“击倒”或抑制特定的目标基因。该技术选择性地“击倒”基因功能而不需要转染或重组技术(Giet，2001；Hammond，2001；Stein P等，2002；Svoboda P等，2001；Svoboda等，2000)。
另一种类型的RNAi通常称为小干扰RNA(siRNA)，这也可以用于抑制SUR1。siRNA可以包括双链结构或单链结构，它的序列与目标基因的至少一部分“基本上相同”(参见WO04/046320，在此将其全部引入作为参考)。“同一性”，如本领域已知的，是两个或多个多核苷酸(或多肽)序列之间的关系，如通过比较序列来测定。在本领域中，同一性还表示多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，如通过这样序列之间的核苷酸次序的匹配所测定的。可以容易地计算同一性。参见，例如Computational Molecular Biology(计算机分子生物学)，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects(生物计算机化信息学和基因组计划)，Smith，D.W.，ea.，Academic Press，New York，1993，和WO 99/32619、WO 01/68836、WO 00/44914和WO 01/36646中公开的方法，在此特意引入作为参考。存在多种方法用于测定两个核苷酸序列之间的同一性，该术语是本领域公知的。通常设计测定同一性的方法来产生核苷酸序列匹配的最大程度，且通常体现为计算机程序。这样的程序对于相关领域的那些技术人员是可获得的。例如，GCG程序包(Devereux等)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul等)和CLUSTAL(Higgins等，1992；Thompson等，1994)。
因此，siRNA包含与目标基因的至少一部分基本上相同的核苷酸序列，所述目标基因例如SUR1或与NCCa-ATP通道相关的任何其他分子实体如孔形成亚基。本领域技术人员知道易于在GenBank中获得SUR1的核酸序列，例如，GenBank登录号L40624，在此将其全部引入作为参考。优选，siRNA包含与目标基因的至少一部分完全相同的核苷酸序列。当然，将RNA序列与DNA序列比较时，“相同的”RNA序列在DNA序列含有脱氧核糖核苷酸的位置将含有核糖核苷酸，此外RNA序列通常在DNA序列含有胸腺嘧啶的位置含有尿嘧啶。
本领域技术人员将认识到可以在较长片段的整个长度比较两个不同长度的多核苷酸。或者，可以比较小区域。为了最终估计它们在本发明实践中的可用性，通常比较相同长度的序列。优选用作siRNA的dsRNA和目标基因(例如，SUR1)的至少15个连续核苷酸之间的序列同一性为100％，尽管具有70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高同一性的dsRNA也可以用于本发明中。与目标基因至少一部分基本上相同的siRNA也可以是dsRNA，其中两个互补链之一(或，在自我互补RNA的情况中，两个自我互补部分之一)与目标基因的该部分的序列相同或相对于目标基因该部分的核苷酸序列含有一个或多个插入、缺失或单点突变。因此siRNA技术具有能够耐受可能预期由遗传突变、菌株多态性或进化趋异形成的序列变异的特性。
存在几种制备siRNA的方法，如化学合成、体外转录、siRNA表达载体和PCR表达盒。与使用的方法无关，设计siRNA分子中的第一步是选择siRNA靶向位点，其可以是目标基因中的任何位点。特定实施方案中，本领域技术人员可以人工选择基因的目标选择区域，可以是ORF(可读框)作为目标选择区域并可以优选“ATG”起始密码子下游的50-100个核苷酸。然而，存在几种容易获得的程序来用于辅助设计siRNA分子，例如Promega的siRNA Target Designer、GenScriptCorp.的siRNA Target Finder，Imgenex Corp.的siRNA RetrieverProgram、EMBOSS siRNA算法、Qiagen的siRNA程序、Ambion siRNA预测器、Ambion siRNA预测器、Whitehead siRNA预测器和Sfold。因此，设想上述程序的任一种可以用来产生可以用于本发明中的siRNA分子。
c)核酶核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白复合物。核酶具有特定的催化结构域，该结构域具有核酸内切酶活性(Kim和Cech，1987；Forster和Symons，1987)。例如，许多核酶以高度特异性加速磷酯转移反应，通常只切割寡核苷酸底物中的几种磷酯中的一种(Cech等，1981；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。已经将这种特异性归因于在化学反应之前底物通过特异性碱基配对相互作用结合到核酶的内部指导序列(“IGS”)的要求。
主要观察到核酶催化作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的一部分(Joyce，1989；Cech等，1981)。例如，U.S.专利5,354,855报道了特定核酶可以作为核酸内切酶，具有高于已知核糖核酸酶和近似DNA限制酶的序列特异性。因此，序列特异性核酶介导的基因表达抑制特别适用于治疗应用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990；Sioud等，1992)。大部分的这种工作涉及目标mRNA的修饰，基于通过特异性核酶切割的特定突变密码子。根据在此包括的信息和本领域普通技术人员的知识，特异性瞄准给定基因的其他核酶的制备和使用现在将是清楚简易的。
其他合适的核酶包括来自具有RNA切割活性的RNase P的序列(Yuan等，1992；Yuan和Altman，1994)、发夹核酶结构(Berzal-Herranz等，1992；Chrowrira等，1993)和基于δ肝炎病毒的核酶(Perrotta和Been，1992)。核酶指导的RNA切割活性的一般设计和最佳化已经详细讨论过了(Haseloff和Gerlach，1988；Symons，1992；Chowrira等，1994；和Thompson等，1995)。
关于核酶设计的其他变量是给定目标RNA上的切割位点的选择。根据通过互补碱基对相互作用与位点的退火，将核酶靶向给定序列。对于这种瞄准需要同源性的两段序列。这些同源序列片段位于以上限定的催化核酶结构的侧面。每段同源序列可以长为7至15个核苷酸。对于限定同源序列仅有的要求是，在目标RNA上，它们通过作为切割位点的特异性序列分开。对于锤头状核酶，切割位点是目标RNA上的二核苷酸序列，尿嘧啶(U)接着腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶(A、C或U；Perriman等，1992；Thompson等，1995)。这种二核苷酸在任何给定的RNA中发生的频率在统计学上是16个中3个。
用于目标RNA有效切割的核酶的设计和测试是本领域技术人员公知的过程。Chowrira等(1994)以及Lieber和Strauss(1995)描述了设计和测试核酶的科学方法实例，各自引入作为参考。靶向SUR1的核酶中所用的有效和优选序列的鉴定只是制备和测试给定序列的问题，且是本领域技术人员已知的常用筛选方法。
C.筛选调节剂的方法本发明进一步的实施方案可以包括鉴定改变活性和/或表达的NCCa-ATP通道调节剂例如激动剂或拮抗剂的方法。这些测定可以包括候选物质大文库的随机筛选；或者，可以将测定用于聚焦特定类别的化合物，这些化合物是着眼于认为使它们更有可能调节NCCa-ATP通道的功能或活性或表达的结构性质而选定的。
功能表示本领域技术人员可以测试mRNA表达、蛋白表达、蛋白活性或通道活性，更具体地，调节剂打开或抑制或阻断NCCa-ATP通道的能力。因此，根据本发明筛选的化合物包括但不限于结合NCCa-ATP通道并打开通道(例如，激动剂)或阻断通道(例如，拮抗剂)的天然或合成有机化合物、肽、抗体及其片段、肽拟似物(peptidomimetics)。为了用于治疗神经细胞肿胀或脑肿胀，优选阻断通道的化合物。打开通道或将通道维持于打开状态的激动剂包括肽、抗体或其片段和其他有机化合物，其包括NCCa-ATP通道的SUR1亚基(或其一部分)并结合和“中和”SUR1的循环配体。
关于影响NCCa-ATP通道的化合物的筛选，可以筛选已知化合物的文库，包括天然产物或合成化学物质，和生物活性物质，包括蛋白质，选择作为抑制剂或激活剂的化合物。优选，这样的化合物是NCCa-ATP拮抗剂，其包括NCCa-ATP通道抑制剂、NCCa-ATP通道阻断剂、SUR1拮抗剂、SUR1抑制剂和/或能够减小通过通道的膜电流大小的化合物。
化合物可以包括但不限于小的有机或无机分子、化合物文库中可获得的化合物、肽，例如，可溶性肽，包括但不限于随机肽文库中的成员(参见，例如，Lam，K.S.等，1991，Nature 35482-8 4；Houghten，R.等，1991，Nature 35484-86)，和组合化学衍生的分子文库，由D-和/或L-构型氨基酸、磷酸肽(包括，但不限于，随机或部分简并的、定向的磷酸肽文库的成员；参见，例如，Songyang，Z.等，1993，Cell 72767-778)、抗体(包括，但不限于，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合或单链抗体，和FAb、F(ab′)2和FAb表达文库片段及其表位结合片段)构成。
根据本发明可以筛选的其他化合物包括但不限于能够穿过血脑屏障、进入合适的神经细胞并影响NCCa-ATP通道基因或一些其他涉及NCCa-ATP通道活性的基因的表达(例如，通过与涉及基因表达的调节区域或转录因子相互作用)的小有机分子；或影响NCCa-ATP通道的活性或涉及NCCa-ATP通道活性的一些其他胞内因子的活性的化合物。
为了鉴定、制备、产生、提供、制造或获得调节剂，通常测定候选物质存在、不存在或两种情况下的NCCa-ATP通道活性，其中将抑制剂或拮抗剂定义为下调、减小、抑制、阻断或降低NCCa-ATP通道表达或活性的任何物质，其中将激活剂或激动剂定义为上调、提高、激活或打开NCCa-ATP通道的任何物质。例如，方法通常包括(a)提供怀疑在体外或在体内激活或抑制NCCa-ATP通道表达或活性的候选物质；(b)测定候选物质在体外或在体内激活或抑制NCCa-ATP通道表达或活性的能力；(c)选择调节剂；和(d)制造调节剂。
特定实施方案中，可选的评估步骤可以评估候选物质在体外或在体内特异性结合NCCa-ATP通道的能力；进一步的实施方案中，可以在细胞或无细胞系统中提供NCCa-ATP通道并将NCCa-ATP通道接触候选物质。接着，通过评估候选物质对NCCa-ATP通道活性或表达的作用来选择调节剂。一旦鉴定了调节剂，方法可以进一步提供调节剂的制造。
V.癌症治疗的方法A.用激动剂治疗特定实施方案中，本发明涉及治疗需要这样治疗的癌症病人的方法，包括给药神经元细胞或神经胶质细胞或神经内皮细胞的NCCa-ATP通道的激动剂，其中激动剂激活NCCa-ATP通道。特定的实施方案中，激动剂靶向NCCa-ATP通道的SUR1。特定的实施方案中，癌症位于脑中，更具体地，包括位于脑中的转移性肿瘤。
或者，本发明涉及破坏肿瘤-脑屏障的方法，包括给药星形细胞的NCCa-ATP通道的激动剂，其中所述激动剂激活所述NCCa-ATP通道。
随着NCCa-ATP通道激动剂的给药，由于NCCa-ATP通道的打开，细胞增殖得到消除、减缓、降低或抑制。这样其中可以给药NCCa-ATP通道激动剂的神经元细胞可以包括表达SUR1的任何细胞。
可以给予细胞的NCCa-ATP通道的激动剂或拮抗剂的有效量包括约0.0001nm至约2000μM的剂量。更具体地，给药的激动剂的剂量为约0.01nM至约2000μM；约0.01μM至约0.05μM；约0.05μM至约1.0μM；约1.0μM至约1.5μM；约1.5μM至约2.0μM；约2.0μM至约3.0μM；约3.0μM至约4.0μM；约4.0μM至约5.0μM；约5.0μM至约10μM；约10μM至约50μM；约50μM至约100μM；约100μM至约200μM；约200μM至约300μM；约300μM至约500μM；约500μM至约1000μM；约1000μM至约1500μM和约1500μM至约2000μM。当然，所有这些量是示例性的，且预期这些点之间的任何量在本发明中也是有用的。
预想NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物将直接或间接抑制细胞的增殖或肿瘤的生长，通过在体外或在体内可测量地减缓、停止或逆转细胞或肿瘤或肿瘤细胞的生长速率。理想地，生长速率减缓20％、30％、50％或70％或更多，如使用合适的用于测定细胞生长速率的测试所测定的。
更进一步，本发明提供了通过给药NCCa-ATP通道的激动剂来治疗癌症的方法。可以非肠道或消化道给药激动剂或其相关化合物。非肠道给药包括，但不限于，静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、肿瘤内、皮下或腹膜内，U.S.专利N0.6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363(在此特意将每篇全部引入作为参考)。消化道给药包括但不限于口服、口含、直肠或舌下。
本发明治疗化合物和/或治疗的给予可以包括全身、局部和/或区域性的并可以口服、静脉内和肌内。或者，也可以考虑其他给药途径，如动脉输注、腔内、腹膜内、胸膜内、心室内、肿瘤内、实质内和/或鞘内。如果需要，可以通过和化疗剂相同的途径来给药治疗化合物，即使治疗化合物和化疗剂不是同时给药。本领域技术人员知道使用标准方法和程序来确定合适的给药途径。一实例中，在想要评估对化疗的应答(外周和中枢)的情况中，健康护理专家可以使用系统给药。
治疗方法包括使用有效量的含有NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物的组合物来治疗个体。通常将有效量描述为足以可检测地和重复地来缓解、降低、最小化和限制疾病或其症状程度的量。更具体地，预想使用NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物的治疗将直接或间接地杀灭细胞、抑制细胞生长、抑制细胞增殖、抑制转移、降低肿瘤大小和以其他方式逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型。
待使用的NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物的有效量或“治疗有效量”是在接受动物或病人体内有效产生有益效果的那些量，特别是关于癌症治疗而言。通过阅读公开文献、通过进行体外测试或通过在健康实验动物中进行代谢研究可以初步确定这样的量。在用于临床环境中之前，在动物模型中进行证实研究是有益的，优选广泛公认的待治疗特定疾病的动物模型。用于特定实施方案中的优选动物模型是啮齿动物模型，因为它们使用经济，特别是因为广泛公认获得的结果可以作为临床值的预测，因此是优选的。
如本领域公知的，活性化合物如NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物对于任何特定患者的特定剂量水平取决于各种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。负责给药的人将决定用于个体患者的合适剂量。此外，对于人给药，制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物学标准办公室所要求的。
NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物作为治疗的治疗有效量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。本发明的一实施方案中，NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物的剂量范围为约0.0001μg/kg体重至约500mg/kg体重。当待治疗的是动物的时候，术语“体重”是适用的。当待治疗的是分离的细胞时，在此所用的“体重”应当理解为意思是“总细胞体重”。术语“总体重”可以适用于分离的细胞和动物治疗。也认为在本申请中表达为“体重”或简单“kg”的所有浓度和治疗水平涵盖类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而，本领域技术人员将认识到多种剂量范围的可用性，例如，0.0001μg/kg体重至450mg/kg体重、0.0002μg/kg体重至400mg/kg体重、0.0003μg/kg体重至350mg/kg体重、0.0004μg/kg体重至300mg/kg体重、0.0005μg/kg体重至250mg/kg体重、5.0μg/kg体重至200mg/kg体重、10.0μg/kg体重至150mg/kg体重、100.0μg/kg体重至100mg/kg体重或1000μg/kg体重至50mg/kg体重。此外，本领域技术人员将认识到各种不同剂量水平将是有用的，例如，0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg，1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。当然，所有这些剂量是示例性的，且预期这些点中间的任何剂量在本发明中也是有用的。对于NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物，可以使用上述任一的剂量范围或剂量水平。
将按照一般用于给药化疗剂的方案来将本发明的治疗性NCCa-ATP通道激动剂组合物给药于病人或患者，如果有的话，考虑NCCa-ATP通道激动剂的毒性。预期按照需要可以重复治疗循环。还考虑了各种标准疗法，以及外科手术干预，可以与所述治疗联用。
治疗可以包括各种“单位剂量”。将单位剂量定义为含有计算产生与其给药(例如，合适的途径和治疗方案)相关所需应答的预定量治疗组合物(NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物)。待给药的量，以及特定的途径和制剂，是临床领域技术人员的技术范围内的。待治疗的患者也是重要的，特别是患者的状态和所需的保护。单位剂量不需要作为单次注射给药，而是可以包括设定时间段内的连续输注。
根据本发明，可以用NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物组合物直接注射肿瘤来治疗癌症。或者，使用任何合适的传送载体用组合物输注或灌注肿瘤。关于肿瘤，还考虑了局部或区域性给药。更优选，可以进行全身给药或口服给药。合适的情况中也可以使用连续给药，例如，在切除肿瘤并治疗肿瘤床来消除残余的、微观疾病的情况中。优选通过注射器或导管插入术来传送。启动治疗后这样的连续灌注可以进行约1-2小时，至约2-6小时，至约6-12小时，至约12-24小时，至约1-2天，至约1-2周或更长的时间段。通常，通过连续灌注的治疗组合物的剂量等于通过单次或多次注射给予的量，在进行灌注过程中的时间段内调节。对于＞4cm的肿瘤，待给药的体积为约4-10ml(优选10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，使用约1-3ml的体积(优选3ml)。作为单剂量传送的多次注射包括约0.1至约1ml体积。
