专利名称：梯度支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及梯度支架及其制备方法。所述梯度支架尤其包括沿着一种或几种性质的所需方向显示出控制变化的支架，其中所述性质包括孔径、化学组成、交联密度或其组合。
背景技术：
迄今为止，在成功的组织工程中的一个限制是缺乏可以组装复杂组织的合适材料和构架，尤其是缺乏使合适细胞能够沿所需方向排列形成功能组织。现有方法也没有提供合适的底物促进形成各组织区域连接在一起的组织，其中各个区域在居留细胞类型和组成上不同。
许多组织和器官在解剖学上通常借助非具体性组织如筋膜而与相邻的组织/器官分开。然而，其它组织/器官并入相邻的器官并且该类延伸在结构上显示出循序渐进的变化，即它在一种或多种性质上形成梯度，因而给予组织以新的重要功能性质。用这种“连接体”组织以梯度结构的形式连接两个组织/器官产生了新的生理功能，这种新的生理功能在两个组织/器官的连接切断时，例如在外伤后将丢失。该类组织的实例包括与肌骨骼连接的腱、韧带和关节软骨。在这些实例的每一个中，对身体的健康机能很重要的机械力由一个器官传递到相连的“连接体”组织，并进而传递到其所连接的另一个器官。
当两种分化组织或器官通过第三者连接体组织相连时，连接体通常包含三种组织。在每个末端，连接体通常在结构或功能上与其连接的组织或器官相同。连接体的中间部分通常具有与其机械功能(包括与其连接的两种组织的机械耦合)相关的不同且独特的结构或构架。
肌骨骼连接的组织可能经常受到外伤损伤。为了组织成功发挥其功能且为了整个器官的恢复，除了通过刺激其修复(结疤)或再生功能而治疗组织本身以外，还有必要适当治疗末端器官和连接体组织。方案如在腱和韧带受到损伤时，这些结构以及与它们相连的骨骼都要得到治疗，然而，为了恢复受损伤的肢的功能也需要使保持与骨骼连接的组织得到适当地治疗。诱导修复的支架也必需因此刺激新连接体组织的合成，其由参考组织/器官延伸至将与其连接的相邻组织/器官。由于连接体组织通常由至少三种不同的组织组成，它们在空间上排列以保持适当连接，因此所述支架必需刺激三种组织的合成，并且该合成必需提供具有适当构架的连接体。
在现有技术中支架已存在，迄今为止所用的材料诱导单一组织类型的再生。支架的再生活性相当敏感地取决于平均孔径、化学组成和交联密度，并且现有技术强调这些性质之一在整个支架材料中的均匀性。诱导组织再生的支架具有密切相关的构架，所述构架几乎就是进行再生的组织中的基质构架(连接组织)的复制品。如目前所用的其特征为在整体中具有均匀结构的支架将不易于进行连接体组织/器官的合成，所述连接体组织/器官必需包含不同的组织类型因而为了成功组织再生需要非均匀结构。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了固体、生物相容性的梯度支架，在另一个实施方案中其为多孔的。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中固体聚合物包含至少一种合成或天然的聚合物、陶瓷、金属、细胞外基质蛋白或其类似物。在另一个实施方案中，支架为不均匀的多孔材料，或者说在另一个实施方案中支架内的孔具有不均一的平均直径。在另一个实施方案中，所述孔的平均直径作为其在所述支架中的空间组织的函数而变化，或者在另一个实施方案中，所述孔的平均直径作为沿所述支架的任意轴的孔径分布的函数而变化。在另一个实施方案中，支架在其平均孔径或其分布、成分浓度、交联密度或它们的组合上变化。在另一个实施方案中，所述孔的平均直径为0.001-500μm。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的不均匀多孔固体生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)在冻结温度下产生梯度的条件下，对至少一种细胞外基质组分或其类似物的溶液进行冷冻干燥，和(b)在所述冷冻干燥过程中达到热平衡以前，升华在步骤(a)的淤浆中形成的冰晶(ice-crystal)；
其中冰晶沿着一个梯度而形成，这个梯度为梯度冻结温度的函数，从而该冰晶体的升华导致了沿着该梯度排列的孔的形成。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，细胞外基质组分包含胶原、粘多糖或其组合。在另一个实施方案中，本方法还包括以下步骤使在步骤(b)中形成的支架内的至少一个区域润湿，然后在包含标准大气压的条件下干燥润湿区，从而导致该区域中孔的瓦解。在另一个实施方案中，所生成的支架包含无孔区域。在另一个实施方案中，区域润湿应是在曝于干燥之后进行的，所述无孔区域具有特殊的形状。在另一个实施方案中，该区域不能穿过具有回转半径或有效直径至少为1000Da大小的分子。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于盐浓度增加的溶液梯度的步骤。在一个实施方案中，曝于盐造成至少一种细胞外基质组分在所述支架中的选择性增溶。在另一个实施方案中，至少一种细胞外基质组分的选择性增溶随盐浓度的增加而增加。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶降解或增溶至少一种细胞外基质组分。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，至少一种细胞外基质组分的消化随酶浓度的增加而增加。在一个实施方案中，该酶是胶原酶、糖苷酶或其组合。在另一个实施方案中，酶的浓度为0.001-500U/ml。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于一个温度梯度下的步骤。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，温度梯度为25-200℃。在另一个实施方案中，将支架曝于温度梯度导致在该支架中交联密度梯度的形成。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，将支架曝于交联剂导致在该支架中的交联密度梯度的形成。在一个实施方案中，交联剂为戊二醛、甲醛、多聚甲醛、福尔马林、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳二酰亚胺(EDAC)或紫外光或其组合。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的生物相容性的不均匀多孔固体支架的方法，其包括步骤(a)将两种或更多种细胞外基质组分或其类似物的溶液冷冻干燥；(b)升华在步骤(a)的淤浆中形成的冰晶以产生具有均匀分布孔的支架；
(c)使在步骤(b)中形成的所述支架的至少一个区域润湿；和(d)将在步骤(c)中产生的润湿区域在标准大气压的条件下曝于干燥，其中将所述润湿区域曝于干燥导致在该区域中孔的瓦解，因此形成生物相容性的不均匀多孔固体支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于盐浓度增加的溶液梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶降解或增溶至少一种细胞外基质组分。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于一个温度梯度的步骤，从而在支架中产生交联密度的梯度。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备两种或更多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于盐浓度增加的溶液梯度；其中将所述支架曝于所述盐浓度增加的溶液梯度造成至少一种细胞外基质组分的选择性增溶，并且所述增溶随硫酸盐浓度的增加而增加，因此形成固体生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含一种或多种细胞外基质组分或其类似物的多孔固体生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于酶浓度增加的溶液梯度，所述酶至少消化所述两种或更多种细胞外基质组分中一种；其中将所述支架曝于所述梯度溶液造成所述两种或更多种细胞外基质组分中的至少一种的选择性消化，并且所述消化随酶浓度的增加而增加，因此形成多孔固体生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含一种或多种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于温度梯度，其中将所述支架曝于所述温度梯度造成交联密度在该支架中的梯度，因此形成固体多孔生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的固体多孔支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度，其中将所述支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度造成交联密度在所述支架中的梯度，因此形成固体多孔生物相容性梯度支架。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明方法制备的固体多孔生物相容性梯度支架。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种受体器官或组织工程方法其包括将本发明支架植入受体(subject)的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种受体器官或组织修复或再生的方法，其包括将本发明支架植入受体的步骤。
