专利名称：具抗微生物的防腐效果的用于静脉给药的稳定乳剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有防腐效果的用于静脉给药的稳定的水包油型乳剂组合物。特别是涉及具有防腐效果、用于静脉给药的丙泊酚(Propofol)的稳定的水包油型乳剂组合物。本发明的其它实施方案涉及用于静脉供养的油类和脂肪的具有防腐效果的水包油型乳剂组合物。本发明的另一实施方案涉及含有亲脂性药物和亲水性药物组合的具有防腐效果的水包油型乳剂组合物。本发明的又一实施方案涉及具有防腐效果的水包油型乳剂组合物，该组合物含有静脉用脂肪乳剂成分和亲水性/亲脂性药物。
用于静脉给药的组合物比那些准备用于其它给药方式(如口服剂型、外用剂型等)的组合物需要满足更严格的安全性要求。
背景和现有技术A静脉用丙泊酚乳剂组合物(Intravenous Propofol EmulsionCompositions)丙泊酚(即2，6-二异丙基苯酚)是一种公知的和广泛使用的静脉注射麻醉剂。丙泊酚是一种疏水性、不溶于水的油。为了克服溶解度问题，必须将其与增溶剂、表面活性剂和/或溶剂混合。
US-A-5637625(1997年6月10日发布，相当于1997年9月24日公布的EP-A-07996616)公开了丙泊酚的包裹磷脂的微滴制剂，该制剂无脂肪和甘油三酯，能提供更长时间的镇静作用且无脂肪过载。由于不含支持细菌生长的营养素，这些微滴制剂是抑菌和杀菌的(例如自灭菌)，因此其贮存期延长。转载以下来自US-A-5637625说明书的段落用于清楚的理解。
......“丙泊酚微滴的包裹材料可以选自在我的美国专利No.4,725,442(在此通过引用将其引入本文)第5-7栏中描述的脂类，特别是在A、B和C类中描述的磷脂。另外，所述微滴可以由在癸烷存在下能形成定向的单层和双层的某些单-甘油酯来包裹(Benz等人，Biochim.Biophys.Acta 394323-334，1975)。有用的单-甘油酯的例子包括，但不限于以下1-单棕榈酰基-(外消旋)-甘油(单棕榈酸甘油酯)；l-单辛酰基-(外消旋)-甘油(单辛酸甘油酯)；1-单油酰基-(外消旋)-甘油(C181，顺-9)(单油酸甘油酯)；1-单硬脂酰基-(外消旋)-甘油(单硬脂酸甘油酯)”......
......“包有稳定磷脂单层的大约0.1μm直径的油状药物小滴的包裹磷脂的微滴描述于我的早期专利美国专利No.4,622,219和4,725,442中，在此通过引用引入它们的公开内容。微滴制剂已用于许多化合物，包括甲氧氟烷、异氟烷和维生素E。本发明提供一种微滴丙泊酚制剂，该制剂允许在无脂肪的情况下给予丙泊酚。”......
在这篇美国专利中描述的微滴组合物不含任何脂肪，因此不支持任何微生物的生长。但是，注射也变得痛苦难忍。
丙泊酚注射剂通常通过在油中稀释丙泊酚，然后配制成水包油型乳剂而制成。下面将结合进油相并制成用于静脉给药的水包油型乳剂的丙泊酚组合物称为“静脉用丙泊酚乳剂组合物”。
下面将用于全胃肠外营养的静脉用脂肪乳剂称为“静脉用脂肪乳剂组合物”。
丙泊酚/大豆油乳剂广泛应用于麻醉的诱导和/或维持、监控麻醉护理的维持和重症监护室(ICU)中的镇静。其优势在于它麻醉起效快，且恢复时间短。
但是，植物油和磷脂的存在使乳剂极易因偶然的外源性污染而产生微生物生长的危险，尤其是在接受ICU镇静作用的患者中长期使用期间。
静脉用丙泊酚乳剂组合物正逐渐用于重病患者、特别是ICU中的患者的镇静作用，其中连续地输注所述组合物。在ICU患者中经常观察到医院获得性(即医院得到的)感染。全静脉营养乳剂补充剂通过输注装置给药时，其微生物污染被认为是ICU患者发生医院获得性感染的主要原因之一。因此，建议经常更换静脉给药装置，至少每6或12小时进行更换。连续输注使药品容易生长微生物。
为了减少不受控制的微生物生长的危险，已经尝试将各种可能的防腐剂加入静脉用丙泊酚乳剂组合物。发现一些可能的试剂会导致所述乳剂不稳定。其它可能的试剂不能提供所需的抗菌活性水平。必须用在尽可能低的浓度能提供所需抗菌活性水平的防腐剂保存所述组合物，以使物理不稳定的可能性减到最小和使毒性的忧虑减到最小。
EP-A-0814787(1998年1月7日公布；相当于1998年2月3日发布的US-A-5714520)公开了一种含有依地酸盐作为抗菌剂的丙泊酚水包油型乳剂。依地酸盐的含量优选以重量计不超过0.1％，但通过试验测定足以阻止金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 8739)绿脓假单胞菌(ATCC 9027)和白色念珠菌(ATCC 10231)中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍，其中所述试验中，在20-25℃范围的温度下将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落-形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，在该温度范围培养并测试24小时后所述生物体的活菌计数。目前销售的制剂包含1％w/v丙泊酚、10％w/v大豆油、1.2％w/v作为乳化剂的卵磷脂、2.25％w/v甘油和0.0055％w/v依地酸二钠、氢氧化钠和注射用水。
已经显示依地酸盐会延迟、但不能阻止丙泊酚乳剂中微生物生长的开始(参见下文的WO-A-00/24376)。需要将丙泊酚乳剂组合物稀释多至5次(1∶4)用于长期输液。稀释物中依地酸盐的浓度减少至0.0011％。发现0.0025％及以下浓度的依地酸盐在防止广谱微生物生长不超过10倍的增加中无效(参见下文的US-A-6028108)。
在该制剂中作为防腐剂的依地酸盐是去除诸如锌的必需微量元素的金属离子螯合剂。这可能对长期持续给予丙泊酚的患者具有潜在危险，因为它会导致某些个体缺锌。即使该产品的制造商也建议采取补锌治疗以克服这种不良反应。
WO-A-99/39696(1999年8月12日公布；相当于2002年10月22日发布的US-A-6469069)公开了一种含有亚硫酸盐作为抗菌剂的丙泊酚水包油型乳剂。亚硫酸盐的优选含量以重量计在0.0075％-0.66％的范围内，并且通过试验测定足以防止金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 8739)绿脓假单胞菌(ATCC 9027)和白色念珠菌(ATCC 10231)中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍，所述试验中，将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落-形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在30-35范围的温度下培养，然后测试24小时后所述生物体的活菌计数。亚硫酸盐的使用有两个问题，即(a)影响所述乳剂的稳定性和(b)在略微高的剂量水平下亚硫酸盐是潜在毒性物质。
在所述水包油型乳剂中，所提到的不与水混溶的溶剂是甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。溶剂的优选含量以重量计为5-25％。
按照WO-A-99/39696/US-A-6469069的优选组合物在以50μg/kg/分钟的速度输注24小时会导致亚硫酸盐浓度接近毒性水平。此外，所述组合物可引起过敏性反应，因为已报道亚硫酸盐分子和所述组合物在曝光时是物理和化学不稳定的(参见Han J等人，InternationalJournal of Pharmaceutics 2001，215(1-2)207-220 & Baker MT等人，Anesthesiology 2002，97(5)1162-1167)。
US-A-6028108(2000年2月22日发布；相当于2000年4月27日公布的WO-A-00/23050)公开了含有三胺五乙酸盐作为抗菌剂的丙泊酚水包油型乳剂。三胺五乙酸盐的优选含量以重量计为0.0005％-0.1％，足以防止在偶然的外来污染后金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 8739)、绿脓假单胞菌(ATCC 9027)和白色念珠菌(ATCC 10231)中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍。
