增加脑血流量的方法

专利名称：增加脑血流量的方法
技术领域：
在本文中描述的本发明的主题涉及增加正在经受血流量减少的血 管中脑血流量的方法。更特别地，本发明的主题涉及到通过给药Delta 蛋白激酶C(5PKC)的抑制剂来增加血管中脑血流量的方法。
背景技术：
当脑的血流被阻塞时，就会出现缺血性卒中。在美国，由于疾病 比如卒中和心脏停搏引起的脑缺血和血再灌注损伤是残疾和死亡的主 要原因。仅在美国(U.S)，每年出现超过700,000例卒中，并且，如在 2001年，有4,800,000人正在经受卒中的后果。卒中的整体死亡率为约 58%，约50X的这些患者死在医院(American Heart Association Heart Disease and Stroke Statistics, 2004年更新)。
除了缺血性卒中，出血性卒中(包括脑内和蛛网膜下类型)占所有卒 中事件的12%。与缺血性卒中不同，出血性卒中是由于血液从血管系 统进入薄壁组织、蛛网膜下腔或硬膜下腔的损失引起的。与缺血性卒 中相比，这种类型的卒中引起的死亡率更高(30天内的死亡率为37-38 %)(American Heart Association Heart Disease and Stroke Statistics, 2004 年更新)。出血性卒中通常导致产生慢性延迟的脑血管收縮和血管痉挛。 实际上，2/3的已经经受治疗的蛛网膜下出血的患者在出血之后的3到 13天内遭受脑血管痉挛的痛苦。Suhardja,A.， Mm/w C//". Prac.， Ow^/ovosc. Met/.l(2):110-116(2004)。这些脑血管功能的改变发生于较 大直径的血管(例如基底动脉、大脑中动脉)中，也发生于较小直径的血 管中，包括毛细管和小动脉。血管痉挛部分是由于在脉管系统周围建
立了反应性血产物，包括氧合血红蛋白，其分离血管舒张剂一氧化氮。 脑血流量自我调节的丧失，包括血管收縮和血管痉挛，导致增加了来 自有限血流量的脑损伤，引起在损伤的周围区域脑损伤的恶化，且是 失血性卒中患者的状况恶化的部分原因。
其它破坏脑血管自动调节的原因包括长期血压高或高血压。高血
压影响了大约五分之一的美国人(4分之一的成年人)(American Heart Association Heart Disease and Stroke Statistics,, 2004年更ff)，其是脑卒 中损伤和其它包括充血性心力衰竭的慢性疾病的一个重要危险因素。 高血压与脑血流量减少有关(Rodriguez,G.等,Stroke 18(1):13-20(1987))。 因此，保持足够的脑灌注为在这些存在危险的患者中进行脑部保护很 重要。对于在其它原发性原因的脑血管收縮和血管痉挛中保持脑灌注， 控制脑部血流也是很重要的，所述其它原发性原因包括偏头痛、怀孕、 Call-Fleming综合症和中枢神经系统的良性血管病(Singhal,A.B. 7bp. S/rafe Ae/zaW/. 11 (2): 1 -6(2004))。
另外，脑血管疾病的费用是巨大的。在美国，直接健康支出和由 于发病和死亡所引起的生产力损失总计约为$536亿。(American Heart Association Heart Disease and Stroke Statistics, 2004年更,新)。
尽管临床需求很大，目前用于脑缺血和再灌注损伤的治疗选择是 受限的。用于卒中的唯一临床批准的药物，重组组织血纤维蛋白溶酶 原激活剂(rtPA)，仅在全国约1%到约2%的患者中使用，大部分是由 于其窄的治疗窗和高危险特征，包括增加了脑出血和死亡的危险。
在设计用于缺血性卒中的药物或治疗时，期望设计一种可多次给 药而不引起患者脱敏的药物或治疗。当给药所述药物而没有治疗效果 或治疗效果降低时，会出现患者对药物的脱敏，其为给药所述药物的 次数的函数。对某些药物会出现该现象，包括例如用于治疗心肌缺血 的硝酸甘油。
因此，存在用于提高脑血管中血流量的药物和治疗方法的需要。 进一步，存在不会引起患者脱敏并从而可根据需要长期给药这种药物 和治疗方法的需要。本发明解决了这些需求。

发明内容
己经发现，delta蛋白激酶C(SPKC)抑制剂可增加正在经受由于局 部缺血和其它缺氧性事件引起的脑血流量减少的哺乳动物中脑血流 量。从而，提供用于增加在这种正在经受血流量减少的哺乳动物脑血 管中的血流量的方法。而且，提供了用于增加这种哺乳动物脑血管中 的血流量而不会引起脱敏的方法。也提供用于增加这种哺乳动物血管 中血流量的试剂盒。
在本发明的第一个方面，提供用于增加哺乳动物脑血管中血流量 的方法，其特征在于，所述哺乳动物正在以不同的方式经受由于疾病 或病症例如局部缺血事件导致的血流量减少。在一个方式中， 一种用 于增加这种哺乳动物脑血管中血流量的方法包括向需要的患者治疗给 药有效量的S蛋白激酶C。在本发明的某些方式中，所述抑制剂是一 种肽，进一步地为5V1-1肽。在本发明的另一个方式中，抑制剂是SVl-2 肽、SV1-5肽或SV5肽。进一步描述了在本发明的方法中使用的前述 肽的片段或衍生物。本发明可以有利地用于有效地增加在以脑部血流 量减少为特征的病症中的脑部血流量。例如，本发明可以用于增加脑 部血流量，从而减少来自局部缺血事件例如局部缺血卒中或出血性卒 中之后的血管收縮和血管痉挛的损伤。该方法也可用于在出于任何其 它目的的想要增加血流量的体内的脑血管中血流量，包括正在经受由 于慢性高血压和/或原发性原因的一个或多个血管血流量减少的个体。
在本发明的一个方式中， 一种用于增加哺乳动物脑血管的血流量 的方法，所述哺乳动物的特征在于，或正在以别的方式经受由在本文 中描述的或其它现有技术中己知的疾病或病症引起的血流量减少，方 法包括向需要的患者给药治疗有效量的5蛋白激酶C抑制剂，其中， 所述抑制剂能够长期给药而不会引起患者对抑制剂的脱敏。
在本发明的另一个方式中， 一种用于增加哺乳动物脑血管的血流 量的方法，所述哺乳动物的特征在于，或正在以别的方式经受由于在 本文中描述的和/或其它本领域已知的疾病或病症环引起的血流量减 少，方法包括多次向需要的患者给药有效量的S蛋白激酶C抑制剂而 不会引起患者对抑制剂的脱敏。
在本发明的第二个方面，提供用于改善增加哺乳动物脑血管中血 流量的试剂盒，所述哺乳动物的特征在于，正在以别的方式经受由在
本文中描述的和/或其它本领域己知的疾病或病症引起的血流量减少。 在一个方式中，试剂盒包括在本文中描述的S蛋白激酶C抑制剂和使 用该抑制剂来增加一个或多个脑血管的血流量的使用说明。
本发明的一个目的在于提供一种增加哺乳动物脑血管中血流量的 方法，其特征在于，所述哺乳动物正在以别的方式经受由于疾病或病 症比如，例如局部缺血事件或出血性卒中之后的血管收縮或血管痉挛； 由于长期高血压；和/或由于原发性原因引起的血流量减少。
本发明的进一步的目的是提供用于增加哺乳动物脑血管血流量的 方法，其特征在于，所述哺乳动物正在以不同的方式经受由在本文中 描述的和/或其它本领域已知的疾病或病症引起的血流量减少，其不引 起患者对药效产生脱敏作用。
本发明的另一目的在于提供用于增加哺乳动物脑血管血流量的试 剂盒，其特征在于，所述哺乳动物正在以不同的方式经受由在本文中 描述的和/或其它本领域已知的疾病或病症引起的血流量减少，
