用二乙烯基砜交联透明质酸的方法

专利名称：：用二乙烯基砜交联透明质酸的方法
背景技术：
：本发明涉及一种制备用于化妆品、生物医学和制药应用的改性透明质酸(HA)、特别是交联的HA的方法。透明质酸(HA)是属于非硫酸化糖胺聚糖类别的天然和线性碳水化合物高分子。其由β-1，3-N-乙酰基葡糖胺和β-1，4-葡糖醛酸重复的二糖单元组成，分子量(MW)高达6MDa。HA存在于透明软骨、滑液关节流体、和皮肤组织(真皮和表皮二者)中。HA可以从天然组织包括脊椎动物的结缔组织中、从人脐带中和从鸡冠中提取。但是，目前优选通过微生物方法制备HA，以使传播传染物的潜在风险最小化，和增加产品均匀性、质量和可用性(WO03/0175902、Novozymes)。已确认了体内HA的许多功能。其在生物有机体中起到重要的功能，作为用于许多组织如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞的机械载体。HA参予到关键的生物过程中，如组织的润湿，和润滑过程。也怀疑其在大量生理机能中起作用，如粘附、成长、细胞运动性、癌症、血管发生、和创伤愈合。由于HA的独特物理与生物性能(包括粘弹性、生物相容性、生物降解性)，在化妆品、眼科学、风湿病学、给药、创伤愈合和组织工程之内的宽范围现有与发展中的应用中使用了HA。HA在一些这些应用中的用途受限于这样的事实，HA在室温、即约20℃下溶于水，其被体内的透明质酸酶快速降解，且其难以加工成生物材料。由此，已提出了HA的交联，由此改进HA的物理与机械系能和其体内停留时间。US4,582,865(BiomatrixInc.)描述了HA的交联凝胶的制备，单独地或者与其它亲水性聚合物混合地，使用二乙烯基砜(DVS)作为交联剂。利用多官能环氧化物制备交联的HA或其盐公开于EP0161887B1。用于通过共价键交联HA的其它二-或多-官能试剂包括甲醛(U.S.4,713,448、BiomatrixInc.)，聚氮丙啶(WO03/089476A1、GenzymeCorp.)，L-氨基酸或L-氨基酯(WO2004/067575、BiosphereS.P.A.)。也已报道了碳二亚胺来交联HA(US5,017,229、GenzymeCorp.；US6,013,679、AnikaResearch，Inc)。US4,957,744中公开了用脂肪醇全部或部分交联的HA的酯，和这种偏酯与无机或有机碱的盐。发明概述本发明所要解决的问题是如何制备具有改进的性质的基于透明质酸的水凝胶，如更高的均质性、增强的柔软性、和/或更容易的可注射性。通过本发明的方法制得的交联的凝胶，相对于标准DVS交联的HA-水凝胶，显示增强的均质性和增强的柔软性。如实施例中所示，由本发明方法获得的凝胶也更容易通过注射器注射。由此，一方面，本发明涉及一种制备包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS加到步骤(a)的溶液中，由此用DVS交联透明质酸或其盐以形成凝胶；(c)用缓冲剂处理步骤(b)的凝胶，其中凝胶溶胀且形成包含由DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。第二方面，本发明涉及一种包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶，其均质性足以用稳定注射力以12.5mm/min的速度在55mm的距离之上通过27G1/2针从1mL注射器中注射，该注射力在注射的最初40秒钟之后、和直到注射器清空，变化不超过约5牛顿(N)，优选地不超过约4N，更优选3N、2N，或者最优选地不超过约1N。第三方面，本发明涉及一种组合物，其包含第二方面中所定义的水凝胶和活性成分，优选地该活性成分是药理学活性剂。本发明的第四方面涉及药物组合物，其包含有效量的第二方面中所定义的水凝胶，以及可药用载体、赋形剂或稀释剂。第五方面涉及药物组合物，其包含有效量的第二方面中所定义的水凝胶作为媒介物(vehicle)，以及药理学活性剂。第六方面涉及化妆用品(cosmeticarticle)，其包含作为活性成分的有效量的第二方面中所定义的水凝胶，或者第三、第四、或第五方面任一项中所定义的组合物。第七方面，本发明涉及卫生、医疗或外科用品，其包含第二方面中所定义的水凝胶，或者第三、第四、或第五方面任一项中所定义的组合物；优选地该用品为尿布、卫生巾、外科纱布(surgicalsponge)、创伤愈合纱布(woundhealingsponge)、或者绷带(bandaid)或其它创伤敷料(wounddressingmaterial)中所含的一部分。重要的方面涉及药物胶囊或微胶囊，其包含第二方面中所定义的水凝胶，或者第三、第四、或第五方面任一项中所定义的组合物。许多方面涉及第二方面中所定义的水凝胶或者第三、第四、或第五方面任一项中所定义的组合物的用途，用于制备治疗骨关节炎、癌症的药物，制备眼科治疗(ophtalmologicaltreatment)用药物，制备治疗创伤的药物，制备血管发生用药物，制备治疗脱发(hairloss)或秃顶(baldness)的药物，制备保湿剂或化妆品(cosmetic)，或者用于美容处理(cosmetictreatment)。