此中使用的三胺五乙酸盐是指二亚乙基三胺五乙酸盐或“DTPA”以及其衍生物。通常，合适的DTPA衍生物是指那些对DTPA比钙具有更低亲合力的盐。具体的衍生物包括但不限于三胺五乙酸一钙三钠。
在该制剂中作为防腐剂的三胺五乙酸盐是去除诸如钙、镁和锌的阳离子的金属离子螯合剂。这会对长期持续给予丙泊酚的患者有潜在的危险。
WO-A-00/24376(2000年5月4日公布；相当于US-A-6140373和US-A-6140374，二者均发布于2000年10月31日)公开了一种含有抗菌剂的丙泊酚水包油型乳剂，其中抗菌剂选自(a)苯甲醇，单独或优选与依地酸钠或苯甲酸钠一起，以及(b)苄索氯铵。优选地，所述组合物包含0.1-5.0％重量的丙泊酚；1-30％重量的植物油，优选大豆油；0.2-2％重量的表面活性剂，优选卵磷脂；2-3％重量的甘油；和抗菌剂，所述抗菌剂选自(i)0.0175-0.9％重量的苯甲醇，(ii)0.07-0.9％重量的苯甲醇和0.005％重量的依地酸钠，(iii)0.01-0.1％重量的苄索氯铵，以及最优选(iv)0.0175-0.9％重量的苯甲醇和0.07％重量的苯甲酸钠。
在此水包油型乳剂中所涉及的不与水混溶的溶剂是中链或长链脂肪酸的酯，例如甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。溶剂的优选用量以重量计为10-20％。
对于长期使用，不推荐诸如苯甲醇和苄索氯铵的抗菌剂，因为它们是有毒的。
WO-A-00/56364(2000年9月28日公布；相当于2001年1月23日发布的US-A-6177477)公开了水包油型乳剂形式的含有丙泊酚的用于肠胃外给药的无菌药物组合物，其中含有氨丁三醇(即2-氨基-羟甲基-l，3-丙二醇)作为抗菌剂，氨丁三醇的含量足以防止偶然外来污染后至少24小时内微生物的显著生长。优选地，所述氨基丁三醇以重量计为0.15％-0.25％的量存在。该组合物的pH值为高度碱性，在长期储存中将使磷脂和丙泊酚降解。
此外，已知氨丁三醇会在注射剂部位引起外渗并可造成组织损伤，并且还报道会引起呼吸阻抑。
WO-A-00/59471(2000年10月12日公布；相当于2000年8月8日发布的US-A-6100302)公开了含有降低水平的大豆油、脂肪或甘油三酯的静脉注射麻醉用的丙泊酚乳剂。该制剂优选由直径在160-200纳米的包裹磷脂的微滴组成。这些微滴含有溶于溶剂(如植物油)中并由磷脂稳定层包围的丙泊酚球体。据报道这种制剂可以长期安全地提供镇静作用，并且含有丙泊酚的低油浓度乳剂提供了稳定的水包油乳剂，以及，还出乎意料地表现出与含有防腐剂且含不与水混溶溶剂浓度较高的乳剂相当的抗菌性能。
通常地，所述乳剂包含以重量计为0.1-5％、优选以重量计为1％-2％的丙泊酚。所述不与水混溶的溶剂(优选大豆油)在组合物中的适宜含量为0.1-3％(以重量计)，更适宜的含量为1-3％(以重量计)。但是，含油量的减少使注射更痛苦，因为水相中存在游离的丙泊酚。
WO-A-00/59475(2000年10月12日公布；相当于2002年5月7日发布的US-A-6383471)描述了包含具有至少一种离子化官能团和载体的疏水性治疗剂的药物组合物。所述载体包括能离子化官能团的离子化剂、表面活性剂和任选的增溶剂、甘油三酯，和中和剂。它还描述了一种制备此类组合物的方法，即通过提供离子化的疏水性治疗剂、离子化剂和表面活性剂的组合物，和用中和剂中和一部分离子化剂。该组合物特别适用于口服剂型并且可装入胶囊或通过在颗粒载体上包衣来制成剂型。还可以将它们配制成溶液、乳膏剂、洗剂、软膏、栓剂、喷雾剂、气溶胶、糊剂或凝胶。可供选择的剂型可通过选自口服、非肠道、局部、透皮、眼部、肺部、阴道、直肠和透过粘膜的途径来给药。
所列举的用于该组合物的表面活性剂包括甘油单酯，具体提到的是甘油一月桂酸酯；列举的治疗剂包括丙泊酚，但没有任何含甘油单酯或含丙泊酚组合物的示例。
在上述讨论的现有技术的组合物中据信只有两种产品(一种具有依地酸盐，另一种具有偏亚硫酸氢盐)是已商品化。因此，有必要开发出一种具有改进防腐效果的静脉用丙泊酚乳剂组合物。
B静脉用脂肪乳剂组合物(Intravenous Fat EmulsionCompositions)含有乳化植物油的静脉用脂肪乳剂组合物已在临床使用了近四十年。起初将这些组合物引入是为了向不能摄取食物的患者提供卡路里来源。全静脉营养补充剂(total intravenous nutrition supplements)是水包油型乳剂。随着患者营养需求的提高，这些静脉用油类供养乳剂组合物也被不断改进。
JP-A-58-230918(在下文的US-A-5874470中提及)描述了一种用于口服和非口服的含有二十碳五烯酸的乳剂。所述乳剂含有1-40％w/v的二十碳五烯酸或优选其甲酯或乙酯；1-30％w/v的植物油(优选大豆油)；0.01-30％w/v的α-生育酚；和0.1-5％w/v的作为乳化剂的磷脂(优选蛋黄和/或大豆磷脂)；以及0.1-10％w/v的非离子型合成乳化剂。
DE-A-3409793(1984年9月20日公布；相当于1991年7月23日发布的US-A-5034414)公开了一种用于输液的营养液体乳剂，其包含至少一种C20-22脂肪酸或其酯或其混合物、植物油、乳化剂和水。据报告具有抗血栓和抗动脉硬化活性以及营养价值。在优选情况下，所述组合物包含5-20％w/v的所述脂肪酸或酯、1-19％w/v的植物油、1-2％w/v的乳化剂和1-5％w/v的乳化稳定剂。所述植物油优选大豆油和/或红花油，和所述乳化剂优选蛋黄或大豆磷脂。
EP-A-0145873(1985年6月26日公布)公开了一种含有脂肪、乳化剂和水的输液乳剂并计划作为营养补充剂。该脂肪相由10-50％w/v的α-亚麻酸酯，优选甘油三酯或乙酯组成。脂肪的平衡可以是植物油，优选红花油或大豆油。
EP-A-0311091(1989年4月12日公布；相当于1999年2月23日发布的US-A-5,874,470)公开了加入ω-3-脂肪酸、ω-6-脂肪酸和中链甘油三酯的等渗脂肪乳剂。所述乳剂计划用于后攻击代谢中、在慢性炎症疾病的情况下和在新生儿科和小儿科中的肠胃外给药，并且可以提供肝脏保护效果。由于ω-3-脂肪酸和/或其生理上可接受的酯与中链甘油三酯的组合，中链甘油三酯将优先在生物体中被氧化，而防止了ω-3-脂肪酸的快速氧化，以使它们能更多地用于三重不饱和类花生酸的形成。该乳剂具有5-30％的总脂肪含量以及占脂肪含量5-12％的乳化剂含量。乳化剂优选磷脂，甘油可用作等渗剂，乳剂的优选pH值是6-9。
这里没有提及抗菌剂的存在；唯一提到的防腐剂是用于ω-3-脂肪酸组分的抗氧化剂。
这样的全静脉营养制剂补充剂都不能防止由外来污染产生以及导致感染的可能的微生物生长。因此需要改进这样的产品，并克服静脉用脂肪乳剂组合物特别是商品化销售制剂的缺点。
发明目的本发明的主要目的是提供用于静脉给药的无菌、稳定的药用水包油型乳剂，所述乳剂不支持以下组合物中的显著的微生物生长(a)亲脂性药物(尤其是丙泊酚)的组合物，用于静脉给药的(b)用于静脉供养的油类和脂肪的组合物和(c)亲脂性药物和亲水性药物和/或用于静脉供养的油类和脂肪的组合物。
更特别地，本发明的目的是提供具有防腐效果的水包油型乳剂组合物，所述防腐效果达到的程度是在偶然的外来污染后绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和白色念珠菌(Candida albicans)中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍。
本发明概述根据本发明的一个方面，在此提供用于静脉给药的无菌水包油型乳剂组合物，其中含有作为抗菌防腐剂的甘油单酯，优选甘油一月桂酸酯。优选地，甘油单酯含量足以防止在偶然的外来污染后白色念珠菌ATCC 10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538中每种微生物培养物在至少24小时生长的增加不超过10倍。微生物生长通过以下试验进行测定将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在20-25℃范围的温度下培养白色念珠菌的培养物，在30-35℃范围的温度下培养其余微生物，然后测试24小时后所述生物体的活菌计数，其中甘油单酯含量不超过由含有1.5％w/v甘油一月桂酸酯的组合物所得到的对抗所述培养物的抗菌当量(antimicrobial equivalent)。