除了上文记载的示例性的方面和实施方案之外，进一步的方面和 实施方案将通过参照附图和通过研究下述说明书而变得显而易见。


图1显示了在用在实施例1中更详细地描述的治疗有效量的SV1-1 肽处理的假性沐卒中的)大鼠中脑血流量(CBF)作为时间的函数图。箭 头指示SV1-1肽的递送。假性处理的大鼠为用5V1-1肽处理的，测定 CBF，所有都如在实施例1中描述的。
图2描述了在接受由大脑中动脉(MCA)栓塞引起局部缺血/再灌注 损伤和用如实施例1中更详细描述的治疗剂的SV1-1肽处理的大鼠中 CBF作为时间的函数图。
图3描述了在接受由局部缺血/再灌注损伤和用如实施例2中更详 细描述的治疗剂的5V1-1重复处理的大鼠中CBF作为时间的函数图。 箭头指示5V1-1肽的递送。
图4是来自对照的(健康的)未经受局部缺血/再灌注损伤的大鼠(图 4A、 4D、 4G、 4J)和来自由大脑中动脉(MCA)栓塞引起的局部缺血/再 灌注损伤且用TAT肽(图4B、 4E、 4H、 4K)或SV1-1-TAT(图4C、 4F、
41、 4L)处理的大鼠的脑组织的计算机生成的显微照片。
图5是在用于经受由大脑中动脉(MCA)栓塞而引起的局部缺血/再 灌注损伤和用TAT肽处理或用SV1-1-TAT处理的动物的组织的显微镜 领域中微脉管血管的平均数量的柱状图。类似地处理假性处理的动物， 但并没有经受局部缺血/再灌注损伤或肽的递送。
具体实施例方式
为了增进理解在本文描述的主旨目的，此处将参照引入优选的实 施方案和使用特定语言对其描述。然而，不应当将其理解为其意味着 限制其范围，所述主旨的这种改变和进一步的修饰和在本文中阐明的 原理的进一步的应用，都以该主旨所属领域的技术人员通常想到的方 式被包括在内。
提供增加脊椎动物脑血管血流量的方法，其特征在于，所述动物 正在经受由于疾病或病症引起的血流量减少。所述疾病或病症是引起 脑血流量减少的原因之一。血流量的降低可由于多种事件引起，包括 缺血性卒中、再灌注、原发性原因，或l)在出血性卒中之后或另外的 与其相关；2)由于长期高血压；3)由于再灌注；和/或4)由于原发性原 因导致的血管收縮或血管痉挛。已经发现，选择的蛋白激酶C(PKC)的 同工酶增加了在这种哺乳动物脑血管中的血流量。还发现，可以有利 地利用这种酶来减少由于以血流量减少为特征的病症引起的细胞、组 织或器官的损伤、死亡或其它损伤，所述病症包括由于缺氧事件例如 缺血性卒中引起的损伤，或由于出血性卒中后的血管收縮或血管痉挛 引起的损伤；由于长期高血压；和/或原发性原因引起。在本文中，"缺 氧性事件"和"缺氧症"指引起细胞、组织和器官接受氧供应不足的 事件。在本文中，"缺血性卒中"、"局部缺血"和"局部缺血情况"指 对特定细胞、组织和器官的供血不足。供血降低的结果是对细胞、组 织或器官的供氧不足(即缺氧)和营养素供应不足。
尽管不受理论的限制，相信在缺氧事件期间和/或在其之后，存在 一个灌注不足的组织区域，已知其为环绕直接从栓塞的血管体供给组 织的缺血半影区，或是在局部缺血的核的直接末梢外部的大脑区域。 尽管直接由称为局部缺血核的栓塞的血管供给的某些这类该组织区域
可能在缺氧事件开始的几分钟内被不可逆地损害，在本文中据信此处 的半影区组织可能通过维持血流量和/或血管的开放来补救。
灌注不足的区域也可出现于由于长期高血压和/或由于原发性原因 的患有出血性卒中后的血管收縮的患者中。在本文中据信，由血管收 縮引发的灌注不足会诱发神经细胞、星形胶质和血管损害，其可能通 过增加血流量和/或血管开放来补救。在本发明的一个方式中， 一种方
法包括向需要的患者给药治疗有效量的S蛋白激酶C抑制剂(5PKC)。
也已经被发现的是5蛋白激酶C抑制剂可以长期给药而不会诱发 对抑制剂的脱敏。因此，在本发明的另一个方式中， 一种增加脊椎动 物脑血管的血流量的方法，其特征在于，所述动物正在以不同的方式 经受由在本文描所述的疾病或病症引起的血流量减少，包括给药需要 的患者治疗有效量的S蛋白激酶C抑制剂，其中，所述抑制剂能够长 期给药而不会引起对抑制剂脱敏。也提供用于增加哺乳动物脑血管中 血流量的试剂盒，其特征在于，所述动物正在经受用于由在本文描所 述的疾病或病症引起的血流量减少。在一个方式中，试剂盒包括S蛋 白激酶C抑制剂和使用此抑制剂来增加正在经受由在本文中描述的疾 病或病症引起的血流降低的脊椎动物脑血管中血流量的使用说明。
在一方面，提供了用于增加脊椎动物脑血管中血流量的方法，其 特征在于，所述动物正在以不同的方式经受由疾病或病症引起的血流 量减少。在一个实施方案中， 一种方法包括给药患者治疗效量的S蛋 白激酶C抑制剂。
在本文中，"血流量"此处通常指的是在每单位时间内在各个血管 内血流的量。在本文中，"增加血流量"指在特定时间点，相对于在某 些预定时间点的血流量增加了，所述预定时间点例如在经受比如本文 中描述的和/或本领域己知的局部缺血、缺氧或其它细胞、组织或器官 损伤事件开始时，或在其开始后的时间点；包括当患者经受由于出血 性卒中引起的血管收縮或血管痉挛时或当患者经受由长期高血压时。 典型地，在用本文中描述的抑制剂处理之后，相对于这种处理之前的 血流量，血流量增加了。在本文中，"血流量减少"指在特定时间点， 相对于在某些预定时间点的血流量降低了，所述预定时间点例如本文 中描述的和/或本领域已知的局部缺血、缺氧或其它细胞、组织或器官
损伤事件开始时，或在其开始后的时间点；包括当患者经受例如由于 出血性卒中引起的血管收縮或血管痉挛时或当患者经受由长期高血压 引起的血管收縮或血管痉挛时。用于测定在一个或多个血管中血流量 的某些方法是本领域已知的。可以使用例如，激光多普勒血流仪(LDF)、 核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)和计算机断层(CT)成 像，包括单光子发射断层显像(SPECT)测定脑血流量。(Leenders， K丄 等.5ra/" 113:27-47 (1990); Sakai, F等.《/ CaeZ . B/ood F/cw Meto6. 5:207-213 (1988); Rempp, K.A等，i ^fo/ogy 193:637-641 (1994); Baird, A. E, and Warach, S., J. CwA. F/ow Meto6. 18:583-609 (1998);
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在所描述的方法中，可以使用大量的5蛋白激酶C抑制剂。在本 文中，5蛋白激酶C抑制剂指抑制SPKC的生物活性或功能的化合物。 如本领域已知，SPKC参与无数细胞过程，包括细胞生长的调节和基因 表达的调节。所述抑制剂可以例如抑制SPKC的酶活性。所述抑制剂 可以通过例如防止SPKC的活化或可以防止SPKC结合其蛋白底物来抑 制SPKC的活性。这种酶活性的抑制将防止，例如蛋白质中氨基酸的 磷酸化。所述抑制剂也可以抑制SPKC结合其锚定蛋白和有关SPKC 定位至其亚细胞位置，所述锚定蛋白也称为活化的激酶(RACK)的受 体。
在此方法的一个方式中，可使用包括生物碱的有机分子抑制剂。 例如，可以使用苯并菲啶(benzophenanthridine)生物碱，包括白屈菜赤 碱、血根红碱、白屈菜红碱(chelirubine)、血根黄碱和chililutine。这
