用于癌症治疗的酪氨酸激酶抑制剂和her-2/neu的组合的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的酪氨酸激酶抑制剂和her-2/neu的组合的制作方法
用于癌症治疗的酪氨酸激酶抑制剂和HER-2/NEU的组合 发明领域本发明涉及下述物质的组合(a)喹唑啉衍生物，它是酪氨酸激 酶人表皮生长因子受体2 (也称作HER-2/neu或c-erbB"和表皮生长因 子受体(也称作EGFR或c-erbBl)的抑制剂，和(b)靶向HER-2分子的 免疫原性组合物。该组合可以用于治疗癌症。发明背景蛋白酪氨酸激酶催化参与调节细胞生长和分化的各种蛋白中的 特定酪氨酰残基的磷酸化。HER-2/neu和EGFR是蛋白酪氨酸激酶的 实例。具体蛋白酪氨酸激酶的抑制剂的实例在例如W099/35146 (US2002 177567)中给出，其在本文中引作参考。EGFR是一种170-kDa单链跨膜糖蛋白，它由具有酪氨酸激酶活 性的胞内催化结构域、锚定跨膜结构域和胞外配体结合区组成。HER-2/neu是表皮生长因子受体家族(一个酪氨酸激酶受体家 族)的成员。靶向HER-2/neu分子的疫苗或免疫原性组合物的实例已 经记载在，例如，WO00/44899 (US2002 177567)中，其在本文中引作 参考。HER-2/neu是一种跨膜蛋白，它的预测相对分子量是185 kD,它 长约1255氨基酸。HER-2/neu具有约645氨基酸的胞外结构域(ECD)、 高度疏水的跨膜结构域和约580氨基酸的羧基末端胞内结构域 (ICD)。术语"PD"代表胞内结构域中的"磷酸化结构域"(即被磷酸 化的结构域)，"APD"指磷酸化结构域中磷酸化结构域的特定片段(如 SEQ ID NO: 16所示)，且"KD"指胞内结构域中的激酶结构域。 HER-2/neuPD的长度是268氨基酸，是细胞内的，且可以被蛋白酪氨 酸激酶磷酸化。在约30%的乳腺癌患者中，扩增HER-2/neu基因，并超表达该蛋 白。HER-2/neu超表达已经被描述在许多种不同的恶性肺瘤中，包括 乳房、卵巢、肾细胞、前列腺、胰、结肠、非小细胞肺、胃、唾液腺、 膀胱和口腔扁平细胞。在乳腺癌患者中，HER-2/neu超表达是一种较
差的预后因子，且似乎预示对有些化疗剂的抗性。已经显示，基于HER-2/neu DNA和Her2肽的HER-2/neu疫苗在 动物模型和人疫苗试验中诱导对HER-2/neu的T细胞免疫。而且，发 现司徒曼布(Hercepth^， 一种人源化的针对HER-2/neu的单克隆抗体) 可以有效地治疗转移性乳腺癌。发明内容在本发明的第一个方面，提供了一种治疗哺乳动物癌症的方法， 其包含给所述哺乳动物施用治疗有效量的(a) 本文所述的式I、 II、 III或IV化合物，和/或其盐、溶剂化物 或生理功能衍生物，其中R,是Cl或Br; X是CH、 N或CF;且Het 是p塞唑或呋喃；和(b) 免疫原性组合物，其包含分离的蛋白，所述蛋白包含至少一 个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。在本发明的第二个方面，提供了一种药物组合，其包含治疗有效 量的(a) 本文所述的式I、 II、 III或IV化合物，和/或其盐、溶剂化物 或生理功能衍生物，其中R,是Cl或Br; X是CH、 N或CF;且Het 是p塞唑或呋喃；和(b) 免疫原性组合物，其包含分离的蛋白，所述蛋白包含至少一 个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。在本发明的第三个方面，提供了本文所述药物组合在制备治疗癌 症的药物中的应用。在本发明的第四个方面，提供了药物组合在制备治疗个体的癌症 的药物中的应用，所述药物组合包含治疗有效量的本文所述式I、 II、 III或IV化合物和/或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，其中该个体 已经被施用本文所述的免疫原性组合物，其包含至少一个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。令人惊奇地，发明人已经发现，本发明的组分(a)与用本发明的免 疫原性组合物(b)免疫接种后得到的血清一起施用的组合，导致乳腺 癌细胞生长抑制。这两种组分的协同作用远远高于用单一试剂治疗所 表现的抑制。
附图简述