用于所述静脉给药的组合物的甘油单酯优选甘油一月桂酸酯(Monolaurin)。
本发明详述甘油单酯在静脉给药组合物中的量通常为含有高达1％w/v甘油一月桂酸酯、优选高达0.5％w/v甘油一月桂酸酯、更优选高达0.1％w/v甘油一月桂酸酯的组合物得到的对抗所述培养物的抗菌当量。
在一个实施方案中，本发明的静脉给药组合物用于全胃肠外营养；在另一实施方案中，它是含有亲脂性药物(尤其是丙泊酚)的药剂。
亲脂性药物的含量通常是所述组合物的0.001％w/v至10％w/v，优选0.01％-5％w/v，更优选0.1％-2％w/v。
通常，甘油单酯(以甘油一月桂酸酯计算)与亲脂性药物之比以重量计为1∶0.01至1∶5000，优选以重量计为1∶0.2至1∶1000，更优选以重量计为1∶4至1∶200，尤其是1∶20至1∶100(以重量计)。
通常，本发明的可静脉给药的组合物包含至少一种甘油三酯油和至少一种磷脂。
优选地，所述至少一种甘油三酯油选自天然植物油和合成MCT(中链的甘油三酯)油，并且甘油三酯油(一种或多种)的含量不超过所述组合物的30％w/v，更优选5％w/v至20％w/v，尤其是大约10％w/v或大约20％w/v。优选的甘油三酯油是大豆油。
优选地，所述至少一种磷脂选自纯化卵磷酯和纯化大豆磷脂并且所述磷脂(一种或多种)的含量是组合物的0.1％w/v至3％w/v，尤其是大约1.2％w/v。
通常，本发明的可静脉给药的组合物将包含至少一种等渗剂，优选甘油，并且所述组合物是与血液等渗的。
优选地，本发明的可静脉给药的组合物具有6-8.5之间的pH值，通过适量氢氧化钠的存在来方便地调节pH值。
在第二个方面，本发明提供甘油单酯在静脉给药用的无菌的水包油型乳剂组合物中作为抗菌剂(an antimicrobial agent)的用途。在这方面，静脉给药组合物的甘油单酯和/或其它组分可如上文第一个方面中所述。
在另一方面，本发明提供制备本发明的含有亲脂性药物的可静脉给药组合物的方法，所述方法包括以下步骤i)将甘油单酯和亲脂性药物溶解在保持在升高的温度的甘油三酯油中；ii)将磷脂加入并溶解在步骤i)制备的溶液中；iii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后加热所述水相；iv)在搅拌条件下，将步骤ii)的溶液加入至步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；和v)匀化步骤iv)得到的粗乳。
在又一方面，本发明提供一种制备本发明的静脉给药组合物的方法，所述方法包括以下步骤i)将甘油单酯和亲脂性药物(如果存在)溶解在保持在升高的温度的甘油三酯油中；ii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后加热所述水相；iii)将磷脂加入并分散在步骤ii)制备的水相中；iv)在搅拌条件下，将步骤i)的溶液加入至步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；和v)匀化步骤iv)得到的粗乳。
在上述提到的方法方面，优选所述匀化是达到小于500纳米的平均球径；过滤匀化的组合物；
将所得滤液装入容器，接着用氮气掩蔽并密封填充容器；和通过高压灭菌法消毒装满所述滤液的密封容器。
A静脉用丙泊酚乳剂组合物根据本发明的优选实施方案，在此提供用于静脉给药的无菌药用水包油型乳剂组合物，所述组合物包含(i)丙泊酚；(ii)一种或多种甘油三酯油一天然的例如植物油，或合成的例如MCT油；(iii)一种或多种天然存在的磷脂，例如纯化卵磷酯、大豆磷脂；(iv)等渗剂(一种或多种)，例如甘油；(v)甘油一月桂酸酯，其含量通过试验测定足以防止白色念珠菌ATCC 10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538中的每种微生物培养物在至少24小时生长的增加不超过10倍，试验中将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在20-25℃范围的温度下培养白色念珠菌，在30-35℃范围的温度下培养其余微生物，然后测试24小时后所述生物体的活菌计数，以及其中所述甘油一月桂酸酯的量不超过所述组合物的1％w/v。
该实施方案的一种优选的组合物包含大约1％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，大约0.05％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
该实施方案的另一优选的组合物包含大约2％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，
大约0.05％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
该实施方案的另一优选的组合物包含大约1％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，大约0.01％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
如上所述，丙泊酚乳剂组合物易受微生物污染，因此它们需要用防腐剂来保存，以使所述产品在偶然的外来污染情况下不支持微生物生长。因为所有抗菌剂都是有毒的，所以为了最大限度保护患者，防腐剂的浓度必需保持在能对生物体生长产生所需抑制作用的最低水平。
在上文引用的现有技术专利中，其中的五种是水包油乳化剂并且使用防腐剂。对这些组合物中防腐剂的要求是能提供如下程度的防腐效果，即在偶然的外来污染后，绿脓假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍，并且使用的防腐剂是安全的。
依地酸盐、三胺五乙酸盐和偏亚硫酸氢盐在酸性pH下可满足上述测试。但是，依地酸盐和三胺五乙酸盐消耗来自身体的锌，而偏亚硫酸氢盐长期使用是有害的。
苯甲醇、乙二胺四乙酸钠、苄索氯铵和苯甲酸钠被宽泛地分类为抗菌剂，与非防腐制剂相比，这些抗菌剂在24小时内可延迟生长的开始或减缓生长速度至小于1对数的增加。但是，它们长期使用是有毒的。
用作防腐剂的氨丁三醇在无菌静脉用脂肪乳剂中的用量足以防止外来污染后微生物在至少24小时生长的增加至少十倍。但是，它在注射部位引起外渗并可引起组织损伤，并且还引起呼吸阻抑。
丙泊酚
本发明的丙泊酚组合物通常包含0.01％-5％w/v的丙泊酚。优选地，所述组合物包含0.1％-2％w/v的丙泊酚。更优选地，所述组合物包含大约1％和大约2％w/v的丙泊酚。
甘油三酯在本发明的优选组合物中甘油三酯油(一种或多种)含量达到所述组合物的30％w/v，优选在所述组合物的5％-20％w/v范围内，更优选占所述组合物的大约10％w/v或大约20％w/v。
适用于本发明组合物的甘油三酯油包括天然油类例如植物油，或合成的油例如MCT油。通常，天然油是植物油并且优选选自大豆油、葵花油、红花油、花生油、棉籽油。合成油通常由化学和/或物理改性和/或精炼的植物油制成。MCT油是合成油的典型例子，是从Cocosnucifera L的胚乳的硬的、干燥部分提取的不挥发性油获得的。该不挥发性油经水解并蒸馏后产生所需脂肪酸，然后将脂肪酸再酯化以产生MCT油(中链的甘油三酯)。本发明还可包含一种或多种植物油和/或合成油的任何组合。大豆油是用于本发明组合物的优选天然植物油。
磷脂在本发明的优选组合物中，天然磷脂含量为所述组合物的0.1％-3％w/v范围，更优选在0.6％-1.5％w/v的范围，最优选大约1.2％w/v。
在本发明的水包油型乳剂组合物中，天然磷脂作为乳化剂用于稳定水包油型乳剂。所使用的优选天然磷脂是纯化卵磷酯或纯化大豆磷脂或其混合物。更优选地，所使用的天然磷脂是纯化卵磷酯。
在本发明中，除了磷脂外，优选不使用乳化剂。
众所周知，磷脂用于与水性介质水合以形成脂质体，它在本发明中用作乳化剂并用于稳定所述乳剂。它们在本发明中不用于形成脂质体组合物。
等渗剂(isotonic agents)本发明的组合物优选通过加入合适的张力调节剂如甘油、葡萄糖或甘露糖醇的方式而产生与血液的等渗。甘油是优选的张力调节剂。
