专利名称：用于预防和治疗呼吸系统疾病的山豆根提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗呼吸系统疾病的苦参(SophoraeRadix)提取物。本发明还涉及包含苦参提取物的用于预防和治疗呼吸系统疾病的药物，所述的预防和治疗呼吸系统疾病是因这些药物在预防气道收缩、呼吸道感染、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶4、气道高反应性或气道重建、白细胞三烯D4以及具有止咳作用中的极佳作用所致。
背景技术：
哮喘是具有呼吸困难、咳嗽和喘鸣的反复和间歇性的症状的典型呼吸系统疾病。约30％的儿科哮喘患者在初生1年中就开始表现出症状，而约80％的哮喘患者在4-5岁时表现出症状。在韩国，哮喘的暴发率在约10％。
哮喘的发病率根据国家、种族、年龄等的不同可以在一定程度上变化。根据1991年英国的报告，约7％的成年人和13.5％的儿童患有哮喘。在韩国，哮喘患者的数量因生活方式和环境条件，诸如严重的污染和蓄积的紧张状态的剧烈改变而在增加。近来因环境污染，诸如污染物而导致发生哮喘的年龄下降且其症状已经延长。
作为哮喘特征之一的呼吸阻塞通过3步发生即支气管平滑肌收缩；肺粘膜胼胝体形成和支气管及细支气管中粘液蓄积。在它们中，支气管平滑肌收缩更易于恢复。
在外因性(过敏性)哮喘发作中，已知IgE起极为重要的作用并且还通常涉及IgG。IgE通过活化肥大细胞诱导超敏反应释放介体(组胺、SRS-A、ECF-A、NCF、PAF、激肽、PGs等)。对内因性(非过敏性)哮喘仍然并不了解，但这种类型的哮喘看起来由自主神经介导。在内源性哮喘患者中，胆碱能刺激可以直接释放介体，诸如来自肥大细胞的组胺，杯状细胞的分泌增加，肺血管扩张和气管、支气管和大的细支气管收缩，由此导致支气管痉挛和粘液释放增加。
迄今为止，仍然没有治愈哮喘。尽管存在用于预防因哮喘导致的痉挛和并发症的许多方法和药物，但是它们仍然不令人满意。预防哮喘发作的最有效的方式之一可能在于发现涉及导致哮喘的确切因素。已经用于治疗哮喘的治疗剂的实例为吸入支气管扩张药、口服或可注射支气管扩张药(交感神经刺激剂和茶碱类)、类固醇制剂(吸入、口服和可注射形式等)、白细胞三烯拮抗剂(孟鲁司特、普仑司特、齐留通等)、抗过敏药(色甘酸钠、酮替芬等)等。
支气管炎可以为急性或慢性的。根据其原因的不同，将支气管炎分成过敏性、感染性和外因性支气管炎，而从病理学上说，它是传统的卡他性支气管炎、化脓性支气管炎、闭塞性支气管炎、溃疡性支气管炎和浸润性支气管炎。支气管炎的最常见的原因在于因感染细菌、病毒、真菌等所致。正常情况下不感染上述病原体的人在其免疫系统低下时可以被感染。过敏性支气管炎可以为因吸入过敏原导致的直接过敏反应或因全身过敏反应导致的部分症状。外因性支气管炎可以因化学刺激物，诸如氯和二氧化硫气体或因物理刺激物，诸如粉尘而发生。生活在具有污染空气的大城市中的人易发生呼吸道感染。就急性支气管炎而言，从病理学观点来看，易于观察到红核、肿胀和干燥病，并且还有粘液或脓液分泌。一般而言，哮喘可以恢复而无不能治愈的并发症。然而，如果它发展成慢性哮喘，那么它可产生肿胀、胼胝体和萎缩。在延长的慢性哮喘中，它导致纤维增生、支气管狭窄或肺气肿。支气管炎的最特有的症状为咳嗽和粘痰。如果支气管炎的原因是感染，那么通常发生发热和胸痛，而如果它是因外因所致，那么通常发生对口腔、鼻、眼等粘膜的刺激。在疗法中，认为咳嗽是一种身体防御且由此并不推荐有意识地止咳。必需的情况是实施针对所述原因的疗法与其它措施。在冬季，需要增加室温并且给予少量可待因、阿托品、麻黄碱、抗组安药等。类固醇或茶碱类在治疗感染中的应用并不令人满意。
鼻部过敏性炎症通常指的是鼻变态反应或过敏性鼻炎。它使人发生猝然连续的咳嗽的症状，流大量澄清的鼻粘液，鼻部不通气，头重，流泪等症状。当这些症状类似，但未确定过敏原时，它是血管痉挛性鼻卡他。例如，上述症状在体温于早晨短暂降低时发生并且它们通常在几小时内恢复，并且这些症状通常在寒冷季节中的人中观察到。这种情况有时可能与鼻部感冒混淆，但它不同于感冒且通常伴随哮喘和荨麻疹。
过敏性鼻炎中的过敏反应为抗原-抗体超敏反应，其中组胺从肥大细胞和嗜碱粒细胞的细胞壁中释放，并且释放花生四烯酸以通过环加氧酶(COX)和5-脂氧合酶(5-LO)产生前列腺素和白细胞三烯，由此介导在接触抗原后2-90分钟发生的初步反应和此后4-8小时发生的后反应。最初的反应通过介导物质进行，而后反应由细胞浸润介导。此后，过敏性和非-过敏性鼻炎均作为发生哮喘的危险因素。
在疗法中，当清楚地鉴定了抗原时，进行脱敏。其它疗法，诸如使用药物、手术、物理疗法，但并不将它们视为可完全治愈的手段。
存在各种因诸如化脓菌、特殊细菌(结核分支杆菌、白喉棒杆菌、螺旋体等)、病毒、真菌导致的呼吸道感染，并且还将它们分成急性和慢性呼吸道感染。当鼻腔、咽和喉独立地受到感染时，根据相应器官的名称命名疾病。然而，当上述器官作为整体受到感染时，它们称作上呼吸道感染，并且有代表性的实例为上呼吸道疾病。除此之外，就特殊细菌或真菌导致的感染情况而言，它们还通常称作上呼吸道结核病、上呼吸道白喉、上呼吸道念珠菌病等。
如上所述，呼吸系统疾病，诸如哮喘、过敏性鼻炎、急性和慢性支气管炎在其原因或症状方面不同，但它们在以下几个方面中具有共同的特征。
首先，它们均为炎性疾病。这些呼吸系统疾病由过敏原、感染等导致，但炎症在疾病的加剧和治疗中起关键作用。即过敏原、感染等刺激的白细胞引入呼吸道并且在其中活化和从白细胞和炎性介体中释放的各种细胞因子使疾病恶化并且影响治疗。