定义本文中所使用的术语“透明质酸”含义为由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的残基构成的具有不同分子量的酸性多糖，其天然地存在于细胞表面中，脊椎动物的结缔组织的碱性细胞外物质中，关节的滑液中，眼睛的内延髓流体中，人脐带组织中和鸡冠中。术语“透明质酸”实际上经常用于表示全系列的多糖，其具有交替的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的残基，以及变化的分子量或者甚至其降解部分，且其由此似乎使用复数形式的“透明质酸”更准确。但是，该说明书中仍然使用单数形式；另外，经常使用“HA”代替该集合术语。“透明质酸”在本文中定义为由交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接在一起的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单元组成的非硫酸化糖胺聚糖。透明质酸也称为乙酰透明质酸(hyaluronan)、透明质酸盐、或HA。术语乙酰透明质酸和透明质酸在本文中也可交换地使用。公鸡冠是乙酰透明质酸的重要商用原料。微生物是替换的原料。US4,801,539公开了用于制备透明质酸的发酵方法，包括兽瘟链球菌(Streptococcuszooepidemicus)的菌株，所报道的产量为约3.6g透明质酸/升。欧洲专利EP0694616公开了利用改进的兽瘟链球菌菌株的发酵方法，所报道的产量为约3.5g透明质酸/升。如WO03/054163(Novozymes)中所公开的那样，其全部内容引入本文，可以在例如格兰氏阳性(Gram-positive)芽孢杆菌宿主中重组地制得透明质酸或其盐。已描述了来自眷椎动物、细菌病原体和海藻病毒的乙酰透明质酸合酶(DeAngelis、P.L.、1999、Cell.MoI.LifeSci.56670-682)。WO99/23227公开了似马链球菌中的GroupI透明质酸盐合酶。WO99/51265和WO00/27437描述了Pasturellamultocida中的GroupII透明质酸合酶。Ferretti等公开了酿脓链球菌的透明质酸合酶，其由三种基因hasA、hasB、和hasC组成，其分别编码透明质酸合酶、UDP葡萄糖脱氢酶、和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，4658-4663，2001)。WO99/51265描述了具有似马链球菌乙酰透明质酸合酶的编码区域的核酸片段。由于重组的芽孢杆菌属细胞的乙酰透明质酸直接表达到培养基，可以采用简单的方法将乙酰透明质酸从培养基中分离出来。首先，将芽孢杆菌属细胞和细胞碎片从培养基中物理去除。如果需要的话，可以首先将培养基稀释以降低介质的粘度。用于从培养基中除去细胞的许多方法是本领域技术人员已知的，如离心或微滤。如果需要的话，随后可以将剩余的上清液过滤，例如通过超滤进行过滤，以将小分子污染物从乙酰透明质酸中浓缩和除去。除去细胞和细胞碎片之后，可以通过已知的机理从介质中进行简单地沉淀乙酰透明质酸。可以采用盐、醇、或盐与醇的组合将乙酰透明质酸从滤液中沉淀。一旦变为沉淀物之后，可以通过物理方法容易地将乙酰透明质酸从溶液中分离。可以采用本领域已知的蒸发技术将乙酰透明质酸干燥或从滤液中浓缩，如冻干法或喷雾干燥法。宿主细胞优选实施方式涉及第一方面的方法，其中重组地制得透明质酸或其盐，优选地通过格兰氏阳性细菌或宿主细胞，更优选地通过芽孢杆菌属的细菌。该宿主细胞可以是适合于透明质酸的重组制备的芽孢杆菌属细胞。该芽孢杆菌属宿主细胞可以是野生型的芽孢杆菌属细胞或其突变体。用于实施本发明的芽孢杆菌属细胞包括、但并非限定于，Bacillusagaraderhens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、Bacillusclausii、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞。特别地适合于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞描述于WO98/22598。非封装的(non-encapsulating)芽孢杆菌属细胞特别适用于本发明。优选实施方式中，该芽孢杆菌属宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌、Bacillusclausii、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞为解淀粉芽孢杆菌细胞。另一更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞为Bacillusclausii细胞。另一更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞为迟缓芽孢杆菌细胞。另一更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞为地衣芽孢杆菌细胞。另一更优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞为枯草芽孢杆菌细胞。