特定实施方案中，待治疗的肿瘤至少开始时可能不是可切除的。用治疗性的NCCa-ATP通道激动剂组合物的治疗可以提高肿瘤的可切除性，直接或间接在边缘处收缩，或通过消除某些特别入侵性部分。治疗后，切除术是可能的。切除后的其他治疗将用来消除肿瘤部位微观的残余疾病。
B.将癌症治疗联合NCCa-ATP通道的激动剂和/或其他抗癌剂本发明的内容中，考虑可以将NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物结合其他的治疗剂使用来更有效地治疗癌症。抗癌剂可以包括但不限于放疗、化疗、基因治疗、激素治疗或靶向癌症/肿瘤细胞的免疫治疗。
当给药其他治疗剂时，只要其他治疗剂的剂量没有超过之前所提出的毒性水平，可以将其他治疗剂的有效量简单地限定为当结合NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物给药于动物时有效抑制和/或降低癌症生长的量。这可以通过监测动物或病人并测量表示给定治疗成功的那些健康和疾病的物理和生化参数来容易地确定。这样的方法在动物测试和临床实践中是常规的。
为了使用本发明的方法和组合物直接或间接地杀灭细胞、诱导细胞周期停止、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其他方式逆转或降低癌细胞的恶性表型，通常将细胞接触NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物结合其他治疗剂。以有效抑制细胞生长和/或诱导细胞凋亡的组合量来提供这些组合物。这个过程包括将细胞接触NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物，同时结合其他治疗剂或因子。这可以通过将细胞接触包括两种药剂的单一组合物或药物制剂，或将细胞同时接触两种不同的组合物或制剂来获得，其中一种组合物包括NCCa-ATP通道的激动剂或其衍生物，而另一种包括其他的药剂。
或者，可以在其他药剂治疗之前或之后以几分钟至几周的时间间隔用NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物来治疗。在将其他药剂分开运用至细胞的实施方案中，通常确保在每次传送时间之间有效的时间段没有期满，使得药剂对细胞仍然能够发挥有利的组合作用。这样的情况中，考虑将细胞在彼此约12-24小时内接触两种治疗形式，更优选，在彼此约6-12小时内，最优选只有约12小时的延迟时间。然而一些情况中，可能期望显著地延长治疗时间段，其中在各自给药之间有几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)的间歇。
还可以想到的是NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物联合其他治疗剂如抗癌剂的多于一次给药是理想的。可以使用各种组合，其中NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物是“A”且其他治疗剂是“B”，如下所示A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BB/B/B/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B1.化疗剂本发明的一些实施方案中，可以给予化疗，如同典型的作法，按照规则周期。一个周期可以包括一个剂量，此后几天或几周没有治疗，使正常组织从药物副作用中恢复过来。可以连续几天给予剂量，或每隔一天持续几天，接着停止一个阶段。如果使用多于一种的药物，治疗计划将具体说明每隔多久给予每种药物和给予每种药物的确切时间。在治疗开始之前(基于癌症的类型和阶段)可以决定病人接受的周期数，或可以是灵活的，以便考虑肿瘤收缩有多快。特定的严重副作用还需要医生来调整化疗计划以给予患者时间来恢复。
治疗癌症中可以结合本发明的激动剂或其相关化合物使用的化疗剂包括但不限于顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、plicomycin、丝裂霉素、足叶乙甙(VP16)、三苯氧胺、雷洛西芬(raloxifene)、雌激素受体结合剂、gemcitabien、新霉酰胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、transplatinum、5-氟尿嘧啶和氨甲蝶呤，或前述的任何相关化合物或衍生物变体。
2.放疗剂在治疗癌症中放疗剂也可以结合本发明的化合物使用。这样引起DNA损伤并已经广泛使用的因子包括通常已知的γ-射线、X-射线和/或定向传送至肿瘤细胞的放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，如微波和UV-照射。很可能的是所有这些因子对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持实现宽范围的损伤。对于X-射线的剂量范围为持续延长时间段(3至4周)的50至200伦琴的日剂量至2000至6000伦琴的单次剂量。可以宽泛地改变放射性同位素的剂量范围，并取决于同位素的半衰期、所发射照射的强度和类型，以及肿瘤细胞的摄取。
3.免疫治疗剂在本发明中也可以将免疫治疗剂结合NCCa-ATP通道激动剂或其相关化合物用于治疗肿瘤中。免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向并破坏癌细胞。免疫效应物可以是，例如，肿瘤细胞表面上一些标记的特异性抗体。抗体单独可以作为治疗的效应物或它可以募集其他细胞来实际执行细胞杀灭。抗体还可以缀合药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并只作为靶向剂。或者，效应物可以是携带与肿瘤细胞目标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
通常，肿瘤细胞必须带有一些适合靶向的标记，例如，在大部分其他细胞上不存在的标记。存在许多肿瘤标记，且在本发明的范围内这些中的任何一种适用于靶向。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胚胎性抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。
4.细胞增殖的抑制剂肿瘤抑制癌基因起作用来抑制过度的细胞增殖。这些基因的灭活破坏了它们的抑制活性，导致不受调节的增殖。以下描述肿瘤抑制因子p53、p16和C-CAM。
在通过化学致癌作用、紫外线照射和几种病毒转化的许多细胞中发现了高水平的突变p53。p53基因是多种人肿瘤中突变灭活的常见目标，并已经证明了是常见的人癌症中最常突变的基因。它在超过50％的人NSCLC(Hollstein等，1991)和广谱的其他肿瘤中突变。
p53基因编码可以与宿主蛋白如大的-T抗原和E1B形成复合物的393个氨基酸的磷蛋白。在正常组织和细胞中发现该蛋白，但是与转化细胞或肿瘤组织相比较浓度是微小的。
认为野生型p53是许多细胞类型中的重要生长调节因子。错义突变对于p53是常见的且对于致癌基因的转化活性是必要的。通过点突变促成的单一遗传改变可以形成致癌的p53。然而，和其他致癌基因不一样，已知p53点突变在至少30个不同的密码子中产生，通常形成产生细胞表型转移而对纯合性没有降低的显性等位基因。此外，这些显性阴性等位基因中的许多似乎在生物体中是耐受的并在种系中传递。各种突变等位基因似乎从最小的功能障碍至强烈渗透的显性阴性等位基因(Winberg，1991)。
另一种细胞增殖的抑制剂是p16。通过细胞周期素-依赖性激酶或CDK来引发真核细胞周期的主要转变。一种CDK，细胞周期素-依赖性激酶4(CDK4)，调节通过G1的进程。这种酶的活性可以在G1后期磷酸化Rb。通过激活亚基D-型细胞周期素和通过抑制亚基p16INK4来控制CDK4的活性，p16INK已经在生化上表征为特异性结合并抑制CDK4的蛋白，因此可以调节Rb磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。因为p16INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，删除该基因可以提高CDK4的活性，导致Rb蛋白的超磷酸化。还已知p16调节CDK6的功能。
p16INK4属于新描述的一类CDK-抑制蛋白，还包括p16B、p19、p21WAFI和p27KIP1。p16INK4基因作图于9p21，许多肿瘤类型中通常删除的染色体片段。p16INK4基因的同源删除和突变在人肿瘤细胞系中是常见的。该证据表明了p16INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，已经通过p16INK4基因改变的频率在初级未培养的肿瘤中比培养的细胞系中低得多的观察来挑战这种解释(Caldas等，1994；Chemg等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Okamoto等，1994；Arap等，1995)。通过质粒表达载体转染恢复野生型p16INK功能通过一些人癌细胞系降低了克隆形成(Okamoto等，1994；Arap等，1995)。
根据本发明可以使用的其它基因包括Rb、mda-7、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓剂(例如，COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、涉及血管生成的基因(例如，VEGF、FGF、凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF或其受体)和MCC。
5.程序性细胞死亡的调节剂凋亡或程序性细胞死亡是癌症治疗中的基本过程(Kerr等，1972)。已经证明了蛋白的Bcl-2家族和ICE-样蛋白酶在其他系统中是重要的调节剂和凋亡的效应物。Bcl-2蛋白，发现与滤泡性淋巴瘤相关，在控制应答不同凋亡刺激物的凋亡和提高细胞存活中起着突出作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。目前认为在进化上保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的成员，其可以归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
考虑在治疗癌症中将起作用来促进细胞死亡的Bcl-2的成员如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad和Harakiri，结合NCCa-ATP通道的激活剂或其相关化合物使用。
6.外科手术进一步考虑可以在本发明中进行外科手术程序。约60％患有癌症的人将接受一定类型的外科手术，这包括预防性、诊断或分级、治疗性和缓解性的外科手术。治疗性的外科手术包括切除，其中将全部或部分癌组织物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除指的是物理去除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除，通过外科手术的治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微控制的外科手术(Mohs′手术)。进一步考虑可以结合表面癌、癌前病变或附带适量正常组织的去除来使用本发明。
切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤时，在体内形成空腔。可以通过用其他的抗癌治疗对部位灌注、直接注射或局部应用来完成治疗。这样的治疗可以是重复的，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以改变剂量。
7.其他药剂考虑可以结合本发明使用其他药剂来提高治疗的治疗效力。这些其他的药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体上调和GAP连接的药剂、抑制细胞生长和分化的药剂、细胞附着抑制剂或提高过度增殖性细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子相关的化合物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。进一步考虑通过对过度增殖性细胞建立自分泌或旁分泌作用，细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将加强本发明的凋亡诱导能力。通过升高GAP连接的数量提高的胞内信号将提高对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖效果。其他实施方案中，抑制细胞生长或分化的药剂可以结合本发明使用来提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞附着抑制剂来提高本发明的效力。细胞附着抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步考虑提高过度增殖性细胞对凋亡敏感性的其它药剂，如抗体c225，可以结合本发明使用来提高治疗效力。
VI.脑缺血治疗的方法A.用拮抗剂的治疗其他实施方案中，本发明的治疗化合物包括神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的拮抗剂。考虑将拮抗剂用于治疗与颅内压和/或中枢神经系统的细胞毒性水肿相关的不利病症。这样的病症包括外伤(例如，外伤性脑损伤(TBI))、缺血性脑损伤、原发性和继发性神经元损伤、中风、动静脉畸形(AVM)、肿块占位病损(例如，血肿)和出血性梗死。拮抗剂保护表达NCCa-ATP通道的细胞，这对于以下情况的临床治疗是有利的其中形成离子性或细胞毒性水肿，其中在缺血后失去了毛细血管完整性，和其中神经胶质膜囊完整性是重要并必须维持来防止感染的传播，如脑脓肿。本领域技术人员知道脑脓肿是完全封闭的并导致大脑肿胀。通过抑制NCCa-ATP通道的保护作用与脑离子性和细胞毒性水肿的降低相关。因此，抑制NCCa-ATP通道的化合物是神经保护性的。
一方面中，将NCCa-ATP通道阻断、抑制或以其它方式降低活性。这样的实例中，给药和/或运用NCCa-ATP通道的拮抗剂。拮抗剂调节NCCa-ATP通道，使得通过通道的流量(离子和/或水)减少、中止、降低和/或停止。对于神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的NCCa-ATP通道的活性，拮抗剂可以具有可逆或不可逆的活性。因此，NCCa-ATP通道的抑制可以降低细胞毒性水肿和内皮细胞的死亡，这与离子性水肿的形成和出血转化相关。
因此，本发明在急性脑缺血的治疗或缓解中是有用的。根据本发明的特定实施方案，有效量活性化合物的给药可以阻断通道，而如果该通道保持打开则导致神经元细胞肿胀和细胞死亡。各种SUR1的拮抗剂适用于阻断通道。合适的SUR1拮抗剂的实例，包括但不限于，格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素、雌激素相关化合物及其组合。本发明的优选实施方案中，SUR1拮抗剂选自格列本脲和甲苯磺丁脲。另一种可以使用的拮抗剂是MgADP。可以采用防止神经细胞肿胀和细胞死亡的其他治疗“策略”，包括但不限于维持神经细胞极化状态的方法和防止强烈去极化的方法。
进一步的实施方案中，NCCa-ATP通道的抑制剂或拮抗剂可以用来降低或缓解或消除出血转化。基于从血管内区室移动至脑实质中的主要成分，可以将缺血后在毛细血管中发生的病理顺序分成三个阶段(Ayata 2002；Betz，1996；Betz 1989)。第一阶段的特征在于“离子性”水肿的形成，在该过程中BBB保持完整，电解质(Na+、Cl-)加水移动至脑实质中。第二阶段的特征在于“血管性”水肿的形成，由于BBB的破坏，在该过程中大分子加水进入脑实质中。第三阶段的特征在于出血转化，由于毛细血管的灾害性破坏，在该过程中血液的所有成分外渗进入脑实质中。根据Starling’s定律，理解这些阶段需要鉴定2个情况(i)“推动”物质进入实质中的驱动力；和(ii)使这些物质穿过进入实质中的通透性孔。
因此，使用拮抗剂或其相关化合物可以降低中风患者的死亡率和/或拯救半影区域或防止半影区域中的损伤，所述半影区域包括处于变成不可逆损伤风险中的组织区域。
随着NCCa-ATP通道拮抗剂的给药，由于NCCa-ATP通道的打开内皮细胞去极化得到消除、减缓、降低或抑制。因此，细胞去极化的消除导致Na+流入的消除或抑制，这防止了渗透梯度的改变，因此防止了水流入内皮细胞中并停止了细胞肿胀、起泡和细胞毒性水肿。因此，防止或抑制或减轻内皮细胞去极化可以防止或降低出血转化。
其中可以给药NCCa-ATP通道拮抗剂的神经元细胞可包括表达SUR1的任何细胞，例如，任何神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞。
可以用拮抗剂或其相关化合物治疗的患者包括患有以下病症或处于产生以下病症风险中的那些外伤(例如，外伤性脑损伤(TBI))、缺血性脑损伤、原发性和继发性神经元损伤、中风、动静脉畸形(AVM)、脑脓肿、肿块占位病损和出血性梗死，或与导致脑水肿和/或提高颅内压的脑缺氧或脑缺血相关的任何其他病症，例如，但不限于，脑肿块、脑水肿、血肿、末期脑水肿、脑病等。因此，拮抗剂可以是治疗性治疗，其中治疗性治疗包括预防或预防性治疗。拮抗剂或其相关化合物是神经保护性的。
可以用本发明的拮抗剂治疗的其他患者包括处于发中风风险或倾向于发生中风的那些患者。这样的患者可以包括但不限于患有房颤、凝血障碍和/或肺栓塞风险的患者。
特定实施方案中，处于发生中风风险的患者可以包括正在接受治疗的患者，例如但不限于，脑/血管内治疗、外科手术(例如，开颅术、头颅手术、脑肿瘤(例如，血肿)的去除、冠状动脉旁路移植术(CABG)、血管造影术、支架放置、其他脉管手术和/或其他CNS或神经学外科手术)，和使用血栓溶解剂的心肌梗塞(MI)治疗。这样的情况中，在实际治疗之前用本发明的拮抗剂或其相关化合物治疗患者。预治疗可以包括在实际治疗或外科手术之前给药拮抗剂和/或相关化合物几个月(1、2、3等)、几周(1、2、3等)、几天(1、2、3等)、几小时(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)或几分钟(15、30、60、90等)。在治疗和/或外科手术过程中以及治疗和/或外科手术后可以持续拮抗剂和/或相关化合物的治疗直至患者发生中风的风险得到降低、减少或缓解。
进一步的实施方案中，本发明的拮抗剂可以给予处于发生头/颈外伤风险中的患者，如涉及运动或其他具有提高的头/颈外伤风险活动的患者。