其次，呼吸道收缩和舒张无法正常进行，由此使得呼吸困难。即呼吸道受到损伤，由此对正常刺激物产生过度的反应(哮喘)或它变得过于狭窄而无法进行正常的支气管呼吸，由此需要适当治疗。
第三，在主要的药物疗法中，抗炎药、抑制呼吸道收缩的活性剂、支气管扩张药、抑制呼吸道舒张的活性剂起重要作用并且其它治疗药也通常联用。例如，通常使用抗组胺药、抗胆碱能药、β2受体激动剂、类固醇、白细胞三烯D4受体拮抗剂、茶碱的磷酸二酯酶4抑制剂。虽然如此，但是支气管扩张药，诸如抗胆碱能药、β2受体激动剂等在治疗炎症中无效，它们仅可以单纯缓解症状。因此，长期使用治疗药物可以产生耐药性并且仍然存在恶化的风险。已知类固醇可有效治疗炎症，但它们具有严重副作用，并且不适合于长期使用且还证实它们在治疗慢性支气管炎中无效。因此，开据上述两种药物的处方以便联合给药，而因类固醇药物的副作用，已经将其配制成非口服给药形式的吸入剂型，由此因给药困难而造成依从性降低。因此，需要研发一种可以解决上述目前使用治疗药物的局限并且有效改善症状的新的治疗药物。然而，如上所述，各种白细胞或不同细胞因子或炎性介体涉及呼吸系统疾病，难以使用单一组分化学物质治疗呼吸系统疾病且由此具有各种活性组分和机制的天然提取物能够用作有效的治疗药物。
此外，看起来存在许多导致呼吸系统疾病，诸如哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎、急性下呼吸道感染(支气管炎、细支气管炎等)、急性上呼吸道感染(扁桃体炎、咽喉炎)的原因，但是治疗它们仅是短暂缓解，并且通常在治疗后存在疾病复发的问题。因此，预防和治疗呼吸系统疾病已经上升为医学科学中需要实现的最重要的任务之一，并且研发呼吸系统疾病的基础预防和治疗的新的治疗药物是迫切的需求。
作为原料药使用的本发明苦参为具有1-2m高的灌木。它具有约2-5条具有淡棕黄色的圆柱状根。其茎具有圆柱形，在表面上具有沟并且覆盖有致密的短和软的体毛，其中茎的上部分一般为弯曲的，成中文的″之″字形式。在干燥后用作药物的根具有长的圆柱形并且略为弯曲，具有10-25-35cm长，直径为0.3-1cm。其表面为棕色或暗棕色，具有垂直形成的皱纹和具有少许旋光性的长皮孔。其主要产地在中国的广西省。在东方医学中，它已经用于治疗肿瘤、水肿、疼痛、黄疸、腹泻、痔等。其活性组分为生物碱类，诸如苦参碱、氧化苦参碱、臭豆碱、甲基野靛碱等；和黄酮类，诸如广豆根素、广豆根酮、环广豆根素、环广豆根酮等(Chinese Medicine Encyclopedia，Jungdam Publishing，pp.2627-2632，1998)。然而，苦参提取物对呼吸系统疾病的作用尚未研究。
发明概述本发明的发明人已经进行了广泛深入的努力以便研发有效治疗呼吸系统疾病的治疗药物并且作为结果，已经发现苦参提取物具有极佳的抑制呼吸道收缩、呼吸道感染、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶4、气道高反应性和气道重建的活性；对白细胞三烯D4的拮抗活性；和止咳作用。因此，本发明的目的在于提供用于预防和治疗呼吸系统疾病的包含苦参提取物作为活性组分的治疗药物。
附图简述本发明的上述方面和其它特征在下文的描述中结合附图解释，其中附
图1为表示对气道高反应性的作用的示意图[SAL盐水，OVA卵清蛋白，SOS制备实施例2中制备的提取物]；附图2A-F为表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中气道粘液表达的作用的照片；附图3为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中气道粘液表达的作用的直方图；附图4A-F为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中α-平滑肌表达的作用的照片；
附图5为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中α-平滑肌表达的作用的直方图；附图6A-F为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中支气管周围纤维化的作用的照片；附图7为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中纤维化的作用的直方图；附图8为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠总肺胶原蛋白含量的作用的直方图；且附图9为表示制备实施例2制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏的和-攻击的小鼠肺组织中IL-4、IL-5和IL-13蛋白质表达的作用的蛋白质印迹结果。
发明详述本发明在一个方面中涉及用于预防和治疗呼吸系统疾病的苦参提取物。本发明在另一个方面中涉及包含苦参提取物作为活性组分的药物，其具有极佳的抑制呼吸道收缩、呼吸道感染、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶4活性、气道高反应性的作用和抑制气道重建的活性；对白细胞三烯D4的拮抗活性；止咳作用；由此用于预防和治疗呼吸系统疾病，诸如哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、急性下呼吸道感染(支气管炎、细支气管炎等)、急性上呼吸道感染(咽喉炎、扁桃体炎、喉炎)等。