甘油单酯醇甘油的脂肪酸酯被称为酰基甘油或甘油酯。它们是植物和动物细胞，特别是脊椎动物的脂肪细胞中贮存(或贮藏)脂肪的主要组分。当甘油的一个羟基用脂肪酸酯化时，将其称为单酰基甘油或甘油单酯。饱和脂肪酸包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸(arachadic acid)、木蜡酸。不饱和脂肪酸包括棕榈烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。优选的甘油单酯是甘油一月桂酸酯。
甘油一月桂酸酯(Monolaurin)US-A-5714520(上文)公开了为了有效，任何防腐剂的抗菌性能必须在水相中发挥。具有亲脂性质的防腐剂以通常使用水平加入时是没有效果的，因为虽然在相之间有一些分配，但水相中的浓度不足以发挥防腐效果。增加此类防腐剂的总量会造成脂质层中防腐剂水平高到不能接受的程度，至少会引起毒性问题。
US-A-6469069(上文)公开了防腐剂应可溶于水相并且不分配到有机相中。
与US-A-5714520和US-A-6469069的教导相反，现已令人惊讶地发现，非水溶性的月桂酸甘油单酯(甘油一月桂酸酯)在浓度低到0.01％时作为防腐剂是有效的。
使用甘油单酯(例如甘油一月桂酸酯)和中链脂肪酸(包括己酸、辛酸脂肪酸)组合的食品级材料用作食物、化妆品和药物制剂中的防腐剂，已在EP-A-0244144(1987年11月4日公布；相当于2003年10月28日发布的US-A-6638978)中描述并且在此引用。但是，这些组合物对于保存用于静脉给药的水包油型乳剂组合物是不相关的。
甘油一月桂酸酯在该系统中作为防腐剂提供防腐效果，其程度是在偶然的外来污染后绿脓假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中每种在至少24小时生长的增加不超过10倍，并且它是毒理学上安全的。
用于本申请的甘油一月桂酸酯是指分子式为C15H30O4且分子量大约274.4的月桂酸的药学上所有可接受的甘油酯。商品化甘油一月桂酸酯的其它名称，例如“外消旋-1-月桂酰基甘油”、“1-单十二烷酰基-外消旋-甘油”、“1-单月桂酰基-外消旋-甘油”、“外消旋-甘油1-月桂酸酯”和“DL-α-月桂酸甘油酯”。
月桂酸的1和2甘油单酯混合物，或其2-甘油单酯也是甘油一月桂酸酯。甘油一月桂酸酯可含有一些月桂酸甘油二酯。甘油一月桂酸酯的纯度并非关键，它应富含C12(月桂)脂肪酸但含有一定量的C10、C14等脂肪酸也是可接受的。
甘油一月桂酸酯表现出多晶型。已经报道α型、β’型和β型分别具有44℃、59.5℃和63℃的熔点。
用于本发明的甘油一月桂酸酯的性质不是关键的，只要它满足如果发生如上所述的偶然外来污染后能阻止微生物在至少24小时的显著生长的要求。用量的要求在一定程度上取决于所用甘油一月桂酸酯的性质。
甘油一月桂酸酯在水性介质中不溶，但是高度可溶于所谓脂肪溶剂，例如氯仿、苯、乙醇或丙酮。
当将甘油一月桂酸酯口服给予大鼠时，已报道LD50是大约53,000毫克/千克体重。
对于制药领域的技术人员显而易见的是，其它甘油单酯诸如单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单辛酸甘油酯、单油酸甘油酯等或其混合物可与甘油一月桂酸酯一起使用，并且其使用浓度优选能足以防止前述的微生物培养物生长的增加不超过1 0倍。对于制药领域的技术人员同样显而易见的是，乙氧基化或丙氧基化的甘油单酯也可用来防止前述的微生物培养物生长的增加不超过10倍。
甘油一月桂酸酯的HLB值小于10，因此它只适宜作为乳化剂或增溶剂来制备油包水型乳剂，而非水包油型乳剂。在本发明中少量使用作为防腐剂，而非作为乳化剂或作为增溶剂。
组合物通常，甘油一月桂酸酯以0.001％-1.5％w/v的浓度范围存在于本发明的组合物中。优选地，甘油一月桂酸酯在0.01％-1％w/v的范围存在，更优选0.01％-0.5％w/v。甘油一月桂酸酯最优选的浓度为所述组合物的0.01％w/v-0.1％w/v。
本发明的组合物还可以制成更高含量亲脂性药物和甘油一月桂酸酯并在给药时适当地稀释的浓缩物，例如可制成含有更高量的丙泊酚和甘油一月桂酸酯的乳剂浓缩物并在给药时适当地稀释。在此类组合物中的甘油一月桂酸酯与丙泊酚的重量比以重量计为1∶0.01至1∶5000，优选以重量计为1∶0.2至1∶1000，更优选以重量计为1∶4至1∶200，并且最优选以重量计为1∶20至1∶100。
本发明组合物的pH值通常在6至8.5之间，并且可根据需要使用碱例如氢氧化钠来调节。
本发明的典型的水包油型乳剂组合物包含大约1％w/v的丙泊酚大约10％w/v的大豆油大约1.2％w/v的纯化卵磷酯大约2.25％w/v的甘油大约0.01％w/v的甘油一月桂酸酯适量的氢氧化钠以调至所需的pH值水加至100％。
在另一组合物中，丙泊酚为大约2％w/v。
本发明的含有丙泊酚的组合物可以通过包括以下步骤的方法来制备i)将甘油一月桂酸酯和丙泊酚溶于保持在大约75℃的甘油三酯油(优选大豆油)中；ii)将乳化剂纯化卵磷酯加入并溶解在步骤i)制备的丙泊酚溶液中；iii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后将所述水相加热至大约70℃；iv)在搅拌条件下，将步骤ii)的丙泊酚溶液加入步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；v)将步骤iv)得到的粗乳匀化至小于500纳米的平均球径；vi)过滤在步骤v)结束时得到的所述组合物；vii)将在步骤vi)结束时得到的所述滤液装入诸如小瓶、安瓿之类的容器中，接着用氮气掩蔽并密封装满的容器；viii)通过高压灭菌法消毒装有所述滤液的密封容器。
另一种制备本发明含有丙泊酚的组合物的方法包括以下步骤i)将甘油一月桂酸酯和丙泊酚溶于保持在大约75℃的甘油三酯油(优选大豆油)中；ii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后将所述水相加热至大约70℃；iii)将乳化剂纯化卵磷酯加入并分散在步骤ii)制备的水相中；
iv)在搅拌条件下，将步骤i)的丙泊酚溶液加入至步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；v)将步骤iv)得到的粗乳匀化至小于500纳米的平均球径；vi)过滤在步骤v)结束后得到的所述组合物；vii)将在步骤vi)结束后得到的所述滤液装入诸如小瓶之类的容器中，接着用氮气掩蔽并密封装满的容器；viii)通过高压灭菌法消毒装有所述滤液的密封容器。
可以按照上述两种方法来制备含有其它亲脂性药物的组合物以及其中将丙泊酚替换为另外的亲脂性药物。
B静脉用脂肪乳剂组合物除了不含丙泊酚之外，本发明的另外的实施方案与丙泊酚实施方案(上文)相似。
该实施方案提供用于营养目的的静脉给药的静脉用脂肪乳剂，所述脂肪乳剂包含一种或多种甘油三酯油-天然的例如植物油，或合成的例如MCT油；一种或多种天然存在的磷脂，例如纯化的卵磷酯或大豆磷脂；和等渗剂(一种或多种)，如甘油；并且甘油一月桂酸酯的量通过试验测定要足以防止白色念珠菌ATCC 10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538中的每种微生物培养物在至少24小时生长的增加不超过10倍，所述试验中，将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在20-25℃范围的温度下培养白色念珠菌，在30-35℃范围的温度下培养其余微生物，然后测试24小时后所述生物体的活菌计数，其中所述的甘油一月桂酸酯的量不超过所述组合物的1％w/v。在前述的实施方案中指定的其它甘油单酯也可以用于替换甘油一月桂酸酯，其用量优选足以防止所述生物体的微生物培养物生长的增加不超过10倍。甘油一月桂酸酯是优选的甘油单酯，并且其它甘油单酯也可以与甘油一月桂酸酯联合使用，其用量应足以防止所述生物体的微生物培养物生长的增加不超过10倍。
对于不可能口服营养的患者，甘油三酯油能用作提供卡路里需要的来源。
可使用任何食用级油或脂肪或其混合物。其中一些还另外含有其它油类与一定量的多不饱和脂肪酸(PUFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和ω-3脂肪酸的混合物。