最优选的实施方式中，芽孢杆菌属宿主细胞为枯草芽孢杆菌A164Δ5(参见U.S.5,891,701)或枯草芽孢杆菌168Δ4。分子量可以依据改进的咔唑方法(Bitter和Muir，1962，AnalBiochem.4330-334)测量透明质酸的含量。另外，可以采用本领域中的标准方法测量透明质酸的平均分子量，如Ueno等，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta2721-40；和WyattTechnologies，1999，″LightScatteringUniversityDAWNCourseManual″与″DAWNEOSManual″WyattTechnologyCorporation，SantaBarbara，California描述的那些方法。优选实施方式中，本发明的透明质酸或其盐的分子量为约10,000～约10,000,000Da。更优选的实施方式中，其分子量为约25,000～约5,000,000Da。最优选的实施方式中，透明质酸的分子量为约50,000～约3,000,000Da。优选实施方式中，本发明的透明质酸或其盐的分子量范围为300,000～3,000,000，优选地为400,000～2,500,000，更优选地为500,000～2,000,000，且最优选地为600,000～1,800,000。仍另一优选实施方式中，透明质酸或其盐的低平均分子量(lowaveragemolecularweight)范围为10,000～800,000Da，优选地为20,000～600,000Da，更优选地为30,000～500,000Da，甚至更优选地为40,000～400,000Da，且最优选地为50,000～300,000Da。盐和交联的HA优选的实施方式涉及第一方面的方法，其包括透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、或透明质酸钴。其它成分优选实施方式中，通过本发明方法制得的产品也可以包含其它成分，优选一种或多种活性成分，优选一种或多种药理学活性的物质，且也优选水溶性赋形剂，如乳糖或非生物学衍生的糖。可以用于本发明的活性成分或药理学活性的物质的非限定性实例包括维生素，蛋白质和/或肽药物，如人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、促生长激素释放激素/肽(growthhomronereleasinghormone/peptide)、粒细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、巨噬细胞-集落刺激因子、促红细胞生成素、骨形态发生蛋白、干扰素或其衍生物、胰岛素或其衍生物、心房肽激素-III、单克隆抗体、肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、白介素、肿瘤退化因子(tumordegeneratingfactor)、胰岛素-样生长因子、表皮生长因子、组织纤溶酶原激活物、因子IIV、因子IIIV、和尿激酶。出于稳定活性成分的目的，可以包括水溶性赋形剂，该赋形剂可以包括蛋白质，例如白蛋白或明胶；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸及其盐；碳水化合物如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖和硫酸软骨素；无机盐如磷酸盐；表面活性剂如TWEEN(ICI)、聚乙二醇，及其混合物。该赋形剂或稳定剂的用量范围可以为该产品的0.001～99wt％。本发明的几个方面涉及各种组合物和药物，其包括，除其它成分之外，有效量的交联的HA产品，和活性成分，优选地该活性成分为药理学活性剂；可药用载体、赋形剂或稀释剂，优选水溶性赋形剂，且最优选乳糖。本发明的优选实施方式涉及泡腾片(effervescenttablet)中所包含的本发明的产品或组合物，其可以如本领域中所述以其它方式配制。例如，泡腾片可以包括柠檬酸、碳酸氢钠、和寡糖或其它糖。泡腾片容易储存，且采用本发明的快速溶解的产品，它们快速溶解且由此提供了口服给药的理想方式。另外，本发明的方法涉及包含第一方面中所定义的产品或者上述方面和实施方式中定义的组合物的用品，例如化妆用品、卫生用品、医疗或外科用品。最后的方面中，本发明涉及药物胶囊或微胶囊，其包含第一方面中所定义的产品或者本发明其它方面和实施方式中所定义的组合物。图1阐述了由透明质酸酶降解获得的DVS-HA水凝胶的重量损失随时间的变化。将如实施例2中所述，通过加热步骤(“加热的”)制得的DVS-HA水凝胶与未进行热处理(“未加热的”)的DVS-HA水凝胶比较。图2显示了一组具有不同交联比例或者程度的DVS交联的HA水凝胶在磷酸盐缓冲剂(pH＝7.0)中溶胀期间的PH值的时间过程，如以下实施例6中详细地描述。图3显示了依据本发明制得的两种HA水凝胶的弹性模量(G’)，其用圆形标注，和剪切损失(shearloss)或粘性模量(viscousmodulus)(G”)，其用正方形标注，一种采用10∶1的HA/DVS比例和6％HA制备，另一种采用15∶1的HA/DVS比例和6％HA制备，如下实施例7中详细地描述。