些生物碱可以以商业方式购买，和/或从本领域已知的和比如例如在美
国专利No.5，133,981中描述的植物中分离。
也可以使用二吲哚基马来酰亚胺(Bisindolylmaleimide)类化合物作 为SPKC的抑制剂。二B引哚基马来酰亚胺的实例包括二吲哚基马来酰 亚胺I、 二吲哚基马来酰亚胺II、 二吲哚基马来酰亚胺III、 二吲哚 基马来酰亚胺IV、 二刚哚基马来酰亚胺V、 二喷哚基马来酰亚胺VI、 二吲哚基马来酰亚胺VII、 二吲哚基马来酰亚胺VIII、 二吲哚基马来 酰亚胺IX、 二吲哚基马来酰亚胺X或其它在抑制SPKC方面有效的二 口引哚基马来酰亚胺。这些化合物可以为商业购买的和/或通过本领域技 术人员已知的方法合成的，例如，在美国专利No. 5， 559， 228和Brenner 等在rez^a力erfro/7 44(10) 2887-2892 (1988)中描述的方法。也可使用 从粗糠柴树中获得的和有效地抑制SPKC的驱虫染料，包括粗糠柴毒 素，其可以为商业购买的或由本领域技术人员合成的。
在本发明的某些形式中，可以利用SPKC的蛋白抑制剂。所述蛋 白抑制剂可以是肽的形式。在本文中使用的和在本领域已知的蛋白质、 肽和多肽指的是由某些氨基酸单体通过肽键结合形成的化合物。除非 另有说明，所述肽的各个序列为以从氨基端起到羧基端的顺序给出。 所述SPKC的蛋白酶抑制剂可以通过对本领域熟练技术人员已知的方 法获得。例如，蛋白抑制剂可以利用本领域已知的各种固相合成技术 化学合成，比如例如Williams, Paul Lloyd等在C72ew/ca/ v4p/ raac/z&s to Ae S，f/7es/s 。/P取/(ies /Vote/ra, CRC Press, Boca Raton, FL, (1997) 中描述的方法。
另外，所述蛋白酶抑制剂可以通过本领域已知和比如例如 Sambrook等,在Mo/ecw/<ar C7om'"g.' j Z^60rato7 Maw認/， Cold Springs Harbor laboratory, 2nd ed， Cold Springs Harbor, New York (1989), Martin, Robin, /V她/w 6jy"f/ as^: Mef/20A <a"d /Votoco/s， Humana Press, Totowa， NJ (1998)禾口 Cwrewf尸ratoco/sAfo/ecw/ar (Ausubel等.,eds.)，
John Wiley & Sons (其定期对内容更新)中描述的重组技术方法产生。 例如，可以使用表达载体在适宜的宿主细胞中产生期望的肽抑制剂， 然后通过已知的方法分离。例如，表达载体可以包括编码期望肽的核 苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接到启动子序列。
如在本文中定义的，当核苷酸序列和其它核苷序列置于功能性关
系时，其为"可操作地连接"至其它核苷序列。例如，如果编码序列 可操作地连接至启动子序列，这通常指所述启动子可以启动编码序列
的转录。可操作地连接指连接的DNA序列典型地为邻接的，且当需要
加入两个蛋白编码区时，是相邻的且在阅读框内。然而，因为增强子 可以相距启动子数千个碱基起作用，内含子序列可是各种长度的，某 些核苷序列可操作地连接但并非邻接。此外，如在本文中定义的，核
苷序列指的是天然的或合成的核苷酸(nudeotide)和/或核苷(nudeoside) 以及其衍生物的线性和依次排列。术语"编码(encoding和coding)"指 核苷酸序列通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程，根据该信息， 一系列氨基酸能够装配成特定氨基酸序列，从而产生多肽。
所述抑制剂衍生自PKC的同工酶，例如SV1-1，其来自褐鼠的氨 基酸序列在SEQIDNO:l(SFNSYELGSL)中列出，其表示如在Genbank AccessionNo,AAH76505中发现的大鼠SPKC中的氨基酸8-17。另夕卜， 所述肽抑制剂可以是PKC的其它片断，例如Wl-2、 SVl-5和/或5V5， 或SV1-1、 SVl-2、 SV1-5和5V5的某些组合。来自褐鼠的SVl-2的氨 基酸序列在SEQ ID NO:2(ALTTDRGKTLV)中列出，其表示如在 Genbank Accession No.AAH76505中发现的大鼠SPKC中的氨基酸 35-45 。 来自褐鼠的5V1-5 的氨基酸序列在SEQ ID NO:3(KAEFWLDLQPQAKV)中列出，其表示如在Genbank Accession No.AAH76505中发现的大鼠SPKC的氨基酸101-114。3V5的氨基酸序 列列在SEQ ID NO:4中，其表示如在Genbank Accession No.BAA01381 中发现的人SPKC的氨基酸569-626，氨基酸ll(天冬氨酸)被脯氨酸取 代。
所述肽抑制剂可以包括天然氨基酸，例如L-氨基酸或非天然氨基 酸例如D-氨基酸。在所述肽中的氨基酸可以通过肽键连接或，在本文 中描述的修饰的肽中的氨基酸可以通过非肽键连接。
可对连接氨基酸的酰胺键进行大量修饰，其是本领域已知的。这 些修饰在综述中包括在Freidinger, R. M. "Des/gw oroi Sj^Aes^ o/Wove/ Pe/^/tZ&s 尸e/ ricfo附/wef/cs 〃 C7 e附.46:5553 (2003),
禾口 Ripka, A. S.， Rich, D.H. "Peptidomimetic Design" Curr. Opin. Chem. Biol. 2:441 (1998)中讨论。这些肽的修饰经设计通过增加所述肽的功效或通过设计这些修饰的目的是为了通过提高所述肽的效力或通过增加 所述肽的半衰期来改善所述肽的性质。
所述肽的功效力可以通过限制所述肽的构象柔性来增加。这可以 通过，例如包括在酰胺键的氮或a-碳上配置另外的烃基来获得，例如 Zuckerman等的类肽策略，和例如Goodman, M.等的a -修饰(Pure Appl. Chem. 68:1303 (1996))。所述酰胺氮和a-碳可以连接在一起，从而提供 另外的限制(Scott et al， Org. Letts. 6:1629-1632 (2004》。
肽的半衰期可以通过将非降解的部分引入到肽链中来增加。这可 以通过例，如用脲残基取代所述酰胺键(Patil等，J. Org. Chem. 68:7274-7280 (2003))或用氮杂肽连接取代所述酰胺键(Zega and Urleb， Acta Chim. Slov. 49:649-662 (2002))来实现。可引入到肽链部分的其它 的非降解部分的其它实例包括将另外的碳("P肽"，Gellman, S. H. Acc. Chem. Res. 31 : 173 (1998))或乙烯单元(Hagihara等，J. Am. Chem. Soc. 114:6568 (1992))引入到链中，或使用羟基乙烯基(Patani, G.A. Lavoie, E丄Chem. Rev. 96:3147-3176 (1996))和本领域熟知的方法。此外，可以 通过同型配位部分，比如例如Hirschmann等(J. Am. Chem. Soc. 122:11037 (2000))的吡咯烷酮或四氢吡喃(Kulesza， A等，Org. Letts. 5:1163 (2003))来取代一个或多个氨基酸。