可以给予细胞的NCCa-ATP通道拮抗剂的有效量包括约0.0001nM至约2000μM的剂量。更具体地，给药的激动剂的剂量为约0.01nM至约2000μM；约0.01μM至约0.05μM；约0.05μM至约1.0μM；约1.0μM至约1.5μM；约1.5μM至约2.0μM；约2.0μM至约3.0μM；约3.0μM至约4.0μM；约4.0μM至约5.0μM；约5.0μM至约10μM；约10μM至约50μM；约50μM至约100μM；约100μM至约200μM；约200μM至约300μM；约300μM至约500μM；约500μM至约1000μM；约1000μM至约1500μM和约1500μM至约2000μM。当然，所有这些量是示例性的，且预期这些点中间的任何量在本发明中也是有用的。
拮抗剂或其相关化合物可以非肠道或消化道给药。非肠道给药包括，但不限于，静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内，U.S.专利No.6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363(在此特意将每篇全部引入作为参考)。消化道给药包括但不限于口服、口含、直肠或舌下。
本发明治疗化合物和/或治疗剂的给药可以包括全身、局部和/或区域性给药，例如，局部(皮肤、经皮)、通过导管、可植入的泵等。或者，也可以考虑其他给药途径，如动脉灌注、腔内、腹膜内、胸膜内、心室内和/或鞘内。本领域技术人员知道使用标准方法和程序来确定合适的给药途径。说明书别处讨论了其他的给药途径并在此引入作为参考。
治疗方法将包括用有效量的含有NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的组合物来治疗个体。通常将有效量限定为足以可检测和可重复地改善、降低、最小化或限制疾病或其症状程度的量。更具体地，预想用NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的治疗将抑制细胞去极化、抑制Na+流入、抑制渗透梯度改变、抑制水流入细胞中、抑制细胞毒性细胞水肿、降低中风大小、抑制出血转化和降低患者的死亡率。
待使用的NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的有效量是在接受动物或病人中有效产生有益效果的那些量，特别是对于中风治疗。通过阅读公开文献、通过进行体外测试或通过在健康实验动物中进行代谢研究可初步确定这样的含量。在用于临床环境中之前，在动物模型中进行证实研究是有益的，优选广泛公认的待治疗特定疾病的动物模型。用于特定实施方案中的优选动物模型是啮齿动物模型，因为它们使用经济，特别是因为广泛公认获得的结果可以作为临床值的预测，因此是优选的。
如本领域公知的，活性化合物如NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物对于任何特定患者的特定剂量水平取决于各种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。负责给药的人将决定用于个体患者的合适剂量。此外，对于人给药，制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物学标准办公室所要求的。
本领域技术人员知道拮抗剂或其相关化合物的有效量可以是获得所需结果需要的量中风风险的降低、颅内压的降低、细胞死亡的降低、中风大小的降低等。该量还可以是维持患者合理血糖水平的量，例如，拮抗剂的量维持至少60mmol/l的血糖水平，更优选，将血糖水平维持在约60mmol/l至约150mmol/l的范围内。因此，该量防止患者变成低血糖。如果葡萄糖水平不正常，那么本领域技术人员将根据患者是血糖过低或血糖过高而给药胰岛素或葡萄糖。
作为治疗的NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的治疗有效量根据待治疗的宿主和特定的给药方式而改变。本发明的一实施方案中，NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的剂量范围为约0.01μg/kg体重至约20,000μg/kg体重。当待治疗的是动物的时候，术语“体重”是适用的。当待治疗的是分离的细胞时，在此所用的“体重”应当理解为意思是“总细胞体重”。术语“总体重”可以适用于分离的细胞和动物治疗。还认为本申请中表达为“体重”或简单“kg”的所有浓度和治疗水平涵盖了类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而，本领域技术人员将认识到多种剂量范围的可用性，例如，0.01μg/kg体重至20,000μg/kg体重、0.02μg/kg体重至15,000μg/kg体重、0.03μg/kg体重至10,000μg/kg体重、0.04μg/kg体重至5,000μg/kg体重、0.05μg/kg体重至2,500μg/kg体重、0.06μg/kg体重至1,000μg/kg体重、0.07μg/kg体重至500μg/kg体重、0.08μg/kg体重至400μg/kg体重、0.09μg/kg体重至200μg/kg体重或0.1μg/kg体重至100μg/kg体重。此外，本领域技术人员将认识到各种不同的剂量水平是有用的，例如，0.0001μg/kg、0.0002μg/kg、0.0003μg/kg、0.0004μg/kg、0.005μg/kg、0.0007μg/kg、0.001μg/kg、0.1μg/kg、1.0μg/kg、1.5μg/kg、2.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、15.0μg/kg、30.0μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、150μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、0mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和/或30mg/kg。当然，所有这些剂量是示例性的，且预期这些点中间的任何剂量在本发明中也是有用的。对于NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物，可以使用以上任一个的剂量范围或剂量水平。
将按照用于中风治疗中所用治疗剂如血栓溶解剂给药的一般方案将本发明治疗性的NCCa-ATP通道拮抗剂组合物给药于病人或患者，如果有的话，考虑NCCa-ATP通道拮抗剂的毒性。预期按照需要可以重复治疗循环。还考虑了各种标准疗法，以及外科手术干预，可以结合上述治疗使用。
治疗可以包括各种“单位剂量”。将单位剂量定义为含有计算产生与其给药(例如，合适的途径和治疗方案)相关期望应答的预定量治疗组合物(NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物)。待给药的量，以及特定的途径和制剂，是临床领域技术人员的技术范围内的。待治疗的患者也是重要的，特别是患者的状态和所需的保护。单位剂量不需要作为单次注射给药，而是可以包括设定时间段内的连续输注。
B.联合治疗在本发明的范围内，考虑可以将NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物结合其他治疗剂使用来更有效地治疗脑缺血的事件，和/或降低颅内压。一些实施方案中，考虑常规疗法或药剂，包括但不限于，药理学治疗剂可以联合本发明的拮抗剂或其相关化合物。
药理学治疗剂和给药方法、剂量等是本领域技术人员公知的(参见例如，“Physicians Desk Reference”(医师案头参考)，Goodman& Gliman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”(治疗的药理学基础)、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(雷明顿药物科学)和“The Merck Index，Eleventh Edition” (默克索引，第十一版)，在此将相关部分引入作为参考)，并根据在此的公开内容可以与本发明联合。根据待治疗患者的状况必定产生剂量的一些改变。任何情况下，负责给药的人将决定用于个体患者的合适剂量，且这样的个体决定是在本领域普通技术人员的技术范围内的。
可以用于本发明中的药理学治疗剂的非限制性实例包括抗高脂蛋白血症剂、抗动脉硬化剂、抗胆固醇剂、抗炎剂、抗血栓形成剂/纤维蛋白溶解剂、抗凝血剂、抗血小板剂、血管扩张剂和/或利尿剂。所用的血栓溶解剂可以包括但不限于尿激酶原、链激酶和组织纤溶酶原激活剂(tPA)。抗胆固醇剂包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、烟酸及其衍生物、贝丁酸(fibricacid)及其衍生物。HMG-CoA还原酶抑制剂包括他汀类药物，例如但不限于阿伐他汀钙(Lipitor)、西伐他汀钠(Baycol)、氟伐他汀钠(Lescol)、洛伐他汀(Advicor)、普伐他汀钠(Pravachol)和辛伐他汀(Zocor)。已知降低摄入的胆固醇吸收的药剂包括，例如，Zetia。胆汁酸多价螯合剂包括但不限于消胆胺酯(cholestryramine)、考来替泊(cholestipol)和colesevalam。其他抗胆固醇剂包括贝丁酸及其衍生物(例如，吉非贝奇(gemfibrozil)、非诺贝特(fenofibrate)和安妥明(clofibrate))；烟酸及其衍生物(例如，nician、洛伐他汀)和延长烟酸释放的药剂，例如缓释烟酸(niaspan)。抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎剂(例如，萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、celeoxib)和甾体抗炎剂(例如，糖皮质激素)。抗凝血剂包括但不限于肝素、华法林和香豆定。抗血小板剂包括但不限于阿司匹林和阿司匹林相关化合物，例如醋氨酚。利尿剂包括但不限于如速尿灵(furosemide)(Lasix)、丁尿胺(Bumex)、托拉塞米(torsemide)(Demadex)、噻嗪&噻嗪样利尿剂(例如，氯噻嗪(Diuril)和双氢氯噻嗪(Esidrix)、苄噻嗪、环噻嗪、氯噻酮、bendroflumethizide、美托拉宗(metolazone))、氨氯吡脒(amiloride)、三氨苯蝶啶(triamterene)和螺甾内酯(spironolacton)。血管扩张剂包括但不限于硝酸甘油。
因此，特定实施方案中，本发明包括共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂和血栓溶解剂。这两种化合物的共同给药将增大血栓溶解剂的治疗窗。可以用于本发明的方法和药物组合物中的合适血栓溶解剂的实例是尿激酶原、链激酶和组织纤溶酶原激活剂(tPA)。
特定实施方案中，本发明包括共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂和葡萄糖或相关的碳水化合物来维持血清葡萄糖的合适水平。合适的血糖水平是在约60mmol/l至150mmol/l的范围内。因此，结合给药葡萄糖或相关碳水化合物将血清葡萄糖维持于该范围内的。
当其他的治疗剂，只要其他治疗剂的剂量没有超过之前所引用的毒性水平，可以将其他治疗剂的有效量简单地限定为当结合NCCa-ATP通道的激动剂或其相关化合物给药于动物时有效降低脑水肿的量。这可以通过监测动物或病人并测定表示给定治疗成功的那些健康和疾病的物理和生化参数容易地确定。这样的方法在动物测试和临床实践中是常规的。
为了使用本发明的方法和组合物抑制出血转化、减轻细胞肿胀等，通常将细胞接触NCCa-ATP通道的拮抗剂或其相关化合物，结合其他的治疗剂，如tPA、阿司匹林、他汀类药物、利尿剂、华法林、香豆定、甘露醇等，以有效抑制出血转化、细胞肿胀和水肿的组合量来提供这些组合物。该过程包括将细胞接触NCCa-ATP通道的激活剂或其相关化合物，同时结合其他治疗剂或因子。这可以通过以下方式来实现将细胞接触包括两种药剂的单一组合物或药物制剂，或将细胞同时接触两种不同的组合物或制剂，其中一种组合物包括NCCa-ATP通道的拮抗剂或其衍生物，另一种包括其他药剂。
或者，可以在其他药剂治疗之前或之后以几分钟至几小时至几周至几个月的时间间隔来使用NCCa-ATP通道拮抗剂或其相关化合物的治疗。在将其他药剂分开运用至细胞的情况中，通常确保每次传送时间之间的有效时间段没有期满，使得药剂仍然能够对细胞发挥有利的组合作用。在这样的情况中，考虑在彼此约1-24小时内将细胞接触两种治疗形式，更优选，在彼此约6-12小时内。
通常，对于血栓溶解剂的最大益处，治疗必须在中风症状发作三小时内开始，使得快速诊断以及中风和中风类型的区分成为关键。然而，在本发明中，NCCa-ATP通道拮抗剂和血栓溶解剂的给药增大了这种治疗窗。通过共同给药NCCa-ATP通道的拮抗剂可以将血栓溶解剂的治疗窗增加几个(4-8)小时。
更进一步，拮抗剂和tPA的组合导致再灌注后出血转化的降低或防止。出血转化是循环恢复后温和(bland)梗死转化成出血性梗死。通常认为这些中风和再灌注的并发症归因于随着缺血进展而恶化的毛细血管内皮细胞功能障碍。因此，本发明对于作为缺血事件结果发生的内皮细胞功能障碍是保护性的。
内皮细胞功能障碍包括三个阶段。阶段一的特征在于离子性水肿的形成，血脑屏障仍然是完整的。第二阶段的特征在于血管性水肿的形成，其中血脑屏障不再完整。阶段三的特征在于出血转化，由于毛细血管完整性的破坏，在该过程中血液的所有成分包括红细胞外渗进入脑实质中。BBB的破坏包括缺血诱导的内皮细胞的激活，导致MMP特别是MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)的表达和释放。
因为出血转化提高了患者的死亡率，这些患者接受紧急方式的治疗是必要的。例如，已知如果在血栓性中风后再灌注和tPA治疗延迟超过3小时或更长时间，通常导致患者出血转化。因此，给药本发明的拮抗剂将降低缺血内皮细胞的坏死性死亡，并因此将延长tPA的治疗窗，因此降低患者的死亡率。
VII.诊断拮抗剂或相关化合物可以用于诊断、监测或预测神经元、胶质细胞的缺血或损伤或监测脑水肿、转移性肿瘤等区域中的神经元细胞。
A.遗传诊断本发明的一个实施方案包括检测NCCa-ATP通道任何部分的表达的方法，例如，调节单元SUR1的表达，和/或孔形成亚基的表达。这可以包括测定所表达的SUR1水平和/或所表达的孔-形成亚基水平。通过本发明理解的是NCCa-ATP通道表达的上调或提高涉及提高的SUR1水平，这与增加的神经元损伤相关，如脑水肿。
首先，从患者获得生物样品。生物样品可以是组织或液体。特定实施方案中，生物样品包括来自脑和/或大脑内皮细胞或微血管和/或神经胶质膜囊的细胞。例如，转移性肿瘤中，胶质细胞得到激活并在肿瘤周围形成膜囊。
根据标准方法(Sambrook等，1989)从生物样品中所含的细胞分离所用的核酸。核酸可以是基因组DNA或分级分离的或全细胞RNA。在使用RNA的情况中，将RNA转化成互补DNA(cDNA)是理想的。一实施方案中，RNA是全细胞RNA；另一实施方案中，是多-A RNA。通常，将核酸扩增。
根据格式，直接使用扩增或扩增后使用第二种已知的核酸来鉴定样品中特定的目标核酸。接着，检测所鉴定的产物。在特定的应用中，通过目测方式来进行检测(例如，凝胶的溴化乙锭染色)。或者，检测可以包括产物的间接鉴定，通过化学发光、放射性标记的放射性闪烁扫描法或荧光标记乃至通过使用电或热脉冲信号的系统(AffymaxTechnology；Bellus，1994)。
检测后，可以将给定患者中看到的结果与正常患者和已经诊断为中风、癌症、脑水肿等患者的统计学显著参照组相比较。
更进一步，考虑基于芯片的DNA技术如Hacia等(1996)和Shoemaker等(1996)所述的那些可以用于诊断。简而言之，这些技术涉及用于快速而准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记基因和使用固定的探针阵列，可以使用芯片技术来分离作为高密度阵列的目标分子并基于杂交来筛选这些分子。请参阅Pease等(1994)；Fodor等，(1991)。
B.诊断的其他类型为了提高分子例如化合物和/或蛋白质和/或抗体作为诊断剂的效用，通常连接或共价结合或复合至少一种所需的分子或部分。
缀合物的特定实例是其中分子(例如，蛋白质、抗体和/或化合物)连接可检测标记的那些缀合物。“可检测标记”是由于特异性的功能特征和/或化学特征可被检测的化合物和/或元素，它的使用可以使它们连接的抗体得到检测，和/或如果需要的话进一步定量。
通常优选将缀合物用作诊断剂。诊断通常属于两个类别，用于体外诊断如各种免疫测定中的那些，和/或用于体内诊断方案的那些，通常称为“分子定向成像”。
许多合适的成像剂是本领域已知的，它们连接分子例如抗体的方法同样是已知的(参见，例如，U.S.专利No.5,021,236；4,938,948；和4,472,509，各自在此引入作为参考)。所用的成像部分可以是顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR-可检测物质；X-射线成像。
在顺磁离子的情况中，举例来说可以提及离子如铬(III)、镁(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，特别优选钆。其他情况如X-射线成像中有用的离子，包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，尤其是铋(III)。
在放射性同位素用于治疗和/或诊断应用的情况中，可以提及砹211、11碳、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。通常优选将125I用于特定实施方案中，由于低能量和用于长范围检测的合适性，锝99m和/或铟111通常也是优选的。
考虑用作缀合物的荧光标记中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、若丹明绿、若丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或Texas Red。
本发明中考虑的另一种缀合物是主要旨在用于体外的那些，其中分子连接第二结合配体和/或在接触发色底物时将产生有色产物的酶(酶标记物)。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链霉抗生物素。这样标记的使用是本领域技术人员公知的并描述于例如U.S.专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241；各自在此引入作为参考。
在科学文献如例如Nakamura等(1987)中已经描述了各种其他有用的免疫检测方法的步骤。免疫测定最简单和最直接的理解是结合测定。特定的优选免疫测定是各种类型的放射性免疫测定(RIA)和免疫珠子捕获测定。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，显而易见的是检测不限于这样的技术，蛋白质印迹、点印迹、FACS分析等也可以结合本发明使用。