图1显示了人HER-2/neu蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。图2显示了大鼠HER-2/neu蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。激酶结构域跨从氨基酸721至氨基酸998 (包含它们)的 区域。图3显示了胞外HER-2/neu蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。图4显示了人HER-2/neu蛋白的磷酸化结构域(PD)的氨基酸序 列(SEQIDNO: 15)。图5显示了人HER-2/neu蛋白的磷酸化结构域的部分(APD)的氨 基酸序列的实例(SEQIDNO: 16)。图6显示了包含人HER-2/neu蛋白的胞外结构域(ECD)和磷酸化 结构域(PD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO: 17)。图7显示了包含人HER-2/neu蛋白的胞外结构域(ECD)和磷酸化 结构域的示例部分(APD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。图8显示了大鼠HER-2/neu蛋白的胞外结构域(ECD)的氨基酸 序列(SEQIDNO: 19)。图9显示了编码人HER-2/neu蛋白的DNA分子的全长核苷酸序 列(SEQ ID NO: 20)。该全长核苷酸序列记载在WO 96/30514 (US 5,726,023),且该融合蛋白记载在WO00/44899 (US2002/0177567),它 们的公开内容在本文中整体引作参考。图10显示了编码大鼠HER-2/neu蛋白的DNA分子的全长核苷酸 序列(SEQIDNO:21)。该全长核苷酸序列记载在Bargmann等(1986) Nature, 319: 226-30，和GENBANK/X03362，它们的公开内容在本文 中整体引作参考。图11A显示了抗HER2/neu多克隆抗体与拉帕替尼(Lapatinib ) 组合对BT474人乳腺癌细胞增殖的抗增殖作用。图11B显示了抗HER2/neu多克隆抗体与拉帕替尼组合对SKBR3 人乳腺癌细胞增殖的抗增殖作用。图12A(上图)显示了用下述物质处理指数生长的BT474细胞的结 果(i)单独的DMSO (拉帕替尼的阴性对照)(ii)拉帕替尼(0.1 |iM)， (iii)pAb(100吗/ml), (iv)拉帕替尼(0.1 pM)和pAb (100pg/ml), (v) TA2021 (100pg/ml)， (vi)拉帕替尼(0.1 fxM)和TA2021(100 pg/ml), (vii)司徒曼布(10fig/ml)，或(viii)拉帕替尼(0.1 (iM)和司徒 曼布(IO (ig/ml)。 72小时后，使用膜联蛋白V染色和流式细胞术评价细胞凋亡。图12E显示了与图12A类似的结果。72小时后，还使用蛋白印迹评价了激活的磷酸-ErbB2(p-ErbB2)、 总ErbB2和存活蛋白的稳态蛋白水平(下图，其中泳道1是单独的 DMSO;泳道2是拉帕替尼(0.1 pM);泳道3是pAb (100|_ig/ml);泳 道4是拉帕替尼(0.1 (iM)和pAb (100pg/ml);泳道5是TA2021 (100|ig/ml);泳道6是拉帕替尼(0.1 pM)和TA2021(100 ng/ml);泳道 7是司徒曼布(10iag/ml);泳道8是拉帕替尼(0.1 jaM)和司徒曼布(lO pg/ml)。肌动蛋白稳态蛋白水平用作蛋白的等量加载的对照。用载体 (DMSO)或TA2021处理的BT474细胞分别用作拉帕替尼和pAb的对 照。图12B显示了使用相差显微镜术看到的指定的处理条件对BT474 细胞生长的作用(72小时后)。处理条件包括关于图12A所述的那些， 以及另夕卜，gefitinib (Iressa) (0.1 jxM); gefitinib (O.lpM)和pAB (100|xg/ml); gefitinib (O.l(xM)和TA2021 (100|ig/ml);和gefitinib 0.1|iM 和司4走曼布(1 Opg/ml)。图12C显示了使用膜联蛋白V染色和流式细胞术测得的，递增浓 度的单独的pAb或与拉帕替尼(lOOnM)组合的pAb对BT474细胞的细胞凋亡的作用。图12D显示了通过蛋白印迹评价的递增量的单独的pAb或与拉帕 替尼(100nM)组合的pAb引起的总ErbB2和p-ErbB2的稳态蛋白水平。肌动蛋白稳态蛋白水平用作蛋白的等量加载的对照。 图12E显示了与图12A类似的结果。图13显示拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)引起 Erkl/2和Akt的激活状态的调控。在所述处理条件下，培养指数生长 的BT474细胞72小时。