根据本发明的这些方面，在一个实施方案中，本方法还包括将细胞植入受体的步骤。在一个实施方案中，将细胞播种在所述支架上。在另一个实施方案中，细胞为干细胞或祖细胞。在另一个实施方案中，本方法还包括给予受体以细胞因子、生长因子、荷尔蒙或其组合的步骤。在另一个实施方案中，器官或组织工程由不同种类的细胞组成。在另一个实施方案中，器官或组织为连接体器官或组织，而在另一个实施方案中为腱或韧带。
具体实施例方式
本发明涉及固体梯度支架、其制备方法以及由其应用产生的治疗应用。
由于缺乏可以组装复杂组织的合适材料和构架，尤其是缺乏使合适的细胞包括多种细胞类型能够在三维中自我排列以形成功能组织，组织工程、修复和再生已经被严重阻碍。现有方法也没有提供合适的底物促进形成各组织区域连接在一起的组织，其中各个区域在居留细胞类型和组成上不同。
在一个实施方案中，本发明提供了包含聚合物的固体多孔生物相容性梯度支架。
在一个实施方案中，术语“支架”指一种三维结构，其作为细胞、生物分子或其组合的载体和/或连接细胞、生物分子或其组合。在一个实施方案中，支架提供了用于组织或器官的修复、再生或产生的载体。
在一个实施方案中，术语“梯度支架”指由其性质在整个支架中变化的材料组成的支架，在一个实施方案中，所述性质为组成支架的成分的浓度，或者在另一个实施方案中，为其多孔性(在另一个实施方案中可由孔径、孔形状、孔的百分比而体现)，或者在另一个实施方案中，为其交联密度，或者在另一个实施方案中，为其密度。在另一个实施方案中，术语“梯度支架”指在整个支架中由不同孔径的材料组成的支架。
在一个实施方案中，梯度支架的特征在于渐进变化的孔隙容积分数，为0-0.999。
在一个实施方案中，平均孔径为0.001-500μm。在一个实施方案中，平均孔径为0.001-0.01μm，或者在另一个实施方案中，为0.001-500μm，或在另一个实施方案中，为0.001-0.1μm，或在另一个实施方案中，为0.1-1μm，或在另一个实施方案中，为0.001-50μm，或在另一个实施方案中，为0.1-10μm，或在另一个实施方案中，为1-10μm，或在另一个实施方案中，为1-25μm，或在另一个实施方案中，为10-50μm，或在另一个实施方案中，为0.001-500μm，或在另一个实施方案中，为10-74μm，或在另一个实施方案中，为25-100μm，或在另一个实施方案中，为100-250μm，或在另一个实施方案中，为100-500μm。
在一个实施方案中，术语“梯度支架”是指在支架中形成的孔具有不均一的平均直径。在另一个实施方案中，术语“梯度支架”是指支架中形成的孔在整个支架材料中具有均一平均直径，不均匀分布。
在另一个实施方案中，术语“梯度支架”是指构成支架的固体聚合物浓度发生变化。在一个实施方案中，浓度变化贯穿整个支架。在另一个实施方案中，固体聚合物浓度沿着支架至少一个方向发生变化。在另一个实施方案中，固体聚合物浓度在支架中特定的位置发生变化，这在另一个实施方案中，有利于细胞粘附。
在一个实施方案中，术语“梯度支架”是指用于合成紧密相邻的一个或多个组织的材料。
在一个实施方案中，术语“生物相容性”指不单单分解为基础成分，而是分解为对受体或其环境确实有益或无害的成分的产品。在另一个实施方案中，术语“生物相容性”指在将支架曝于受体或所述受体中的细胞以后，不会引起纤维变性、发炎反应、主体排斥反应或细胞粘附的性质。在另一个实施方案中，术语“生物相容性”指对曝于支架周围的细胞或组织直接或间接地造成影响的话，具有最小影响(即与对照相比没有发现显著的不同)的任何物质或化合物。
在一个实施方案中，本发明的聚合物可以为共聚物。在另一个实施方案中，本发明的聚合物可以为均聚物，或者在另一个实施方案中为杂聚物。在另一个实施方案中，本发明的聚合物是合成聚合物，或者在另一个实施方案中为天然聚合物。在另一个实施方案中，本发明的聚合物为自由基无规则共聚物，或者在另一个实施方案中为接枝共聚物。在一个实施方案中，聚合物可以包括蛋白质、肽或核酸。
在一个实施方案中，本发明的聚合物可以包含疏水性聚合物，例如聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚氨酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸交酯或它们的任何共聚物。在另一个实施方案中，聚合物可以包含硅氧烷如2，4，6，8-四甲基环四硅氧烷、天然和/或合成橡胶、玻璃、金属，包括不锈钢或石墨、或其组合。
在一个实施方案中，本发明的聚合物还包含亲水性聚合物，例如亲水性二醇、亲水性二胺或其组合。所述亲水性二醇可以为聚(亚烷基)二醇、基于聚酯的多元醇或聚碳酸酯多元醇。在一个实施方案中，术语“聚(亚烷基)二醇”指低级亚烷基二醇的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇和聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)。术语“基于聚酯的多元醇”指其中的R基团为低级亚烷基如亚乙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丙基、1，4-亚丁基、2，2-二甲基-1，3-亚丙基等的聚合物。本领域熟练技术人员可以理解聚合物的二酯结构部分还可以变化。例如本发明也预计使用丁二酸酯、戊二酸酯等。术语“聚碳酸酯多元醇”指在链端具有羟基官能团并且在聚合物链中具有醚及碳酸酯官能团的那些聚合物。在另外一些实施方案中，聚合物的烷基结构部分可以由C2-C4脂族基团组成，或者在某些实施方案中，由更长链的脂族基团、脂环族基团或芳族基团组成。在一个实施方案中，术语“亲水性二胺”指其中的端羟基由反应性的氨基取代或已经衍生为具有端氨基的延长链的任何上述亲水性二醇。例如在一个实施方案中，亲水性二胺是“二氨基聚氧化烯”，即其中端羟基由氨基取代的聚(亚烷基)二醇。术语“二氨基聚氧化烯”也指在链端具有氨基烷基醚基团的聚(亚烷基)二醇。合适的二氨基聚氧化烯的一个实例是聚(丙二醇)二(2-氨基丙基醚)。具有不同平均分子量的多种二氨基聚氧化烯都是可以获得的，并且作为JeffaminesTM销售(例如Jeffamines 230、Jeffamines 600、Jeffamines 900和Jeffamines2000)。这些化合物例如可以由Aldrich Chemical Company得到。也可以用文献方法来进行合成。
在另一个实施方案中，本发明的聚合物可以包含聚丙烯纺织纤TM、尼龙、DekleneTM、聚酯或其组合。
在另一个实施方案中，本发明的聚合物可以包含聚硅氧烷聚合物。在一个实施方案中，聚硅氧烷聚合物可以是线性的。在一个实施方案中，聚硅氧烷聚合物是具有两个反应性官能团(即官能度为2)的聚二甲基硅氧烷。所述官能团例如可以为羟基、氨基或羧酸基。在某些实施方案中，可以使用聚硅氧烷聚合物的组合，其中第一结构部分包含羟基并且第二结构部分包含氨基。在一个实施方案中，所述官能团位于聚硅氧烷聚合物的链端。多种合适的聚硅氧烷聚合物可以从如Dow Chemical Company(Midland，Mich，USA)和General Electric Company(Silicones Division，Schenetady，N.Y.，USA)获得。还可以通过通用合成方法由可市购的硅氧烷(United Chemical Technologies，Bristol Pa.，USA)来制备其它的聚硅氧烷聚合物。在另一个实施方案中，聚硅氧烷聚合物的分子量可以为约400-10,000，或者在另一个实施方案中为约2000-4000。
在另一个实施方案中，本发明的聚合物可以包含细胞外基质组分，例如透明质酸和/或其盐，如透明质酸钠；粘多糖如硫酸皮肤素、硫酸乙烯肝素、硫酸软骨素和/或硫酸角质素；粘液糖蛋白(例如润滑素)；玻连蛋白；tribonectins；表面活性磷脂质；鸡冠透明质酸酯。在某些实施方案中，所述细胞外基质组分可通过商业渠道获得，例如ARIHREASETM高分子量透明质酸钠、STYNVISCHylan G-F 20、HYLAGAN透明质酸钠、HEALON透明质酸钠和SIGMA6-硫酸软骨素。