结合蛋白质印迹使用的基于免疫学的检测方法包括酶-、放射性标记-或荧光-标记的第二分子/对抗NCCa-ATP通道SUR1或调节亚基的抗体，在这方面认为特别有用。涉及这样标记使用的U.S.专利包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，各自引入作为参考。当然，通过使用第二结合配体如二抗或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列可以发现其他优势，如本领域已知的。
除了以上成像技术，本领域技术人员还知道正电子发射技术、PET成像或PET扫描，也可以用作诊断检查。PET扫描涉及生理图像的获取，基于来自正电子发射的放射检测。正电子是给药于患者时从放射性物质发射的微小颗粒。
因此，本发明的特定实施方案中，拮抗剂或其相关化合物是酶-、放射性标记-、或荧光标记的，如上所述并用于诊断、监测和/或分级由脑水肿引起的神经元损伤。例如，酶-、放射性标记-或荧光标记的拮抗剂或其相关化合物可以用于确定肿瘤的大小、界限和/或边界。难以测定特定肿瘤例如转移性肿瘤的边界。在转移性肿瘤中，胶质细胞得到激活并在肿瘤周围形成被膜或神经胶质膜囊。因此，标记的拮抗剂或其相关化合物可以用于确定肿瘤的边界，这可以提高外科手术去除的效率。更进一步，标记的拮抗剂或其相关化合物可以用于确定或限定半影或处于后期梗死或中风后损伤风险中的区域。
VIII.制剂和化合物的给药途径本发明的药物组合物包括溶解或分散于药物学上可接受载体中的有效量的一种或多种NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物或其他药剂。短语“药物学或可药用”指的是给药于动物例如如果合适给药于人时不产生不利、过敏或其他不适反应的分子实体和组合物。本领域技术人员根据本发明的公开内容将知道含有至少一种NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物或其他活性成分的药物组合物的制备，如Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)，18版，Mack Printing Company，1990，中所示例的，在此引入作为参考。此外，对于动物(例如，人)给药，将理解制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物学标准办公室所要求的。
如在此所用的，“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似的物质及其组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，18版，Mack PrintingCompany，1990，pp.1289-1329，在此引入作为参考)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于药物组合物中。
根据是否以固体、液体或气溶胶形式给药，和对于如注射这样的给药途径是否需要无菌，NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物可以包括不同类型的载体。本发明可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、心室内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、口服、局部、区域、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴目标细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、霜剂、液体组合物(例如，脂质体)，或通过其他方法或之前的任意组合来给药，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，18版，Mack Printing Company，1990，在此引入作为参考)。
可以将NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐，包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，如异丙基胺、三甲胺、组胺或普鲁卡因。配制时，以与药剂相容的方式和治疗有效的量来给予溶液。可以以各种剂型来容易地给药制剂，如为非肠道给药而配制的，如注射液，或用于传送至肺的气溶胶，或为了消化道给药而配制的，如药物释放胶囊等。
进一步根据本发明，在可药用载体中提供适于给药的本发明的组合物，用或不用惰性稀释剂。载体应当是可同化的并包括液体、半固体，即，糊状物，或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接收者或其中含有的组合物的治疗有效性是有害的，否则用于本发明方法实践中的可给药组合物中是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。组合物还可以包括各种抗氧化剂来防止一种或多种成分的氧化。此外，可以通过防腐剂来防止微生物的作用，如各种抗细菌和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、水杨乙汞或其组合。
根据本发明，以任何常规和实用的方式将组合物与载体混合，即，通过溶解、悬浮、乳化、混合、包胶、吸收等。这样的方法对于本领域技术人员是常规的。
本发明的特定实施方案中，将组合物与半固体或固体载体彻底合并或混合。可以以任何常规方式如研磨来进行混合。在混合过程中还可以加入稳定剂，以便保护组合物以免丢失治疗活性，即，在胃中的变性作用。用于组合物中的稳定剂实例包括缓冲剂、氨基酸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物如葡聚糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等，进一步的实施方案中，本发明可以涉及药物脂质载体组合物的使用，该组合物包括NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物、一种或多种脂质和含水溶剂。如在此所用的，将术语“脂质”限定为包括特征在于在水中不溶且用有机溶剂可以提取的大范围物质中的任何一种。这一大类的化合物是本领域技术人员公知的，如术语“脂质”在此使用的，不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然产生的或是合成的(即，通过人设计或生产的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域公知的，并包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质，及其组合。当然，本发明的组合物和方法也包括除了在此特意所述那些以外的本领域技术人员理解为脂质的化合物。
本领域技术人员熟知多种可以将组合物分散在脂质载体中的技术。例如，可以将NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物分散于含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质合并、与脂质共价结合、作为悬浮液包含于脂质中、包含或复合胶束或脂质体，或通过任何本领域技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构另外结合。分散可以导致或可以不导致脂质体的形成。
给药于动物患者的本发明组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来决定，如体重、病症的严重程度、待治疗疾病的类型、之前或目前的治疗和/或预防性干预、患者的自发病和给药的途径。根据给药的剂量和途径，根据患者的应答可以改变优选剂量和/或有效量的给药次数。负责给药的医师将在任何情况下决定用于个体患者的组合物中活性成分的浓度和合适的剂量。
特定实施方案中，药物组合物可以包括，例如，至少约0.1％活性化合物。其他实施方案中，活性化合物可以包括约2％至约75％重量单位，或例如约25％至约60％，以及从此衍生的任何范围。自然地，以在任何给定单位剂量化合物中获得合适剂量的方式来制备每个治疗上有用组合物中的活性化合物的量。本领域技术人员制备这样的药物制剂将考虑因素如溶解性、生物利用率、生物半衰期、给药途径、产品货架期以及其他药理学考虑，因而，各种剂量和治疗方案是所希望的。
A.消化道组合物和制剂本发明的优选实施方案中，将NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物配制成通过消化道途径来给药。消化道途径包括其中组合物直接接触消化道的所有可能给药途径。具体地，在此公开的药物组合物可以口服、口含、直肠或舌下给药。因此，可以将这些组合物与惰性稀释剂或可同化的可食载体一起配制，或可以封装于硬-或软-壳明胶胶囊中，或可以压制成片剂，或可以直接掺入膳食的食物中。
特定实施方案中，活性化合物可以掺入赋形剂并以可摄取的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、水等形式来使用(Mathiowitz等，19971；Hwang等，1998；U.S.专利No.5,641,515；5,580,579和5,792,451，在此特意将每篇全部引入作为参考)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有以下物质粘合剂，如，例如，黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，如，例如，磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，如，例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻朊酸或其组合；润滑剂，如，例如，硬脂酸镁；润湿剂，如，例如，蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，如，例如，薄荷、冬绿油、樱桃调味料、橙子调味料等。当单位剂型是胶囊时，除了上述种类的物质，可以含有脂质载体。可以存在各种其他材料来作为包衣或以其它方式改变单位剂量的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以包覆虫胶、糖，或两者。当剂型是胶囊时，除了上述类型的物质，可以含有载体，如液体载体。可以将明胶胶囊、片剂或丸剂肠溶包衣。肠衣防止组合物在pH是酸性的胃或上部肠中变性。参见，例如，U.S.专利No.5,629,001。达到小肠时，其中的碱性pH溶解包衣并允许组合物释放和通过专门的细胞例如上皮消化道细胞和派伊尔结M细胞来吸收。酏剂的糖浆可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味剂，如樱桃或橙子香精。当然，制备任何单位剂型中所用的任何材料应当是药物学纯的并在所用的量中是基本上无毒的。此外，可以将活性化合物掺入持续释放的制剂和配方中。
对于口服，本发明的组合物可以可选地掺入一种或多种赋形剂以漱口水、牙膏、口含片、口腔喷雾或舌下口服给药制剂的形式。例如，可以将活性成分以所需的含量掺入合适的溶剂中，如硼酸钠溶液(Dobell’s溶液)，来制备漱口水。或者，活性成分可以掺入口服溶液如含有硼酸钠、甘油和碳酸二钾的溶液中，或分散于牙膏中，或以治疗有效量加入包括水、粘合剂、磨料、调味剂、起泡剂和湿润剂的组合物中。或者，可以将组合物制成可以置于舌下或以其它方式溶解于口中的片剂或溶液形式。
适于其他消化道给药方式的其他制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常是加有药物的，用于插入直肠中。插入后，栓剂在腔液体中软化、熔化或溶解。通常，对于栓剂，典型的载体可以包括，例如，聚乙二醇、甘油三酯或其组合。特定实施方案中，栓剂可以由含有例如约0.5％至约10％优选约1％至约2％活性成分的混合物形成。
B.非肠道组合物和制剂进一步的实施方案中，可以通过非肠道途径来给药NCCa-ATP通道的调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物。如在此所用的，术语“非肠道”包括绕开消化道的途径。具体地，在此公开的药物组合物可以例如但不限于静脉内、皮内、肌内、动脉内、心室内、鞘内、皮下或腹膜内，U.S.Pat.Nos.6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363(在此将每篇全部引入作为参考)。
可以在水中制得作为游离碱或药物学上可接受盐的活性化合物的溶液，合适地混合表面活性剂，如羟基丙基纤维素。可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制得分散剂。在常规的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂来防止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂，和用于无菌注射液或分散剂临时制备的无菌粉末(U.S.专利5,466,468，在此特意全部引入作为参考)。在所有的情况中，形式必须是无菌的并必须流动至易于注射力存在的程度。在制造和存储的条件下必须稳定且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有，例如，水、乙醇、DMSO、多元醇(剂，甘油、乙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，和/或植物油。例如通过使用包衣如卵磷脂，或在分散体的情况中通过维持所需的粒径，和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、水杨乙汞等。许多情况中，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂例如一硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
对于水溶液的非肠道给药，例如，如果需要，溶液应当得到适当地缓冲，并使用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。关于这点，根据本发明的公开内容可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一剂药溶解于1ml等渗NaCl溶液中并加入1000ml皮下灌注术流体或在提议的输注部位注射(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，15版，p1035-1038和1570-1580)。根据待治疗患者的情况，必定发生剂量的-些改变。负责给药的人员在任何情况下将决定用于个体患者的合适剂量。此外，对于人给药，制剂应当满足无菌、热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物学标准办公室所要求的。
通过将活性化合物以所需量掺入合适的溶剂中制得无菌注射液，根据需要，使用以上列举的各种其他配料，接着无菌过滤。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入无菌载体中制得分散体，该载体含有基础的分散介质和来自以上列举那些的所需其他配料。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，这从之前无菌过滤溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。将粉末状的组合物与液体载体混合，如例如，水或盐溶液，用或不用稳定剂。
C.混杂的药物组合物和制剂本发明的其他优选实施方案中，可以配制NCCa-ATP通道的活性化合物调节剂(拮抗剂和/或激动剂)或相关化合物来用于通过各种混杂途径给药，例如，局部(即，经皮)给药、粘膜给药(鼻内、阴道等)和/或吸入。
用于局部给药的药物组合物可以包括活性化合物，配制成用于加有药物的应用如膏剂、糊剂、霜剂或粉末。膏剂包括所有用于局部应用的油质的、吸收、乳化和水溶性基础组合物，而霜剂和洗剂是只包括乳化基料的那些组合物。局部给药的药物可以含有渗透增强剂来帮助活性成分通过皮肤的吸收。合适的渗透增强剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和luarocapram。用于局部应用组合物的可能基料包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂以及任何其他合适的吸收剂、乳化剂或水溶性膏剂基料。局部制剂还可以包括乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂，按照需要来保护活性成分并提供均匀的混合物。本发明的经皮给药还可以包括“贴剂”的使用。例如，贴剂可以在固定的时间段内以预定的速率和连续方式提供一种或多种活性物质。
特定实施方案中，可以通过滴眼剂、鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶传送载体来传送药物组合物。已经描述了通过鼻气溶胶喷雾将组合物直接传送至肺的方法，例如，U.S.专利No.5,756,353和5,804,212(各自在此特意全部引入作为参考)。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(U.S.专利No.5,725,871，各自在此特意全部引入作为参考)的药物传送在药物学领域中也是公知的。同样，以聚四氟乙烯支持基质形式经粘膜的药物传送描述于U.S.专利No.5,780,045中(在此特意全部引入作为参考)。
术语气溶胶指的是分散于液化或加压气体推进剂中的液体的细分固体颗粒的胶体系统。本发明用于吸入的典型气溶胶由液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂混合物中的活性成分悬浮液构成。合适的推进剂包括烃类和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力需要而改变。气溶胶的给药将根据患者的年龄、体重以及症状的严重程度和应答而改变。
IX.诊断或治疗盒在此所述的任何组合物可以包含于药盒中。非限制性的实施例中，预想诊断盒中可以包括选择性结合或识别SUR1的化合物。将这样的化合物称为“SUR1标记”，其可以包括但不限于抗体(单克隆或多克隆)、SUR1寡核苷酸、SU1多肽、小分子或其组合、拮抗剂、激动剂等。预想这些SUR1标记中的任何一种可以连接放射性物质和/或荧光标记和/或酶标记物，用于快速检测。药盒还可以在合适的容器装置中包括脂质和/或其他试剂，例如放射性或酶或荧光标记。