尽管在本文中描述的肽主要参照来自褐鼠的氨基酸序列，应当理 解所述肽并不限于在SEQ ID NO:l-4中列出的特定的氨基酸序列。本 领域技术人员将认识到，通过突变和/或进化过程，可产生不同长度的 和具有不同成分的多肽，例如具有氨基酸插入、取代、缺失等，其可 与在本文中列出的具有如本文中描述的氨基酸同源性和有利地功能的 序列有关，或与所述序列十分类似。术语"SV1-1肽"、"SV1-2肽"、 "SV1-5肽"和"5V5肽"通常用于指具有在本文中描述的特性的肽， 优选的实例包括分别具有SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的肽。起具有如本文中描述的增加脑血 流量的功能的肽的变体也被包括在该定义中，并且包括在本发明的范 围内。
在本文中描述的多肽抑制剂还包括类似于在本文中提出的氨基酸 序列的氨基酸序列，其具有至少约50%同一性，且起增加脑血流量的
功能。优选地，包括在本发明中的所述肽抑制剂的氨基酸序列包括与
在本文中列出的包括SEQ ID NOS:l-4的氨基酸序列的至少约60%的 同一性，进一步地为至少约70%的同一性、优选地为至少约75%或80 %同一性，更优选地为至少约85%或90%的同一性，更优选地为至少 约95%的同一性。
百分比同一性可以例如通过利用先进的BLAST计算机程序比较 序列信息来确定，所述计算机程序包括2.2.9版本，得自National Institutes of Health 。 BLAST禾呈序是基于Karlin和Altschul的比对方法， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264- 2268 (1990)，如在Altschul等的J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Karlin And Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5873-5877 (1993);和Altschul等的Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)中讨论的。简单地说，BLAST程序定义同一性为 相同比对的符号(S卩，核苷酸和氨基酸)的数除以在两个序列中较短的之 中符号的总数。该程序可用来测定比较中的蛋白质的全部长度的百分 比同一性。提供默认参数是用于最佳地用査询序列在例如所述程序的 blastp中的搜索。当通过Wootton和Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163 (1993)的SEG程序测定时，该程序也允许使用SEG过滤器 来屏蔽查询序列。
因此，也可有利地使用在本文描述的肽抑制剂的片段或衍生物， 其包括具有能增加脑血流量的与SEQ ID NOS:l-4同一性有特定百分比 的氨基酸序列。例如，在本发明中，也可有利地使用如在本文中描述 的5V1-1 、SVl-2、SVl-5和5V5的片段或衍生物，其可有效地抑制5PKC， 并且可增加哺乳动物脑血流量。
可在本文中描述的氨基酸序列中进行保守氨基酸的取代，以获得 可以有利地用于本发明的肽的衍生物。如本领域已知的和如在本文中 所指的保守氨基酸取代，包括用具有在例如结构、尺寸和/或化学性质 方面类似的侧链的氨基酸取代蛋白质中的氨基酸。例如，具有下述任 何一种基团的氨基酸可以和属于同一组的其它氨基酸互换具有脂肪 族侧链的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸; 具有非芳基、含羟基侧链的氨基酸，例如丝氨酸和苏氨酸；具有酸性 侧链的的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸，包括赖氨酸、
精氨酸和组氨酸；具有芳香环侧链的氨基酸，包括苯丙氨酸、酪氨酸
和色氨酸；具有含硫侧链的氨基酸，包括半胱氨酸和蛋氨酸。此外，
在本文中，认为具有酸性侧链的氨基酸如天门冬氨酸、谷氨酸，可与 具有酰胺基侧链的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺互换。
因此，期望获得导致对5PKC的有效抑制作用和伴随的如在本文 中描述的增加脑血流量的5V1-1的修饰包括在下述情况中显示的对 SEQ ID NO:l的下述改变tFNSYELGSL (SEQ ID NO:5)、aFNSYELGSL (SEQIDNO:6)、 SFNSYELGtL (SEQ ID NO:7)，包括这三种取代的任意 组合，例如tFNSYELGtL (SEQ ID NO:8)。其它可能的修饰包括 SyNSYELGSL (SEQ ID NO:9)、 SFNSfELGSL (SEQ ID NO: 10)、 SNSYdLGSL (SEQ ID NO:ll )、 SFNSYELpSL (SEQ ID NO:12)。
期待产生在本发明中起作用的的肽的其它可能的修饰肽包括一个 或两个L至[J I或V的变化，例如SFNSYEiGSv (SEQ ID NO:13)、 S簡YEvGSi (SEQ ID NO:14)、 S簡YELGSv (SEQ ID NO:15)、 SFNSYELGSi (SEQ ID NO: 16)、 SFNSYEiGSL (SEQ ID NO: 17)、 SFNSYEvGSL(SEQIDNO:18)、 aFNSYELGSL (SEQ ID NO:19)，上述 的修饰的任意组合，和在本文中描述的其它保守氨基酸的取代物。
SV1-1的片断或修饰片断也是期望的，包括YELGSL (SEQ ID NO:20)、 YdLGSL (SEQ ID NO:21 )、 fdLGSL (SEQ ID NO:22)、 YdiGSL (SEQ ID NO:23)、 iGSL (SEQ ID NO:24)、 YdvGSL (SEQ ID NO:25)、 YdLpsL (SEQ ID NO:26)、 YdLgiL (SEQ ID NO:27)、 YdLGSi (SEQ ID NO:28)、 YdLGSv(SEQIDNO:29)、 LGSL (SEQ IDNO:30)、 iGSL (SEQ ID NO:31)、 vGSL (SEQ ID NO:32)、 LpSL (SEQ ID NO:33)、 LGiL (SEQ ID NO:34)、 LGSi (SEQ ID NO:35)、 LGSv (SEQ ID NO:36)。
因此，如在本文中使用的术语"SV1-1肽"进一步指与SEQIDNO:l 相同的肽，和具有包含在本文中描述的与氨基酸序列SEQ ID NO:l的 特定百分比同一性的氨基酸序列的肽，包括但不限于在SEQ ID NO:5-19中列出的肽，以及如在本文中描述的保留用于增加脑血流量的 活性的这些肽的任意片段，如通过但不限于SEQIDNOS:20-36所例举 的。