通过蛋白印迹，评价总Erkl/2、激活的磷酸 -Erkl/2、总Akt和激活的磷酸-Akt的稳态蛋白水平。用载体(DMSO) 或单独的TA2021处理的细胞用作对照。图14显示了拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)对 ErbB3的激活状态的作用。在所示的各种处理条件下，培养BT47斗细 胞。72小时后，收集细胞裂解物，并通过蛋白印迹评价总ErbB3和激 活的磷酸-ErbB3的稳态蛋白水平。图15A显示了指定的处理条件对BT474细胞的细胞凋亡的作 用。使用膜联蛋白V染色和流式细胞术，评价细胞凋亡。图15B显示了在指定的处理条件下培养的BT474细胞中72小时 后总ErbB2、 p-ErbB2和存活蛋白的稳态蛋白水平的蛋白印迹分析。图15C显示了处理72小时后通过蛋白印迹评价的指定的处理条 件对总Erkl/2、 p-Erkl/2、总Akt和p陽Akt的稳态蛋白水平的作用。图16显示了用下述物质处理SKBR3细胞的细胞凋亡作用(i)单 独的DMSO(拉帕替尼的阴性对照)(ii)拉帕替尼(0.1 (iii) pAb(100|xg/ml), (iv)拉帕替尼(0.1 (xM)和pAb (100|ig/ml); (v) TA2021 (100|xg/ml)， (vi)拉帕替尼(0.1 一)和TA2021 (100fxg/ml), (vii)司徒 曼布(10(xg/ml)，或(viii)拉帕替尼(0.1 ixM)和司徒曼布(10^ig/ml)。 72 小时后，使用膜联蛋白V染色和流式细胞术，评价细胞凋亡。图17显示了当用下述物质处理SKBR3细胞72小时时，对存活 蛋白的作用(i)单独的DMSO(拉帕替尼的阴性对照)(ii)拉帕替尼 (O.ljxM)， (iii) pAb (100|ig/ml), (iv) 4立帕替尼 (0.1 pM)和pAb (100吗/ml); (v)TA2021 (100pg/ml), (vi)拉帕替尼(O.lpM)和TA2021 (100叫/ml), (vii)司徒曼布(10jxg/ml),或(viii)拉帕替尼(O.lpM)和司 徒曼布(10pg/ml)。图18显示了拉帕替尼和抗-Her-2/neu抗体对SkbR3细胞中 pTyr/ErbB12和下游生物标记的作用，如指示的。发明详述在本说明书中，除非上下文另有要求，词语"包含"和"包括" 或其变形应当理解为包含地，也就是说，这些词语的使用暗示着可能 包含没有特别指出的整数或元素。应当指出，贯穿本说明书中提及的所有参考文献和出版物都在本 文中引作参考。另外，术语"蛋白"在本文中与"多肽"或"肽"可互换地使用。 组分(a)下面的结构代表着式I化合物:
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其中R,是Cl或Br; X是CH、 N或CF;且Het是噻唑或呋喃。在一个实施方案中，R,是C1; X是CH;且Het是呋喃，且组分 (a)可以是式II化合物和/或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物。
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式II化合物具有化学名称1^{3-氯-4-[(3-氟千)氧]苯基}-6-[5-({[2-(曱磺酰基)乙基]氨基}曱基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺 (quinazolinamine )。在另一个实施方案中，Ri是Cl; X是CH;且Het是噻唑，且组 分(a)可以是式III化合物和/或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物。 m式III化合物是(4-(3-氟-苄氧基)-3-氯苯基)-(6-(2-((2-曱磺酰基-乙 基氨基)-曱基)-噻唑-4-基)喹唑啉-4-基)-胺。在另一个实施方案中，Ri是Br; X是CH;且Het是呋喃，且组 分(a)可以是式IV化合物和/或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物。IV式IV化合物是(4-(3-氟-节氧基)-3-溴苯基)-(6-(5-((2-曱磺酰基-乙 基氨基)-曱基)-呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)-胺。