在另一个实施方案中，聚合物可以包含生物聚合物例如胶原蛋白。在另一个实施方案中，聚合物可以包含生物相容性聚合物如α-羟基羧酸的聚酯，例如聚(L-交酯)和聚乙醇酸交酯(PGA)；聚对二烷酮(PDO)；聚己内酯(PCL)；聚乙烯醇(PVA)；聚环氧乙烷(PEO)；公开于美国专利6,333,029和6,355,699中的聚合物；以及任何在其中描述的其它生物吸收性和生物相容性聚合物、共聚物或聚合物混合物或共聚物混合物。
在一个实施方案中，聚合物包含聚脲、聚氨酯或聚氨酯/聚脲组合。在一个实施方案中，该聚合物可以通过使二异氰酸酯与醇和/或胺结合而形成。例如在聚合条件下结合异佛尔酮二异氰酸酯与PEG 600和1，4-二氨基丁烷提供了具有氨基甲酸酯键和脲键的聚氨酯/聚脲组合物。
在另一个实施方案中，包含细胞外基质组分的聚合物可通过本领域已知方法从组织中纯化。例如在一个实施方案中若需要胶原蛋白，则可以处理天然形成的细胞外基质以基本除去除胶原蛋白以外的所有材料。可以通过已知方法进行纯化以基本除去糖蛋白、蛋白聚糖、油脂、非胶原蛋白的蛋白质和核酸(DNA或RNA)。
在另一个实施方案中，聚合物可以包含I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、明胶、琼脂糖、含细胞收缩的胶原蛋白的蛋白多糖、葡糖胺基聚糖或糖蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白、弹性蛋白、血纤维蛋白、由多元羧酸(例如聚乳酸、聚乙醇酸或聚氨基酸)制成的合成聚合物纤维、聚己内酯、聚氨基酸、多肽凝胶、它们的共聚物和/或它们的组合。在一个实施方案中，支架由该类材料制成，从而是生物可降解的。
在另一个实施方案中，本发明的固体聚合物可以是无机但仍是生物相容性材料，例如羟基磷灰石、所有磷酸钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙、碳酸钙、碳酸钡、硫酸钙、硫酸钡、磷酸钙的多晶型物、陶瓷颗粒或其组合。
在另一个实施方案中，聚合物可以包含能够与其它感兴趣的分子成键的官能团，在下文中进一步给出所述官能团的一些实例。在一个实施方案中，官能团为适于形成氢键的那些(例如羟基、氨基、醚键、羧酸和酯基等)。
在另一个实施方案中，官能团可以包含有机酸基。在一个实施方案中，术语“有机酸基”包括任何包含有机酸离子化氢的基团，例如羧酸基和磺酸基。“有机酸官能团”意旨包括在反应条件下任何与有机酸基功能类似的基团，例如该酸基的金属盐，尤其是碱金属盐如锂、钠和钾盐，碱土金属盐如钙或镁盐，以及该酸基的季胺盐，尤其是季铵盐。
在另一个实施方案中，官能团可以包含可酸解的键，其包括邻酯基和氨基。在另一个实施方案中，官能团可以包含可碱解的键，其包括α-酯和酸酐基。在另一个实施方案中，官能团可以包含既可酸解又可碱解的键，其包括碳酸酯和亚氨碳酸酯。在另一个实施方案中，官能团可以包含现有技术中已知的不稳定键，它们可易于用于在此描述的方法和支架中(例如参见Peterson等，Biochem.Biophys.Res.Comm.200(3)1586-159(1994)和Freel等，J.Med.Chem.434319-4327(2000))。
在另一个实施方案中，支架还包含pH-改性化合物。在一个实施方案中，术语“pH-改性化合物”指当将化合物放置或溶解于含水环境时，该化合物改变含水环境的pH的能力。在另一个实施方案中，pH-改性化合物可以促使聚合物中的可水解键在该聚合物曝于湿气和/或热时的水解。在一个实施方案中，pH-改性化合物基本上不溶于水的。合适的基本水不溶性的pH-改性化合物可包括基本水不溶性的酸和碱。在另一个实施方案中，可以使用无机和有机酸或碱。
在另一个实施方案中，支架为不均匀多孔型。在一个实施方案中，术语“多孔”指包含孔洞或空穴的基材，使材料具有渗透性。在一个实施方案中，不均匀的多孔支架允许支架中的某些区域具有渗透性，而其它区域没有渗透性，或者在另一个实施方案中，支架中的渗透性程度不同。
在一个实施方案中，支架内的孔具有不均一的平均直径。在另一个实施方案中，所述孔的平均直径作为其空间组织的函数而变化，或者在另一个实施方案中，所述孔的平均直径作为孔径沿所述支架的任意轴的分布的函数而变化。
在一个实施方案中，不均匀多孔型的支架尤其适于组织工程、修复或再生，其中所述组织是连接体组织或者将支架用于相互紧邻的两种或三种或更多种组织工程、修复或再生。在一个实施方案中，多孔性的差异可以有助于不同型细胞向支架合适区域的迁移。在另一个实施方案中，多孔性的差异可以有助于在包含支架的细胞类型中发展合适的细胞-细胞连接，这为合适地构建组织的发展/修复/再生所需要。例如，树枝晶或细胞的延伸可以经由支架材料变化的多孔性而更恰当地进行。在另一个实施方案中，支架材料的渗透性差异可以防止并加强外显率以使不具有均匀的多孔性可用作分子筛，其中外显率为分子尺寸的函数。应理解的是本发明的梯度支架可以用于任何需要不均匀多孔性的目的，并且看作本发明的一部分。
在另一个实施方案中，支架在其平均孔径和/或其分布上发生变化。在另一个实施方案中，孔的平均直径作为其在所述支架中的空间组织的函数而变化。在另一个实施方案中，孔的平均直径作为孔径沿支架的任意轴的分布的函数而变化。在另一个实施方案中，支架包含无孔区域。在另一个实施方案中，该区域不能穿过尺寸大于1000Da的分子。
在另一个实施方案中，支架在其聚合物浓度或支架的浓度和组分(包括掺入支架内的生物分子和/或细胞)上发生变化。
在另一个实施方案中，如这里所述，可以将其它分子掺入支架中，而在另一个实施方案中，如这里所述，其它分子可以经由官能团而连接起来。在另一个实施方案中，分子可以直接结合到支架上。
在一个实施方案中，可以将一个或多个生物分子掺入支架中。在另外一些实施方案中，生物分子可以包含药物、荷尔蒙、抗生素、抗微生物物质、染料、放射性物质、荧光物质、聚硅氧烷弹性体、乙缩醛、聚氨酯、辐射透不过的纤维或物质、抗菌物质、化学品或试剂，并且包括它们的任何组合。所述物质可用于加强处理效果，降低潜在的可植入体的腐蚀或身体排斥、加强视效、显示合适的定位、抑制传染、促进治疗、提高软化或任何其它所需作用。
在另一个实施方案中，生物分子可以包含趋化剂、抗生素、甾族或非甾族止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗癌药物、各种蛋白质(例如短链肽、骨形成蛋白、糖蛋白和脂蛋白)、细胞连接介质、生物活性配体、整联蛋白结合次序、配体、各种生长剂和/或分化剂(例如表皮生长因子、IGF-I、IGF-II、IGF-βI-III、生长因子、分化因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素衍生生长因子、转化生长因子、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关的肽、bFGF、IGFβ超家族因子、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12、sonic hedgehog、GDF 5、GDF 6、GDF 8、PDGF)、影响具体生长因子的增量调节的小分子、生腱蛋白-C、透明质酸、硫酸软骨素、纤连蛋白、饰胶蛋白聚糖、thromboelastin、凝血酶衍生肽、肝素结合区块、肝素、硫酸乙酰肝素、DNA片段、DNA质粒或它们的任何组合。
在另一个实施方案中，支架可以包含一种或多种以下组分骨骼(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)和/或骨骼衍生物；软骨(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)和/或衍生物，例如包括半月板组织；肠组织(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；胃组织衍生物(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；膀胱组织衍生物(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；营养组织(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；呼吸组织(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；生殖器组织(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括黏膜下层；肝脏组织(自体组织移植、同种异体移植、异种移植)，例如包括肝脏基底膜；皮肤组织衍生物；富含血小板血浆；贫血小板血浆；骨髓采取、去矿化骨骼基质、胰岛素衍生生长因子；全血；血蛋白凝块；血凝块。
在另一个实施方案中，支架可以包含细胞。在一个实施方案中，细胞可以包括一种或多种下列细胞软骨细胞、纤维软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、滑膜细胞、骨髓细胞、间充质细胞、基质细胞、干细胞、胚胎干细胞、衍生于脂肪组织的祖细胞、外周血祖细胞、由成人组织分离的干细胞、转基因细胞、软骨细胞与其它细胞的组合、骨细胞与其它细胞的组合、滑膜细胞与其它细胞的组合、骨髓细胞与其它细胞的组合、间充质细胞与其它细胞的组合、基质细胞与其它细胞的组合、干细胞与其它细胞的组合、胚胎干细胞与其它细胞的组合、由成人组织分离的祖细胞与其它细胞的组合、外周血祖细胞与其它细胞的组合、由成人组织分离的干细胞与其它细胞的组合、转基因细胞与其它细胞的组合。