期望获得导致对S PKC的有效抑制作用和伴随的如在本文中描述
的增加脑血流量的SV1-2的修饰包括在下述情况中显示的对SEQ ID NO:2的下述改变ALsTDRGKTLV(SEQIDNO:37)、 ALTsDRGKTLV (SEQIDNO:38)、 ALTTDRGKsLV (SEQ ID NO:39)，这三种取代的任意 组合，ALTTDRpKTLV (SEQ ID NO:40)、 ALTTDRGrTLV (SEQ ID NO:41)、 ALTTDkGKTLV(SEQIDNO:42)、 ALTTDkGkTLV (SEQ ID NO:43); —个或两个L到I或V的变化，或上述V到I或L的变化和 任意上述的组合。特别地，L和V可以用V， L， IR取代，而D、 E 可以用N或Q取代。本领域技术人员应当认识到，根据在本文中的描 述，可进行其它保守的取代以获得其它SV1-2的衍生物。
因此，如在本文中使用的术语"5Vl-2肽"进一步指SEQIDNO:2， 和具有包含在本文中描述的与氨基酸序列SEQ ID NO:2的特定百分比 同一性的氨基酸序列的肽，包括但不限于在SEQ ID NO:37-43中列出 的肽，以及如在本文中描述的保留用于增加脑血流量的活性的这些肽 的任意片段。
期望获得导致对S PKC的有效抑制作用和伴随的如在本文中描述 的增加脑血流量的SV1-5片段的修饰包括在下述情况中显示的对SEQ ID NO:3的下述改变rAEFWLDLQPQAKV (SEQ ID NO.44); KAdFWLDLQPQAKV (SEQ ID NO:45); KAEFWLeLQPQAKV (SEQ ID NO:46)， KAEFWLDLQPQArV (SEQ ID NO;47)， KAEyWLDLQPQAKV (SEQ ID NO:48), KAEFWiDLQPQAKV (SEQ ID NO:49), KAEFWvDLQPQAKV (SEQ ID NO:50)， KAEFWLDiQPQAKV (SEQ ID NO:51), KAEFWLDvQPQAKV (SEQ ID NO:52)， KAEFWLDLnPQAKV (SEQ ID NO:53), KAEFWLDLQPnAKV (SEQ ID NO.54), KAEFWLDLQPQAKi (SEQ ID NO;55)， KAEFWLDLQPQAKI (SEQ ID NO:56)， KAEFWaDLQPQAKV (SEQ ID NO:57),KAEFWLDaQPQAKV (SEQ ID NO;58),禾口 KAEFWLDLQPQAKa (SEQ ID NO:59)。
SV1-5的片段也是期望的，包括KAEFWLD (SEQ ID NO:60)、 DLQPQAKV (SEQ ID NO:61 )、 EFWLDLQP (SEQ ID NO:62)、 LDLQPQA (SEQ ID NO:63)、 LQPQAKV (SEQ ID NO:64)、 AEFWLDL (SEQ ID NO:65)和WLDLQPQ (SEQ ID NO:66)。
对5V1-5片段的修饰也是期望的，包括用于在本文中描述的全部 长度的片段以及其它保守氨基酸取代基显示的修饰。如在本文中使用
的术语"SV1- 5肽"进一步指SEQ ID NO:3，和具有包含在本文中描 述的与氨基酸序列SEQ ID NO:3的特定百分比同一性的氨基酸序列的 肽，以及如在本文中描述的保留用于增加脑血流量的活性的其片段。
期望获得导致对S PKC的有效抑制作用和伴随的如在本文中描述 的增加脑血流量的SV 5片段的修饰包括一种或多种保守氨基酸的取代
物，包括取代用Q取代在3位的R;用T取代在8位的S;用W取
代在15位的F;用L取代在6位的V和用E取代在30位的D;用R 取代在31位的K;用D取代在53位的E;以及这些修饰的多种组合， 以及由本领域熟练技术人员根据在本文中的说明可做出的其它修饰。
SV5的片段也是期望的，包括例如下述的SPRPYSNF (SEQ ID NO:67)、 RPYSNFDQ(SEQIDNO:68)、 SNFDQEFL (SEQ ID NO:69)、 DQEFLNEK (SEQ ID NO:70) 、 FLNEKARL (SEQ ID NO:71 )、 LIDSMDQS (SEQ ID NO:72) 、 S函QSAFA (SEQ ID NO:73)、 DQSAFAGF (SEQ ID NO:74) 、 FVNPKFEH (SEQ ID NO:75)、 KFEHLLED (SEQ ID NO:76) 、 NEKARLSY (SEQ ID NO:77)、 RLSYSDKN (SEQ ID NO:78) 、 SYSDKNLI (SEQ ID NO:79)、 DKNLIDSM (SEQ ID NO:80)、 PFRPKVKS (SEQ ID NO: 81 )、 RPKVKSPR (SEQ ID NO:82)和VKSPRPYS (SEQ ID NO:83)。
SV5的片段的修饰也是期望的，包括用于在本文中描述的全部长 度的片段以及其它保守氨基酸取代基显示的修饰。如在本文中使用的 术语"5V5肽"进一步指SEQ ID NO: 4，和包含在本文中描述的具有 与氨基酸序列SEQ ID NO: 4的特定百分比同一性的氨基酸序列的肽， 以及保留用于增加脑血流量的活性的其片段。在本文中，用于治疗使 用的抑制剂可以包括在本文中描述的肽的组合。
可作为SPKC的抑制剂起作用的其它适宜的分子或化合物，包括 小分子，可以通过本领域已知的方法来确定。例如，这些分子可以通 过它们抑制5PKC向亚细胞定位的转移来识别。这些试验可以利用， 例如荧光标记酶和荧光显微镜，以确定一种特定的化合物或试剂是否 可有助于SPKC的细胞转移。这样的试验为，例如在Schechtman,D等 的J.Biol.Chem. 279(16): 15831 -15840 (2004)中描述的，且包括所选择 的抗体的使用。其它用于测量细胞转移的试验包括蛋白质印迹试验，
如在Dorn, G.W，II等的7Va"U.S.A. 96(22): 12798-12803
(1999) and Johnson, J.A.和Mochly-Rosen, D., Cz>c 76(4):654画63 (1995)中描述的。
所述抑制剂可以通过修饰而成为融合蛋白的一部分。所述融合蛋 白可包括起增加细胞摄取所述肽抑制剂作用的蛋白或肽，具有其它期 望的生物学效果，例如治疗学效果，或可同时具有这些功效。例如， 可期望使SVl- 1肽或其它在本文中描述的肽结合或以其它方式连接细 胞因子或其它引出期望的生物应答的蛋白。所述融合蛋白可以通过本 领域熟练技术人员公知的方法产生。所述肽抑制剂可以以本领域公知 的多种方式结合(bound)或以不同的方式结合(conjugated)另一种肽。例 如，所述肽抑制剂肽可以通过交联结合载体肽，例如细胞渗透运载蛋 白或其它在本文中描述的肽，其中所述融合蛋白的两个肽都保留其活 性。作为进一步的实例，所述肽可以通过来自一个肽的C-末端和另一 个肽的N-末端的酰胺键连接或以其它方式结合。所述抑制剂肽和其它 所述融合蛋白的成员之间的连接可以是包含肽键而不可裂解的，或者 包含例如己知的酯或其它可裂解的键而可裂解的。