药盒可以包括合适等分的本发明的SUR1标记、脂质和/或其他试剂组合物，不管标记或未标记，只要可以用于制备检测测定的标准曲线。可以在含水介质中或以冻干形式包装药盒的组成成分。药盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，将成分置于其中，优选，适当等分。在药盒中存在多于一种成分的情况中，药盒通常还含有第二个、第三个或其他另外的容器，可以将其他的成分分开置于其中。然而，小瓶中可以包括成分的各种组合。本发明的药盒通常还包括用于商业出售的密闭结构的包含SUR1标记、脂质、其他试剂和任何其他试剂容器的装置。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器，其中保存所需的小瓶。
本发明的治疗盒是包括拮抗剂、激动剂或其相关化合物的药盒。根据待治疗的病症和/或疾病，药盒包括SUR1拮抗剂或其相关化合物来阻断和/或抑制NCCa-ATP通道，或药盒可以包括SUR1激动剂或其相关化合物来打开NCCa-ATP通道。这样的药盒通常在合适的容器装置中含有SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物的药物学可接受制剂。药盒可以具有单个的容器装置，和/或可以具有用于每种化合物的不同容器装置。
以一种和/或多种液体溶液提供药盒的组成成分时，液体溶液是水溶液，特别优选无菌水溶液。还可以将SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物配制成可注射的组合物。在这种情况中，容器装置可以自身是注射器、移液管和/或其他这样的类似装置，从其将制剂施加至身体的受感染部位，注射至动物中，和/或甚至运用至和/或混合药盒的其他成分。
水溶液的实例包括但不限于乙醇、DMSO和/或林格氏溶液。特定实施方案中，所用的DMSO或乙醇浓度不高于0.1％或(1ml/1000L)。
然而，可以以干粉提供药盒的成分。当以干粉提供试剂和/或成分时，可以通过加入合适的溶剂来重建粉末。预想还可以在另一个容器装置中提供溶剂。
容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置，其中合适地分配SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物。药盒还可以包括第二个容器装置，用于盛装无菌的、可药用缓冲剂和/或其他稀释剂。
本发明的药盒通常还包括供商业销售的密闭构造的用于包含小瓶的装置，如，例如，注射和/或吹塑塑料容器，其中保存所需的小瓶。
与容器的数量和/或类型无关，本发明的药盒还可以包括用于辅助SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物注射/给药和/或放置至动物体内的装置，或者用这样的装置包装本发明的药盒。这样的装置可以是注射器、移液管、镊子和/或任何医学上批准的传送载体。
除了SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物，药盒还可以包括第二种活性成分。第二种活性成分的实例包括防止低血糖的物质(例如，葡萄糖、D5W、胰高血糖素等)、血栓溶解剂、抗凝血剂、抗血小板剂、他汀类药物类、利尿剂、血管扩张剂等。这些第二种活性成分可以和SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物合并于相同的小瓶中，或它们可以包含于分开的小瓶中。
更进一步，本发明的药盒还可以包括葡萄糖测试盒。因此，使用葡萄糖测试盒测量患者的血糖，然后可以将SUR1拮抗剂、激动剂或其相关化合物给药于患者，接着测量患者的血糖。
除了上述药盒，可以装配本发明的治疗盒使得IV袋包括可以打开或破坏以将化合物释放至IV袋中的隔膜或室。另一种药盒可以包括推注药盒，其中推注药盒可以包括预先装满的注射器或相似的易于使用的快速给药装置。输液药盒可以包括小瓶或安瓿和用于在输注之前将小瓶或安瓿加入其中的IV溶液(例如，林格氏溶液)。输液药盒还可以包括推注药盒，用于在输液之前、之中或之后将推注/负荷剂量给药于患者。
X.实施例包括以下实施例来展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本发明的公开内容应当认识到可以在公开的特定实施方案中形成许多改变并仍然获得相像或相似结果，而没有脱离本发明的精神和范围。
实施例1通过雌激素的调节
KATP通道(Kir6.1、Kir6.2)的特征性特征是通过膜脂质PIP2的存在来调节对ATP的通道亲和性。通过将PIP2应用至膜的细胞质侧来提高KATP通道的打开状态稳定性(Ashcroft，1998；Baukrowitz等，1998；Rohacs等，1999)。打开状态稳定性的提高呈现为ATP不存在下通道打开可能性的提高，以及相应的对ATP抑制敏感性的降低(Enkvetchakul等，2000；Haruna等，2000；Koster等，1999；和Larsson等，2000)。
已知KATP通道和NCCa-ATP通道之间的众多相似之处，发明人假定NCCa-ATP通道的ATP-敏感性将以相同的方式来应答PIP2。通过研究内面向外式膜片中的NCCa-ATP通道来测试这一点，使用Cs+作为电荷载体，并在浴槽中使用1μM Ca2+和10μM ATP，期望后者完全阻断通道。在这些条件下，在R1星形细胞中只记录NCCa-ATP通道。将PIP2(50μM)加入浴槽中时，通道活性变得明显(图1)，如通过PIP2对KATP通道作用的类推所预测的。通过格列本脲阻断了这种通道活性，证实了通道的鉴定。
为了测定受体介导的机制是否涉及NCCa-ATP通道活性的调节，使用公知的磷脂酶C(PLC)来研究PLC激活是否引起PIP2的降解和消耗并因此提高对ATP的亲和性，例如，降低通道打开。雌激素是公知的脑中以及别处的PLC激活剂(Beyer等，2002；Le Mellay等，1999；Qui等，2003)。对于这个实验，研究细胞附着的膜片来防止胞内信号机制的改变。通过暴露于叠氮化钠引起细胞ATP的耗尽来产生NCCa-ATP通道活性(图2，记录的最初部分)。
将雌激素(E2；10nM)运用至浴槽中时，很快终止了由NCCa-ATP通道引起的活性(图2)。这表明了雌激素发挥了对NCCa-ATP通道的调节控制，并表明了这些细胞上存在能够快速(非基因组)激活信号级联的雌激素受体。
其次，为了测定在来自雄性和雌性的R1星形细胞中是否可以检测到雌激素受体。在一组3只雌性大鼠(F)和另一组3只雄性大鼠(M)中植入后7天收集明胶海绵植入物。通过蛋白质印迹在2个稀释度(4x＝50μg总蛋白；1x＝12.5μg总蛋白)分析从每个组集合的蛋白，将来自子宫的蛋白用作对照(图3A)。用识别α和β雌激素受体的抗体对膜进行印迹。雄性和雌性在α(66kDa)和β(55kDa)受体的合适分子量处显示出明显的条带(图3)(Hiroi等，1999)。还将来自雄性和雌性的相同蛋白样品用于证实SUR1的存在，将来自胰腺的蛋白用作阳性对照(图3B)。值得注意的是，之前已经报道过来自雄性和雌性星形细胞中的雌激素受体(Choi等，2001)。在大脑皮层中，报道了β同种型含量更大(Guo等，2001)，如通过蛋白质印迹所表明的。
接下来，使用从雄性大鼠收集的R1星形细胞重复图2的电生理实验。如上，研究了细胞附着的膜片，其中通过暴露于叠氮化钠后耗尽胞内ATP来激活NCCa-ATP通道的活性(图4A)。检查较高时间分辨的记录证实了对于NCCa-ATP通道合适电导的充分限定通道的活性(图4B)。将雌激素运用至浴槽中时(图4，E2，10nM，箭头)，快速终止了由NCCa-ATP通道引起的活性(图4)。这些数据提供了更多雌激素对NCCa-ATP通道发挥了调节控制的证据，此外表明了这种应答在来自雄性和雌性的R1星形细胞中同样强烈。
通过对雌激素作用的类推，预期耗尽PIP2的其他机制，包括其他受体介导的机制以及更直接的PLC激活剂如C-蛋白等，对NCCa-ATP通道的活性具有相似的抑制作用并因此发挥保护效果。
实施例2神经胶质膜囊标准模型包括麻醉大鼠的顶叶刺伤并将无菌异物(明胶海绵；Gelfoam)植入刺伤伤口中。标准模型的改变包括将海绵浸透物质(例如，例如脂多糖，LPS)或使用渗透迷你泵通过直接置于海绵中的传送导管持续体内输注物质。损伤程序是动物能够充分耐受的，实际上没有病发或死亡且疼痛为最小程度。在体内合适的时间后，收集整脑用于组织切片的组织学或免疫组织化学研究。或者，如果将海绵自身温和地从脑中取出，神经胶质膜囊的内区附着于海绵并连其一起切除。因此，测试海绵的蛋白(例如，蛋白质印迹)或mRNA(RT-PCR)，或将其进行酶促离解来产生组成细胞，用于电生理或其他单细胞测量。
在受伤后7-10天神经胶质膜囊得到充分发展。在脑灌注-固定之前通过用Evans蓝灌注动物在冠状切片中显现神经胶质膜囊(图5A)。看到水肿区域(暗)描绘出了围绕明胶海绵(暗)的无血管神经胶质膜囊(亮)外廓。用抗-GFAP抗体的免疫组织化学检测显示出海绵附近的脑实质带有许多GFAP-阳性反应性星形细胞(图5B；箭头显示出哪里是明胶海绵)。在较高的放大倍数，显示出这些实质内的GFAP-阳性细胞是大型的并带有许多显著的细胞突起(图5C，箭头)。检测明胶海绵自身显示出迁移至海绵空隙中的GFAP-阳性反应性星形细胞(图5D，箭头)。
实施例3从神经胶质膜囊分离细胞通过木瓜蛋白酶消化神经胶质膜囊的内区和明胶海绵而新鲜分离细胞的相差显微照片揭示出三种类型的细胞。大部分细胞(＞90％)是大的、圆的，不具有细胞突起且是相亮的(图6A)。一些细胞(3-5％)是小的、圆的、不具有细胞突起且是相暗的(图6B)。偶尔，发现中等大小、相亮的、并具有长度超过一个细胞直径的多个突起的细胞(Chen等，2003)。免疫荧光研究表明所有这些细胞对于典型的星形细胞标记，包括GFAP(图6C、D)和波形蛋白(图6E、F)，是强阳性的。小神经胶质细胞在神经胶质膜囊自身的内区中不明显，如通过稀疏的OX-42标记所示的。神经胶质膜囊内区的细胞对于02A前体标记A2B5和成纤维细胞标记脯氨酰4-羟化酶(Dalton等，2003)是阴性的。
如同新鲜分离的细胞，在原代培养物中观察到三种形态上不同类型的细胞。大部分细胞(＞90％)是大的多角形细胞(图6Gb)，少数(3-5％)是小的双极细胞(图6Ga)，只有偶尔观察到带有突起的星状细胞(Perillan等，2000)。所有这些细胞都强烈标记抗GFAP抗体(图6H)。其中通过酶消化获得细胞随后单独原代培养的实验显示了大的相亮细胞发育成大的多角形细胞(图6Gb)，小的相暗细胞发育成小的双极细胞(图6Ga)(Dalton等，2003)。
来自神经胶质膜囊内区的GFAP阳性星形细胞的三种形态上可区分类型呈现出非常不同的宏观全细胞电生理特征(i)对星状星形细胞的电生理研究显示出它们表达Kir2.3和Kir4.1向内整流通道，免疫标记实验表明它们还表达由SUR1和Kir6.1亚基构成的KATP通道(Chen等，2003；Perillan等，2000)。
(ii)对R2星形细胞的电生理研究表明它们表达新的Ca2+-激活的Cl-通道，其对来自蝎子Leiurus quinquestriatus的多肽毒素敏感(Dalton等，2003)。只有R2星形细胞表达这种通道。
(iii)对R1星形细胞的电生理研究表明它们表达Kir2.3内向整流通道，通过PKCδ受到TGFβ1的调节(Perillan等，2002；Perillan等，2000)。新鲜分离而不是在培养后，R1星形细胞也表达新的SUR1调节的NCCa-ATP通道(Chen等，2003；Chen等，2001)。
实施例4SUR1的表达格列本脲结合磺酰脲受体SUR1和SUR2，对SUR1的亲和性较高。使用抗SURx抗体进行免疫荧光研究。就在明胶海绵外侧的神经胶质膜囊的内区被抗SUR1抗体强烈标记(图8A)，但不被抗SUR2抗体强烈标记(图7B)。尽管在低的放大倍数没有分辨出单个细胞，较高的放大倍数显示出SUR1标记均匀分布在分离后的单个细胞中(图7C)。
在对植入后7天分离的明胶海绵的mRNA进行的RT-PCR实验中也发现了SUR1而不是SUR2转录的证据。星形细胞中观察到的信号(图7D，泳道3)存在于凝胶上的合适位置，与来自对照胰岛素瘤RIN-m5f细胞的相似(图7D，泳道2)。相反，SUR2的mRNA在反应性星形细胞中没有得到转录(图7D，泳道5)，尽管其在用作对照的心肌细胞中得到了转录(图7D，泳道4)。
实施例5神经胶质膜囊内区的表征为了测定是否神经胶质膜囊中的所有GFAP-阳性反应性星形细胞都是SUR1阳性的，研究了一周前已经植入明胶海绵，然后灌注-固定并在PBS中的40％蔗糖中平衡x2天的大鼠脑。用抗GFAP和抗SUR1抗体将冷冻切片双标记并用免疫荧光来研究。对于这种和其他免疫标记研究，标准对照方案包括在可获得时使用合适免疫原性肽或者省略一抗。
将五只动物切片并用低放大倍数显像来成像。图像总是显示出明胶海绵边缘的GFAP应答深度(厚度)高于SUR1应答深度几倍。GFAP应答深度的测量产生约400-500μm的值(图8A；在图8A-8I中，明胶海绵植入物的位置总是在左边；图8F中的条等于100μm)。相反，SUR1应答的主要部分仅延伸25-50μm的深度(图8D)。SUR1-阳性带的外侧是宽区域的GFAP-阳性反应性星形细胞，大部分是SUR1阴性的。SUR1应答总是精确地位于与异物的接触面，在神经胶质膜囊最里面的区带中。是SUR1阳性的细胞总是GFAP阳性的。从这个实验证明了粘着明胶海绵的且与其一起收集的细胞最有可能表达SUR1。此外，清楚的是这最里面区域中的R1星形细胞包括独特的反应性星形细胞亚群。从这个观察形成了神经胶质膜囊的“内区”是不同于神经胶质膜囊其余部分的独特实体的构思。
实施例6神经胶质膜囊内区的其他特征进行了其他研究来进一步评价神经胶质膜囊的内区。在之前的实验中，发现了含氧量正常培养条件下的R1星形细胞原代培养物在3天后导致SUR1-调节的NCCa-ATP通道的丧失，而在低氧的条件下培养导致通道的持续表达(Chen等，2003)。因此，确定了通道的表达需要含氧量低的条件，因此发现表达SUR1的R1星形细胞之处的神经胶质膜囊内区也可能是含氧量低的。为了评价这一点，使用了组织化学标记哌莫硝唑，其在pO2＜10mmHg条件下与细胞蛋白形成可以免疫组织化学检测的不可逆的共价加合物(Arteel等，1998；Hale等，2002；Kennedy等，1997)。
简而言之，用刺伤和植入明胶海绵来准备大鼠。使大鼠存活1周。在死亡之前给药哌莫硝唑，并加工冷冻切片来用于免疫荧光研究，使用合适的抗体来检测哌莫硝唑加合物。将冷冻切片对GFAP双标记。该实验证实了含氧量低的条件的存在限于神经胶质膜囊的SUR1-阳性内区，最明显的哌莫硝唑标记延伸仅20-50μm深(图8B；没有显示GFAP，但是GFAP应答的深度类似图8A中的)。高分辨率图像显示了哌莫硝唑标记(图8G，右上侧)存在于大的GFAP阳性星形细胞中(图8G，左下侧)。
推理内区的缺氧可能导致缺氧反应性转录因子HIF-1的上调/激活。为了检测这一点，用抗HIF-1α抗体进行切片的免疫标记，对GFAP共同标记。该实验证实了HIF-1α标记主要限于神经胶质膜囊的SUR1-阳性内区，标记只延伸了20-50mμ深(图8C；没有显示GFAP，但是GFAP应答的深度类似图8A中的)。高分辨率图像显示HIF-1α标记(图8H，右上)存在于大的GFAP-阳性星形细胞中(图8H，左下)。
还检测了紧密连接蛋白的表达。研究了两种紧密连接蛋白，ZO-1和闭合蛋白-5，用对抗这些蛋白的抗体标记备用的冷冻切片。将切片对GFAP双标记。再次，对ZO-1或闭合蛋白-5只标记了最内层20-50μm深(图8E和8F；没有显示GFAP，但是GFAP应答的深度类似于图8A中的)。高分辨率的图像显示了闭合蛋白-5标记(图8I，右上)存在于大的GFAP阳性星形细胞中(图8I，左下)。
因此，神经胶质膜囊的内区，具有表达SUR1-调节的NCCa-ATP通道和紧密连接蛋白的R1星形细胞，可以作为异物和脑之间的重要屏障，例如，异物-脑屏障(FbBB)。如果真是这样的话，可以预期破坏屏障可以显著影响对损伤的整体应答。
实施例7内区的操纵根据我们常用的方案用刺伤和植入明胶海绵来准备大鼠并使其存活1周。在手术时，还给大鼠皮下植入了渗透迷你泵，传送导管置于脑中的损伤部位。动物通过泵接受格列本脲(1μM，0.5μl/hrx7天)或二氮嗪(10μM，0.5μl/hrx7天)。没有观察到系统毒性，神经行为没有受到损伤，且动物表现为健康和没有发烧。
检测损伤脑冷冻切片的GFAP。接受格列本脲的动物中，观察到与周围脑清晰地区分出来的轮廓分明的神经胶质膜囊，内区显示出GFAP阳性细胞的密集定居(图9A；明胶海绵在右)。相反，接受二氮嗪的动物显示出远离异物延伸的扩大的GFAP阳性应答，外部区域分界不清晰，内区松散且不紧密(图9B；明胶海绵在右)。
还用核标记DAPI检测了冷冻切片。在格列本脲处理动物的切片中，大部分标记可归因于GFAP-阳性星形细胞。然而，在二氮嗪处理动物的切片中，DAPI标记显示出小的有核细胞“层”(图10A中的暗淡点)。检查发现，这些细胞层显示出是多形核白细胞(PMN，嗜中性粒细胞)。通过用PMN-特异性标记MMP-8标记证实了这一点(图10B)。重要的是注意到不存在感染的证据，且外植材料的微生物培养显示出没有细菌生长，包括需氧和厌氧培养，表明了炎症应答不是由于感染而引起的。
因此，用格列本脲保护内区R1星形细胞显示出抑制了对损伤的整体GFAP应答，而用二氮嗪杀灭内区R1星形细胞显示出引起整体GFAP应答的扩大和极大数量嗜中性白细胞的募集。这些观察强烈地加强了神经胶质膜囊的“内区”是独特实体的构思，在决定对损伤的整体应答中起关键作用。
实施例8多种脑病理学中的SUR1从3种大鼠模型(外伤、脓肿和中风)和人转移性肿瘤获得组织，并用对抗GFAP和SUR1的抗体进行双重免疫标记。低放大倍数图显示出邻近明胶海绵植入物的组织层对GFAP的免疫标记是阳性的，同时与SUR1阳性免疫标记相重叠(图11A、B)。在高放大倍数对个体细胞的检查显示出SUR1免疫标记存在于大的星状星形细胞中，证明了围绕异物植入物的神经胶质膜囊内区中SUR1-阳性R1星形细胞的存在(图11C)。
研究了大鼠的脑脓肿模型。通过在全身麻醉下皮质下植入自体粪粒来产生脓肿。这些动物存活地非常好，尽管它们显示出轻度体重减轻的迹象。当手术后1周处死时，发现了由神经胶质膜囊围绕的含脓的腔。邻近脓区的神经胶质膜囊的低放大倍数视图显示出GFAP阳性免疫标记的细胞，同时与SUR1阳性免疫标记相重叠(图11D、E)。以高放大倍数检视单细胞显示出SUR1免疫标记存在于大的星状星形细胞中，证实了围绕脑脓肿的神经胶质膜囊内区中SUR1-阳性R1星形细胞的存在(图11F)。
研究了标准的大鼠中风模型。通过在全身麻醉下将线插入颈动脉内直至颈内动脉的分叉，产生中风。在1周时将中风存活的动物处死并检查脑。邻接中风部位组织的低放大倍数视图显示出GFAP阳性免疫标记的细胞，同时与SUR1阳性标记相重叠(图11G、H)。高放大倍数检查单细胞显示出SUR1免疫标记存在于大的星状星形细胞中，证实了围绕中风的神经胶质膜囊中SUR1-阳性R1星形细胞的存在(图11I)。
从接受切除转移性脑肿瘤手术的人获得组织。手术时，围绕转移瘤的神经胶质膜囊容易地从肿瘤自身和水肿性白质区分出来。邻近转移瘤的神经胶质膜囊的低放大倍数视图显示出GFAP阳性免疫标记细胞，与SUR1阳性免疫标记相重叠(图11J、K)。高放大倍数检查单细胞显示SUR1免疫标记存在于大的星状星形细胞中，具有多个充分发展的突起，证实了人中围绕转移性脑肿瘤的神经胶质膜囊中SUR1-阳性R1星形细胞的存在(图11L)。