在一个实施方案中，支架在其交联密度上发生变化。在另一个实施方案中，支架中的交联密度作为组分在所述支架中的空间组织的函数而变化。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的不均匀多孔固体生物相容性梯度支架的方法，其包括(a)在冻结温度下产生梯度的条件下，冷冻干燥至少一种细胞外基质组分或其类似物的溶液，和(b)在所述冷冻干燥过程中达到热平衡以前，升华在步骤(a)的淤浆中所形成的冰晶体；其中冰晶体沿着作为梯度冻结温度的函数的梯度而形成，并且所述冰晶体的升华导致沿着所述梯度排列的孔的形成。
在一个实施方案中，高度多孔状的支架可以根据本发明方法通过冷冻干燥和升华材料而制得。这可以通过本领域技术人员熟知的任何方式来实现，例如美国专利4,522,753，Dagalakis等所公开的方法。例如多孔梯度支架可以通过冻干法而实现。在一个实施方案中，可以将细胞外基质材料悬浮于液体中。然后冷冻该悬浮液并随后使其冻干。冷冻悬浮液导致液体中冰晶的形成。在冻干过程中这些冰晶在真空下升华，因此在材料中先前由冰晶体占据的地方留下空隙。在一个实施方案中，所得支架的材料密度和孔径可以通过控制悬浮液的冷冻速率和/或细胞外基质材料在冷冻过程初期悬浮于其中的水量而进行变化。
例如为了制备具有较大的均匀孔径且较低的材料密度的支架，可以以缓慢的可控速率(-1℃/min或更小)将细胞外基质悬浮液冷冻至约-20℃的温度下，随后将所得物质冻干。为了制备具有较小的均匀孔径且较高的材料密度的支架，在冷冻之前可以通过基本均匀的方式离心细胞外基质材料以除去部分液体(例如水)而将该材料紧密压实。然后，使用液氮急速冷冻所得的细胞外基质材料，随后将物块冻干。为了制备具有中等的均匀孔径且中等材料密度的支架，可以以较快速率(＞-1℃/min)将细胞外基质冷冻到-20℃至-40℃的温度，随后将物块冻干。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，为了制备本发明的梯度支架，要控制冷冻速率使在其形成过程中在支架中产生热梯度。例如可以将包含所述聚合物和/或这里举例的所述聚合物物的淤浆置入过冷硅油浴中，这如Loree等(1989)，Proc.15thAnnual Northeast Bioeng.Conf.，第53-54页所述。根据这个方面，在一个实施方案中，仅将容器部分浸入而不是完全浸没在油浴中，从而产生了沿容器长度向上传播的冷冻前沿，因此在淤浆中形成温度梯度。
在一个实施方案中，通过在达到热平衡以前中断冷冻过程而保持梯度。对于具有给定形状的容器，本领域熟练技术人员很容易理解测定在淤浆中达到热平衡的时间的方法，进而掌握确定浸入时间的方法。在达到所需温度梯度后，在一个实施方案中将淤浆从油浴中移去并进行冷冻干燥。升华后，剩余的材料为包含聚合物的具有平均孔径梯度的支架。
在另一个实施方案中，支架的冷冻速率梯度由在容器和冷冻器的架板之间使用分级保温层而产生，其中所述容器装盛支架组分并且放置在所述架板上。在一个实施方案中，保温层的梯度可以通过本领域技术人员熟知的任何方法而构建，例如沿特定方向在内中建造较厚区域，或者在另一个实施方案中，通过改变保温层的导热率而构建。后者可以通过使用如铝和铜或者树脂玻璃和铝以及其它材料而实现，所有这些均为本发明的代表实施方案。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。应理解的是这里所列的支架的任何实施方案(适用的话)均被看作这里描述的制备本发明梯度支架方法的实施方案。
在另一个实施方案中，本方法还包括以下步骤润湿在步骤(b)中形成的支架内的至少一个区域，以及使润湿区域在本领域技术人员已知的合适条件如标准大气压下曝于干燥，从而造成该区域中孔的瓦解。在另一个实施方案中，所形成的支架包含无孔区域。在另一个实施方案中，润湿区域应在曝于干燥之后进行，所述无孔区域具有特殊的形状。在另一个实施方案中，该区域不可穿过具有回转半径或有效直径至少为1000Da大小的分子。
在一个实施方案中，可控孔瓦解沿支架轴进行。在一个实施方案中，所述区域的水蒸发可以在本领域已知的适当压力下例如通过在所述区域使用热空气而实现。根据本发明的这个方面，干燥区域将没有孔，或者在另一个实施方案中，通过由于表面张力组织而控制这些孔的瓦解而使该区域中多孔程度减小。
在另一个实施方案中，该可控的孔闭合可用于生成支架，应用其在需要生物挡板时。在一个实施方案中，术语“生物挡板”指将物理隔离一个区域的生物活性和相邻区域的生物活性的物体。
在一个实施方案中，该可控的孔闭合支架可用于播种细胞的支架以给予特殊生物活性，这如美国专利4458,678或美国专利4,505,266中所描述。在一个实施方案中，由可控孔闭合而产生的生物挡板产生了无孔区域，或者在另一个实施方案中，产生可穿过细胞的区域，或者在另一个实施方案中，产生了这两种区域。在某些实施方案中，该挡板可用于分开播种在支架中的特殊类型细胞，或者在另一个实施方案中，用于在分开的区域产生不连续环境，每个具有特殊的生物化学组成，例如在细胞因子、生长因子、趋化激素等的浓度和/或类型上发生变化的区域。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于盐浓度增加的溶液梯度的步骤。在一个实施方案中，曝于盐造成至少一种细胞外基质组分在所述支架中的选择性增溶。在另一个实施方案中，至少一种细胞外基质组分的增溶随盐浓度的增加而增加。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，所制备的梯度支架还可以通过控制所得支架的化学组成而进一步受到影响。在一个实施方案中，化学组成可以通过描述于美国专利4,280,954中的多种方法来控制。
例如在一个实施方案中，支架由I型胶原蛋白和GAG的接枝共聚物组成，其比例通过调节用于混合以形成共聚物的大分子的质量来控制的。
在一个实施方案中，冷冻干燥并升华所述混合物，产生在整个固体体积中具有均匀组成的多孔材料。在一个实施方案中，然后将固体曝于增加的盐梯度中，例如NaH2PO4或者在另一个实施方案中为NaCl，或者在另一个实施方案中为电解质，或者在另一个实施方案中，它们的组合(例如参见Yannas等，JBMR，14第107-131页，1980)。
在一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为0.001-10。在另一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为0.001-1，或者在另一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为0.01-10，或者在另一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为0.1-10，或者在另一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为1-10，或者在另一个实施方案中，盐溶液对应于离子浓度为1-20，或者在另一个实施方案中为可进行选择性增溶且保持支架完整的任何浓度。
在一个实施方案中，然后将支架曝于水。在另一个实施方案中，细胞外基质组分的增溶随溶剂浓度的增加而增加。
在一个实施方案中，硫酸盐使固体中的GAG增溶。在另一个实施方案中，盐浓度的增加使GAG增溶增加，导致胶原蛋白/GAG比例的梯度。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，至少一种细胞外基质组分的消化随酶浓度的增加而增加。
在一个实施方案中，术语降解或增溶包括部分降解或部分增溶，或者在另一个实施方案中，包括完全降解或增溶。
在一个实施方案中，所述酶为胶原酶、糖苷酶或其组合。在一个实施方案中，所述酶为催化配糖键断裂的内切糖苷酶。在一个实施方案中，所述内切糖苷酶为类肝素酶，例如类肝素酶I、II或III。在另一个实施方案中，内切糖苷酶为糖醛酸酶，例如Δ4，5-类肝素酶。在另一个实施方案中，糖苷酶为内切木糖苷酶、内切半乳糖苷酶、N-糖苷酶或内切葡糖醛酸酶。
在一个实施方案中，酶为纯化过的酶，或者在另一个实施方案中，来自重组源。