而且，在本发明的其它方式中，运载蛋白例如细胞渗透运载蛋白 或其它可以增加细胞摄入肽抑制剂的肽可以是例如i>wop/n7a ^wfewwaped/a /wmeocfowm'w-存f 生的序歹U ， 其在 SEQ ID NO:84(CRQIKIWFQNRRMKWKK)中列出，并且可以通过一个N-末端 Cys-Cys键的交联来连接抑制剂，如在Theodore, L等的A^/raw/. 15:7158-7167 (1995); Johnson, J.A等的CV>c. b 79:1086 (1996)中讨论 的。另外，所述抑制剂可以通过来自I型人类免疫缺陷病毒的转运活性 (transactivating)调节蛋白(Tat)衍生的转运多肽(例如来自在SEQ ID NO:85; YGRKKRRQRRR中显示的Tat的氨基酸45-57)或聚精氨酸来修 饰，所述转运多肽如在Vives等的 / C7zem， 272:16010-16017
(1997)、美国专利No. 5,804,604和Genbank Accession No. AAT48070 中描述的；所述聚精氨酸如在Mitchell等的《/ Pe/^Vfe/ " 56:318-325
(2000) 和Rothbard等，的Atowe MW. 6:1253-1257 (2000)中描述的。所 述抑制剂也可以通过其它本领域技术人员已知的方法修饰，以增加细 胞摄取抑制剂。
所述抑制剂可以以各种方式有利地给药。例如，所述抑制剂可以 以用于舌下给药的片剂形式、以溶液或乳浊液形式给药。所述抑制剂
也可以和药学可接受的携带者(carrier)或载体混和。所述载体可以是 适宜的液体，例如，对于非肠道给药，所述载体包括水、生理盐水或 其它水相溶液，或可以是油或气雾剂。可以选择所述载体用于静脉内 或动脉内给药，或者其可包括无菌水性或非水性溶液，所述溶液包含 本领域已知的防腐剂、抑菌剂、缓冲剂和抗氧化剂。在气雾剂形式中， 所述抑制剂可以用作粉末，具有用于最佳分散性的己知的性质，包括 颗粒尺寸、形态和表面能。在片剂形式中，固体载体可以包括例如乳 糖、淀粉、羧甲基纤维素、糊精、磷酸钙、碳酸钙、合成的或天然的 calcium allocate、氧化镁、无水氢氧化铝、硬脂酸镁、碳酸氢钠、干酵 母或其组合。所述片剂优选包括一种或多种有助于口腔溶解的试剂。 所述抑制剂也可以以本领域已知的其它类似药物的给药方式给药。
使用的所述抑制剂能够长期给药，而不会引起患者对抑制剂的脱 敏。即，抑制剂可以多次给药予患者，或在包括一、二、三或多天； 一两周或三周或更多周或几个月的延长的时间段后，并且将持续引起 各个血管的血流量增加。
所述抑制剂可以通过多种途径给药患者，例如，抑制剂可以通过 非肠道给药，包括腹腔内；静脉内；动脉内；皮下或肌内注射。所述 抑制剂也可以经由下述方式给药粘膜表面，包括经直肠和阴道内； 鼻内；通过吸入，口服或鼻内；口服，包括舌下；眼球内和皮下。也 可以采用这些给药途径的组合。优选的给药方式是通过输注或再灌注 入栓塞或部分栓塞的脑动脉，或连接到这些栓塞或部分栓塞的动脉的 动脉。在本文中，"部分栓塞的脑动脉"指与在影响脑血管的事件或攻 击之前相比，其中在影响脑血管的减少血流量的事件后血流量减少的 脑血管。这些血流量减少的事件包括缺血性卒中或其它缺氧性事件， 以及，例如随着出血性卒中的血管收縮和血管痉挛。与所述血管的基 准或标准的血流速率相比，其中血流量减少的脑动脉包括在定义"部 分栓塞的脑动脉"中。这样的速率是本领域熟练技术人员熟知的。
提供了一种治疗有效量的所述抑制剂。如在本文中使用的，所述 抑制剂的治疗有效量为用于增加哺乳动物脑血管血流量和/或减少由于
下述原因引起的细胞、组织或器官损伤或死亡所需要的抑制剂的量 各种细胞损伤事件，包括缺血性卒中、包括出血性卒中后的血管收縮 或血管痉挛；长期高血压和/或原发性因素。该数量取决于给药时间(例 如在局部缺血事件之前、在卒中时、或卒中之后)、给药途径、治疗持 续时间、使用的特定抑制剂和患者的健康状况，如本领域已知的。本 领域技术人员能够确定最佳剂量。通常，典型地使用的抑制剂的数量
可以是，例如大约0.0005 mg/kg体重至大约50 mg/kg体重，但优选的 为大约0.05mg/kg至大约0.5mg/kg。
优选地，抑制剂的用量为，与处理之前的血流量相比，足以增加 血流量至少约5%，优选地为至少约25%、进一步为至少约50%、更 优选地为至少约75%，进一步地为至少约100%，所述处理之前包括 例如，在局部缺血事件期间或在前述事件开始之后的特定时间段内， 例如在开始之后约24小时。与前述事件开始时的血流量、或所述事件 开始后约2小时、约3小时或约6小时后的血流量相比，血流量按前 述提及的水平增加。应当理解，也可以获得比前述提及的更大的血流
其中血流量可以增加的血管包括任何其中期望血流量增加的脑血 管。这些血管也包括可能被完全或部分栓塞的，其可以是易于栓塞的， 以及其已经暴露于缺氧性事件或其它事件中的那些血管，所述缺氧性 事件比如缺血性卒中，所述其它事件比如血管收縮或血管痉挛，其减 少了包括葡萄糖的细胞营养的递送。这些血管包括，例如，脑动脉例 如大脑前动脉、大脑中动脉和大脑后动脉。也可以处理脑血管或其它 向其它脑血管供血的血管以增加血流量，如在本文描述的。这些血管 包括，例如椎动脉和颈动脉，比如颈内动脉、颈总动脉和颈外动脉。 也可以增加从前述动脉中分支的动脉中的血流量，如在本发明中描述 的。例如，从大脑中动脉中分支出来的豆纹动脉，可以根据在本文中 描述的方法来处理。可以进一步增加在脑微血管毛细血管和微动脉中 的血流量，这些血管是本领域所熟知的。服从增加其中的脑血流量的 这些脑血管并非是详尽的。根据在本文中的描述，本领域熟练技术人 员应知道可以用在本文中描述的方法处理的其它脑血管。
待处理的患者典型地为需要这种处理的，包括易于或已经经受来
自一种或多种事件的脑血流量降低的人，所述事件例如局部缺血或缺 氧性事件，或者具有可能使得细胞、组织或器官损伤作为结果的事件。 所述患者可以包括那些正在经受或另外地易于经受由在出血性卒中后 引起的血管收缩或血管痉挛；长期高血压和/或由于原发性原因的。所 述患者可进一步典型地为脊椎动物，优选哺乳动物，包括人类。也可 以治疗的其它动物包括家畜、例如马、羊、牛和猪。可治疗的其它示 范性的动物包括猫、狗；啮齿动物、包括来自啮齿目的，比如小鼠、 大鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠；兔形目成员，包括家兔和野兔，以及任何 其它可以通过该此治疗而获益的哺乳动物。优选地在活体内行治疗所 述患者，优选局部缺血事件开始时。患者也可以在局部缺血或其它导 致缺氧或细胞营养匮乏的事件发生之后的约1分钟至约10小时、但优 选地为约1分钟至约2小时，更优选地为不超过约24小时。
所述患者典型地为是能够从增加脑血流量获益的人。例如，患有 经受缺氧性事件例如缺血性卒中的患者，或者是患有在出血性卒中后 引起的血管收縮或血管痉挛；由于长期高血压；和/或由于原发性原因 引起的患者，可以从增加缺血半影区的血流量获益的人，如前所述。