这些数据第一次显示了神经胶质膜囊形成部位的反应性星形细胞中的SUR1上调，与R1星形细胞中SUR1调节的NCCa-ATP通道的表达相一致。数据表明了神经胶质膜囊中的R1星形细胞中的SUR1表达是影响脑的众多病理状况中的常见现象。这些数据突出了通过研发作用于SUR1并因此可以决定这些细胞死亡或存活的药剂来选择性地操纵内区的R1星形细胞的独特机会。
总的说来，这些观察强烈地增强了神经胶质膜囊的“内区”是不同于神经胶质膜囊其余部分的独体实体的构思。
实施例9NCCa-ATP通道和坏死性死亡在中风的啮齿动物模型中研究了NCCa-ATP通道。在半影中，在也是GFAP-阳性的星状细胞中发现了SUR1标记(图12A)。在中风的中间，不存在星状细胞，但是在也是GFAP-阳性(未显示)的呈现水泡样外观的圆形细胞中发现了SUR1标记(图12B、C)。原位起泡的圆形细胞类似在体外暴露于叠氮化钠后经受坏死性死亡的反应性星形细胞。测定了格列本脲与盐水相比的效果。通过皮下植入的渗透迷你泵来给药格列本脲或盐水(1μM，0.5μ1/hr)。在盐水处理的大鼠中，中风后3-天死亡率为68％，而在格列本脲处理的大鼠中，3-天死亡率降低至28％(每组n＝29；通过x2，p＜0.001)。在分开的动物中，格列本脲处理大鼠中的中风半球只含有盐水处理大鼠中一半那样多的过量水(每组n＝5；通过t-检验，p＜0.01)，证实了NCCa-ATP通道在水肿形成中的重要作用。
还在外伤啮齿动物模型中研究了SUR1。检测了使用植入的渗透迷你泵将药物直接输注至外伤部位中的效果。将通道抑制剂格列本脲用于降低反应性星形细胞的死亡，用通道激活剂二氮嗪促进星形细胞死亡。与对照相比较，格列本脲输注降低了整体的损伤应答，稳定了异物植入物周围的神经胶质膜囊并最小化了炎症应答。
相反地，二氮嗪实质性地破坏了神经胶质膜囊并引起了巨大的炎症应答，特征在于多核形白细胞(PMN)的大量流入(图10A、B)。这些数据表明NCCa-ATP通道在损伤应答中起着关键作用，它们强烈地支持炎症与NCCa-ATP通道的活性和反应性星形细胞的坏死性死亡密切相关的假设。
实施例10永久性MCA模型将成年雄性或雌性Wistar大鼠(275-350gm)禁食过夜，然后麻醉(氯胺酮，60mg/kg加甲苯噻嗪，7.5mg/kg，i.p.)。将导管插入右股动脉，并监测生理参数，包括体温、pH、pO2、pCO2和葡萄糖。使用腹侧颈切口，将右侧颈外动脉和翼腭动脉结扎。将颈总动脉在近端结扎并插入导管使得颈内动脉栓塞。
对于血栓栓塞性(TE)中风，用7-8个1.5mm长的同种异体血凝块进行栓塞。制备同种异体的、凝血酶诱导的富含血纤蛋白的血凝块(Toomy等，2002)。
对于伴随恶性脑水肿(MCE)的大型MCA中风，发明人首先用微粒进行栓塞(Nakabayshi等，1997)[聚乙烯醇(PVA)颗粒；TargetTherapeutics，Fremont CA；150-250μm直径，1.5ml肝素化盐水中600μg]，接着使用单丝缝线(4-0尼龙，顶端磨圆，并涂覆聚L-赖氨酸)进行标准永久性腔内缝合闭塞(Kawamura等，1991)，直至ICA分叉处，并通过结扎固定在位。
中风后，通过dermoclysis给予动物10ml无葡萄糖的生理盐水。使用servo控制的温热毛毯将直肠温度维持在≈37℃直至动物从麻醉苏醒过来。中风时的血气和血清葡萄糖是对照中，pO2，94±5mmHg；pCO2，36±5mmHg；pH，7.33±0.01；葡萄糖142±6mg/dl；格列本脲处理的动物中，pO2，93±3mmHg；pCO2，38±2mmHg；pH，7.34±0.01；葡萄糖152±7mg/dl。
在两组模型中，动物迅速地从麻醉中苏醒过来并到处活动，通常呈现异常的神经功能，典型地为转圈行为和偏瘫。血栓栓塞(TE)模型的死亡率是最小的，而恶性脑水肿(MCE)模型，动物呈现延迟的恶化，通常导致死亡。大部分死亡发生在MCA闭塞后12-24小时，尸体剖检证实了死亡是由于温和的梗死。罕见地，动物在中风后＜6小时死亡，并在尸体剖检时发现具有蛛网膜下腔出血，此时将其从研究中排除。患有MCE和温和梗死的未处理动物的死亡率为65％，与患有大型MCA中风的人中相似(Ayata & Ropper，2002)。
实施例11对中风大小、死亡率、组织-水和药物定位的研究MCA闭塞后(TE和MCE两种模型)，皮下植入传送盐水或格列本脲(Sigma，St.Louis，MO；300μM或148μg/ml，皮下0.5μl/hr，无负荷剂量)的迷你渗透泵(Alzet 2002，Durect Corporation，Cupertino，CA)。中风后48小时时比较2个处理组中的中风大小(TE模型)，中风大小以连续2mm厚切片中TTC(-)组织的体积来测量并表示为占半球体积的百分比，每组包括10只雄性大鼠，用盐水或格列本脲处理。在中风后第一周中比较2个处理组中的死亡率(MCE模型)，每组包括29只大鼠(19只雌性加上10只雄性)，用盐水或格列本脲处理。在中风后8小时时比较2个处理组中的水肿(MCE模型)，每组包括11只雄性大鼠，用盐水或格列本脲处理；将这2个处理组每组中的大鼠再分成2个亚组，将这其中的第一组用来分析整个累及半球中的水(无TTC处理)，将第二组用来分析累及半球的TTC(+)相对TTC(-)部分中的水。为了荧光标记药物的定位，将20只雄性大鼠接受MCA中风(MCE模型)并植入传送BODIPY缀合的格列本脲(BODIPY-FL-格列本脲，Molecular Probes，Eugene，OR；300μM或235μg/ml，皮下0.5μl/hr，无负荷剂量)的迷你渗透泵。这些中，将15只大鼠用于药物作用的证实(死亡率、组织水和葡萄糖)，5只大鼠用于药物分布的测定。
实施例12免疫标记将脑灌注-固定(4％多聚甲醛)并冷冻保护(30％蔗糖)。制得冷冻切片(10μm)并使用标准技术来免疫标记(Chen等，2003)。透化(0.3％曲通X-100持续10分钟)后，将切片封闭(2％驴血清1小时；Sigma D-9663)，然后用对抗SUR1的一抗孵育(1∶300；室温1小时然后4℃48小时；SC-5789，Santa Cruz Biotechnology)。洗涤后，用荧光二抗孵育切片(1∶400，驴抗山羊Alexa Fluor 555；MolecularProbes，OR)。为了共同标记，使用对抗NeuN(1∶100；MAB377；Chemicon，CA)；GFAP(1∶500；CY3缀合的；C-9205；Sigma，St.Louis，MO)和vWf(1∶200；F3520，Sigma)的一抗并根据制造商的推荐来处理组织。按照需要，使用物种合适的荧光二抗。使用荧光显微镜(NikonEclipse E1000)观察荧光信号。
实施例13TTC染色，中风大小将新鲜收集的脑切成2-mm厚的冠状切片，并将切片暴露于TTC(62.5mM Tris-HCl、13mM MgCl2、1.5％二甲基甲酰胺中0.125％w/v)37℃ 30分钟。对于中风大小，将染色的切片拍照并分析图像(ScionImage)来测定累及半球中TTC(-)组织占据的百分比；没有进行对水肿的校正。为了水或SUR1蛋白含量的一些测定，在放大下将单个冠状切片分成3部分(i)非累及的对照半球；(ii)累及半球的TTC(+)部分；(iii)累及半球的TTC(-)部分。对于每只动物，然后处理从这3部分汇集的组织，用于组织水测量或用于蛋白质印迹。
实施例14组织水含量通过湿/干重方法来定量组织水(Hua等，2003)。将组织样品吸干来除去少量吸附的液体。用精密的秤将样品称重来获得湿重(WW)，在80℃和低真空干燥至恒重，然后再次称重来获得干重(WD)。然后按照(WW-WD)×100/WW来计算每个组织样品的百分比H2O。
实施例15免疫印迹制得组织裂解物和凝胶(Perillan等，2002)。将膜对SUR1(SC-5789；Santa Cruz Biotechnology)、Kir6.1(Santa Cruz)或Kir6.2(Santa Cruz)显影。将膜剥离并再次对β-肌动蛋白印迹(1∶5000；Sigma，St.Louis，MO)，将这用于标准化最初的数据。使用ECL系统(Amersham Biosciences，Inc.)进行检测，使用常规的成像和定量(Fuji LAS-3000)。
实施例16原位杂交根据制造商的方案(Roche)使用SP6或T7 RNA聚合酶制得非放射性洋地黄毒苷标记的探针。从pGEM-T easy质粒(Promega)产生RNA dig-标记的探针(有义和反义)，所述质粒中SUR1插入片段(613bp)两侧为引物5’AAGCACGTCAACGCCCT3’(正向)；5’GAAGCTTTTCCGGCTTGTC3’(反向)。将大鼠脑(MCA中风后3、6、8小时)的新鲜-冷冻(10μm)或石蜡包埋(4μm)切片用于原位杂交(Anisimov等，2002)。
实施例17神经胶质膜囊的内区为了评估缺血的其他诱因例如动脉闭塞是否导致SUR1的上调，使用了实施例10中描述的两种永久性局灶性脑缺血的啮齿类动物模型。
将MCE模型用来评价SUR1蛋白和mRNA，并用来评估SUR1抑制对水肿和存活的效果，而将TE模型用来测量SUR1抑制对中风大小的效果。将缺乏灌注(图14A)，TTC染色(Mathews等，2000)(图14B)和GFAP免疫标记用来区分梗死和梗死周围区域。
在梗死核心中SUR1表达瞬时提高。在此，早在MCA闭塞后2-3小时，远在坏死发作之前，SUR1的增加就变得明显(图14D)，之后随着坏死开始而消失(图14C，图的右侧)。在坏死之前的这些较早时间，SUR1在共同标记NeuN的神经元中非常明显(图14D-F)。
在梗死周围的区域中，包括大脑前动脉(ACA)和MCA区域之间的典型缺血“分水岭”区域，SUR1表达提高迟于核心中，但是持续。到6-12小时，SUR1表达清晰地将梗死和梗死周围区域划分界线(图14C)。这里，在神经元、星形细胞和毛细血管内皮细胞中发现了SUR1表达，如各自通过NeuN、GFAP(图14G-I)和von Willebrand因子的共同标记所示的(图14J-L)。SUR1在这些皮层和皮层下区域通常不以这样的丰度表达(Treherne & Ashford，1991；Karschin等，1997)，如在对侧组织中所示(图14C，图的左侧)。
蛋白质印迹显示了SUR1蛋白表达的提高，在梗死周围区域最为突出(图15A-D)。然而，KATP通道的孔形成亚基Kir6.1或KIr6.2，没有得到上调(图15C-D)。在原位杂交中显示了来自缺血区域的神经元和毛细血管中的SUR1转录物不存在于对照组织中(图15E-G)，表明SUR1，而不是KATP通道，在脑缺血中转录上调。
因此，这些数据表明SUR1，而不是Kir6.1或Kir6.2，在脑缺血中转录上调，首先在注定要经受坏死的区域中，之后在梗死周围的区域中。
实施例18SUR1上调图15A-G显示了SUR1在中风中显著上调。还显示了孔-形成亚基Kir6.1和Kir6.2在中风中没有上调，表明没有涉及KATP通道。为了证明SUR1上调是由于NCCa-ATP通道而不是KATP通道引起的，进行了缺血部位神经元和内皮细胞的膜片钳记录。中风后3小时(图16A)和6小时酶解分离大的神经元样细胞。进行膜片钳研究，在浴槽和移液管中使用Cs+来阻断所有K+通道，包括KATP通道。这些实验显示出由格列本脲阻断的强有力的阳离子通道活性，正如对NCCa-ATP通道预测的(图16B)。此外，当用K+记录通道活性时，斜率电导是34pS(图16C、D)，和之前在新鲜分离的R1星形细胞中报道的一样，且比对KATP通道报道的70-75pS低得多。
实施例19SUR1在脑缺血中的功能为了测定在脑缺血中新表达的SUR1的功能，研究了格列本脲的作用，格列本脲是一种高度选择性的SUR1抑制剂。研究了格列本脲对死亡率(MCE模型)的作用。在一大群有雄性和雌性的动物中，与盐水相比较，用格列本脲处理导致了死亡率的显著降低，从65％降至24％(p＜0.002；图17A)。
因为格列本脲已经显示出改善由能量耗尽诱导的星形细胞的细胞毒性水肿(Chen等，2003)，推论对死亡率的有益效果与水肿相关。研究了中风(MCE模型)诱导后8小时时格列本脲对水肿形成的作用。这是死亡率研究中任何动物死亡之前的时间。在两个实验的第一个中，使用实施例14中所述的方法测量了累及和未累及半球中的含水量。对于对照半球，水是77.9±0.2％。对于累及半球，对于用盐水处理的组，水提高了3.4％，至81.3±0.5％，而对于格列本脲处理的组，只提高了2.0％，至79.9±0.3％。这些值是显著差异的(p＜0.05)，与SUR1对水肿形成的重要作用相一致。
其次，为了更好地表征水肿的位置，检测了将冠状脑切片分成有活力TTC(+)和无活力TTC(-)部分后的含水量。未累及半球中的水为78.0±0.1％(图17B)，与之前的77.9±0.2％的值相似，表明TTC处理没有改变水含量。对于累及半球，对于盐水处理的组，TTC(+)组织中的水提高了5.4％，至83.4±1.1％，而对于格列本脲处理的组，只提高了2.5％，至80.5±0.3％(图17B)。这些值是显著差异的(p＜0.05)。相反，对于TTC(-)组织中水的值，使用盐水和使用格列本脲各自为78.7±1.0％和78.6±0.4％，没有差异(p＝0.97)，且只是略高于未累及半球的值(78.0％)，反映出需要进行中的血流来提高组织水(图17B)(Ayata & Ropper，2002)。
在这些动物中，8小时(测量水肿时)时的血清葡萄糖保持在不可能对缺血诱导的损伤具有效应的范围内(Li等，1994；Wass &Lanier，1996)(对于盐水和格列本脲处理的动物，分别为122±4对93±3mg/dl；11只大鼠/组)。总的说来，这些数据表明了水肿几乎全部位于邻近中风早期核心的有活力的梗死周围(半影)组织中，格列本脲高度有效地降低了这种水肿，与SUR1在水肿形成中的重要作用相一致。
因此，使用低剂量的对SUR1高度选择性的格列本脲(Gribble &Reinmann，2003；Meyer等，1999)的数据，提供了SUR1在脑水肿形成中关键作用的非常有说服力的证据。
实施例20中风大小的效果使用非致命血栓栓塞(TE)模型来评估中风诱导后48小时时的中风大小。
使用TE模型，与盐水对照相比较，格列本脲处理导致中风体积的高度显著减小(32.5±4.9％对15.5±2.3％；p＜0.01)(图17C-E)。基本上所有的动物，与处理组无关，都遭受累及由末端豆纹小动脉供血的基底神经节的梗死。然而，格列本脲组中减小的中风体积通常伴随显著的大脑皮层防护(图17C-D)，这是之前对解压开颅术报道过的现象(Doerfler等，2001)。使用格列本脲，皮层防护可以反映出由于减轻的脑水肿和降低的颅内压而改善的柔脑膜侧支血流。
实施例21中风后的MCE模型使用荧光衍生物BODIPY-格列本脲来体内标记中风后(MCE模型)的组织。
当以与母体化合物相同方式传送时，荧光衍生物呈现出相似的保护效果，但是功效较低[7-天死亡率，40％(n＝10)；8小时时累及半球TTC(+)部分中的水，82.7±1.4％(n＝5)；血清葡萄糖，109±4mg/dl]，与标记药物的降低效力一致(Zunkler等，2004)。使用低全身剂量药物在未累及半球中(图18B)和胰腺中产生了最小标记，且在无灌注的中风核心中没有标记。然而，梗死周围区域中的细胞得到明显标记，大的神经元样细胞和微血管(图18A)包括毛细血管(图18C)具有边界清晰的标记，显示出SUR1的显著表达(图18D)。缺血脑中的优先细胞标记很可能反映出不仅格列本脲结合位点增加，而且还有摄取的提高，可能是由于血脑屏障的改变。
因此，数据表明了除了之前描述的它们存在于星形细胞中(Chen等，2001；Chen等，2003)，NCCa-ATP通道还存在于毛细血管内皮和神经元中。对MCA闭塞(MCE模型)后1-6小时时从缺血皮层分离的神经元和微血管的另外的膜片钳实验证实了NCCa-ATP通道的存在，显示了约30-35pS电导的非选择性阳离子通道，用Cs+作为电荷载体容易记录，并通过格列本脲阻断。该通道不存在于非缺血脑组织的细胞中。
鉴于以上所述的，表明通过ATP耗尽打开且在缺血神经元、星形细胞和内皮细胞中新表达的SUR1调节的NCCa-ATP通道构成了重要的、此前未鉴定的Na+流入通路，其中Na+流入是细胞毒性和离子性水肿的形成所需要的。总的说来，这些发现表明SUR1在决定脑缺血后水肿形成的新途径中关键性的参与。针对SUR1的分子治疗可以提供重要的新途径，用于治疗与缺血相关的许多类型的CNS损伤。
实施例22格列本脲和tPA的共同给药使用血栓栓塞中风的啮齿动物模型(Aoki等，2002；Kijkhuizen等，2001；Kano等，2000；Sumii等，2002；Tejima等，2001)。简而言之，使用氟烷(N2O/O2的70/30混合物中1-1.5％)通过自发呼吸将已经禁食过夜的雄性自发高血压大鼠麻醉(Lee等，2004；Sumii等，2002)。用恒温器控制的加热垫将直肠温度维持在≈37℃。将导管插入右股动脉，并监测生理参数，包括体温、平均血压、pH、pO2和pCO2、葡萄糖。使用栓塞模型获得暂时性局灶性缺血，栓塞模型使用同种异体血凝块来闭塞MCA。使用改编自Niessen等的方法来制得异源的、凝血酶诱导的、富含血纤蛋白的血凝块(Asahi等，2000；Niessen等，2003；Sumii等，2002)。将1.5mm长的七个血凝块用于栓塞。
使用腹侧颈切口，将颈内和颈外动脉暴露。将颈外动脉和翼腭动脉结扎。将可取出的外科芯片运用至颈总动脉和颈内动脉。将含有血凝块的改进型PE-50导管逆向插进颈外动脉中并直至颈内动脉。取出临时芯片，并将血凝块注射进去。将切口闭合。
中风后，通过dermoclysis给予动物无葡萄糖的生理盐水，总共10ml。维持温度直至动物苏醒并到处走动。
就在指定处理(再灌注)时间之前，将动物再次麻醉并将导管插入股静脉中。在指定处理时间，首先给予盐水或负荷剂量的格列本脲(1.5μg/kg，i.v.，Sigma，St.Louis)。然后，用i.v.给予rtPA(10mg/kg，阿替普酶，Genetech；溶解于2ml蒸馏水中，在30分钟内给予)来实现再灌注(Buesseb等，2002)。然后，使用背胸切口，将传送盐水或格列本脲(300μM或148μg/ml，0.5μl/hr s.q.)的迷你渗透泵(Alzet 2002，Duret Corporation，Cupertiono，CA)皮下植入。监测生理参数，包括体温、平均血压(尾套囊体积描记法)、血气和葡萄糖。
在6小时的相同时间，用盐水或格列本脲(负荷剂量1.5μg/kgi.v.加上含有148μg/ml＝300μM以1/2μl/hr传送的迷你渗透泵的植入)共同处理动物。中风后24小时对动物实施安乐死并将脑灌注以从血管内区室除去血液。制得新鲜脑的冠状切片并拍照，接着将该切片处理以进行TTC染色来鉴定梗死的区域。
用盐水共同处理的所有动物(5/5)在梗死的皮层和皮层下实质部位中显示出大范围的出血转化，伴随脑室内出血的迹象(图19A-D)。相反，只有1/5用格列本脲共同处理的动物具有出血转化，4/5显示没有出血迹象(图19E-H)。
这些数据表明给药格列本脲保护了免于出血转化，以及降低了中风大小、离子性水肿和血管性水肿。