在一个实施方案中，酶的浓度为0.001-500U/ml。在另一个实施方案中，酶的浓度为0.001-500U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.001-1U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.001-10U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.01-10U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.01-100U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.1-10U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为0.1-100U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为1-10U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为1-100U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为10-100U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为10-250U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为10-500U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为100-500U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为100-250U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为50-100U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为50-250U/ml，或者在另一个实施方案中，酶的浓度为50-500U/ml。
在一个实施方案中，酶的活性可以通过本领域技术人员熟知的任何方法来测定。在一个实施方案中，酶促GAG的降解可以通过质谱、质子核磁分析和碳13核磁分析来测定，或者在另一个实施方案中，通过毛细管HPLC-ESI-TOF-MS、高效液相色谱(HPLC)、常规色谱、凝胶电泳等进行测定。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，梯度支架可以通过以下步骤制备制备由具有特殊组成的聚合物(为共聚物)组成且以可控方式沿特定轴或根据所需形状消化或增溶支架的至少一个组分，从而得到梯度支架。
在一个实施方案中，形成了两种不同的细胞外基质组分的接枝共聚物，例如I型胶原蛋白和GAG。在另一个实施方案中，胶原蛋白/GAG的最终比例可以通过本领域已知方法等于85/15-100/0重量/重量之间的任何组合(Yannas等，PNAS1989，86933)。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，然后将聚合物链曝于胶原酶的浓度梯度一段时间，其中在另一个实施方案中，变化这个时间，这在另一个实施方案中可以在这些暴露的支架部分为例如胶原蛋白提供更好的消化。在一个实施方案中，消化是酶浓度的函数，或者在另一个实施方案中，是暴露于给定浓度的时间的函数，或者在另一个实施方案中，是它们的组合的函数。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，温度梯度为25-200℃。在另一个实施方案中，将支架曝于温度梯度产生交联密度在所述支架中的梯度。
在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在一个实施方案中，交联密度可以通过本领域已知的任何方式而被影响。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，曝于交联剂产生交联密度在所述支架中的梯度。
在一个实施方案中，具有变化的交联密度的梯度支架可以经由改进的已知方法(例如Yannas等，1980，J.Biomed.Mat.Res.14107-131；Dagalakis等，1980，J.Biomed.Mat.Res.15511-528；或者美国专利4,522,753)而得到，其中将冷冻干燥的支架放置于真空烘箱中并且曝于温度和/或真空下。在一个实施方案中，例如在通过所述在酸性pH下溶液的沉淀而制备时，该曝露将交联引入了包含呈离子络合形式的胶原蛋白和GAG的支架中。
在一个实施方案中，交联密度的空间控制可以通过将未交联支架在真空下(例如在真空烘箱中)经历温度梯度而实现。该带有可控温度分布的烘箱对本领域技术人员是已知的，并且可以包括，例如在烘箱内安装具有特殊形状的加热元件，从而可以将一侧加热到与另一侧不同的温度。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，交联密度为升高温度的函数。
在另一个实施方案中，具有交联密度梯度的梯度支架可以使用交联剂制备。
在一个实施方案中，交联剂为戊二醛、甲醛、多聚甲醛、福尔马林、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳二酰亚胺(EDAC)或紫外光或其组合。在一个实施方案中，交联剂的浓度可以为以下范围戊二醛或甲醛，0.01-10％；(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳二酰亚胺(EDAC)，0.01-1000mM；以及紫外光，100-50,000μW/cm2。
在一个实施方案中，本方法可包括制备冷冻干燥的固体支架，并且将支架曝于一系列的交联剂浓度增加的浴，其中所述交联剂如所述例如为戊二醛或(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳二酰亚胺(EDAC)。在另一个实施方案中，可以将冷冻干燥的支架曝于压力梯度，例如美国专利4,448,718中描述的甲醛气体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的生物相容性的不均匀多孔固体支架的方法，其包括步骤(a)将至少一种细胞外基质组分或其类似物的溶液冷冻干燥；(b)升华在步骤(a)的淤浆中形成的冰晶以产生具有均匀分布孔的支架；(c)润湿在步骤(b)中形成的支架的至少一个区域；和(d)将在步骤(c)中产生的润湿区域在标准大气压的条件下曝于干燥，
其中将所述润湿区域曝于干燥导致在该区域中孔的瓦解，因此形成生物相容性的不均匀多孔固体支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于盐浓度增加的溶液梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括(a)制备至少一种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)将步骤(a)的溶液冷冻干燥以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于盐浓度增加的溶液梯度；其中将所述支架曝于所述盐浓度增加的溶液梯度造成至少一种细胞外基质组分的选择性增溶，并且所述增溶随硫酸盐浓度的增加而增加，因此形成固体生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，所述酶使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含一种或多种细胞外基质组分或其类似物的固体生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于酶浓度增加的溶液梯度，所述酶对所述两种或更多种细胞外基质组分的至少一种进行消化；其中将所述支架曝于所述梯度溶液造成所述两种或更多种细胞外基质组分的至少一种的选择性消化，并且所述消化随酶浓度的增加而增加，因此形成固体生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于温度梯度的步骤。在另一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含一种或多种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备两种或更多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于温度梯度，其中将所述支架曝于所述温度梯度造成交联密度在所述支架中的梯度，因此形成固体多孔生物相容性梯度支架。
根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，本方法还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括步骤(a)制备至少一种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度，其中将所述支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度造成交联密度在所述支架中的梯度，因此形成固体多孔生物相容性梯度支架。