根据优选的实施方案，用于静脉给药的无菌药用水包油型脂肪乳剂组合物包含(i)一种或多种甘油三酯油-天然的例如植物油，或合成的例如MCT油；(ii)一种或多种天然存在的磷脂，例如纯化的卵磷酯、大豆磷脂；(iii)等渗剂(一种或多种)，例如甘油；(iv)甘油一月桂酸酯，其用量通过试验测定要足以防止白色念珠菌ATCC 10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538中的每种微生物培养物在至少24小时生长的增加不超过10倍，其中所述试验是将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在20-25℃范围的温度下培养白色念珠菌，在30-35℃范围的温度下培养其余微生物培养物，然后测试24小时后所述生物体的活菌计数，其中所述的甘油一月桂酸酯含量不超过所述组合物的1％w/v。
在上述关于含丙泊酚的实施方案中所述的优选情况同样应用于此实施方案。
优选地，甘油一月桂酸酯以组合物的0.001％-1％w/v的浓度范围存在于本发明的脂肪乳剂组合物中。
优选的脂肪乳剂组合物可以通过包括以下步骤的方法来制备i)将甘油一月桂酸酯溶解在保持在大约75℃的甘油三酯油、优选大豆油中；ii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后将所述水相加热至大约70℃；iii)将乳化剂纯化的卵磷酯加入并分散在步骤ii)制备的水相中；iv)在搅拌条件下，将步骤i)的甘油一月桂酸酯溶液加入步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；v)将步骤iv)得到的粗乳匀化至小于500纳米的平均球径；vi)过滤在步骤v)结束后得到的所述组合物；vii)将在步骤vi)结束得到的所述滤液装入诸如小瓶之类的容器中，接着用氮气掩蔽并密封装满的容器；
viii)通过高压灭菌法消毒装有所述滤液的密封容器。
C静脉用亲脂性药物乳剂组合物在本发明的另一实施方案中，任何其它亲脂性药物代替含丙泊酚实施方案中的丙泊酚。
属于不同组(如甾体类、抗真菌剂、麻醉剂、抗癌剂、精神治疗药、前列腺素、抗生素、脂溶性维生素)的很多亲脂性药物均可被结合进甘油三酯油中、进行乳化并有利地以水包油型乳剂的方式施用。
可以结合进静脉用乳剂组合物的一些此类药物包括例如黄体酮、氢化可的松、氢化泼尼松、倍他米松、伊曲康唑、克霉唑、两性霉素B、丙泊酚、苯佐卡因、利多卡因、紫杉醇、美法仑、环己亚硝脲、苯巴比妥、地西泮、前列地尔、卡前列素、地诺前列酮、迷索前列醇、米非司酮、克拉霉素、红霉素、氯霉素、地高辛、维生素A、维生素E。
因此，本发明还提供包含亲脂性药用物质的治疗用水包油型乳剂组合物，所述组合物还包含适量的甘油单酯，优选甘油一月桂酸酯，其浓度足以防止如果发生偶然外来污染后在至少24小时微生物的显著生长。
在上述关于含丙泊酚的实施方案中所述的优选情况同样应用于此实施方案。
D含亲脂性和亲水性药物的组合的乳剂组合物在本发明的另一实施方案中，亲脂性药物和亲水性药物的组合同样用甘油单酯(优选甘油一月桂酸酯)配制。
在上述关于亲脂性药物乳剂组合物的实施方案中所述的优选情况同样应用于此实施方案。所述亲水性药物例如包括盐酸奥丹亚龙、盐酸地尔硫卓、呋塞米、双氢氯噻嗪、盐酸利多卡因。
E药物与静脉用脂肪乳剂组合物的组合在本发明的另一实施方案中，所述组合物含有静脉用营养脂肪乳剂组合物和亲水性/亲脂性药物。
在这些组合物中，按照患者的需要同时提供营养需要和药物需要。例如，当静脉给予此类组合物时能满足手术后患者的镇静和营养的需要。
因此，还可以制备具有甘油一月桂酸酯的静脉给药组合物，其中油相包含亲脂性药物和/或营养性油类，而水相包含亲水性药物和/或水溶性营养素。
上述与脂肪乳剂组合物相关的优选条件设定同样应用于本实施方案。
此外，还可以制备含有甘油一月桂酸酯的静脉给药组合物，其中水相包含亲水性药物和/或水溶性营养素。
防腐效果的测试本发明组合物的防腐效果进行测试，其中将各白色念珠菌ATCC10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538的标准菌株的洗涤悬浮液以每毫升大约50-250个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中。按照美国药典第51章(U.S.P.<51>)中“Antimicrobial effectiveness testing(抗菌作用试验)”的建议，将所述等分试样在20-25℃的温度下进行真菌培养并在30-35℃进行细菌培养。接种后至少24小时能阻止每种所述生物体生长的增加不超过10倍的组合物被认为符合本发明的目标标准。
实施例现在将通过实施例的方式举例说明本发明。实施例只是举例说明的方式并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例中所用的材料和设备丙泊酚符合欧洲药典(Ph.Eur.)规范，甘油、氢氧化钠、注射用水符合印度药典(IP.)规范，豆油(大豆油符合U.S.P.规范，纯化卵磷酯(在实施例中称为卵磷酯)由M/s.Lipoid生产，甘油一月桂酸酯是从Sigma获得的外消旋混合物，使用实验室Remi搅拌器进行高速混合。使用高压APV匀化器均化乳剂。
实施例I-IV含有防腐剂甘油一月桂酸酯的丙泊酚水包油型乳剂组合物在表1中给出实施例I-IV的组成。
表1丙泊酚水包油型乳剂组合物Qty/100ml
通过以下方法以300毫升的量制备实施例I-IV的组合物。
油相的制备将豆油加热至70-75℃，加入甘油一月桂酸酯和丙泊酚并混合。然后将卵磷酯加入该豆油-丙泊酚混合物中并通过搅拌溶解。
水相的制备向注射用水中加入甘油，并用氢氧化钠溶液将pH值调至大约10.5。
乳化将油相加入到水相混合，并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到小于500纳米的所需的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶，并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
实施例V防腐效果的测定实施例I-IV的组合物的防腐效果使用以下步骤测试。
将用于防腐效果试验的大约50-250个菌落形成单位(cfu)/毫升的四个标准U.S.P.微生物，即金黄色葡萄球菌ATCC 6538、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和白色念珠菌ATCC 10231，接种到每个实施例的组合物中，并在32±2℃培养。24小时后测定试验微生物的活菌计数。
测定方法第1天1、将一个铂环量的来自保藏斜面的无污染(即外科无菌的)培养物接种到10毫升无菌的大豆-酪蛋白(Caesin)肉汤培养基中。
2、将接种的试管在32℃±2℃培养24小时。
第2天3、检查生长情况，然后将0.2毫升培养物加入到100毫升无菌的大豆-酪蛋白肉汤培养基中。
4、将接种后的培养基在32℃±2℃培养18小时。
第3天5、在32℃±2℃培养18小时后，检查生长情况，然后将10毫升培养肉汤转移到15毫升无菌的带螺盖的“V”离心管中。
6、将培养肉汤在5000rpm离心10分钟。
7、弃去上清液并通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在5毫升无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
8、将上述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第1次洗涤)。
9、通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在5ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
10、将所述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第2次洗涤)。
11、通过将内容物涡流3-4分钟，将小粒再次重新悬浮在5ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