HA/DVS10∶1水凝胶的弹性模量(G’圆形)在全部频率(x-轴)为上面的线(y-轴)，且HA/DVS10∶1水凝胶的剪切损失模量(G”正方形)是下面的线，除了在x-轴的最左手侧，其为上面的线。图4显示了采用本文实施例2中所述的方法制得的(“新的，加热的”)DVS交联的HA水凝胶(HA/DVS10∶1，wt)、和如下面实施例9中所述的那样依据现有技术(参见US4,582,865，实施例1)不加热制得的水凝胶的可注射性(syringeability)。y-轴显示以牛顿为单位的注射力，开始于0.0，增量为2.5，且结束于35.0。图5显示了采用本文实施例2中所述的方法制得的(“新的，加热的”)DVS交联的HA水凝胶(HA/DVS15∶1，wt)、和如下面实施例9中所述的那样依据现有技术(参见US4,582,865，实施例1)不加热制得的水凝胶的可注射性(syringeability)。y-轴显示以牛顿为单位的注射力，开始于0.0，增量为2.5，且结束于30.0。发明详述本发明的第一方面涉及一种制备包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS加到步骤(a)的溶液中，由此用DVS交联透明质酸或其盐以形成凝胶；(c)用缓冲剂处理步骤(b)的凝胶，其中凝胶溶胀且形成包含由DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。先前已描述了如何在芽孢杆菌属宿主细胞中重组地制备透明质酸，参见WO2003/054163，NovozymesA/S，其全部引入本文中。由此，在优选的实施方式中，本发明涉及第一方面的方法，其中在芽孢杆菌属宿主细胞中重组地制备透明质酸或其盐。有益地出于具体目的，已描述了各种分子量分数的透明质酸。本发明的优选实施方式涉及第一方面的方法，其中该透明质酸或其盐的平均分子量为100～3,000kDa，优选地为500～2,000kDa，且最优选地为700～1,800kDa。本发明的方法中，透明质酸或其盐的初始浓度影响获得的交联凝胶和溶胀的水凝胶的性质。由此，本发明的优选实施方式涉及第一方面的方法，其中碱性溶液包含浓度为0.1％～40％(w/v)的溶解的透明质酸或其盐。交联反应期间的pH值也影响结果，由此在优选实施方式中本发明涉及第一方面的方法，其中该碱性溶液包含浓度为0.001～2.0M的溶解的氢氧化钠。也值得注意的是，交联剂的浓度显著影响获得的凝胶。由此，本发明的优选实施方式涉及第一方面的方法，其中以HA/DVS(干重)为1∶1～100∶1、优选HA/DVS(干重)为2∶1～50∶1的重量比将DVS加到步骤(a)的溶液中。发明者发现，在将DVS加到HA-溶液期间和/或之后紧接着，初始阶段的搅拌是期望的，由此获得满意的凝胶化。由此，本发明的优选实施方式涉及第一方面的方法，其中在搅拌下将DVS加到步骤(a)的溶液中，且其中将溶液温度保持在5℃～50℃、优选15℃～40℃、更优选20℃～30℃；优选地，该搅拌持续1～180分钟。在第一方面的方法的另一优选实施方式中，将DVS加到步骤(a)的溶液中，而不搅拌。本发明者证实，在将DVS加到溶液中之后加热步骤是有益的。由此，本发明的优选实施方式涉及第一方面的方法，其中将步骤(b)中溶液温度加热到20℃～100℃，优选为25℃～80℃，更优选为30℃～60℃，和最优选为35℃～55℃，且其中将温度保持在该范围下至少5分钟，优选至少10分钟，20分钟，30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最优选地至少180分钟；优选不搅拌。有利的是在进行交联反应之后使凝胶在室温下放置短暂的时间。在第一方面的方法的优选实施方式中，将凝胶保持在0℃～40℃、优选10℃～30℃的温度范围下至少5分钟，优选至少10分钟、20分钟、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最优选地至少180分钟。预想本领域技术人员众所周知的多种类型的缓冲剂适用于溶胀和中和本发明的交联的凝胶。在优选的实施方式中，该缓冲剂包含pH值范围为2.0～8.0、优选为5.0～7.5的缓冲剂。最佳地，选择适宜的缓冲剂，其pH值导致溶胀的水凝胶的pH尽可能地接近中性。优选的实施方式中，该缓冲剂包含其pH值使水凝胶的pH值在5.0～7.5之间的缓冲剂。优选地，在第一方面的方法中，该缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和/或盐缓冲剂(salinebuffer)。在溶胀步骤中，缓冲剂的体积必须足以容纳溶胀的凝胶直到该凝胶完全溶胀。由此，在第一方面的方法的优选实施方式中，步骤(c)中的缓冲剂的体积是步骤(b)的凝胶的体积的至少3倍。在第一方面的方法的优选实施方式中，在20℃～50℃温度下进行步骤(c)的溶胀至少5分钟，优选至少10分钟、20分钟、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170，或者最优选地至少180分钟。