缺血半影区，其可能为可补救的组织，可以通过本领域技术人员 所已知的方法来在病人体内确定。例如，缺血半影区可通过观察在灌 注加权成像(perfUsion-weighted imaging )禾B扩散加权成像 (diffusion-weighted imaging限定的不正常区域之间的不同来确定，如 Duong, T. Q.和Fisher, M.在，Curr. Atheroscl. Rep. 6:267-273 (2004)中 描述的。在定义区域中的不同被称为灌注-扩散不匹配。所述灌注-扩散 渗出不匹配区域被假定为接近缺血半影区。血管收縮和血管痉挛通常 是使用如本领域已知的数字减影血管造影术来检测。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于增加包括哺乳动物的脊 椎动物中脑血管的血流量的试剂盒，其特征在于，所述动物以不同的 方式经受由于疾病或病症引起的血流降低，所述疾病或病症，包括局 部缺血事件，例如出血性卒中后；由于长期高血压和/或由于原发性原 因导致的血管收縮或血管痉挛引起的血流量减少。在一个方式中，一 种试剂盒包括一种SPKC抑制剂和如在本文中描述的如本文所记载，
使用所述这种抑制剂，改善增加各个脑血管中血流量的使用说明。在
本发明的某些定方式中，所述抑制剂是如本文所描述的SV1-1、 5Vl-2、 SV1-5或SV5肽，或如在本文描述的这些肽的片段或衍生物，或这些 肽、它们的片断和/或它们的衍生物的组合。所述试剂盒可进一步包括 注射器或本领域已知的用于给药所述抑制剂的类似装置。可将所述试 剂盒的组分放置于一个容器中，例如一个盒子，且每种组分在盒子中 彼此相应地放置。可将所述抑制剂放置在灭菌的小药水瓶或类似容器 中。如果所述抑制剂以干的或冷冻的形式提供，则需要重构，所述试 剂盒还可以进一步在灭菌小瓶或类似的容器中包括如在本文中前述的 药学可接受的载体。优选的载体为如在本文中描述的能溶解所述抑制 剂的无菌溶液。
现在将参照具体的实施例来阐述上述本发明。应当理解，这提供 该实施例是用来阐述本发明优选的实施方案，并不意味着据此限制权 利要求的范围。
实施例1
患有局部缺血/再灌注损伤的大鼠中的脑血流量的增加 本实施例显示了通过用SV1-1肽对大鼠处理治疗，获得了在大鼠 的大脑中动脉中的血流量的改善增加。 材料
将雄性Sprague-Dawley大鼠(280-320g; n二8)用于脑缺血和再灌 注，且随后监测脑血流量。Tat或SVl-l肽为合成的经由如前述的Cys S-S键结合的(Chen等，淑/. JcW. 5W. USA 25(20):11114-11119 (2001 ); Inagaki等，Circulation 11 (108): 2304-2307 (2003))。下述过程中 后立即通过过量的异氟垸处死大鼠。
方法
在雄性Sprague-Dawley大鼠中，使用如在Maier等， / A/ewraswg. 94(1 ):90-96 (2001)中描述的栓塞血栓结构(occluding intraluminal suture)诱导缺氧和再灌注。简而言之，将一个顶部由框(flame)包围 的3-0尼龙单纤维丝结构的未涂层的30mm长的片段，插入进外部颈 动脉残肢(stump)上，并前行进入距离分叉19-20mm的内部颈动脉， 以栓塞大脑中动脉(MCA)的入口。然后缝合该部位，闭合伤口，将动 物放回笼子两小时。这段时期后，再次麻醉动物，拆开缝合，以便进
行脑再灌注。
立即在再灌注后，将大鼠放置在一个立体框中，在相应缺血区域
的同侧半球上，在颅的后方lmm和前卤侧方6mm通过钻出一个孔。 通过该钻孔，使用由显微操纵器(Laserflo BPM403A laser-Doppler flowmeter, Vasamedic, St. Paul, MN)控制的激光多普勒检测器来测量脑 血流量(CBF)。所述显示仅仅为数字的，每秒钟收集8个数值点，并设 置成每O.l秒给出数据的迁移平均值(Perez-Pinzon等，A^ewra/og. 5W. 153 (1):25-31 (1997); Borlongan等，Brazw及仏1010(1-2): 108-116 (2004)。在再灌注开始30分钟开始CBF读数。随后在20-30分钟的一 段时间建立CBF基准线，通过腹膜内推注SPKC抑制剂、SVl-l肽(将 其与Tat结合以递送)，再监测血流量另外20-30分钟。对照假性动物 没有接受局部缺血，但其它处理类似。 结果
发现在经受局部缺血/再灌注损伤的大鼠中，推注、腹膜内递送所 述SV1-1肽在30分钟内增加了脑血流量，如图2所示。随后在30分 钟内用如在图1中所示递送所述SV1-1处理后，假性处理的动物没有 显示出血流量的变化。此外，无论是在假性处理的或局部缺血处理的 动物中，单独使用生理盐水或Tat对照肽对CBF都没有影响(数据未显 示)。
实施例2
在经受局部缺血/再灌注损伤的大鼠中，长期给药SPKC抑制剂对
脑血流量的影响
本实施例显示了在经受缺血/再灌注损伤并且用SV1-1肽进行多次 处理的大鼠没有对所述抑制剂开始脱敏。如实施例1中的描述进行该 实验。
结果
重复腹腔内给药5V1-1肽进一步增加了血流量，如图3所示。
实施例3
在经受局部缺血/再灌注损伤的大鼠中的脑组织的显微镜检査
本实施例显示了在卒中后递送SV1-1-TAT改善了脑血管病变。更 特别定地，在大脑中动脉栓塞之后，腹腔内递送SV1-1-TAT显著增加 了开放微血管的数量和改善在卒中之后的缺血半影区中的微脉管的病 变。
方法
使得Sprague-Dawley大鼠经受120分钟的MCA栓塞，接着进行4 小时的再灌注。在再灌注开始时，通过推注腹膜内注射TAT或 5Vl-l-TAT肽来处理大鼠(每毫升0.2mg/kg，每组11=4)。类似地处理假 性动物，但不经受缺血过程，且不接受肽处理(11=4)。在再灌注期后， 用异氟烷重麻醉大鼠，先用0.7%NaCL/PBS，随后为在0.7%NaCL/PBS 中4%的甲醛经颈静脉灌注。
切除大脑，将其保存在4'C的2%甲醛/2%戊二醛的0.1M 二甲砷 酸钠缓冲液，pH7.3中过夜，然后在同侧皮层(相当于通过激光多普勒 血流检测仪的位置)的前囱方向前方 lmm/侧方 6mm的皮层切开脑 切片( lmm3)。用lX的四氧化锇将组织后固定(post-fixed)1小时，用 水洗涤，在1%的醋酸铀酐溶液中染色。先使用乙醇梯度，而后用100 %的环氧丙烷使组织脱水，用Epon和Embed812介质浸润，放置于模 中，在切片之前于65'C聚合过夜。在聚乙烯醇縮甲醛/碳涂覆的Cu格 挑选上切片(75到90nm)，在1:1过饱和醋酸双氧铀(7.7%)的丙酮中染 色15秒，随后在0.2%柠檬酸铅中染色3至4分钟(所有试剂均来自 Electron Microscopy Sciences, PA)。在JEOL 1230透射电子显微镜(TEM) 中于80kV下观测组织，使用GatanMultiscan 791数码相机拍摄照片。
为了定量开放血管的数量，对每个动物的2-3个切片的10-15个非 重叠区域(1200X放大倍数)拍照。如果内腔和内皮内层的是透明的，鉴 定血管，计数；在更高的放大倍率下，通过扫描这些区域鉴定血管。 由不知治疗组的观察者进行血管计数的评价。然后，平均每组动物的 每个区域血管的数量(每组n=4)。使用未配对的t-test分析组之间的统 计学差异。拍摄的更高放大倍率的图像(5000-15000X)来评价微脉管的 形态。