12、制备0.1 O.D.-调节的细胞悬浮液。
13、使用无菌盐水(pH值7.2-7.4)进行7次十倍量的稀释。
14、用0.1毫升1∶103稀释的悬浮液接种试样(实施例I-IV的组合物)，因此所述接种试样含有50-250个cfu/毫升。
15、将试样在32℃±2℃培养24小时。
16、同样将0.1毫升1-104、-105、-106和-107稀释液表面-铺展在培养平皿上。将所述平皿在32℃±2℃培养24小时。培养后，计数平皿上的菌落数目并确定0.1 O.D.-调节的悬浮液的细胞密度。
第4天17、24-小时培养之后，进行试样的3次十倍量的连续稀释。
18、将0.1毫升试样(未稀释的)以及3次十倍量的连续稀释液试管表面-铺展在无菌的大豆-酪蛋白琼脂陪替氏平皿上。
19、将陪替氏平皿在32℃±2℃培养24小时。
第5天20、计数每个平皿的菌落数目并确定细胞密度。
观察结果提供在表2中。
表2
结论在48小时结束后观察到具有白色念珠菌的试样(实施例I-IV的组合物)中细胞计数不超过十倍增加，以及观察到对其它生物体的杀菌效果，表明组合物中甘油一月桂酸酯具有防腐效果。
实施例VI不含甘油一月桂酸酯的1％丙泊酚水包油型乳剂(比较实施例)除了丙泊酚的量是1g/100ml组合物以及不使用甘油一月桂酸酯之外，按照实施例I制备所述组合物。
实施例VII防腐活性的测定使用以下步骤对实施例III和VI的组合物进行测试以确定防腐活性。
用于测定防腐效果的步骤取每毫升大约50-250个菌落形成单位(cfu)的各白色念珠菌ATCC10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538，(即“抗菌作用试验”下规定的四个标准U.S.P.生物体培养物)分别加入到所述产品的各等分试样中，并在22℃±2℃(对于真菌培养物)和32℃±2℃(对于细菌培养物)培养。24小时和48小时后测定试验生物体的活菌计数。
针对真菌培养物的防腐效果测定方法第1天1、将一个铂环量的来自保藏斜面的无菌培养物接种到10毫升无菌的萨布罗氏葡萄糖肉汤培养基中。
2、将接种的试管在22±2℃培养24小时。
第2天3、检查生长情况，然后将1.0毫升培养物加入到100毫升无菌的萨布罗氏葡萄糖肉汤培养基中。
4、将接种后的培养基在22℃±2℃培养48小时。
第4天5、在22℃±2℃培养48小时后，检查生长情况，然后将10毫升培养肉汤转移到15毫升无菌的带螺盖的“V”离心管中。
6、将所述培养肉汤在5000rpm离心10分钟。
7、弃去上清液和通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在10毫升无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
8、将所述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第1次洗涤)。
9、通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在10ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
10、将所述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第2次洗涤)。
11、通过将内容物涡流3-4分钟，将小粒再次重新悬浮在5ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
12、制备能产生50％光学透射比的细胞悬浮液。
13、使用无菌盐水(pH值7.2-7.4)进行7次十倍量的稀释。
14、用0.1毫升1∶103稀释的悬浮液接种试样，因此所述接种试样含有50-250个cfu/毫升。
15、将试样在22℃±2℃培养24小时。
16、同样将0.1毫升1∶104、1∶105、1∶106和1∶107稀释的悬浮液液表面-铺展在培养平皿上。将所述平皿在22℃±2℃培养48小时。培养后，计数平皿上的菌落数目并确定接种入试样的细胞密度。
第5天17、24-小时培养之后，进行试样的3次十倍量的连续稀释。
18、将0.1毫升试样(未稀释的)以及3次十倍量的连续稀释液试管表面-铺开在无菌的萨布罗氏葡萄糖琼脂陪替氏平皿上。
19、在22℃±2℃将陪替氏平皿培养48小时。
第7天20、计数每个平皿的菌落数目并确定试样(接种24-小时后)中的细胞密度。
21、类似地，所述试样培养48-小时之后，进行3次所述试样的十倍量的连续稀释，将0.1毫升所述试样表面-铺开在无菌的萨布罗氏葡萄糖琼脂陪替氏平皿上，在22℃±2℃培养48小时并确定所述试样(接种48-小时之后)中的细胞密度。
试样中细胞计数不超过十倍量的增加表明试样的防腐效果。
针对细菌培养物的防腐效果测定方法第1天1、将一个铂环量的来自保藏斜面的无污染培养物接种到10毫升无菌的大豆-酪蛋白肉汤培养基中。
2、将接种的试管在32℃±2℃培养24小时。
第2天3、检查生长情况，然后将0.2毫升培养物加入到100毫升无菌的大豆-酪蛋白肉汤培养基中。
4、在32℃±2℃，将接种的介质培养18小时。
第3天5、在32℃±2℃培养18小时后，检查生长情况，然后将10毫升培养肉汤转移到15毫升无菌的带螺盖的“V”离心管中。
6、将培养肉汤在5000rpm离心10分钟。
7、弃去上清液，并通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在5毫升无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
8、将所述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第1次洗涤)。
9、通过将内容物涡流2分钟，将小粒重新悬浮在5ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
10、将所述内容物在5000rpm离心10分钟，然后弃去上清液(第2次洗涤)。
11、通过将内容物涡流3-4分钟，将小粒再次重新悬浮在5ml无菌盐水(pH值7.2-7.4)中。
12、制备产生0.1光密度(O.D.)的细胞悬浮液。
13、使用无菌盐水(pH值7.2-7.4)进行7次十倍量的稀释。
14、用0.1毫升1∶103稀释的悬浮液接种试样，因此所述接种试样含有50-250个cfu/毫升。
15、将试样在32℃±2℃培养24小时。
16、同样将0.1毫升1∶104、1∶105、1∶106和1∶107稀释的悬浮液表面-铺展在培养平皿上。将所述平皿在32℃±2℃培养24小时。培养后，计数平皿上的菌落数目并确定接种入试样的细胞密度。
第4天17、试样培养24-小时之后，进行试样的3次十倍量的连续稀释。
18、将0.1毫升试样(未稀释的)以及3次十倍量的连续稀释液试管表面-铺开在无菌的大豆-酪蛋白琼脂陪替氏平皿上。
19、将陪替氏平皿在32℃±2℃培养24小时。
第5天20、计数每个平皿的菌落数目并确定试样(接种24-小时后)中的细胞密度。
21、类似地，所述试样培养48-小时之后，进行3次所述试样的十倍量的连续稀释，将0.1毫升所述试样表面-铺开在无菌的大豆-酪蛋白琼脂陪替氏平皿上，在32℃±2℃培养24小时并确定所述试样(接种48-小时之后)中的细胞密度。
试样中细胞计数不超过十倍量的增加表明试样的防腐效果。
结果列在表3-A和3-B中。
所述测定以双份进行，在表3-A和3-B中以SET I和SET II来表示。
表3-A丙泊酚乳剂的防腐活性
解答tntc-数目太多无法计数，NA-不适用。
表3-B丙泊酚乳剂的防腐活性
解答tntc-数目太多无法计数，NA-不适用。
表3-A和3-B中的数据清楚地显示出浓度为0.01％w/v的甘油一月桂酸酯在防止试验生物体生长不超过10倍中是有效的。
利用上述观察，推断甘油单酯是有效的抗菌剂，以防止在正文和实施例中描述的组合物中敏感生物体不超过10倍的生长，并可用作静脉给药的无菌水包油型乳剂组合物中的抗菌剂。
实施例VIII急性毒性的测定在Swiss小白鼠中对实施例I和实施例VI的组合物进行毒性研究。
二十只平均体重为20-22g的健康Swiss小白鼠用于本研究。BharatSerums and Vaccines Ltd.的动物房是所述动物的来源。在使用前将所述动物在隔离房间里隔离七天。给予动物不限量的食品小粒和自来水。照明情况是12小时明亮和12小时黑暗。环境温度是22±3℃。将实验动物分组并装进笼子。用着色编码和笼子来标明动物编号。在整个实验中，每个笼子上加贴标签，标明实验编号、组号、动物数目、性别和处理详情。