在下文中更具体地描述本发明。
制备本发明苦参提取物的方法如下。
1)通过使用相对于苦参重量约7-10倍的水或醇溶液经回流且然后过滤提取苦参粗粉。通过加入相对于合并的苦参重量约4-7倍的水或醇溶液，随后加热且然后过滤再次提取残渣。因此，将获得的两次滤液彼此合并并且过滤。
2)通过使用等量的水饱和的低级醇或非极性溶剂且然后在50-60℃和减压下浓缩使上述步骤1)中获得的滤液进行相分离。
3)通过加入相对于上述步骤2)中获得的浓缩物总重约20-50倍的水使上述浓缩物进行共沸浓缩，将其均匀地悬浮于等量的水中且然后在冻干下放置。
更具体地说，向最初的苦参粗粉中加入水或醇溶液并且在回流状态下提取2-5小时，其中水或醇溶液的量优选约为苦参粗粉重量的7-10倍。然后过滤上述提取物。然后向滤液中加入约苦参粗粉重量4-7倍的水或醇溶液，加热，再提取2-5小时，过滤并且与先前获得的滤液合并，由此增加提取效率。
在本文中，如果水量过少，那么就不能提供充分的搅拌并且还降低了所得提取物的溶解度，由此降低了提取效率；而如果水量过多，那么在接下来的纯化步骤中使用的低级醇和非极性溶剂的量就会增加，由此造成浪费且还增加了操作问题。
在本发明中，提取由首次提取或二次提取组成。当批量产生提取物粗品时，它通常含有大量水分，这是因尽管进行了有效过滤，但是药物粗粉自身原因导致。因此，本发明防止了因仅进行首次提取获得的相对低的提取效率的问题。此外，本发明的本发明者对提取效率的进一步研究证实通过二次提取获得总提取物的约80-90％，这提示二次以上的提取的额外提取不一定必要并且也是浪费。
过滤如上所述进行的首次和二次提取获得的提取物，浓缩且然后纯化而可以除去不需要的杂质，诸如蛋白质、多糖类、脂肪酸等。在本发明中，向滤液中加入等量的低级醇或非极性溶剂以便进行2-4次相分离，由此获得溶剂级分，同时分离了杂质。在本文中，低级醇的实例包括具有1-6个碳原子的醇，优选丁醇、丙醇或异丙醇。非极性溶剂的实例为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或甲基乙基酮。当低级醇或非极性溶剂的量低于滤液的量时，通常因存在杂质，诸如脂肪酸而产生颗粒且由此不能有效地进行相分离，并且对活性组分的提取效率也变得相对低，由此无效。在50-60℃和减压下浓缩作为上述相分离结果获得的低级醇或非极性溶剂的级分以便除去样本中剩余的溶剂。使用相对于浓缩物总重约25-50倍的水使由此获得的浓缩物进行2-3次共沸浓缩且然后通过加入等量的水使其均匀悬浮。进行共沸浓缩的主要原因在于可有效控制剩余低级醇的含量，以便将药物粗粉的提取物用作药物的原料。
此外，除上述方法外，还可以通过用水，水饱和的低级醇或非极性溶剂提取，随后纯化来获得本发明的苦参提取物。低级醇的实例包括具有1-6个碳原子的醇，优选丁醇、丙醇或异丙醇。非极性溶剂的实例为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或甲基乙基酮。
因此，将获得的苦参提取物进行冻干且然后获得粉末形式的最终提取物。这种最终的提取物具有极佳的抑制呼吸道收缩、呼吸道炎症、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶4活性、气道高反应性和气道重建的活性；对白细胞三烯D4的拮抗活性；止咳作用等；且由此预计可用于预防和治疗呼吸系统疾病。
在临床研究中，可以通过各种口服或非肠道剂型给予本发明的苦参提取物。当配制它们时，使用稀释剂，诸如填充剂、填料、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等或赋形剂。
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒、胶囊、药片、栓剂等。通过将至少一种选自淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等的赋形剂加入到木聚糖和内酯化合物或其衍生物的混合物中制备这些固体制剂。除简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂，诸如硬脂酸镁、滑石粉等。栓剂用基质为硬脂甘油三酯类、聚乙二醇、聚山梨醇酯、可可油、月桂精油、甘油、明胶等。
口服给药用液体制剂为混悬液、溶液(糖浆剂、饮料等)、乳剂等。例如，除最常用的稀释剂，诸如水或液体石蜡外，还可以使用各种赋形剂，诸如湿润剂、增甜剂、矫味剂和防腐剂。
非肠道给药用制剂为无菌溶液、非水溶液、混悬液、乳剂、冻干粉。用于非水溶液、混悬液或乳剂的溶剂为植物油、丙二醇、聚乙二醇、橄榄油和油酸乙酯。
本发明的苦参提取物已经作为民间验方使用了较长时间并且其安全性已经被毒性试验证实。苦参提取物的剂量取决于各种因素，诸如身体吸收率、体重、年龄、性别、健康状况、受试者的膳食或给药所需的时间、给药方法、排泄率、疾病严重性等。正如在药理实验中证实的，优选给予约1-15mg/kg体重的苦参提取物。因此，应考虑到药物功效的有效范围生产用作药物活性组分的本发明苦参提取物且由此可以在定期间隔或/或按照医学专家监督或受试者要求特定疗法给予生产的单位剂型的药物制剂。
参照下列实施例更具体地描述本发明，然而，不应将它们视为对本发明范围的限制。