结果
检査相当于缺血性半影区(前卤的lmm后/侧面6mm)脑皮层的定 义区域。首先使用较低的放大图像(1200X)来定量微脉管的数量，这些 图像显示于图4A-4C中。如果可确定可辨认的微脉管内腔和周围的内 皮内层，则计数血管。在用TAT肽处理的局部缺血的动物中，与 SV1-1-TAT处理的组织(TAT 1.6±0.6血管/区域；SV1-1-TAT， 3.1 ±0.6血 管/区域；pO.05;『4;图5和图4D-4F)相比，观测到血管数量显著地减 少。在先经受局部缺血，然后在再灌注下用3V1-1-TAT处理的动物中 的微脉管数量与假性动物(假性，3.8+/-0.4血管/区域rLS.; n=4;图5和图 4C对图4A)的类似。
在来自对照假性对照动物的皮层组织中，使用更高的放大倍率的 TEM观察到健康的微脉管结构特征。这些包括完整的基底膜，清楚和 开放的血管内腔和不正常血管周隙的缺乏(图4D、 4G、 4J)。观测到来 自局部缺血的动物的脑组织中微观(ultrastructural)结构破坏的证据(图 41、 4J)，包括血管水肿、星形胶质细胞终足肿胀、内皮细胞核表面扩 张、基底膜的破坏、脉管内腔的压縮和内腔表面的不规则。然而，在 仅仅在再灌注时用SVl-l-TAT处理(0.2mg/kg)的局部缺血的动物中，微 观结构表现出明显较少的损伤(图4F、 41、 4L);在少量血管中观察到 星形胶质细胞终足肿胀(图4F)，然而，大多数血管表现正常(图41、 4L)。
尽管上文讨论了大量示范性的方面和实施方案，本领域技术人员 将认识到其某些修饰、变更、增加和再次组合(sub-combination)。因 此，其意味着下文附加的权利要求和此后引入的权利要求可解释为包 括如在其真正精神和范围内的修饰、变更、增加和再次组合。
权利要求
1.一种增加正在经受血流量减少的哺乳动物的脑血管中血流量的方法，包括向需要的患者给药治疗有效量的δ蛋白激酶C(δPKC)抑制剂。
2. 权利要求1的方法，其中所述抑制剂是肽。
3. 权利要求2的方法，其中所述肽为具有在SEQIDNO:l中列出 的氨基酸序列的SV1-1。
4. 权利要求2的方法，其中所述肽为具有在SEQIDNO:l中列出 的氨基酸序列的SV1-1，具有在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的 SVl-2，具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的SV1-5;具有在SEQ IDNO:4中列出的氨基酸序列的SV5;或其组合。
5. 权利要求2的方法，其中所述肽具有与在SEQIDNO:l中列出 的5V1-1的氨基酸序列至少约50%同一性的氨基酸序列；具有与在 SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的SV1-2至少约50%同一性的氨基 酸序列；具有与在SEQ ID NO:3中列出的5V1-5的氨基酸序列至少约 50%同一性的氨基酸序列；具有与在SEQIDNO:4中列出的5V5的氨 基酸序列至少约50%同一性的氨基酸序列。
6. 权利要求1的方法，其中所述血管已经经受局部缺血或再灌注 事件。
7. 权利要求1的方法，其中所述血管已经经受血管收縮或血管痉挛。
8. 权利要求6的方法，其中与在所述局部缺血事件期间的血流量 相比，增加了在由所述局部缺血事件引起的缺血半影区中的血流量。
9. 权利要求7的方法，其中与在所述事件期间的血流量相比较， 增加了在由于血管收縮或血管痉挛事件导致的血流灌注不足区域的血 流量。
10. 权利要求1的方法，其中所述血管为脑动脉、毛细血管或小动脉。
11. 权利要求10的方法，其中所述脑动脉是大脑前动脉、大脑中 动脉或大脑后动脉。
12. 权利要求1的方法，其中所述血管是颈动脉。
13. 权利要求1的方法，其中所述S蛋白激酶C抑制剂的治疗有 效量为相对于给药所述抑制剂之前的血流量，能有效地增加血流量至 少约10%的有效量。
14. 权利要求1的方法，其中所述SPKC抑制剂的治疗有效量为相 对于给药所述抑制剂之前的血流量，能有效地增加血流量至少约50% 的有效量。
15. 权利要求l的方法，其中所述5PKC抑制剂结合载体肽。
16. 权利要求15的方法，其中所述载体肽具有在SEQ ID NO:84 或SEQ ID NO:85中列出的氨基酸序列。
17. 权利要求1的方法，其中所述抑制剂为通过胃肠道外途径给药。
18. 权利要求1的方法，其中所述抑制剂能够长期给药而不会引起 对所述抑制剂的脱敏。
19. 权利要求18的方法，其中所述抑制剂为多次给药患者。
20、 —种用于增加正在经受血流量减少的哺乳动物的脑血管中血流量的试剂盒，其包含SPKC抑制剂和使用所述抑制剂来增加所述血管的血流量的使用说明。
21、 权利要求20的试剂盒，其中所述抑制剂是肽。
22、 权利要求21的试剂盒，其中所述肽为具有在SEQIDN0:1中 列出的氨基酸序列的SV1-1。
23、 权利要求21的试剂盒，其中所述肽为具有在SEQIDNO:l中 列出的氨基酸序列的SV1-1;具有在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序 列的SVl-2;具有在SEQIDNO:3中列出的氨基酸序列的SVl-5;具有 在SEQIDNO:4中列出的氨基酸序列的SV5;或其组合。
24、 权利要求21的试剂盒，其中所述肽具有与在SEQIDNO:l中 列出的SV1-1的氨基酸序列至少约50%同一性的氨基酸序列；具有与 在SEQIDNO:2中列出的氨基酸序列的SV1-2至少约50%同一性的氨 基酸序列；具有与在SEQ ID NO:3中列出的5V1-5的氨基酸序列至少 约50%同一性的氨基酸序列；具有与在SEQIDNO:4中列出的SV5的 氨基酸序列至少约50%同一性的氨基酸序列。
25、 权利要求21的试剂盒，其中所述5PKC抑制剂结合载体肽。
26、 权利要求25的试剂盒，其中所述载体肽具有在SEQ IDNO:84 或在SEQ ID NO:85中列出的氨基酸序列。
全文摘要
提供增加哺乳动物脑血管中血流量的方法，其特征在于，所述哺乳动物正在以不同的方式经受由于局部缺血或其它缺氧性事件、出血性卒中后的血管收缩或血管痉挛；由于长期高血压；和/或由于原发性原因导致的血流量减少。所述用于增加这种哺乳动物脑血管中血流量的方法包括给药需要的患者治疗有效量的蛋白激酶C抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂可以在不导致所述患者对所述抑制剂脱敏的情况下长期给药。提供用于增加哺乳动物脑血管中血流量的试剂盒，其特征在于，所述哺乳动物正在以不同的方式经受由于局部缺血或其它缺氧性事件、出血性卒中后导致的血管收缩或血管痉挛；由于慢性高血压；和/或由于原发性原因引起的血流量减少。
文档编号A61P9/10GK101111257SQ200580045963
公开日2008年1月23日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年1月4日
发明者D·莫切里-罗森, R·布赖特 申请人:里兰斯坦福初级大学理事会