如本文所使用的，术语"有效量，，指被例如研究人员或临 床医师寻求的将引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的药 物或药剂的量。而且，术语"治疗有效量"指，与未接受该量的对应 受试者相比，导致疾病、病症或副作用的提高的治疗、愈合、预防或 改善，或疾病或病症的进展速度降低的任何量。该术语在它的范围内 也包括有效地增强正常生理功能的量。适宜地，施用有效量和/或治疗 有效量的组分(a)。如本文所使用的，术语"生理功能衍生物"指式I、 II、 III或IV
化合物的任何可药用衍生物，例如，酯或酰胺，其在施用给哺乳动物后，能提供(直接地或间接地)式i、 n、 iii或iv化合物，或其有活性 的代谢物。本领域技术人员知道这样的衍生物，而无需过度试验，且参考Burger's Medicinal Chemistry And Drug Discovery,第5版，Vol 1: Principles and Practice的教导，其在本文中与它教导生理功能衍生物 相同程度地引作参考。如本文所使用的，术语"溶剂化物"指溶质(在本发明中，式I、n、 in或iv化合物或其盐或生理功能衍生物)和溶剂形成的可变化学 计量的复合物。用于本发明目的的所述溶剂不可以妨碍溶质的生物学 活性。合适的溶剂的实例包括但不限于，水、曱醇、乙醇和乙酸。使 用的溶剂可以是可药用溶剂。合适的可药用溶剂的实例包括水、乙醇 和乙酸。在一个实施方案中使用的溶剂是水。式I、 II、 III和IV化合物(a)具有以超过一种形式结晶的能力，这 是它的 一个特征，这称作多晶现象，且应当理解，这样的多晶形式("多 晶型物")是在式I、 II、 III和IV的范围内的。多晶现象通常作为对温 度或压力或二者的变化的响应而发生，且也可以源自结晶过程的变 化。通过本领域已知的各种物理特征，例如X射线衍射花样、溶解度 和熔点，可以区分多晶型物。一般地，式i、 n、 in或iv化合物的盐是可药用盐。术语"可药 用盐"包括的盐指本发明化合物的无毒盐。式i、 n、 III或IV化合物 的盐可以包含源自式i、 n、 m或iv化合物的取代基上的氮的酸加成 盐。代表性盐包括下述盐乙酸盐、苯磺酸盐、苯曱酸盐、碳酸氬盐、 硫酸氬盐、酒石酸氬盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钩、樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二氢 氯化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙 磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿 散酸盐(glycollylarsanilate )、 己基间苯二酚盐(hexylresorcinate )、 p合 胺(hydmbamine )、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘曱酸盐、碘化物、羟 乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、 扁桃酸盐、甲磺酸盐、溴代曱烷、硝酸曱酯、硫酸二曱酯、马来酸一 钾、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-曱基
盐、钾、水杨酸、钠、硬脂酸、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱、曱苯磺酸盐和二曱苯磺酸盐(ditosylate)、三乙 碘化物(triethiodide )、三曱铵和戊酸盐。不可药用的其它盐，可以用 于制备本发明的化合物，且这形成本发明的另一个方面。而且，这样 的盐可以是无水的或水合的形式。在一个实施方案中，式I、 II、 III 或IV化合物是盐酸盐或二曱苯磺酸盐，例如二曱苯磺酸盐，例如二 甲苯磺酸盐的一水合物。式I、 II、 III或IV化合物的侧链CH3S02CH2CH2NHCH2可以连接 到基团Het的任何合适的位置上。类似地，唾唑啉核心的苯基可以连 接到基团Het的任何合适的位置上。在本发明的一个实施方案中，组分(a)可以是二曱苯磺酸拉帕替尼 (GSK572016;拉帕替尼)(GSK)，无论是无水形式还是水合形式，例 如二甲苯磺酸盐的一水合物。组分(b)如本文所使用的，术语"免疫原性组合物"包括，当施用给适宜 的哺乳动物受试者时，具有在该受试者中诱导针对HER-2/Neu的至少 一部分的免疫应答的能力的任何组合物。如本文所使用的，术语"免 疫原"指具有诱导针对HER-2/Neu的至少 一部分的免疫应答的能力的 组合物的组分。