制备实施例1苦参提取物的制备充分混合粉碎成约1.0cm大小的250g苦参并且向其中加入2L水且然后在搅拌的同时加热提取5小时。收集所得滤液并且向残渣中加入1.5L水并且加热提取3小时。合并上述两次滤液且然后浓缩至最终的1.5L体积。向上述浓缩物中加入等体积的水饱和的正丁醇并且进行3次相分离。仅收集正丁醇级分并且在58℃和减压下浓缩至提取物变干燥。在蒸发大部分正丁醇和水后，加入0.1L水并且进行3次共沸浓缩。将所得物质重新悬浮于等量的蒸馏水中且然后冻干至最终获得粉末形式的苦参提取物。
制备实施例2苦参提取物的制备用水清洁苦参并且干燥。向250g苦参中加入2L 50％(v/v)乙醇溶液并且在搅拌的同时回流提取6小时。收集所得滤液并且向残渣中加入1.5L 30％(v/v)乙醇溶液并且加热提取3小时。合并上述两次滤液且然后浓缩至最终的1.5L体积。向上述浓缩物中加入等体积的水饱和的正丁醇并且进行3次相分离。仅收集正丁醇级分并且在58℃和减压下浓缩至提取物变干燥。在蒸发大部分正丁醇和水后，加入0.2L水并且进行3次共沸浓缩。将所得物质重新悬浮于等体积的蒸馏水中且然后冻干至最终获得粉末形式的苦参提取物。
制备实施例3苦参提取物的制备用水清洁苦参并且干燥。向250g苦参中加入2L水饱和的正丁醇溶液并且在搅拌的同时回流提取6小时。收集所得滤液并且向残渣中加入1.5L水饱和的正丁醇溶液并且加热提取3小时。合并上述两次滤液且然后在58℃和减压下浓缩至提取物变干燥。在蒸发大部分正丁醇和水后，加入0.2L水并且进行3次共沸浓缩。将所得物质重新悬浮于等体积的蒸馏水中且然后冻干至最终获得粉末形式的苦参提取物。
实施例1有关抑制气道收缩的实验(体外)为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对气道收缩的抑制作用，如下所述使用切除的支气管进行实验且结果如表1中所示。通过静脉内注射1.5mL/kg抗卵清蛋白抗血清使Hartely雄性豚鼠(400-450g，SLC，Japan)致敏。致敏后48小时，通过放血处死豚鼠且然后分离其气管。在Krebs-Heseleit溶液中除去与支气管粘连的其它组织并且切下环形的支气管，使得它含有2-3个软骨。保持支气管肌肉的完整性，但是切下环的软骨部分并且用两侧上的缝合线连接且吊在器官浴槽中。在稳定后，放入它以便通过添加10μg/mL卡巴胆碱诱导最大收缩。用Krebs-Heseleit溶液洗涤支气管并且使其稳定。加入吲哚美辛(2μmoles)并且在1分钟后将测试物质‘X’加入器官浴槽。在5分钟内加入10μg/mL卵清蛋白(OVA)以便诱导收缩。通过比较用卡巴胆碱和OVA诱导的收缩计算气道收缩率。通过使用与力传感器(FT4，BioPAC系统)连接的生理活性测定装置(MP150，BioPAC系统)测定气道收缩/舒张。
表1
正如上述表1中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制气道收缩的作用。
实施例2有关气道收缩抑制的实验(体内)为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对气道收缩的抑制作用，如下所述通过使抗原接触致敏的豚鼠进行实验且结果如表2中所示。通过静脉内注射1.5mL/kg抗卵清蛋白抗血清使Hartely雄性豚鼠(400-450g，SLC，Japan)致敏。致敏后48小时，对豚鼠口服给药。在30分钟内，通过分别皮下注射10mg/kg马来酸吡拉明、10mg/kg吲哚美辛和0.1mg/kg普萘洛尔预治疗豚鼠。然后将豚鼠放入安装了用于测定各种呼吸指数的容积测量器的双室容积描记盒(DoubleChamber Plethysmograph Box)(HSE，Germany)并且测定基础气道阻力值。在预治疗后30分钟后，喷雾通过在高压下制备压缩气体获得的气溶胶形式的1％OVA 2分钟。将气道阻力测定30分钟作为支气管痉挛的指标。
表2
正如上述表2中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制致敏豚鼠气道收缩的作用。
实施例3有关气道感染抑制的实验为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对支气管炎症的抑制作用，如下所述通过使抗原接触致敏小鼠而利用肺支气管区域的白细胞，诸如嗜酸性粒细胞的增加进行实验且结果如表3中所示。通过分别在第0天，第7天和第14天经腹膜内给予由10μg OVA和明矾组成的0.2mL混合物使6周龄BALB/c雌性小鼠(SLC，Japan)致敏。在最后致敏后8和10天，给小鼠喷雾通过在高压下压缩气体制备的气溶胶形式的0.7％ OVA 50分钟以便诱导气道炎症，在诱导气道炎症24小时后，用1.5mL磷酸盐缓冲溶液洗涤支气管肺泡。收集洗涤的溶液并且分别对洗涤溶液中的白细胞和嗜酸性粒细胞的数量进行计数。此外，通过在肺组织中的苏木精和伊红染色观察白细胞浸润入组织、组织损伤等并且由此给它们分级。最终致敏后7-10天口服给予苦参提取物。
表3
正如上述表3中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制气道感染的作用。尽管作为阳性对照的孟鲁司特的作用在相对低的水平下表现出药物功效的饱和作用，而无剂量依赖性作用，但是经证实本发明的苦参提取物具有足够的药物作用，且为剂量依赖性的。