在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明方法制备的梯度支架。
应理解的是任何制备本发明梯度支架的方法或任何通过本发明方法制备的支架应看作本发明的一部分。
在一个实施方案中，对这里描述的方法和结构的小变化可能形成其特征为沿轴呈不连续变化的不均匀性的支架，在一个实施方案中根据一个具体几何形状沿支架的一个或多个轴呈线性变化，或者在另一个实施方案中呈循环变化，或者在另一个实施方案中呈三维变化。
在一个实施方案中，梯度可以在整个支架中沿着两个或三个轴。在一个实施方案中，该排列可以经由控制这里所列的任何或几个参数而得到。在一个实施方案中，对于给定区域梯度可以沿一个轴呈线性变化，并且在线性区域末端点沿相同轴呈非线性变化，例如指数变化。应理解的是所有这些代表着本发明的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包括将本发明支架植入受体的步骤的受体器官或组织工程方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包括将本发明支架植入受体的步骤的受体器官或组织修复或再生的方法。
根据本发明的这些方面，在一个实施方案中，支架可以为通过本发明方法制备的一种。
在一个实施方案中，本发明方法可用于连接体组织工程、修复或再生。在一个实施方案中，术语“连接体组织”指物理连接两种不同组织的组织，其在两种不同的组织之间提供了物理连接。在一个实施方案中，连接体组织进行非特定连接，例如筋膜的存在。在另一个实施方案中，连接体组织具有功能性质，例如腱、韧带、关节软骨等，而在一个实施方案中，由此相连的一种或两种组织合适的发挥功能取决于连接体组织的整合性、功能或其组合。
例如在一个实施方案中，腱与骨骼连接包括将胶原蛋白纤维(夏贝氏纤维)插入骨骼中。该纤维具有与腱和骨骼中的胶原蛋白不同的结构。矿物结构也不同，在腱中不含羟基磷灰石，而在与骨骼紧邻的区域，胶原蛋白纤维通过加入增多的羟基磷灰石晶体而被钙化，并且在与骨骼对合的区域在胶原蛋白纤维组成上基本无法区分。
在一个实施方案中，在天然组织受到损伤(在一个实施方案中由于外伤)的情况下将支架用于组织的修复、再生。在一个实施方案中，本发明的梯度支架可用于连接体组织的修复、再生或工程，在另一个实施方案中，可用于促使连接体组织连接的组织的物理连接的建立。例如，腱修复和与骨骼的再连接可以经由使用本发明的梯度支架得到促进并且代表本发明的一个实施方案。在另一个实施方案中，梯度支架允许掺入发展/修复/再生组织所需要的各细胞。
根据本发明的这些方面，在一个实施方案中，本方法还包括将细胞植入受体的步骤。在一个实施方案中，将细胞播种在所述支架上。在另一个实施方案中，细胞为干细胞或祖细胞。在另一个实施方案中，本方法还包括给予受体细胞因子、生长因子、荷尔蒙或其组合的步骤。在另一个实施方案中，器官或组织工程由不同种类的细胞组成。在另一个实施方案中，工程的器官或组织为连接体器官或组织，而在另一个实施方案中为腱或韧带。
由以上描述可以看出，本公开的想法具有许多优点。例如本公开的想法提供制备一种可植入的梯度支架，所述梯度支架可以具有变化的机械性质以适应于给定支架设计的需要。例如可以改变孔径和材料密度以制备具有所需机械结构的支架。具体而言，在制备可提供所需量的细胞迁移和所需量的结构刚度的支架时，支架的孔径和材料密度的这种变化是尤其有用的。此外，根据本公开的想法，可以制备这种可植入器件，其不仅具有合适的物理微观结构以在植入时具有所需细胞活性，而且具有组织中天然存在的生物化学(胶原蛋白、生长因子、粘多糖等)，其中将支架植入以用于例如组织修复或再生。
下列实施例用于对本发明某些实施方案进行实践的指导，并且不认作是以任何方式对本发明应用上的限制。
实施例实施例1构建具有变化孔径的梯度支架的冷冻升华方法制备淤浆将细胞外基质组分如microfibriallar、由牛腱中分离的I型胶原蛋白(IntegraLifeSciences)和由鲨鱼软骨中分离的6-硫酸软骨素(Sigma-Aldrich)与0.05M乙酸在约为3.2的pH下结合，并在4℃及15,000rpm下进行混合，然后在50mTorr的真空下脱气。
改变孔径将悬浮液放置于容器中，并且仅将容器的一部分(至多为长度的10％)浸没在过冷的硅油浴中(Loree等，1989)。测定冷冻淤浆的平衡时间，并且在达到热平衡以前停止冷冻。然后将容器从油浴移去，随后经由冷冻干燥(例如VirTis Genesis冻干器，Gardiner，NY)而使淤浆升华。因此在淤浆中产生热梯度，形成了冷冻前沿，其在进行冷冻干燥的热平衡以前停止，产生升华，导致具有分级平均孔径的基质共聚物。
在另一种方法中，将悬浮液放置于在冷冻器架板上的容器中，并将分级保温层放置于容器和架板之间，这也导致形成了上述的梯度冷冻前沿。分级的保温层可以通过任何方法构建，包括使用具有变化导热率的材料，例如铝和铜，或铝和树脂玻璃等。
实施例2用于构建具有变化孔径的梯度支架的可控制孔闭合的方法制备支架如实施例1制备支架，不同之处为在冷冻干燥和升华以前将淤浆完全浸入在油浴中，从而使支架具有较均一的平均孔径。
改变孔径润湿所制得支架的一个区域，在合适的压力下例如经由使用热空气干燥器而使水由该区域蒸发。由于在水的蒸发过程中微孔经受了高的表面张力，其导致孔的瓦解。经由控制进行孔瓦解的支架区域而对具体的孔瓦解进行控制。
实施例3用于构建具有变化化学组成的梯度支架的增溶方法制备支架支架由I型胶原蛋白和粘多糖(GAG)的接枝共聚物制备。将I型胶原蛋白和6-硫酸软骨素在pH约为3.2的0.05M乙酸中进行结合，并在4℃及15,000rpm下进行混合，然后在50mTorr的真空下脱气。胶原蛋白/GAG的比例通过所述调节它们各自的用于形成悬浮液的质量来控制(Yannas等，1980，J.Biomedical Materials Research 14107-131)。然后冷冻干燥并升华悬浮液以形成胶原蛋白/GAG比例在整个支架中较为均匀的多孔支架。
改变化学组成将支架曝于盐溶液的增加浓度梯度下，例如Na2HSO4或NaCl或电解质，该盐溶液使GAG增溶，并且更易于增溶较大质量的GAG，从而胶原蛋白/GAG的比例梯度沿着一个特定轴形成。该溶液的离子强度为0.001-10。对于进一步的细节和实施例参见Yannas等，J.Biomed.Mat.Res.14107-131，1980。
实施例4用于构建具有变化化学组成的梯度支架的酶促消化方法制备支架如所述(Yannas等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，933-937)，支架由胶原蛋白I型胶原蛋白和GAG的接枝共聚物制备成最终胶原蛋白/GAG的比例为98/2重量/重量。
改变化学组成将支架的部分浸入一系列具有增加胶原酶浓度的浴(如Huang和Yannas，1977，J.Biomedical Materials Research 8137-154中所述而制备)中，其导致支架的曝露区域的胶原蛋白溶解的增加。糖苷酶也可以用于降解支架中的GAG组分。所用酶的浓度可以为0.001-500U/ml。
实施例5用于构建具有变化交联密度的梯度支架的方法由胶原蛋白和从酸性pH溶液中沉淀出的GAG的悬浮液制备的支架如以前所述而制备(Yannas，I.V.等，1980，J.Biomedical Materials Research 14511-528；Yannas等，86(3)933-937，1989)。将支架放置于真空烘箱中，并且烘箱中的温度和真空条件随时间和将变化的交联度引入支架的条件的变化而变化。
支架中的交联密度随温度的增加而增加。温度可以经由多种方法而变化，包括使用具有可控温度分布的烘箱。在某些实例中，可以在结构中放置电子加热元件来构建烘箱，从而将一侧加热到与另一侧不同的温度，因此在两侧之间形成温度梯度。支架中的交联密度的梯度大小因此可以通过控制烘箱中的温度梯度(可以为25-200℃)来控制。
可以将化学交联剂以在支架中产生梯度交联密度的方式加入支架中。一种方式为通过如前所述将冷冻干燥的支架曝于一系列具有增加交联剂浓度的溶液浴中，其中所述交联剂例如浓度为0.01-10％的戊二醛或甲醛或者浓度为0.01-1000mM的EDAC。另一种方式为通过将支架曝于压缩气体交联剂的梯度，例如甲醛(参见美国专利4,448,718)，或者例如为100-50,000μW/cm2的紫外光。
本领域技术人员应意识到本发明不受上文具体所述的限制，它们仅作为本发明的某些实施方案的范例。
权利要求
1.一种包含聚合物的固体多孔生物相容性梯度支架。
2.权利要求1的梯度支架，其中所述聚合物包含至少一种合成或天然聚合物、陶瓷、金属、细胞外基质蛋白质或其类似物。
3.权利要求2的梯度支架，其中所述细胞外基质蛋白质包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
4.权利要求3的梯度支架，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
5.权利要求1的梯度支架，其中所述支架为不均匀多孔的。
6.权利要求5的梯度支架，其中所述支架中的孔具有不均匀的平均直径。