也优选用pH值为2.0～8.0、优选为5.0～7.5的水，水与磷酸盐缓冲剂、水与盐缓冲剂、或水和磷酸盐缓冲剂与盐缓冲剂，洗涤步骤(c)中形成的水凝胶至少一次。实施例实施例1-DVS-交联的HA水凝胶的制备该实施例阐述了采用伴随有溶胀和pH调节制备DVS-交联的HA水凝胶。将透明质酸钠(HA，770kDa，1g)溶解到0.2MNaOH中获得4％(w/v)的溶液，将其在室温、即约20℃下搅拌1h。制得三个复制品。随后以足量将二乙烯基砜(DVS)加到HA溶液中，由此分别使HA/DVS重量比为10∶1、7∶1、和5∶1。将混合物在室温下搅拌5分钟并且随后使其在室温下静置1h。随后将凝胶在160mL磷酸盐缓冲剂(pH4.5或6.5)中溶胀24h，如表1中所示。表1DVS-HA水凝胶制备的条件在溶胀步骤期间使凝胶的pH稳定。溶胀后，通过过滤除去任何过量的缓冲剂，并且用IKAULTRA-TURRAXT25均化器(IkaLabortechnik，DE)将水凝胶简单地均化。测量凝胶的体积和pH(参见表2)。表2DVS-HA水凝胶的特征水凝胶的pH范围为7.1～7.6(表2)，其证实了可以利用溶胀步骤在该方法中调节pH。全部凝胶占据的体积为70mL，其对应于约1.4％(w/v)的HA浓度。它们是透明的、粘性的和均质的。柔软性随着交联度降低而增加(表2)。实施例2-均质DVS-交联的HA水凝胶的制备该实施例阐述了高均质的DVS-交联的HA水凝胶的制备。将透明质酸钠(770kDa，2g)溶解到0.2MNaOH中，在室温下搅拌约1h，由此获得8％(w/v)的溶液。随后加入DVS使HA/DVS重量比为7∶1。在室温下搅拌5分钟之后，将一个样品在50℃下热处理2h而不搅拌，并随后使其在室温下静置过夜。将获得的交联凝胶在37℃下溶胀到200mL磷酸盐缓冲剂(pH5.5)中42或55h，最后用100mL水洗涤两次，将其抛弃。测量体积和pH，以及将凝胶从27G*1/2注射针头中推过必须的压力(参见表3)。表3DVS-交联的HA水凝胶的特征相对于未进行热处理的对照水凝胶(表3)，依据该实施例制得的交联的HA水凝胶显示更高的溶胀比例和增强的柔软性。通过27G*1/2针头注射期间施加的压力相对于后一样品的情况更稳定，表明交联的HA水凝胶更均质。实施例3-DVS-交联的HA水凝胶的生物稳定性该实施例采用酶降解阐述了DVS-交联的HA水凝胶的体外生物稳定性。在30mM柠檬酸、150mMNa2HPO4、和150mMNaCl(pH6.3)中制得牛睾丸透明质酸酶(HA酶)溶液(100U/mL)。将DVS-HA交联的水凝胶样品(约1mL)置于完全封闭的(safelock)玻璃瓶中，冻干，和称重(Wo；式1)。随后将酶溶液(4mL，400U)加到每个样品中，并且将瓶子在37℃下在温和振荡(100-200rpm)下温育。在预定的时间间隔，除去上清液并且将样品用蒸馏水彻底清洗以除去残留的盐，随后将它们冻干，和最终称重(Wt；式1)。生物降解表述为相对于样品初始重量的重量损失比例(式1)。由酶降解测试前后每个样品的重量减少计算重量损失。每个生物降解试验重复三次。式1结果示于表4、以及图1中，其阐述了由HA酶降解获得的DVS-HA水凝胶的重量损失随时间的变化。将如实施例2中所述制得的(“加热的”)DVS-HA水凝胶与未进行热处理(“未加热的”)的DVS-HA水凝胶比较。对于两种类型的凝胶，在开始4个小时内降解是快速的，且随后进程减慢直到在24h时结束。重要地，与如实施例2中所述采用加热步骤制得的水凝胶比较时，未加热的样品的重量损失值存在显著的变化。这清楚地显示，通过使用实施例2中所述的方法获得了高均质的DVS-交联的HA水凝胶。实施例4-用于化妆品的油包水乳液的制备在本实施例和随后的实施例中，将DVS-交联的HA水凝胶配制成乳膏(cream)和浆液(serum)，其在施用到皮肤上时增加皮肤湿润性和弹性，并且提供直接的(immediate)抗老化效应，以及成膜效应。通常的油包水(w/o)乳液配制物含有2％的DVS-交联的HA。通过混合所定义的成分(参见表4)，单独地制备每个相(A～E)。随后在采用机械推进搅拌装置搅拌的条件下和在小于40℃的温度下将相B加到相A中。随后在搅拌下加入相C，随后是相D，并且最后是相E。也制备配制物，其中相D中HA水凝胶浓度分别为4％、6％、和8％，由此获得多种w/o配制物。表4表5中显示了另一通常的含有2％DVS交联的HA的W/O-乳剂配制物。通过混合所定义的成分(参见表5)，单独地制得每个相(A～F)。将相B与相A混合，并且将获得的油相在75℃下加热。将相C也加热到75℃。在75℃下在采用机械推进搅拌装置搅拌下将油相加到相C中。随后将乳剂冷却到低于40℃，之后在搅拌下加入相D，随后是相E和最后是相F。也制备配制物，其中相E中HA水凝胶浓度分别为4％、6％和8％，由此获得多种w/o配制物。表5实施例5-硅氧烷浆液的制备如表6中所示，制得了含有2％DVS交联的HA的通常的硅氧烷浆液配制物。在极高搅拌和小于40℃下将全部成分同时混合(参见表6)。也制备配制物，其中HA水凝胶浓度分别为4％、6％和8％，由此获得多种浆液。表6实施例6-溶胀期间的pH平衡；动力学研究动力学研究显示，依据交联度，在磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中溶胀8～14小时之后，获得了具有中性pH的DVS交联的HA水凝胶。