实施例45-脂氧合酶(5-脂氧合酶，5-LO)活性的抑制为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对产生白细胞三烯的酶，即哮喘的主要原因的抑制作用，如下所述进行实验且结果如表4中所示。使人外周血单核细胞(PBML)在37℃的Hank平衡盐溶液(HBSS)中稳定且然后加入苦参提取物并且使其反应15分钟。向上述混合物中加入花生四烯酸作为基质材料并且产生白细胞三烯B4(LTB4)15分钟。通过使用酶免疫测定(EIS)试剂盒测定由此产生的LTB4的量。
表4
正如上述表4中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制5-脂氧合酶活性的作用。
实施例5磷酸二酯酶4(PDE4)活性的抑制为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对磷酸酯酶4，即哮喘的主要原因的抑制作用，如下所述进行实验且结果如表5中所示。使人U937细胞在25℃的包含50mM Tris-HCl和5mM MgCl2(pH7.5)的混合溶液中稳定。合并苦参提取物和作为基质材料的1.01μM([3H]cAMP+cAMP)并且使其反应20分钟以便产生腺苷。通过测定[3H]腺苷的量对由此产生的腺苷的量进行定量。
表5
正如上述表5中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制磷酸酯酶4活性的作用。
实施例6对白细胞三烯D4受体(LTD4)的拮抗活性为了评价制备实施例1-3中制备的苦参提取物对LTD4受体，即哮喘的主要原因的抑制作用，如下所述进行实验且结果如表5中所示。使分离自Duncan Hartely豚鼠肺组织的LTD4受体在25℃下于50mM Tris-HCl缓冲溶液(5mM CaCl2，5mM MgCl2，100μg/mL杆菌肽，1mM苄脒，0.1mM苯甲磺酰氟)中稳定。然后向上述混合物中加入苦参提取物和0.2nM[3H]LTD4并且使其反应。通过放射性配体结合测定法分析结合率并且通过0.1μM LTD4测定非特异性结合。特异性结合率85％，Kd 0.2nM，Bmax 0.24pmol/mg蛋白质。
表6
正如上述表6中所示，证实本发明的苦参提取物具有抑制LTD4受体活性的作用。
实施例7止咳作用所用的方法为对M.H.Boskabady等(Journal ofEntnopharmacology 97，2005，79-82)的方法稍加改进的方法。
对Hartley雄性豚鼠(450～500g，SLC，Japan)口服给药。给药后1小时，将豚鼠放入安装了容积测量器的双室容积描记盒(HSE，Germany)并且通过适应5分钟稳定。稳定后，给豚鼠喷射通过在高压下制备压缩气体获得的气溶胶形式的0.6M柠檬酸7分钟。由经受训练的观察者连续观察豚鼠并且通过使用扩音器和扬声器测定上述喷雾柠檬酸气溶胶诱导的咳嗽的次数。咳嗽因其特定的征兆，诸如具有张口位的特点和高音、腹部活动和空气流即刻改变而与正常的喷嚏不同。
表7
正如上述表7中所示，证实本发明的苦参提取物具有止咳作用。
实施例8气道高反应性的抑制通过分别在第0天，第7天和第14天经腹膜内给予由10μg OVA和明矾组成的0.2mL混合物使6周龄BALB/c雌性小鼠(SLC，Japan)致敏。在分别致敏后8和10天，通过给小鼠喷雾在高压下压缩气体制备的气溶胶形式的0.7％ OVA 50分钟以便诱导气道高反应性。在气压计量容积描记室(All Medicus，Seoul，Korea)中进行气道高反应性测定，同时使室内的所有小鼠自由活动并且有意识。所用的气道高反应性的基础值为3分钟测定的平均值。然后使小鼠吸入每种乙酰甲胆碱浓度下的乙酰甲胆碱3分钟，同时将其浓度从2.5mg/mL逐步增加至50mg/mL并且分别在每种浓度下测定气道高反应性的水平。将增加的间歇(Penh)称作表示气道阻力水平的良好指标并且基于下列等式1计算。增加的间歇(Penh)＝[呼气时间(Te)/舒张时间(RT)-1]X[呼气流量峰值(PEF)/吸气量峰值(PIF)]在测定气道阻力的过程中，每隔10秒记录1次Penh平均值并且每隔1分钟如附图中所示。
正如附图1中所示，证实本发明的苦参提取物具有对气道高反应性的抑制活性。
实施例9气道重建的抑制通过在第1天时经腹膜内注射由500μg OVA和1.0mg氢氧化铝组成的混合溶液(首次治疗)且然后在第11天时使用超声喷雾器吸入2％(第二次治疗)且最终在第21、22和23天时吸入3％OVA(第三次治疗)使8-10周龄无菌处理的雌性BALB/c小鼠致敏。然后使小鼠在接下来的6周中间隔3天吸入1％OVA并且构建具有诱导的气道重建的哮喘模型。在第3次OVA吸入前24小时的晚上，对小鼠给予1次制备实施例2中制备的提取物(SOS)。在第3次OVA吸入的当天(第21，22和23天)对小鼠每日2次给予制备实施例2中制备的提取物(SOS)，即在吸入前1小时给药1次和在第3次OVA吸入的当天晚上进行另一次给药。在为气道重建的8-周OVA吸入期过程中，每天两次对小鼠给药。将下面的试验用于分析气道重建·胶原蛋白试验用于对组织纤维化水平定量分析的方法·PAS染色用于测定杯状细胞超常增生的方法·支气管周围三色染色通过使用Masson三色对组织染色鉴定支气管周围区域的下支气管上的纤维化水平。所有支气管在基于基底膜的长度的大小方面相似并且由此选择10个具有环形的支气管且获得它们的平均值。以μm表示具有150-200μm内径的基于细支气管的基底膜厚度并且通过使用计算机化影像分析器程序测定比值。