7.权利要求6的梯度支架，其中所述孔的平均直径为0.001-500μm。
8.权利要求6的梯度支架，其中所述孔的所述平均直径作为其在所述支架中空间组织的函数而变化。
9.权利要求8的梯度支架，其中所述孔的所述平均直径沿所述支架的任意轴变化。
10.权利要求5的梯度支架，其中所述支架包含无孔区域。
11.权利要求10的梯度支架，其中所述区域不能穿过回转半径或有效直径至少为1000Da大小的分子。
12.权利要求6的梯度支架，其中所述支架在平均孔径或孔径分布、组分浓度、交联密度或其组合上变化。
13.权利要求1的梯度支架，其中所述支架的特征在于在0-0.009的孔分数范围内逐步改变孔的体积分数。
14.权利要求1的梯度支架，其中所述支架沿所需方向在组分浓度、交联密度或其组合上变化。
15.权利要求1的梯度支架，其中所述聚合物在所述支架中的浓度作为其在所述支架中的空间组织的函数而变化。
16.权利要求15的梯度支架，其中所述浓度沿所述支架中的给定方向而变化。
17.权利要求1的梯度支架，其中所述支架的交联密度沿所述支架中的所需方向而变化。
18.权利要求1的梯度支架，其中所述支架还包含细胞、生长因子、细胞因子、荷尔蒙或其组合。
19.一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的不均匀多孔固体生物相容性梯度支架的方法，其包括以下步骤(a)在于冻结温度下产生梯度的条件下，对至少一种细胞外基质组分或其类似物的溶液进行冷冻干燥，和(b)在于所述冷冻干燥过程中达到热平衡以前，升华在步骤(a)的淤浆中所形成的冰晶；其中冰晶沿着作为梯度冻结温度的函数的梯度而形成，并且所述冰晶的升华形成了沿所述梯度而排列的孔。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
21.权利要求20的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
22.权利要求20的方法，其中在所述支架中形成的孔具有不均匀的平均直径。
23.权利要求19的方法，其中形成的所述孔的平均直径为0.001-500μm。
24.权利要求19的方法，其中所述孔的所述平均直径作为其在所述支架中的空间组织的函数而变化。
25.权利要求19的方法，其中所述孔的所述平均直径沿所述支架的任意轴变化。
26.权利要求19的方法，其还包括以下步骤使在步骤(b)中形成的支架内的至少一个区域润湿，将润湿区域在将液体水转化为水蒸汽的合适条件下曝于干燥，使得将所述润湿区域曝于干燥造成了该区域中孔的瓦解。
27.权利要求26的方法，其中所制备的支架包含无孔区域。
28.权利要求26的方法，其中进行润湿所述区域，使得在曝于干燥之后，所述无孔区域具有特殊的形状或图案。
29.权利要求26的方法，其中所述区域不能穿过回转半径或有效直径至少为1000Da大小的分子。
30.权利要求19或26的方法，其还包括将支架曝于溶液梯度的步骤，其中所述溶液的特征在于逐渐更高的盐浓度。
31.权利要求30的方法，其中曝于所述盐导致至少一种细胞外基质组分在所述支架中的选择性增溶。
32.权利要求30的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶随盐浓度的增加而增加。
33.权利要求30的方法，其中所述盐浓度对应于离子强度为0.001-10的范围。
34.权利要求30的方法，其中所述盐为Na2PO4、NaCl或其组合。
35.权利要求30的方法，其中将支架曝于水。
36.权利要求35的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶随溶剂浓度的增加而增加。
37.权利要求19、26或30的方法，其还包括将支架曝于包含酶浓度增加的溶液的溶液梯度的步骤，其使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。
38.权利要求37的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶或降解随酶浓度的增加而增加。
39.权利要求37的方法，其中所述酶为胶原酶、糖苷酶或其组合。
40.权利要求37的方法，其中所述酶浓度为0.001-500U/ml。
41.权利要求19、26、30或37的方法，其还包括将支架曝于温度梯度的步骤。
42.权利要求41的方法，其中所述温度梯度为25-200℃。
43.权利要求41的方法，其中将所述支架曝于所述温度梯度导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
44.权利要求19、26、30、37或41的方法，其还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
45.权利要求44的方法，其中曝于所述交联剂导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
46.权利要求44的方法，其中所述交联剂为戊二醛、甲醛、多聚甲醛、福尔马林、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、紫外光或其组合。
47.一种根据权利要求19、26、30、37、41或44的方法而制备的不均匀多孔固体生物相容性梯度支架。
48.一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的不均匀多孔固体生物相容性支架的方法，其包括以下步骤(a)将一种或多种细胞外基质组分或其类似物的溶液冷冻干燥；(b)升华在步骤(a)的淤浆中形成的冰晶以产生具有均匀分布孔的支架；(c)使在步骤(b)中形成的所述支架内的至少一个区域润湿；和(d)将在步骤(c)中产生的润湿区域在大气压的条件下曝于干燥，其中将所述润湿区域曝于干燥导致该区域中孔的瓦解，从而形成不均匀多孔固体生物相容性支架。
49.权利要求48的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
50.权利要求49的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
51.权利要求48的方法，其中所述支架包含无孔区域。
52.权利要求48的方法，其中所述区域不能穿过回转半径或有效直径至少为1000Da大小的分子。
53.权利要求48的方法，其还包括将支架曝于盐浓度增加的溶液梯度的步骤。
54.权利要求53的方法，其中曝于所述盐导致至少一种细胞外基质组分在所述支架中的选择性增溶。
55.权利要求53的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶随盐浓度的增加而增加。
56.权利要求53的方法，其中所述盐浓度对应于离子强度为0.001-10的范围。
57.权利要求53的方法，其中所述盐为Na2PO4、NaCl或其组合。
58.权利要求53的方法，其中将所述支架曝于水。
59.权利要求53的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶随溶剂浓度的增加而增加。
60.权利要求48或53的方法，其还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，其使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。
61.权利要求60的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的降解程度随酶浓度的增加而增加。
62.权利要求60的方法，其中所述酶浓度为0.001-500U/ml。
63.权利要求60的方法，其中所述酶为胶原酶、糖苷酶或其组合。
64.权利要求48、53或60的方法，其还包括将支架曝于温度梯度的步骤。
65.权利要求64的方法，其中所述温度梯度为25-200℃。
66.权利要求64的方法，其中将所述支架曝于所述温度梯度导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
67.权利要求48、53、60或64的方法，其还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
68.权利要求67的方法，其中曝于所述交联剂导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
69.权利要求67的方法，其中所述交联剂为戊二醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、甲醛、多聚甲醛、紫外光或其组合。
70.一种根据权利要求48、53、60、64或67的方法而制备的不均匀多孔固体生物相容性梯度支架。