在静脉给予试验物质后测定急性毒性。所有动物在给予试验物质后，就其死亡率以及其它可能的临床征象和症状观察7天。
实验组将二十只Swiss小白鼠随机分成两组，每组包含十只动物(五只雄性和五只雌性)。
组1单次静脉注射实施例VI的组合物，剂量为45毫克/千克。
组2单次静脉注射实施例I的组合物，剂量为45毫克/千克。
5％葡萄糖注射液用作稀释剂。
药理学评价对于下列参数，对实验动物观察七天。
1、身体检查注射后每小时至最初的4小时以及整个实验期间每天一次观察所有动物的任何变化的开始、程度和持续时间包括皮肤、毛皮、眼睛和一般行为。
2、死亡率贯穿整个研究期间直至7天，每天记录实验动物中的死亡率。
3、体重在给予试验物质前以及试验的第3天、第7天对每只动物称重。
4、统计分析以平均值±SD的方式记录数据。Student’s配对t-检验用来比较参数数据的基础值和最终值。“p”值小于0.05被认为是显著的。
5、观察在试验期间实验动物没有显示出任何毒性和一般行为的不良征象。
实施例I的试验组的体重值并未显著地不同于实施例VI的试验组(p＞0.05)。
观察到实施例I和VI的两种组合物的LD50大于45毫克/千克体重。
在研究期间在两个研究组中没有观察到任何副作用。
本发明的静脉用脂肪乳剂组合物见于实施例X。比较实施例IX和XI以及实施例X的组合物在表4中给出。
表4静脉用脂肪乳剂组合物Qty/100ml
实施例IX的组合物通过以下步骤制备。
油相的制备将豆油加热至70-75℃。
水相的制备向注射用水中加入甘油和卵磷脂并用氢氧化钠溶液将pH值调至大约10.5。
乳化将油相加入到水相混合并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到所需的小于500纳米的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
实施例X的组合物通过以下实施例IX的步骤来制备，除了将甘油一月桂酸酯加进所述油相之外。
除了将依地酸二钠加进所述水相之外，通过以下实施例IX的步骤来制备实施例XI的组合物。
实施例XII甘油一月桂酸酯的安全性研究以5％葡萄糖注射液作为对照，研究实施例IX、X和XI的组合物。
本研究的目的是获取小鼠在静脉途径给予甘油一月桂酸酯本身以及与EDTA相比的安全性。
四十只平均体重为20-22g的健康Swiss小白鼠用于本研究。
在给予试验物质后测定毒性。在每天给予试验物质后就死亡率、临床征象和症状、血液学和组织病理学的变化，对所有动物观察7天。
数据记录为平均值±SD，中间值用于组织病理学数据。
Student’s配对t-检验用来比较相同组内参数数据的基础和最终值，Student’s非配对t-检验用来比较两个不同组之间的数值。“p”值小于0.05被认为是显著的。
结果就下列参数，对所有实验动物观察七天。
1、死亡率在研究期间从任何实验组没有观察到死亡。
2、临床征象和临终死亡在研究期间没有观察到不利的临床征象和症状。
3、体重在给予研究物质之前和试验期间中每天对每只动物进行称重。每组的平均体重数据提供于表5。
表5各种组合物(实施例IX、X和XI)对小鼠的动物体重的作用
注意所有数字表示平均值±SD。
第1组对照组第2组实施例IX的组合物第3组实施例X的组合物第4组实施例XI的组合物5、血液学参数彼此之间相比时，白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)和血小板(PLT)最终值(第7天)的变化不显著(p＞0.05)。
6、器官重量所有试验组中肝、肺、肾、心脏和脾的器官湿重没有显著不同(p＞0.05)。
7、病理组织学甘油一月桂酸酯组和EDTA组动物的组织病理学数据具有很好的相似性。
实施例XIII制备并分析根据实施例II的组合物的产品。所遵循的方法如下1、球径球径测定原理是基于对激光被悬浮在溶液中的微粒所散射后产生的时间依赖性波动进行测量。使用来自Brookhaven仪器公司的BI-90 Plus仪器。
2、丙泊酚和降解产物的含量通过HPLC确定丙泊酚和降解产物的含量。详情如下柱子 -Hypersil ODS检测器-紫外检测器检测波长 -270nm流动相-60∶15∶25乙腈∶甲醇∶10mM磷酸钾缓冲液样品浓度 -0.2mg/ml流速 -1ml/min.
分析数据的详情提供于表6表6实施例II的组合物的分析数据
*按照实施例VII的步骤这些数据显示出制备的产品符合防腐活性以及其它物理化学参数(包括球径)的要求。
实施例XIV实施例XIII制备的组合物接受稳定性试验，并将加速稳定性数据提供在下面的表7中。
表7在40℃的加速稳定性数据
ND＝未发现实施例XIII的组合物在最初以及40℃完成3个月的贮藏之后，按照实施例VIII的方法进行急性毒性研究，并按照实施例VII进行防腐活性试验，得到的数据表明毒性情况和防腐活性与最初结果相当。
这些数据显示出所述产品是稳定的并且符合令人满意的稳定性要求。
实施例XV含有防腐剂甘油一月桂酸酯的硫酸丁胺卡那霉素(Amikacin sulphate)乳剂组合物实施例XV的组成如下
Qty/100ml
通过以下方法以300毫升的量制备实施例XV的组合物。
油相的制备将豆油加热至70-75℃，加入甘油一月桂酸酯并混合。
水相的制备向注射用水中加入甘油并混合。然后将卵磷酯加入水溶液并通过搅拌来分散。用0.1N氢氧化钠溶液将pH值调节至10.5。通过搅拌将称量的硫酸丁胺卡那霉素溶解在所述水相中。
乳化将油相加入到水相混合并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到所需的小于500纳米的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
实施例XVI含有防腐剂甘油一月桂酸酯的具有盐酸利多卡因的丙泊酚水包油型乳剂组合物实施例XVI的组成如下Qty/100ml
通过以下方法以300毫升的量制备实施例XVI的组合物。
油相的制备将豆油加热至70-75℃，加入甘油一月桂酸酯和丙泊酚并混合。然后将卵磷酯加入至豆油-丙泊酚的混合物中并通过搅拌来溶解。
水相的制备向注射用水中相继加入甘油和盐酸利多卡因并混合均匀。用0.1N氢氧化钠溶液将pH值调节至10.4。
乳化将油相加入到水相混合并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到小于500纳米的所需的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
实施例XVII含有防腐剂甘油一月桂酸酯的静脉用脂肪乳剂组合物实施例XVII的组成如下Qty/100ml
通过以下方法以300毫升的量制备实施例XVII的组合物。
油相的制备将豆油和红花油混合并加热至70-75℃，然后加入甘油一月桂酸酯并混合。
水相的制备向注射用水中加入甘油并混合。然后将卵磷酯加入至水溶液并通过搅拌来分散。用0.1N氢氧化钠溶液将pH值调节至10.5。
乳化将油相加入到水相混合并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到所需的小于500纳米的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
实施例XVIII含有防腐剂甘油一月桂酸酯的紫杉醇(Paclitaxel)水包油型乳剂组合物实施例XVIII的组成如下Qty/100ml
通过以下方法以300毫升的量制备实施例XVIII的组合物。
油相的制备将红花油加热至70-75℃，然后加入甘油一月桂酸酯和紫杉醇并混合。
水相的制备向注射用水中加入甘油并混合均匀。用0.1N氢氧化钠溶液将pH值调节至10.6。然后加入卵磷酯并通过搅拌进行分散。
乳化将油相加入到水相混合并高速搅拌大约10分钟以得到粗乳。然后匀化粗乳以得到所需的小于500纳米的平均球径。
将乳剂过滤，装入U.S.P.I型小瓶并在用氮气掩蔽后密封。然后通过高压灭菌将小瓶消毒。
本发明的优点具有甘油一月桂酸酯的水包油型组合物在偶然污染的情况下不支持微生物的生长。此外，已经观察到含有甘油一月桂酸酯的组合物在静脉给予时对小鼠是安全的。