此外，使用10％甲醛溶液固定收集的肺组织并且包埋在石蜡块中。将石蜡块切成1.5μm厚度的片以便制备载玻片。由此制备的载玻片用于通过H&E染色观察肺中的组织学改变。
附图2表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中气道粘液表达的作用。有代表性的PAS-染色的肺切片。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(A)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(B)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(C)，给予SOS50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(D)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(E)和给予SOS 200mg/kg(F)的OVA-吸入的小鼠中的最后攻击后48小时时进行取样。棒形图表示50μm等级。棒形图表示50μm等级。
附图3为表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中气道粘液表达的作用的直方图。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(SAL+SAL)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(OVA+SAL)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(OVA+MONTE)，给予SOS50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS50)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS100)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS200)中的最后攻击后48小时时对各细支气管中PAS-阳性和PAS-阴性上皮细胞的数量进行计数。棒形图表示来自6次独立实验的平均值SEM。#与SAL+SAL相比p＜0.05；*与OVA+SAL相比p＜0.05。
与吸入盐水后的百分比相比吸入OVA后48小时时的PAS染色阳性的气道上皮百分比显著增加(附图2和3)。通过给予SOS或孟鲁司特显著减少了PAS染色阳性的气道上皮百分比的增加。
附图4表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中α-平滑肌表达的作用。有代表性的肺α-平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学-染色切片。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(A)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(B)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(C)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(D)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(E)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(F)中的最后攻击后48小时时进行取样。棒形图表示50μm等级。棒形图表示50μm等级。
附图5表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中α-平滑肌表达的作用。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(SAL+SAL)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(OVA+SAL)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(OVA+MONTE)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS50)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS100)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS200)中的最后攻击后48小时时测定α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色区域。棒形图表示来自6次独立实验的平均值SEM。#与SAL+SAL相比p＜0.05；*与OVA+SAL相比p＜0.05。