71.一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体生物相容性梯度支架的方法，其包括以下步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于盐浓度增加的溶液梯度；其中将所述支架曝于所述盐浓度增加的溶液梯度造成至少一种细胞外基质组分的选择性增溶，并且所述增溶随硫酸盐浓度的增加而增加，从而形成多孔固体生物相容性梯度支架。
72.权利要求71的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
73.权利要求72的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
74.权利要求71的方法，其中所述盐浓度对应于离子强度为0.001-10的范围。
75.权利要求71的方法，其中所述盐为Na2PO4、NaCl或其组合。
76.权利要求71的方法，其中将所述支架曝于水。
77.权利要求71的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分的增溶随溶剂浓度的增加而增加。
78.权利要求71的方法，其还包括将支架曝于酶浓度增加的溶液梯度的步骤，其使至少一种细胞外基质组分降解或增溶。
79.权利要求78的方法，其中所述细胞外基质组分的降解或增溶随酶浓度的增加而增加。
80.权利要求78的方法，其中所述酶浓度为0.001-500U/ml。
81.权利要求78的方法，其中所述酶为胶原酶、糖苷酶或其组合。
82.权利要求78的方法，其还包括将支架曝于温度梯度的步骤。
83.权利要求82的方法，其中所述温度梯度为25-200℃。
84.权利要求82的方法，其中将所述支架曝于所述温度梯度导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
85.权利要求78的方法，其还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
86.权利要求85的方法，其中曝于所述交联剂导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
87.权利要求85的方法，其中所述交联剂为戊二醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、甲醛、多聚甲醛、紫外光或其组合。
88.一种根据权利要求71、78、82或85的方法而制备的固体生物相容性梯度支架。
89.一种制备包含一种或多种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括以下步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的固体多孔支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于酶浓度增加的溶液梯度，其使所述一种或多种细胞外基质组分的至少一种进行消化；其中将所述支架曝于所述溶液梯度造成所述一种或多种细胞外基质组分的至少一种的选择性消化，并且所述消化随酶浓度的增加而增加，从而形成固体生物相容性梯度支架。
90.权利要求89的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
91.权利要求90的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
92.权利要求89的方法，其中所述酶浓度为0.001-500U/ml。
93.权利要求89的方法，其中所述酶为胶原酶、糖苷酶或其组合。
94.权利要求89的方法，其还包括将支架曝于温度梯度的步骤。
95.权利要求94的方法，其中所述温度梯度为25-200℃。
96.权利要求94的方法，其中将所述支架曝于所述温度梯度导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
97.权利要求89的方法，其还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
98.权利要求97的方法，其中曝于所述交联剂导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
99.权利要求97的方法，其中所述交联剂为戊二醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、甲醛、多聚甲醛、紫外光或其组合。
100.一种根据权利要求89、94或97的方法而制备的固体生物相容性梯度支架。
101.一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括以下步骤(a)制备至少一种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的固体多孔支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于温度梯度，其中将所述支架曝于所述温度梯度造成交联密度在所述支架中的梯度，从而形成固体多孔生物相容性梯度支架。
102.权利要求101的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
103.权利要求101的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
104.权利要求101的方法，其中所述温度梯度为25-200℃。
105.权利要求101的方法，其还包括将支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度的步骤。
106.权利要求105的方法，其中曝于所述交联剂导致交联密度在所述支架中的梯度的形成。
107.权利要求97的方法，其中所述交联剂为戊二醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、甲醛、多聚甲醛、强度足以引起交联的紫外光或其组合。
108.一种根据权利要求101或105的方法而制备的固体生物相容性梯度支架。
109.一种制备包含至少一种细胞外基质组分或其类似物的固体多孔生物相容性梯度支架的方法，其包括以下步骤(a)制备一种或多种细胞外基质组分或其类似物的接枝共聚物的溶液；(b)冷冻干燥步骤(a)的溶液以产生具有均匀组成的多孔固体支架；和(c)将在步骤(b)中形成的支架曝于交联剂浓度增加的溶液梯度，其中将所述支架曝于交联剂浓度增加的所述溶液梯度造成交联密度在所述支架中的梯度，从而形成固体多孔生物相容性梯度支架。
110.权利要求109的方法，其中所述细胞外基质组分包含胶原蛋白、粘多糖或其组合。
111.权利要求110的方法，其中所述粘多糖为硫酸软骨素。
112.权利要求109的方法，其中所述交联剂为戊二醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDAC)、甲醛、多聚甲醛、紫外光或其组合。
113.一种根据权利要求109的方法而制备的固体生物相容性梯度支架。
114.一种受体器官或组织工程的方法，其包括将权利要求1、49、70、88、100、108或113的支架植入所述受体的步骤。
115.权利要求114的方法，其还包括将细胞植入所述受体的步骤。
116.权利要求115的方法，其中将所述细胞播种在所述支架上。
117.权利要求115的方法，其中所述细胞为干细胞或祖细胞。
118.权利要求114或115的方法，其还包括给予细胞因子、生长因子、荷尔蒙或其组合的步骤。
119.权利要求114的方法，其中工程器官或组织由不同类型的细胞组成。
120.权利要求114的方法，其中工程器官或组织为连接体器官或组织。
121.权利要求120的方法，其中所述连接体组织为腱或韧带。
122.一种受体器官或组合修复或再生的方法，其包括将权利要求1、49、70、88、100、108或113的支架植入所述受体的步骤。
123.权利要求122的方法，其还包括将细胞植入所述受体的步骤。
124.权利要求123的方法，其中将所述细胞播种在所述支架上。
125.权利要求123的方法，其中所述细胞为干细胞或祖细胞。
126.权利要求122或123的方法，其还包括给予细胞因子、生长因子、荷尔蒙或其组合的步骤。
127.权利要求122的方法，其中工程器官或组织由不同类型的细胞组成。
128.权利要求122的方法，其中工程器官或组织为连接体器官或组织。
129.权利要求128的方法，其中所述连接体组织为腱或韧带。
全文摘要
本发明涉及梯度支架、其制备方法以及尤其将其用于组织工程、修复和再生应用中的方法。所述梯度支架尤其包括在整个支架中在其孔径、化学组成、交联密度或其组合上变化的支架。
文档编号A61F13/00GK101060821SQ200580039832
公开日2007年10月24日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者I·V·扬纳斯, L·J·吉布森, F·J·奥布赖恩, B·哈利, R·R·布劳, S·萨莫豪斯, M·斯佩克特 申请人:麻省理工学院