如上所述制得一组DVS交联的HA水凝胶，利用4～8％的HA溶液，且利用各种量的DVS交联剂，如表7中所示。表7在定期的间隔(每2小时)，在热处理期间取出水凝胶并倾析，并且测量pH值(参见图2)。每次测量之后使用新的溶胀缓冲剂。结果显示，对于所有水凝胶，2小时的溶胀之后pH范围为11～12。随后pH逐渐降低到7.2-7.5。对于较少交联的水凝胶，即其中HA/DVS比例较高的水凝胶，降低较快。图2中显示了对于HA6％溶液和两种不同比例的HA/DVS的pH降低，其中10∶1的HA/DVS比例用三角形标注，15∶1用正方形标注。在这两种情形中，在8小时之内使pH中和。相反，对于具有更高HA浓度(例如8％)或者更高程度交联(例如HA/DVS比例为2.5)的水凝胶，在14小时溶胀之后达到中性pH。这些观察与低交联水凝胶中HA分子显示更高自由度和灵活性的事实相一致，其容许良好的水合作用和由此更快的pH平衡。实施例7-基于DVS-交联的HA的水凝胶的粘弹性采用板-板几何形状和在25℃的控制温度下，在PhysicaMCR301流变仪(AntonPaar，Ostfildern，Germany)上进行流变学测量。通过动态振幅剪切摆动测试考察样品的粘弹性行为，其中使材料经受正弦剪切应变。首先，进行应变/振幅扫描试验以评价其中线性粘弹性有效的变形区域。应变通常范围为0.01～200％，且频率设定为1Hz。随后，在线性粘弹性区域中，在恒定剪切应变(10％)和0.1～10Hz的频率下，从频率扫描试验中记录剪切储存模量(或弹性模量G’)和剪切损失模量(或粘性模量，G”)值。几何形状、NF和间隙分别为PP25、2和1mm。G’给出了关于变形期间材料中储存的弹性或能量的信息，而G”描述了加热时消散的粘性特征或能量。特别地，弹性模量给出了关于样品支撑负荷和强加应力或变形之后恢复初始结构的能力的信息。全部试验中，每个样品测试至少三次。结果(图3)显示，对于两种水凝胶·G’＞G”和·G’几乎独立于频率。在具有较高程度的交联(即，较低的HA/DVS比例10/1)的水凝胶情形中，G’比G”高一个数量级，表明该样品变现为强的凝胶材料。简要地，整体流变学响应归因于物理与化学交联的贡献，和HA大分子之间的拓扑相互作用。链之间的相互作用带来了它们的本征运动性(intrinsicmobility)的降低，其不能够释放应力，并且由此该材料表现为三维网络，其中所施加应力的主要调整模式是通过网络变形。另外，该水凝胶的弹性高于具有较低程度交联(即，较高比例的HA/DVS15∶1)的水凝胶弹性。实际上，永久共价交联的数目越高，缠结数目越大，且由此水凝胶的弹性响应更高。实施例8-网络结构参数该试验中，使用平行板几何形状(PP30单元)在旋转流变仪(Gemini，BohlinInstruments，UK)上评价粘弹性。使用恒温浴在25℃的控制温度下进行测试。为了避免水蒸发，通过湿度控制附件控制含有该样品的室的湿度。使水凝胶在动态试验(小振幅频率扫描测试)中经受周期性摆动，由此评价弹性和粘性模量G’和G”的依赖性。频率范围为0.01Hz～10Hz。为了确定材料的线性粘弹性响应范围，以1Hz的摆动频率在样品上进行初步的应变扫描测试。每个样品上的测试重复至少三次。可以利用弹性模量值来评估网络结构的参数。由于G与缠结数目成比例(Ferry，1980)，所以弹性模量可以通过下式来表示式2其中，RT为热能，且z为缠结点或交联点的数目，以mol/体积表示。参数z可以通过下式来计算式3其中，c为聚合物浓度，且Me为两个缠结之间聚合物链段的平均分子量。带入式2，Me可以通过下列等式来估算式4为了通过式4计算G，假定橡胶弹性理论有效，且假设凝胶状材料的临时网络，在短于缠结网络的寿命的时间尺度的刺激下表现如同硫化橡胶(Flory，1953)。“悬垂端”，其为仅通过一个缠结点连接于网络的聚合物链链段，不会贡献于G值，因为它们不能储存弹性能量。由此，在式4中需要修正(Flory，1953)式5其中，Mn为数均分子量。利用“等价网络模型”(Schurz，1981)，能够估算DN，其为理想化的“等价网络”中缠结点之间的平均距离式6其中，A为阿伏加德罗数(Avogadro′snumber)。DN和Md的结果在表8中给出。可以注意到的是，对于样品1获得了更高的Md(248120g/mol)和更高的DN(46nm)。样品2具有最低的Md(204000)和43.5nm的DN值。样品3和4具有相同的弹性模量，其特征为在于，Md为240000g/mol和DN为42nm。表8对于DVS-HA水凝胶的网络参数。(a)溶胀期间；(b)0.1Hz下的弹性模量值。实施例9-DVS-交联的HA水凝胶的可注射性将依据本发明制得的DVS-交联的HA水凝胶的可注射性与依据现有技术(例如US4,582,865实施例1)制得的水凝胶的可注射性进行比较。在Texture分析仪(StableMicroSystems，TA.XTPlus)上测量注射性，其为以12.5mm/min的速度在55mm的距离之上将水凝胶通过27G1/2针头注射所需的力(以N表示)。将水凝胶样品转移到装有27G1/2针头的1mL-注射器中，并且将该注射器置于固定器中。每个样品测量三次。图4和5阐述了HA/DVS重量比分别为10∶1和15∶1的DVS-交联的HA水凝胶的可注射性。