与吸入盐水后的区域相比，吸入OVA后48小时时的支气管周围α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色区域显著增加(附图4和5)。通过给予SOS或孟鲁司特显著减少了增加的支气管周围α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色区域。
附图6表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中支气管周围纤维化的作用。有代表性的肺的Masson三色-染色切片。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(A)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(B)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(C)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(D)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(E)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(F)中的最后攻击后48小时时进行取样。棒形图表示50μm等级。
附图7表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中纤维化的作用。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(SAL+SAL)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(OVA+SAL)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(OVA+MONTE)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS50)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS100)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS200)中的最后攻击后48小时时测定石蜡包埋的肺中支气管周围三色染色的区域。棒形图表示来自6次独立实验的平均值SEM。#与SAL+SAL相比p＜0.05；*与OVA+SAL相比p＜0.05。
与吸入盐水后的区域相比，吸入OVA后48小时时的支气管周围三色染色的区域显著增加(附图6和7)。通过给予SOS或孟鲁司特显著减少了增加的支气管周围三色染色的区域。
附图8表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠总肺胶原蛋白含量的作用。使用胶原蛋白测定试剂盒测定肺胶原蛋白的量。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(SAL+SAL)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(OVA+SAL)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(OVA+MONTE)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS50)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS100)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS200)中的最后攻击后48小时时进行取样。棒形图表示来自6次独立实验的平均值SEM。#与SAL+SAL相比p＜0.05；*与OVA+SAL相比p＜0.05。
与吸入盐水后的区域相比吸入OVA后48小时时的肺胶原蛋白水平显著增加(附图8)。通过给予SOS或孟鲁司特显著减少了肺胶原蛋白的增加水平。
实施例10通过蛋白质印迹分析测定细胞因子(IL-4、5和13)OVA-特异性IgE通过使用ELISA试剂盒(细胞因子R&D systems，Abingdon，UK/OVA-特异性IgE；BD sciences)测定肺组织洗涤溶液中的细胞因子(IL-4、5和13)浓度和血清中OVA-特异性IgE的浓度。
附图9表示制备实施例2中制备的提取物(SOS)或孟鲁司特对OVA-致敏和攻击的小鼠肺组织中IL-4、IL-5和IL-13蛋白质表达的作用。在给予盐水的盐水-吸入的小鼠(SAL+SAL)，给予盐水的OVA-吸入的小鼠(OVA+SAL)，给予孟鲁司特的OVA-吸入的小鼠(OVA+MONTE)，给予SOS 50mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS50)，给予SOS 100mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS100)和给予SOS 200mg/kg的OVA-吸入的小鼠(OVA+SOS200)中的最后攻击后48小时时测定IL-4、IL-5和IL-13蛋白质表达。在8次独立实验中的结果类似。