实施例23脑毛细血管和内皮细胞的分离该方法部分改编自Harder等(1994)，使用之前所报道的改进(Seidel，1991)。简而言之，将大鼠深度麻醉，将降主动脉结扎，打开右心房并将导管插入左心室以允许灌注50ml含有1％氧化铁颗粒(粒径，10μm；Aldrich Chemical Co.)悬浮液的生理溶液。取出脑，剥离软脑膜和软膜血管并使用刀片将皮层套膜切成1-2mm3的块。用胰蛋白酶加DNA酶孵育组织块，然后通过尼龙网(210μm)过筛。将阻留的微血管重悬浮于胶原酶中，搅拌并在37℃再孵育10分钟。为了终止消化，使用磁铁将微血管吸附于容器的侧面并重复洗涤来除去酶和细胞碎片。
使用这些方法产生了健康外观的微血管结构，适用于进一步消化来获得用于进一步实验的单个细胞(图21)。
使用制霉菌素穿孔的膜片技术使用新鲜分离的内皮细胞研究了分离的内皮细胞。使用生理溶液，细胞呈现出在负电位明显的、强烈整流向内电流，和在正电位的中等向外电流(图22A)，产生了特征性的电流-电压曲线，在中间电位处电流接近零(图22C)，与在新鲜分离的内皮细胞中之前的观察(Hogg等，2002)相似。当移液管溶液中的K+由Cs+替代时，K+通道电流被完全阻断。在内皮细胞中，这产生了线性的电流-电压曲线(图22E)。这些数据证明了新鲜分离的内皮细胞中的电压依赖性通道全部是不携带Na+的K+通道。
实施例24
神经元的分离从振动切片机切片分离神经元。免疫标记实验表明缺血性NeuN-阳性神经元在MCAO后2-3小时内在坏死明显前表达SUR1。因此，在MCAO后2-3小时制得组织。将脑在前囟水平冠状分割，并从一半制得冷冻切片而从另一半制得振动切片机切片。将冷冻切片(10μm)用于TTC染色(Mathews等，2000)或者高对比度梗死银染(SIS)(Vogel等，1999)来鉴定缺血部位，和用于免疫标记来证实NeuN双标记的神经元中的SUR1上调。将振动切片机切片(300μm)处理(Hainsworth等，2000；Kay等，1986；Moyer等，1998)来获得用于膜片钳的单个神经元。将选定部分的冠状切片在用空气起泡的HBSS中35℃孵育。至少30分钟后，将切片转移至含有1.5mg/ml蛋白酶XIV(Sigma)的HBSS中。蛋白酶处理30-40分钟后，将切片在无酶的HBSS中漂洗并机械磨碎。对于对照，使用未累及半球中镜像皮层区域的细胞。使细胞在装在倒置显微镜置物台上的塑料皮氏培养皿中的HBSS中沉降10-12分钟。选择大的和中等大小的锥形神经元用于记录。在2-3小时的这一早期时间，只有神经元和毛细血管，而非星形细胞，显示出SUR1的上调。
一旦细胞得到分离，使用采用公知方法的膜片钳实验，包括全细胞、内面向外式、外面向外式和穿孔膜片(Chen等，2003；Chen等，2001；Perillan等，2002；Perillan等，2000；Perillan等，1999)。
实施例25格列本脲对MMP的抑制将中风组织中的MMP-9 & MMP-2的激活与对照相比较。简而言之，对照条件(CTR)下，格列本脲(10μM)存在下，和MMP-抑制剂II(300nM；Calbiochem)存在下，重组酶和中风组织的明胶酶活性。
接着，使用明胶-琼脂糖4B(Pharmacia)使上清液接受明胶酶纯化处理，并对纯化的上清液在含有明胶的十二烷基硫酸钠凝胶中进行酶谱法(Rosenberg，1994)。用透明度扫描仪扫描干燥的凝胶，并通过密度分析法分析图像。将单个样品的相对裂解表示为其条带的积分密度值并除以样品的蛋白含量。
酶谱法证实了中风后明胶酶活性提高(图20A)，并显示出格列本脲存在下测定的明胶酶活性(图20B，格列本脲)与没有其存在时测定的相同(图20B，对照)，尽管明胶酶活性受到可购得的MMP抑制剂II的强烈抑制(图20B，MMP-2/MMP-9抑制剂)。这些数据证明了格列本脲并不直接抑制明胶酶活性，并表明了使用格列本脲观察到的出血转化的降低很可能是由于格列本脲对缺血内皮细胞的有益保护作用而引起的。
实施例26中风中SUR1-mRNA的上调使用定量RT-PCR获得了SUR1牵涉于中风中的另外分子证据。
使用异硫氰酸胍从MCAO(中风)对侧(CTR)和同侧的匀浆脑组织样品提取和纯化总RNA。每50μl反应混合物使用4μg总RNA来合成cDNA，使用TaqMan RT试剂盒(Applied Biosystems)。通过相对于H1f0(组蛋白1成员0)标准化来获得SUR1-mRNA的相对值。使用了以下探针，SUR1正向GAGTCGGACTTCTCGCCCT；SUR1反向CCTTGACAGTGGCCGAACC；SUR1 TaqMan探针6-FAM-TTCCACATCCTGGTCACACCGCTGTTAMRA；H1f0正向CGGACCACCCCAAGTATTCA；H1f0反向GCCGGCACGGTTCTTCT；H1f0 TaqMan探针6-FAM-CATGATCGTGGCTGCTATCCAGGCA-TAMRA。
这些数据显示出MCAO后3小时在核心区域中SUR1的mRNA显著提高(图23)。
实施例27SUR1击倒(SUR1KD)是保护性的为了进一步测试SUR1的牵连，通过使用迷你渗透泵输注寡脱氧核苷酸(ODN)14天来原位“击倒”SUR1表达，将传送导管置于脑中gelfoam植入部位，在我们用于R1星形细胞分离的其它方面标准的模型中(Perillan等，1980，Perillan等，2002，Perillan等，2000，Perillan等，1999)。使用反义(AS；5′-GGCCGAGTGGTTCTCGGT-3′)(Yokoshiki等，1999)寡脱氧核苷酸(ODN)实现SUR1表达的击倒(SUR1KD)，将混杂(SCR；5′-TGCCTGAGGCGTGGCTGT-3′)ODN用作对照。
神经胶质膜囊的免疫印迹显示出与接受混杂序列ODN的对照相比较，SUR1击倒(SUR1KD)组织中SUR1表达的显著降低(图24A和24B)。
发明人使用上述的标准细胞分离方案(Chen等，2003)从SUR1KD和对照酶解分离了单个细胞来评估对叠氮化钠诱导的ATP耗尽的功能应答。在来自对照组织的R1星形细胞中，叠氮化钠(1mM)引起快速去极化，由于可归因于NCCa-ATP通道激活的Na+流入(图24C)。值得注意的是，该去极化应答与KATP通道激活时观察到的超极化应答相反。然而，在来自SUR1KD的R1星形细胞中，叠氮化钠对静息膜电势具有极小的效果(图24D)。在对照中，叠氮化钠的应用引起64±3.7mV的去极化，而在SUR1KD的细胞中，去极化仅为8.7±1.7mV(图24E)。
此外，在SUR1KD的细胞中没有观察到通常在暴露于叠氮化钠之后的膜起泡，证实了SUR1在R1星形细胞的细胞毒性水肿中的作用。
实施例28调节SUR1表达的分子因子基于胰腺β细胞中的工作，在认为对于SUR1转录活性的激活重要的近端SUR1启动子区域中已经鉴定出多个SP1转录因子结合位点(Ashfield等，1998；Hilali等，2004)。值得注意的是，基本上没有研究过中风中的SUR1(salminen等，1995)。
简而言之，将缺血的梗死周围的组织对SP1、HIF1α和SUR1自身进行免疫标记，其中SP1对于SUR1表达是重要的，公认HIF1α在脑缺血中上调(semenza 2001；Sharp等，2000)。SP1在通过HIF1α的表达(图25B)证实缺血的区域中的大型神经元样细胞和毛细血管中显著表达(图25A、25C)。值得注意的是，表达SP1的毛细血管也显示出SUR1的显著表达(图25C、25D)。对侧对照组织显示出很少的SP1免疫标记，对HIF1α没有免疫标记(图25E、25F)。
核SP1定位在中风早期显著增加(图26A、26B)，且在MCAO后表达SUR1的大的神经元样细胞中发现核SP1(图26C)。
通过在gelfoam植入物的部位输注反义寡脱氧核苷酸来获得HIF1α击倒动物。图27证实了HIF1α击倒动物导致SUR1表达的显著降低(图27B、27D)，提供了不仅SP1而且HIF1α很可能是SUR1表达的重要调节因子的强有力证据。
参考文献说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域技术人员的水平。在此将所有专利和出版物引入作为参考，程度与如同指示各篇出版物具体和单独引入作为参考相同。
Aguilar-Bryan L，et al.，Science.1995；268423-426.
Ammala C，et al.，Nature.1996；379545-548.
Anisimov，S.V.，et al.，Mech.Dev.117，25-74(2002).
Aoki K，et al.，Acta Neuropathol(Berl).2003；106121-124.
Arteel GE，et al.，Eur J Biochem.1998；253743-750.
Ashcroft FM.Science.1998；2821059-1060.
Ayata，C.& Ropper，A.H.J.Clin.Neurosci.9，113-124(2002).
Babenko AP，et al.，Annu Rev Physiol.1998；60667-687.
Ballanyi，K.J.Exp.Biol.207，3201-3212(2004).
Barclay J，et al.，J Neurosci.2002；2281 39-8147.
Baukrowitz T，et al.，Science.1998；2821141-1144.
Becker JB，et al.，Ann N Y Acad Sci.2001；937172-187.
Beyer C，et al.，J Steroid Biochem Mol Biol.2002；81319-325.
Blurton-Jones M，et al.，J Comp Neurol.2001；433115-123.
Bussink J，et al.，Radiat Res.2000；154547-555.
Cevolani D，et al.，Brain Res Bull.2001；54353-361.
Chen M，et al.，J Neurosci.2003；238568-8577.
Chen M，Simard JM.J Neurosci.2001；216512-6521Chen H.，et al.，J.Neurol.Sci.118，109-6(1993).
Choi I，et al.，Mol Cell Endocrinol.2001；181139-150.
Cress AE.Biotechniques.2000；29776-781.
Dalton S，et al.，Glia.2003；42325-339.
Dhandapani K，et al.，Endocrine.2003；2159-66.
Dhandapani KM，et al.，Biol Reprod.2002；671379-1385.
Dhandapani KM，et al.，BMC Neurosci.2002；36.
Diab A，et al.，Infect Immun.1999；672590-2601.
Doerfler，A.，et al.，Stroke 32，2675-2681(2001).
Drain P，et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 1998；9513953-13958.
Dubik D et al.，Oncogene.1992；71587-1594.
El Ashry D，et al.，J Steroid Biochem Mol Biol.1996；59261-269.
Enkvetchakul D，et al.，Biophys J.2000；782334-2348.
Falk EM，et al.，Pharmacol Biochem Behav.2002；72617-622.
Fischer S，et al.，J Cell Physiol.2004；198359-369.
Foy MR，et al.，Brain Res.1984；321311-314.
Fujita A，et al.，Pharmacol Ther.2000；8539-53.
Garcia-Estrada J，et al.，Brain Res.1993；628271-278.
Garcia-Ovejero D，et al.，J Comp Neurol.2002；450256-271.
Garcia-Segura LM，et al.，Prog Neurobiol.2001；6329-60.
Garlid KD，et al.，Circ Res.1997；811072-1082.
Giaccia AJ，et al.，Int J Radiat Oncol Biol Phys.1992；23891-897.
Gribble，F.M.& Reimann，F.Diabetologia 46，875-891(2003).
Grover GJ.Can J Physiol Pharmacol.1997；75309-315.
Guo XZ，et al.，Cell Res.2001；11321-324.
Hainsworth et al.，Neuropharmacology.2001；40784-791.
Hale LP，et al.，Am J Physiol Heart Circ Physiol.2002；282H1467-H1477.
Halstead J，et al.，J Biol Chem.1995；27013600-13603.
Harder et al.，Am J Physiol.1994；266H2098-H2107.Haruna T，et al.，PflugersArch.2000；441200-207.
Haug A，et al.，Arch Toxicol.1994；681-7.
Higashijima T，et al.，J Biol Chem.1990；26514176-14186.
Higgins CF.Annu Rev Cell Biol.1992；867-113.
Hiroi H，et al.，J Mol Endocrinol.1999；2237-44.
Hobbs MV，et al.，J Immunol.1993；1503602-3614.
Hogg et al.，FEBS Lett.2002；522125-129.
Hogg et al. Lung.2002；180203-214.
Hohenegger M，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1998；95346-351.
Honda K，et al.，J Neurosci Res.2000；60321-327.
Hossain MA，et al.，J Biol Chem.2000；275278 74-27882.
Hua Y，et al.，J Cereb Blood Flow Metab.2003；231448-1454.
Hunt RA，et al.，Hypertension.1999；34603-608.
Huovinen R，et al.，Int J Cancer.1993；55685-691.
Ignotz RA，et al.，J Cell Biochem.2000；78588-594.
Inagaki N，et al.，Neuron.1996；161011-1017.
Isomoto S，et al.，J Biol Chem.1996；27124321-24324.
Jain，Sci.Amer.27158-65，1994.
Jorgensen MB，et al.，Exp Neurol.1993；12070-88.
Jovanovic A，et al.，Lab Invest.1998；781101-1107.
Kakinuma Y，et al.，Clin Sci(Lond).2002；103 Suppl 48210S-214S.
Kangas L.Cancer Chemother Pharmacol.1990；278-12.
Kangas L.J Steroid Biochem.1990；36191-195.
Kanthasamy A，et al.，Neuroscience.2002；114917-924.
Karschin，C.，et al.，FEBS Lett.401，59-64(1997).
Kawamura，S.，et al.，Acta Neurochir.(Wien.)109，126-132(1991).
Kay et al.，J Neurosci Methods.1986；16227-238.
Ke C，et al.，Neurosci Lett.2001；30121-24.
Kelly MJ，et al.，Steroids.1999；6464-75.
Kennedy AS，et al.，Int J Radiat Oncol Biol Phys.1997；37897-905.
Kielian T，et al.，J Immunol.2001；1664634-4643.
Kimura D.Sci Am.1992；267118-125.
Kohshi K，J Neurol Sci.2003；209115-117.
Koster JC，J Gen Physiol.1999；114203-213.
Kucich U，et al.，Arch Biochem Biophys.2000；374313-324.
Kuiper GG，et al.，Endocrinology.1997；138863-870.
Kuiper GG，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1996；935925-5930.
Larsson O，et al.，Diabetes.2000；491409-1412.
Lawson K.Kidney Int.2000；57838-845.
Le Mellay V，et al.，J Cell Biochem.1999；75138-146.
Leaney JL，Tinker A.Proc Natl Acad Sci USA.2000；975651-5656.
Li，P.A.，et al.，Neurosci.Lett.177，63-65(1994).
Lieberherr M，et al.，J Cell Biochem.1999；7450-60.
Liss B，Roeper J.Mol Membr Biol.2001；18117-127.
Liu Y，et al.，Circulation.1998；972463-2469.
Mateo J，et al.，Biochem J.2003；376537-544.
Mathews et al.，J Neurosci Methods.2000；10243-51.
McNally JG，et al.，Methods.1999；19373-385.
Meyer，M.，et al.，Br.J.Pharmacol.128，27-34(1999).
Moon RC，Constantinou AI.Breast Cancer Res Treat.1997；46181-189.
Moyer et al.，J Neurosci Methods.1998；8635-54.
Munoz A，et al.，Stroke. 2003；34164-170.
Murayama T，et al.，J Cell Physiol.1996；169448-454.
Murphy K，et al.，Mol Pharmacol.2003；，in press.