图4和5中记录的注射曲线是样品均质性特征。实际上，施加的注射力越稳定，水凝胶均质性越高。而且，低的力对应于操作者容易注射该水凝胶。该结果清楚地表明，依据本文中所述方法制得的DVSHA水凝胶的均质性远远大于由现有技术方法获得的那些。值得注意的是，现有技术的样品必须用机械方法均质化，由此使它们完全可注射。这种均质化产生了小颗粒，其存在导致非常不规则的注射曲线。另外，依据本发明制得的交联的水凝胶更容易通过细针头注射，这点由需要更低的力而得到证实。值得注意的是，由于形成更强的网络，注射力随着交联度的增加而增加。实施例10-用于局部眼科学的交联的DVS-HA水凝胶的配制物表9中显示了含有1％(w/v)DVS交联的HA的通常的500mL滴眼剂溶液配制物。称量所有成分并转移到500mL容量瓶中。加入水(300mL)并且将混合物在室温下搅拌5h。用2MNaOH将pH调节到7.2，用Milli-Q水将体积调节到准确的500mL。表9实施例11-具有防腐剂的交联的HA/DVS水凝胶采用0.2MNaOH中的1.5gHA钠以获得6％(w/v)溶液，制得DVS交联的HA水凝胶。HA/DVS重量比为10∶1。依据实施例2中所述的工序制备水凝胶的三个复制品，直到溶胀步骤，之后如下处理在50℃的炉中温育2小时之后，将水凝胶浸入Na2HPO4/NaH2PO4缓冲剂(1L，50mM，pH7.0)中，该缓冲剂含有防腐剂(2-苯氧基乙醇/3[(2-乙基己基)氧基]1，2-丙二醇)。防腐剂的浓度为10mL/mL以达到溶胀的水凝胶中最终浓度为1％(v/v)。预期防腐剂将在孵化期间扩散到水凝胶中，且同时，将防止缓冲剂中的微生物污染。将容器用parafilm覆盖并且置于37℃的炉中。1h后，移除溶胀浴并且将水凝胶在含有10mL/mL防腐剂的新鲜磷酸盐缓冲剂中溶胀6-7h。重复该步骤直到溶胀时间为12h，随后测量pH。再继续溶胀2.5h以达到中性pH。通过UV-分光光度法(ThermoE1ectron，Nicolet，Evolution900，equipmentnr.246-90)测量结合到水凝胶中的防腐剂的量。首先分析防腐剂在磷酸盐缓冲剂中的1％(v/v)溶液以选择波长。利用吸液管收集大约5mL的水凝胶。通常，在溶胀的圆形水凝胶的中间，和在该圆形凝胶的北、东、南和西“侧面”中收集样品。随后将样品转移到比色皿中并且在292nm处读出吸光度。每个样品读取三次，且相对于不含防腐剂的空白的DVS交联的HA水凝胶，吸光度为零。结果显示，结合到DVS-HA水凝胶中的防腐剂的量的范围为0.91～1.02％(参见表10)。复用品之间存在极佳的再现性。重要地，并未观察到来自相同水凝胶中的样品之间的显著差别，表明防腐剂均匀地扩散到水凝胶中。表10在掺加1％防腐剂的磷酸盐缓冲剂中溶胀14.5h后结合到DVS-HA水凝胶中的防腐剂的量。(*)吸光度为在相同样品上进行的三次测量的平均值。权利要求1.一种制备包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS加到步骤(a)的溶液中，由此用DVS交联透明质酸或其盐以形成凝胶；(c)用缓冲剂处理步骤(b)的凝胶，其中凝胶溶胀且形成包含由DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。2.权利要求1的方法，其中透明质酸或其盐是在芽孢杆菌属宿主细胞中重组制备的。3.权利要求1或2的方法，其中透明质酸或其盐的平均分子量为100～3,000kDa，优选地为500～2,000kDa，且最优选地为700～1,800kDa。4.权利要求1～3中任一项的方法，其中该碱性溶液包含浓度为0.1％～40％(w/v)的溶解的透明质酸或其盐。5.权利要求1～4中任一项的方法，其中该碱性溶液包含浓度为0.001～2.0M的溶解的氢氧化钠。6.权利要求1～5中任一项的方法，其中以HA/DVS(干重)为1∶1～100∶1，优选HA/DVS(干重)为2∶1～50∶1的重量比将DVS加到步骤(a)的溶液中。7.权利要求1～6中任一项的方法，其中在搅拌下将DVS加到步骤(a)的溶液中，且其中将溶液温度保持在5℃～50℃，优选15℃～40℃，更优选20℃～30℃。8.权利要求7的方法，其中该搅拌持续1～180分钟的时间。9.权利要求1～8中任一项的方法，其中将DVS加到步骤(a)的溶液中而不搅拌。10.权利要求1～9中任一项的方法，其中将步骤(b)中溶液温度加热到20℃～100℃，优选为25℃～80℃，更优选为30℃～60℃，和最优选为35℃～55℃，且其中将温度在该范围保持至少5分钟的时间。11.权利要求10的方法，其中在步骤(b)之后且在步骤(c)之前，将凝胶在0℃～40℃、优选在10℃～30℃的温度保持至少5分钟的时间。12.权利要求1～11中任一项的方法，其中该缓冲剂包含pH值范围为2.0～8.0、优选为5.0～7.5的缓冲剂。13.权利要求1～11中任一项的方法，其中该缓冲剂包含其pH值使水凝胶的pH值在5.0～7.5之间的缓冲剂。14.权利要求12或13的方法，其中该缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和/或盐缓冲剂。15.权利要求1～14中任一项的方法，其中步骤(c)中的缓冲剂的体积是步骤(b)的凝胶的体积的至少3倍。