不同于依地酸钠和三胺五乙酸钠，甘油一月桂酸酯不螯合来自生物系统的痕量金属离子，因此其安全性优于含有螯合/多价螯合剂的产品。
在丙泊酚组合物中使用甘油一月桂酸酯优于使用亚硫酸盐，因为亚硫酸盐使得产品在长期储存时在物理上和化学上不稳定。已经报道亚硫酸盐促进在丙泊酚乳剂中的脂质过氧化并且在静脉给予时引起过敏性反应。
对于长期使用，苯甲酸酯类和苯甲醇在静脉给予时会引起毒性，而甘油一月桂酸酯在使用时不会引起任何毒性(7天以上)。
本发明的产品给出的丙泊酚水包油型乳剂组合物可在临床需要的长时期内静脉给药，而无需担心微生物污染和感染。
本发明的水包油型静脉用脂肪乳剂组合物可用作长期的全胃肠外营养混合物，而无需担心微生物污染和感染。
含有亲水性/和亲脂性药物的本发明的水包油型乳剂组合物使用时间更长，而无需担心微生物污染和感染。
类似地，含有静脉用脂肪乳剂组合物以及亲水性/和亲脂性药物的本发明的水包油型乳剂组合物也可长期使用，而无需担心微生物污染和感染。
本发明还提供按照患者需求特制的兼具药物和营养成分的可静脉给药的专用组合物。
应当理解本发明并不局限于上面描述的具体细节，而是可以产生如以下权利要求中所定义的不背离本发明的许多改变和变化。
权利要求
1.用于静脉给药的无菌的水包油型乳剂组合物，其中含有甘油单酯作为抗菌的防腐剂。
2.如权利要求1中要求的可静脉给药的组合物，其中所述甘油单酯含量通过试验测定足以防止白色念珠菌ATCC 10231、绿脓假单胞菌ATCC 9027、大肠杆菌ATCC 8739和金黄色葡萄球菌ATCC 6538中的每种微生物培养物在至少24小时生长的增加不超过10倍，所述试验中，将各生物体的洗涤悬浮液以每毫升大约50个菌落形成单位的量分别加入所述组合物的各等分试样中，并在20-25℃范围的温度下培养白色念珠菌，在30-35℃范围的温度下培养其余微生物；并测试24小时后所述生物体的存活计数，其中所述甘油单酯含量不超过由含1.5％w/v甘油一月桂酸酯的组合物所得到的对抗所述培养物的抗菌当量。
3.如权利要求1或权利要求2中要求的可静脉给药的组合物，其中所述甘油单酯是甘油一月桂酸酯。
4.如前述任何一项权利要求中要求的可静脉给药的组合物，其中所述的甘油单酯的量是由含达到1％w/v甘油一月桂酸酯的组合物所得到的对抗所述培养物的抗菌当量。
5.如权利要求4中要求的可静脉给药的组合物，其中所述的甘油单酯的量是由含高达0.5％w/v甘油一月桂酸酯的组合物所得到的对抗所述培养物的抗菌当量。
6.如权利要求5中要求的可静脉给药的组合物，其中所述的甘油单酯的量是由含达到0.1％w/v甘油一月桂酸酯的组合物所得到的对抗所述培养物的抗菌当量。
7.如前述任何一项权利要求中要求的可静脉给药的组合物，它用于全胃肠外营养。
8.如权利要求1至6任何一项要求所述的可静脉给药组合物，所述组合物是含有亲脂性药物的药剂。
9.如权利要求8中要求的可静脉给药的组合物，其中所述亲脂性药物是丙泊酚。
10.如权利要求8或权利要求9中要求的可静脉给药的组合物，其中亲脂性药物的含量是所述组合物的0.01％w/v至5％w/v。
11.如权利要求10中要求的可静脉给药的组合物，其中亲脂性药物的含量是所述组合物的0.1％w/v至2％w/v。
12.如权利要求8至11任何一项中要求的可静脉给药的组合物，其中甘油单酯(以甘油一月桂酸酯计算)与亲脂性药物之比以重量计是1∶0.01至1∶5000。
13.如权利要求12中要求的可静脉给药的组合物，其中甘油单酯(以甘油一月桂酸酯计算)与亲脂性药物之比以重量计是1∶0.2至1∶1000。
14.如权利要求13中要求的可静脉给药的组合物，其中甘油单酯(以甘油一月桂酸酯计算)与亲脂性药物之比以重量计是1∶4至1∶200。
15.如权利要求14中要求的可静脉给药的组合物，其中甘油单酯(以甘油一月桂酸酯计算)与亲脂性药物之比以重量计是1∶20至1∶100。
16.如前述任何一项权利要求中要求的可静脉给药的组合物，含有至少一种甘油三酯油和至少一种磷脂。
17.如权利要求16中要求的可静脉给药的组合物，其中至少一种甘油三酯油选自天然的植物油和合成的MCT(中链甘油三酯)油。
18.如权利要求16或权利要求17中要求的可静脉给药的组合物，其中所述甘油三酯油的含量不超过所述组合物的30％w/v。
19.如权利要求18中要求的可静脉给药的组合物，其中所述甘油三酯油的含量是所述组合物的5％w/v至20％w/v。
20.如权利要求16至19任何一项中要求的可静脉给药的组合物，其中至少一种磷脂选自纯化卵磷酯和纯化大豆磷脂。
21.如权利要求16至20任何一项中要求的可静脉给药的组合物，其中磷脂含量为所述组合物的0.1％w/v至3％w/v。
22.如前述任何一项权利要求中要求的可静脉给药的组合物，含有至少一种等渗剂。
23.如权利要求22中要求的可静脉给药的组合物，其中至少一种等渗剂是甘油。
24.如权利要求1中要求的可静脉给药的组合物，其中所述油相含有亲脂性药物和/或营养性油类，而水相含有亲水性药物和/或水溶性营养素。
25.如前述任何一项权利要求中要求的可静脉给药的组合物，其中所述组合物的pH值在6-8.5。
26.如权利要求9中要求的可静脉给药的组合物，其中含有大约1％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，大约0.05％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
27.如权利要求9中要求的可静脉给药的组合物，其中含有大约2％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，大约0.05％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
28.如权利要求9中要求的可静脉给药的组合物，其中含有大约1％w/v的丙泊酚，大约10％w/v的大豆油，大约1.2％w/v的纯化卵磷酯，大约2.25％w/v的甘油，大约0.01％w/v的甘油一月桂酸酯，足以将pH值调至6-8.5之间的氢氧化钠和以体积计加至100％的注射用水。
29.甘油单酯在用于静脉给药的无菌水包油型乳剂组合物中作为抗菌剂的用途。
30.如权利要求29中要求的用途，其中可静脉给药组合物中的甘油单酯和/或其它成分如权利要求1至28任何一项中所定义。
31.制备如权利要求8至28任何一项中要求的可静脉给药的组合物的方法，包含以下步骤i)将甘油单酯和亲脂性药物溶解在保持在升高的温度的甘油三酯油中；ii)将磷脂加入并溶解在步骤i)制备的溶液中；iii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后加热所述水相；iv)在搅拌条件下，将步骤ii)的溶液加入至步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；和v)匀化步骤iv)得到的粗乳。
32.制备如权利要求1至28任何一项中所定义的可静脉给药的组合物的方法，包含以下步骤i)将甘油单酯和，如果存在，亲脂性药物溶解在保持在升高的温度的甘油三酯油中；ii)通过将甘油和氢氧化钠溶解在水中来制备水相，然后加热所述水相；iii)将磷脂加入并分散在步骤ii)制备的水相中；iv)在搅拌条件下，将步骤i)的溶液加入至步骤iii)得到的水相中，以产生粗乳；和v)均化步骤iv)得到的粗乳。
33.如权利要求31或权利要求32中要求的方法，其中所述均化达到小于500纳米的平均球径；将均化的组合物进行过滤；将所得滤液装入容器，接着用氮气掩蔽并密密封已装满的容器；和通过高压灭菌法将装有所述滤液的密封容器消毒。
34.如权利要求1中要求的可静脉给药的组合物，其中水相含有亲水性药物和/或水溶性营养素。
35.用于静脉给药的无菌药用水包油型乳剂组合物，其中含有甘油单酯作为抗菌防腐剂，基本上如正文或实施例中所描述的那样。
全文摘要
甘油单酯，尤其是甘油一月桂酸酯用于保护静脉给药的水包油型乳剂组合物对抗大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生长。所述组合物可以是包含亲脂性药物尤其是丙泊酚，和/或全静脉营养组分的药物。
文档编号A61K31/05GK101090736SQ200580038758
公开日2007年12月19日 申请日期2005年4月7日 优先权日2004年9月13日
发明者G·V·达夫塔里, S·A·佩, G·N·尚布哈格 申请人:印度血清及疫苗有限公司