Nakabayashi，K.et al.AJNR Am.J.Neuroradiol.18，485-491(1997).
Nichols CG，et al.，Science.1996；2721785-1787.
Oehmichen M，et al.，Exp Toxicol Pathol.2000；52348-352.
Oehmichen M，et al.，Neurotoxicology.2001；2299-107.
Olive PL，et al.，Br J Cancer.2000；83l525-1531.
Paczynski RP，et al.，Stroke.2000；311702-1708.
Paech K，et al.，Science.1997；2771508-1510.
Panten U，et al.，Biochem Pharmacol.1989；381217-1229.
Papadopoulos MC，et al.，Mt Sinai J Med.2002；69242-248.
Perillan PR，et al.，J Biol Chem.2002；2771974-1980.
Perillan PR，et al.，Glia.1999；27213-225.
Perillan PR，et al.，Glia.2000；31181-192.
Phillips MI，Zhang YC.Methods Enzymol.2000；31346-56.
Piiper A，et al.，Am J Physiol.1997；272G135-G140.
Pogue BW，et al.，Radiat Res.2001；15515-25.
Proks P，et al.，J Physiol.1999；514(Pt 1)19-25.
Qiu J，et al.，J Neurosci.2003；239529-9540.
Rama Rao KV，et al.，J Neurosci Res.2003；74891-897.
Rama Rao KV，et al.，Neuroreport.2003；142379-2382.
Ramirez VD，Zheng J.Front Neuroendocrinol.1996；17402-439.
Raucher D，et al.，Cell.2000；100221-228.
Robinson AP，et al.，Immunology.1986；57239-247.
Robinson SP，et al.，Eur J Cancer Clin Oncol.1988；241817-1821.
Rohacs T，et al.，J Biol Chem.1999；27436065-36072.
Rossignol F，et al.，Gene.2002；299135-140.
Ruknudin A，et al.，J Biol Chem.1998；27314165-14171.
Ruscher K，et al.，J Neurosci.2002；2210291-10301.
Russo J，et al.，IARC Sci Publ.1990；47-78.
Russo J，Russo IH.Lab Invest.1987；57112-137.
Saadoun S，et al.，Br J Cancer.2002；87621-623.
Schubert P，et al.，Ann NY Acad Sci.2000；90324-33.
Seidel et al.，Cell Tissue Res.1991；265579-587.
Seino，S.Annu.Rev.Physiol 61，337-362(1999).
Semenza GL.Biochem Pharmacol.2000；5947-53.
Shaywitz BA，et al.，Nature.1995；373607-609.
Shyng S，et al.，J Gen Physiol.1997；110643-654.
Singer CA，et al.，J Neurosci.1999；192455-2463.
Singh M，et al.，J Neurosci.1999；191179-1188.
Smith SS，et al.，Brain Res.1987；42240-51.
Smith SS，et al.，Brain Res.1988；475272-282.
Sohrabji F，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1995；9211110-11114.
Stone DJ，et al.，J Neurosci.1998；183180-3185.
Streit WJ，et al.，Prog Neurobiol.1999；57563-581.
Sun MC，et al.，J Neurosurg.2003；98565-569.
Sylvia VL，et al，J Steroid Biochem Mol Biol.2000；73211-224.
Teixeira C，et al.，Cancer Res.1995；553902-3907.
Thrash-Bingham CA，et al.，J Natl Cancer Inst.1999；91143-151.
Toker A.Curr Opin Cell Biol.1998；10254-261.
Toomey，J.R.et al.Stroke 33，578-585(2002).
Toran-Allerand CD.J Steroid Biochem Mol Biol.1996；56169-178.
Torner L，et al.，J Neurosci.2001；213207-3214.
Treherne，J.M.& Ashford，M.L.Neuroscience 40，523-531(1991).
Tucker SJ，et al.，EMB0 J.1998；173290-3296.
Tucker SJ，et al.，Nature.1997；387179-183.
U.S.Patent 5,637,085U.S.Patent 6,391,911Vogel et al.，Stroke.1999；301134-1141.
Wallace W，et al.，Biotechniques.2001；311076-8，1080，1082.
Wang JY，et al.，Glia.2000；32155-164.
Wang YL.Methods Cell Biol.1998；56305-315.
Wass，C.T.& Lanier，W.L.Mayo Clin.Proc.71，801-812(1996).
Wiesener MS，et al.，FASEB J.2003；17271-273.
WO 03/079987Woolley CS.Curr Opin Neurobiol.1999；9349-354.
Xie LH，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1999；9615292-15297.
Yajima Y，et al.，Endocrinology.1997；1381949-1958.
Young，W.& Constantini，S.The Neurobiology of Central Nervous System Trauma.Salzman，S.K.& Faden，A.I.(eds.)，pp.123-130(Oxford University Press，New York，1994).
Zhang L，et al.，Brain Res Mol Brain Res.2002；1031-11.
Zhang Y，et al.，J Neurosci.2001；21RC176.
Zheng J，Ramirez VD.J Steroid Biochem Mol Biol.1997；62327-336.
Zunkler，B.J.，et al.，Biochem.Pharmacol.67，1437-1444(2004).
尽管已经详细描述了本发明及其优势，应当理解在此可以进行各种改变、置换和替换而没有脱离所附权利要求限定的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不限于说明书中所述过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方案。正如本领域技术人员从本发明的公开内容将容易地认识到，根据本发明可以使用现有的或之后待发展的执行基本上相同的动能或获得与在此所述的相应实施方案基本上相同结果的过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。因此，所附的权利要求旨在其范围内包括这样的过程、仪器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。
权利要求
1.治疗患者过度增殖性疾病的方法，包括将适量有效激活神经元细胞、神经胶质细胞或神经内皮细胞中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
2.权利要求1的方法，其中通道的激活导致钠离子(Na+)流入，引起细胞的去极化。
3.权利要求2的方法，其中Na+的流入改变了渗透梯度，引起水流入细胞中。
4.权利要求3的方法，其中水流入细胞中导致细胞毒性水肿。
5.权利要求4的方法，其中细胞毒性水肿导致坏死性细胞死亡。
6.权利要求1的方法，其中神经胶质细胞选自星形细胞、室管膜细胞、少突神经胶质细胞和小神经胶质细胞。
7.权利要求1的方法，其中过度增殖性疾病是肿瘤。
8.权利要求7的方法，其中肿瘤是良性或恶性肿瘤。
9.权利要求7的方法，其中肿瘤是神经瘤。
10.权利要求7的方法，其中肿瘤源自原发性脑肿瘤或转移性脑肿瘤。
11.权利要求7的方法，其中肿瘤是神经胶质瘤。
12.权利要求12的方法，其中神经胶质瘤选自星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、视神经胶质瘤和少突神经胶质瘤。
13.权利要求7的方法，其中肿瘤选自成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、脉络丛的乳头状瘤、转移瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤、淋巴瘤、先天性肿瘤、神经肉瘤、神经纤维瘤病、成神经细胞瘤、颅咽管瘤、松果体部位肿瘤和原始性神经外胚层肿瘤。
14.权利要求1的方法，其中通道具有以下特征(a)是35pS型通道；(b)受到浓度范围约10-8至约10-5M的细胞质Ca2+的刺激；(c)当细胞质ATP低于约0.8μM时打开；和(d)能透过单价阳离子K+、Cs+、Li+和Na+。
15.权利要求1的方法，其中激活剂化合物是选自二氮嗪、吡那地尔和cromakalin的1型磺酰脲受体激动剂。
16.权利要求1的方法，其中激活剂化合物选自3-异丙基氨基-7-甲氧基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(NNC 55-9216)；6，7-二氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 154)；7-氯-3-异丙基氨基-4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 73)；6-氯-3-异丙基氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NNC 55-0118)；6-氯-3-(1-甲基环丙基)氨基-4H-噻吩并[3，2-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(NN414)；3-(3-甲基-2-丁氨基)-4H-吡啶并[4，3-e]-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 44)；3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(4，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 62)；和3-(1′，2′，2′-三甲基丙基)氨基-4H-吡啶并(2，3-e)-1，2，4-噻二嗪1，1-二氧化物(BPDZ 79)。
17.权利要求1的方法，进一步包括给予患者抗癌治疗。
18.权利要求17的方法，其中抗癌治疗是化疗、放疗、免疫治疗、外科手术或其组合。
19.破坏患者脑中肿瘤周围的肿瘤-脑屏障完整性的方法，包括将有效激活神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
20.权利要求19的方法，进一步包括给予患者抗癌治疗。
21.权利要求20的方法，其中抗癌治疗是化疗、放疗、免疫治疗或其组合。
22.权利要求19的方法，其中激活剂化合物是选自二氮嗪、吡那地尔和cromakalin的1型磺酰脲受体激动剂。
23.诱导神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合的细胞死亡的方法，包括将有效激活所述细胞中NCCa-ATP通道的化合物给予细胞。
24.权利要求23的方法，其中神经胶质细胞选自星形细胞、室管膜细胞、少突神经胶质细胞和小神经胶质细胞。
25.权利要求23的方法，其中通道的激活导致Na+的流入，由此改变了渗透梯度，引起水流入细胞中，导致细胞毒性水肿。
26.权利要求25的方法，其中细胞毒性水肿导致细胞死亡。
27.一种药物组合物，包括血栓溶解剂、抗凝血剂、抗血小板剂、他汀类药物、利尿剂、血管扩张剂或其可药用盐和抑制NCCa-ATP通道的化合物或其可药用盐。
28.权利要求27的药物组合物，其中通过1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂来抑制通道。
29.权利要求28的药物组合物，其中SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素和雌激素相关化合物。
30.权利要求27的药物组合物，其中血栓溶解剂是组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿尼普酶、瑞替普酶、替奈普酶或其任意组合。
31.权利要求27的药物组合物，其中抗血小板剂是阿司匹林。
32.权利要求27的药物组合物，其中抗凝血剂是华法林或香豆定。
33.权利要求27的药物组合物，其中血管扩张剂是硝酸甘油。
34.权利要求27的药物组合物，其中药物组合物是神经保护性的。
35.含有源自表达NCCa-ATP通道的内皮细胞的膜制剂的组合物，其中通道受到1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂的阻断。
36.权利要求35的组合物，其中通道具有以下特征(a)是35pS型通道；(b)受到浓度范围约10-8至约10-5M的细胞质Ca2+的刺激；(c)当细胞质ATP低于约0.8μM时打开；和(d)能透过单价阳离子K+、Cs+、Li+和Na+。
37.权利要求35的组合物，其中SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素和雌激素相关化合物。
38.权利要求35的组合物，其中SUR1拮抗剂增大了其中可以给药血栓溶解剂的治疗窗。
39.治疗患者急性脑缺血的方法，包括将适量的血栓溶解剂或其可药用盐联合适量抑制NCCa-ATP通道的化合物或其可药用盐给药于患者。
40.权利要求39的方法，其中通道在神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合上表达。
41.权利要求39的方法，其中通过1型磺酰脲受体(SUR1)拮抗剂来阻断通道。
42.权利要求41的方法，其中SUR1拮抗剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、那格列奈、美格列奈、咪格列唑、LY397364、LY389382、glyclazide、格列美脲、雌激素和雌激素相关化合物。
43.权利要求42的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约0.0001μg/kg/天至约20mg/kg/天。
44.权利要求43的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约0.01μg/kg/天至约100μg/kg/天。
45.权利要求43的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约100μg/kg/天至约20mg/kg/天。
46.权利要求43的方法，其中以推注来给药SUR1拮抗剂。
47.权利要求43的方法，其中以输注来给药SUR1拮抗剂。
48.权利要求43的方法，其中以推注结合输注来给药SUR1拮抗剂。
49.权利要求42的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约0.0001μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗。
50.权利要求49的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约0.01μg/kg/治疗至约100μg/kg/治疗。
51.权利要求49的方法，其中给药于患者的SUR1拮抗剂量为约100μg/kg/治疗至约20mg/kg/治疗。
52.权利要求39的方法，其中血栓溶解剂是组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿尼普酶、瑞替普酶、替奈普酶或其任意组合。
53.权利要求41的方法，其中SUR1拮抗剂阻断Na+流入细胞中，从而防止细胞的去极化。
54.权利要求41的方法，其中SUR1拮抗剂阻断Na+流入细胞中，从而防止细胞毒性水肿。
55.权利要求39的方法，其中治疗降低了出血转化。
56.权利要求39的方法，其中抑制NCCa-ATP通道的化合物增大了给药血栓溶解剂的治疗窗。
57.权利要求39的方法，其中治疗降低了神经元细胞和/或内皮细胞的细胞死亡。
58.降低中风患者死亡率的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
59.权利要求58的方法，其中化合物减小中风大小。
60.权利要求58的方法，其中化合物减轻了位于梗死周围组织中的水肿。
61.权利要求58的方法，进一步包括给予患者血栓溶解剂。
62.权利要求58的方法，进一步包括给予患者抗凝血剂或抗血小板剂。
63.权利要求62的方法，其中抗凝血剂或抗血小板剂是阿司匹林、华法林或香豆定。
64.权利要求58的方法，进一步包括给予患者他汀类药物、利尿剂或血管扩张剂。
65.权利要求58的方法，进一步包括给予患者甘露醇。
66.权利要求58的方法，其中消化道或非肠道给药化合物。
67.权利要求66的方法，其中消化道给药包括口服、口含、直肠或舌下给药。
68.权利要求66的方法，其中非肠道给药包括静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下、腹膜内或心室内给药。
69.权利要求66的方法，其中非肠道给药包括注射至脑实质中。
70.权利要求58的方法，其中将化合物局部或粘膜给药。
71.权利要求70的方法，其中局部给药包括经皮给药。
72.减轻患者梗死周围组织区域中水肿的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
73.维持患者脑脓肿周围的神经胶质膜囊完整性的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCAa-ATP通道的化合物给药于患者。
74.治疗处于发生中风风险中的患者的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
75.权利要求74的方法，其中患者正在接受心脏病的治疗。
76.权利要求75的方法，其中心脏病是心肌梗塞。
77.权利要求76的方法，其中治疗是血栓溶解剂。
78.权利要求74的方法，其中患者患有房颤或凝血障碍。
79.权利要求78的方法，进一步包括给药抗凝血剂联合有效抑制NCCa-ATP通道的化合物。
80.权利要求79的方法，其中抗凝血剂是华法林或香豆定。
81.权利要求74的方法，其中患者具有发生肺栓塞的风险。
82.权利要求74的方法，其中患者正在接受增加患者中风风险的治疗。
83.权利要求82的方法，其中治疗是外科手术。
84.权利要求83的方法，其中外科手术是血管手术或神经手术。
85.权利要求82的方法，其中治疗是脑/血管内治疗、血管造影术或支架放置。
86.治疗处于发生脑水肿风险中的患者的方法，包括将有效抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物给药于患者。
87.权利要求86的方法，其中患者患有动静脉畸形或肿块占位性病损。
88.权利要求86的方法，其中患者涉及提高脑外伤风险的活动。
89.诊断患者脑中神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；测量患者脑中标记SUR1拮抗剂的水平，其中患者脑中标记SUR1拮抗剂的存在表明脑中的神经元细胞水肿和/或细胞毒性损伤。
90.确定患者脑肿瘤边界的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中患者脑中标记SUR1拮抗剂的存在表明脑肿瘤的边界。
91.权利要求90的方法，其中脑肿瘤是转移性肿瘤。
92.权利要求90的方法，其中通过正电子发射断层(PET)扫描来显现。
93.测定患者中风后半影的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中标记SUR1拮抗剂的存在表明患者中风后的半影。
94.监测中风神经疾病的方法，包括标记SUR1的拮抗剂；将标记的SUR1拮抗剂给药于患者；显现患者脑中标记的SUR1拮抗剂，其中患者脑中标记SUR1拮抗剂的存在表明疾病的进展。
95.权利要求92的方法，其中每日进行显现。
96.神经保护性输液药盒，包括抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物和IV溶液。
97.权利要求96的输液药盒，其中化合物和溶液包含于相同的容器中。
98.权利要求96的输液药盒，其中化合物和溶液包含于不同的容器中。
99.权利要求98的输液药盒，其中含有化合物的容器包含于溶液的容器中。
100.权利要求96的输液药盒，进一步包括神经保护性推注药盒，其中推注药盒包括预先装载了抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物的注射器。
101.神经保护性药盒，包括抑制神经元细胞、神经胶质细胞、神经内皮细胞或其组合中NCCa-ATP通道的化合物和血栓溶解剂、抗凝血剂、抗血小板剂、利尿剂、他汀类药物或血管扩张剂。
102.权利要求101的药盒，其中血栓溶解剂是tPA。
103.权利要求101的药盒，其中抗凝血剂是华法林或香豆定。
104.权利要求101的药盒，其中抗血小板剂是阿司匹林。
105.权利要求101的药盒，其中血管扩张剂是硝酸甘油。
106.权利要求101的药盒，其中利尿剂是甘露醇。
全文摘要
本发明涉及靶向星形细胞、神经元或毛细血管内皮细胞的NC
文档编号A61K31/44GK101043891SQ200580035902
公开日2007年9月26日 申请日期2005年7月25日 优先权日2004年9月18日
发明者J·M·西马德, M·陈 申请人:巴尔的摩马里兰大学, 退伍军人事务部