蛋白质印迹分析揭示出与吸入盐水后的水平相比，吸入OVA后48小时时肺组织中IL-4、IL-5和IL-13蛋白质的水平显著增加(附图9)。通过给予SOS或孟鲁司特显著减少了这些细胞因子的增加水平。
实施例11有关在大鼠中反复口服给药的毒性试验如下使用6周龄的不含特异性病原体(SPF)的SD大鼠进行反复给药的毒性试验。
悬浮制备实施例1-3中制备的苦参提取物并且以2g/kg的量对大鼠口服给药2周期限。每组包括6只动物。
在给药后，观察小鼠的死亡、临床症状、体重改变，并且进行血液学和血液生物化学试验。然后对小鼠进行尸体解剖以便用裸眼检验其腹部和胸部器官中的任何异常。结果表明所有的小鼠均存活并且在临床症状方面没有特别的征兆。此外，在血液学和血液生物化学试验中的毒性试验以及尸体解剖中没有明显发现。
因此，证实本发明的苦参提取物为安全的物质，它在达2,000mg/kg的剂量下不会在大鼠中表现出任何毒性。
制剂实施例1片剂的制备通过使用湿制粒和干制粒法将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成口服给药用片剂。苦参提取物250mg，轻的无水二氧化硅10mg，硬脂酸镁2mg，维晶纤维素50mg，羟基乙酸淀粉钠25mg，玉米淀粉113mg，足量的无水乙醇。
制剂实施例2软膏剂的制备将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成软膏剂。苦参提取物7g，十六酸鲸蜡酯20g，十六醇40g，十八烷醇40g，肉豆蔻酸异丙酯80g，硬脂山梨坦20g，聚山梨醇酯60g，对羟基苯甲酸丙酯1g，对羟基苯甲酸甲酯1g，足量的磷酸盐和纯水。
制剂实施例3注射剂的制备将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成注射剂[组成]苦参提取物50mg，甘露糖醇180mg，Na2HPO4 25mg，注射用蒸馏水2,970mg制剂实施例4局部用药剂的制备将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成局部用药剂。苦参提取物0.3g，聚丙烯酸钠1.3g，甘油3.6g，羟基铝0.04g，对羟基苯甲酸甲酯0.2g，水14g。苦参提取物0.6g，丙二醇1.6g，液体石蜡0.8g，肉豆蔻酸异丙酯0.4g，丙烯酸粘合剂1430g，水16.4g。
制剂实施例5药片的制备将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成药片。苦参提取物1g，白糖50g，明胶3g，甘油10g，阿拉伯树胶1g，足量水。
制剂实施例6糖浆剂的制备将具有下列组成的本发明苦参提取物配制成糖浆剂。苦参提取物2g，糖精0.8g，糖25.4g，甘油8.0g，矫味剂0.04g，乙醇4.0g，山梨酸0.4g，足量蒸馏水。
工业实用性如上所述，本发明的苦参提取物不同于已经证实仅在有限呼吸系统疾病模型病例中有效的常用合成药物，这些提取物已经在所有呼吸系统疾病模型中表现出极佳的药物功效。即本发明的苦参提取物具有极佳的抑制呼吸道收缩、呼吸道感染、5-脂氧合酶活性、磷酸二酯酶4活性、气道高反应性和气道重建的活性；对白细胞三烯D4的拮抗活性；和止咳作用，由此用于预防和治疗呼吸系统疾病，诸如哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、急性下呼吸道感染(支气管炎、细支气管炎等)、急性上呼吸道感染(咽喉炎、扁桃体炎、喉炎)。
将本文提及的所有对比文件的全部内容完整地引入本文作为参考。
尽管已经参照具体实施方案描述了本发明，但是可以在不脱离由下列权利要求定义的本发明范围的情况下构建本发明的修改和变型。
权利要求
1.用于预防和治疗呼吸系统疾病的药物，包含苦参提取物作为活性组分。
2.权利要求1所述的药物，其中通过用水或醇溶液提取苦参，随后用水饱和的低级醇或非极性溶剂纯化来制备所述的苦参提取物。
3.权利要求1所述的药物，其中通过用水或水饱和的低级醇或非极性溶剂提取苦参，随后使用它们这些溶剂纯化来制备所述的苦参提取物。
4.权利要求2或权利要求3所述的药物，其中所述的低级醇具有1-6个碳原子并且所述的非极性溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或甲基乙基酮。
5.权利要求1所述的药物，其中所述的呼吸系统疾病为哮喘、急性或慢性支气管炎、过敏性鼻炎、急性上呼吸道感染和急性下呼吸道感染。
6.权利要求1所述的药物，其中所述的呼吸系统疾病因气道收缩、呼吸道感染、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶4、气道高反应性或气道重建、白细胞三烯D4和止咳作用导致。
全文摘要
本发明涉及分离自苦参的用于预防和治疗呼吸系统疾病的提取物。更具体地说，本发明涉及包含苦参提取物的药物，它们具有极佳的抑制气道收缩、呼吸道感染5－脂氧合酶活性、磷酸二酯酶4活性、气道高反应性和气道重建的作用；对白细胞三烯D4的拮抗活性；和止咳作用，由此用于预防和治疗呼吸系统疾病，诸如哮喘、急性或慢性支气管炎、过敏性鼻炎、急性上呼吸道感染和急性下呼吸道感染等。
文档编号A61P11/00GK101072574SQ200580039937
公开日2007年11月14日 申请日期2005年10月21日 优先权日2004年10月27日
发明者韩昌均, 郑基远, 柳宪昇, 赵龙白, 柳根镐, 白惠娟, 金泽洙, 郑仁镐, 郭义宗 申请人:Sk化学株式会社