16.权利要求1～15中任一项的方法，其中在20℃～50℃温度下进行步骤(c)至少5分钟。17.权利要求1～16中任一项的方法，其中用水，和/或pH值为2.0～8.0，优选为5.0～7.5的磷酸盐和/或盐缓冲剂，洗涤步骤(c)中形成的水凝胶至少一次。18.权利要求1～17中任一项的方法，其中将防腐剂作为组分加到水凝胶中，优选地将防腐剂加到步骤(c)的缓冲剂中。19.一种包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的水凝胶，其均质性足以用稳定注射力以12.5mm/min的速度在55mm的距离之上通过27G1/2针从1mL注射器中注射，该注射力在注射的最初40秒钟之后、和直到注射器清空，变化不超过约5牛顿(N)，优选地不超过约4N，更优选3N、2N，或者最优选地不超过约1N。20.权利要求19的水凝胶，其中透明质酸或其盐的分子量为300,000～3,000,000，优选地为400,000～2,500,000，更优选地为500,000～2,000,000，且最优选地为600,000～1,800,000。21.权利要求19的水凝胶，其中透明质酸或其盐的低平均分子量范围为10,000～800,000Da，优选地为20,000～600,000Da，更优选地为30,000～500,000Da，甚至更优选地为40,000～400,000Da，且最优选地为50,000～300,000Da。22.权利要求19～21中任一项的水凝胶，其包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、或透明质酸钴。23.权利要求19～22中任一项的水凝胶，其还包含活性成分。24.权利要求23的水凝胶，其中该活性成分是药理学活性物质。25.权利要求19～24中任一项的水凝胶，其还包含水溶性赋形剂，优选乳糖。26.权利要求19～25中任一项的水凝胶，其还包含防腐剂。27.一种组合物，其包含权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶和活性成分，优选地该活性成分是药理学活性剂。28.权利要求27的组合物，其还包含水溶性赋形剂，优选乳糖。29.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶，以及可药用载体、赋形剂或稀释剂。30.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶作为媒介物，以及药理学活性剂。31.一种化妆用品或组合物，其包含权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物。32.一种卫生、医疗或外科用品，其包含权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶、或权利要求27～30中任一项所定义的组合物；优选地该用品为尿布、卫生巾、外科纱布、创伤愈合纱布、或者绷带(bandaid)或其它创伤敷料中所含的一部分。33.一种药物胶囊或微胶囊，其包含权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物。34.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备治疗骨关节炎的药物的用途。35.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备眼科治疗用药物的用途。36.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。37.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备治疗创伤的药物的用途。38.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备血管发生用药物的用途。39.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备保湿剂或化妆品组合物的用途。40.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物用于制备治疗脱发或秃顶的药物的用途。41.权利要求19～26中任一项所定义的水凝胶或权利要求27～30中任一项所定义的组合物在美容处理中的用途。全文摘要本发明涉及一种制备包含由二乙烯基砜(DVS)交联的透明质酸或其盐的均质水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供透明质酸或其盐的碱性溶液；(b)将DVS加到步骤(a)的溶液中，由此用DVS交联透明质酸或其盐以形成凝胶；(c)用缓冲剂处理步骤(b)的凝胶，其中凝胶溶胀且形成包含由DVS交联的透明质酸或其盐的水凝胶。文档编号A61K9/48GK101107270SQ200580047101公开日2008年1月16日申请日期2005年11月24日优先权日2004年11月24日发明者范妮·朗金,卡迪贾·施瓦科-阿布戴尔拉奥尤申请人:诺维信生物聚合物公司