组分(b)可以包含分离的蛋白，其包含至少一个来自HER-2/neu蛋 白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。在本发明的一个实施方案 中，至少一个表位的长度是9或更多个氨基酸。本文所述HER-2/neu分子可以是大鼠的、小鼠的、非-人灵长类动 物的、人的或其杂合体。在一个实施方案中，本文所述HER-2/neu分 子可以是完整蛋白或其杂合体。在本发明的一个实施方案中，HER-2/neu是人的。在本发明的一个实施方案中，本文所述组分(b)可以包含分离的蛋 白，其包含至少一个来自HER-2/neu胞外结构域的表位，或编码这样 的蛋白的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，至少一个表位的 长度是9或更多个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，组分(b)包含分离的蛋白，其包含HER-2/neu胞外结构域或由它组成，或编码这样的蛋白的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，本文所述组分(b)可以包含分离的蛋 白，其包含至少一个来自HER-2/neu胞内结构域的表位，或编码这样 的蛋白的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，至少一个表位的 长度是9或更多个氨基酸。在一个替代实施方案中，组分(b)包含分离的蛋白，其包含HER-2/neu胞内结构域或由它组成，或编码这样的蛋白的多核苷酸。在本发明的一个替代实施方案中，组分(b)包含融合蛋白，其包含 至少一个来自HER-2/neu蛋白的表位，例如来自胞外结构域，或编码 这样的蛋白的多核苷酸。可以在本发明中使用的融合蛋白的实例记载 在WO00/44899 (US2002 177567)，其在本文中引作参考。术语"融合蛋白"指包含至少2个肽或多肽的蛋白。在融合蛋白 的一个实施方案中， 一个肽或多肽来自一个蛋白序列或结构域，而另 一个肽或多肽来自另一个蛋白序列或结构域。肽或多肽可以共价地连 接，例如通过共价接头，例如氨基酸接头，例如聚甘氨酸接头，或另 一种类型的化学接头，例如碳水化合物接头、脂类接头、脂肪酸接头、 聚醚才妾头, <列浊口, PEG, 等。(参见，伊J长口, Hermanson， Bioconjugate techniques (1996))。在本发明的另 一个实施方案中，组分(b)可以包含本文所述 Her2/neu蛋白和/或其表位，其缀合在载体分子上(例如使用化学缀合 技术)或融合到载体分子上(例如形成包含Her2/neu蛋白和/或其表位 和载体的重组融合蛋白)。载体可以提供T-细胞辅助，以用于产生针 对HER-2/neu分子的免疫应答。可以在本发明中使用的载体的非穷尽列表包括匙孔血蓝蛋白 (KLH)，血清清蛋白例如牛或人血清清蛋白(BSA或HSA)，卵清蛋白 (OVA)，灭活细菌毒素例如破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT),或 其重组片段(例如，TT的片段C的结构域1，或DT的易位结构域)， 纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)。在本发明的一个实施方案中，其 中载体蛋白是动物起源的，例如KLH或血清清蛋白，该载体蛋白可 以重组地书f生。在本发明的一个实施方案中，载体可以是来自流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae )的蛋白D(EP0594610B1,其在本文中引作
参考)。蛋白D是一种来自流感嗜血菌的IgD-结合蛋白，且已经被Forsgren获得专利(WO 91/18926,授权EP 0 594 610 Bl,其在本文中 引作参考)。在有些情况下，例如在重组免疫原表达系统中，可能希望 使用蛋白D的片段，例如蛋白D 1/3 rd (其包含蛋白D的N-末端 100-110氨基酸(GB 9717953.5 (US6,342,224)，其在本文中引作参考))。在本发明的一个实施方案中，载体可以是"T-细胞辅助(Th)表位" 或"T-辅助表位"，它是能结合动物物种的MHC分子并刺激T-细胞的 肽。T-辅助表位可以是外来或非自身表位。T-细胞表位可以是非种系 选择性表位，即结合动物物种或群体中的MHC II类分子的主要级分 的表位(Panina國Bordignon等，EJI. 1989， 19: 2237-2242; Reece等，JI 1993,151: 6175-6184，其在本文中引作参考)。非种系选择性Th-表位在动物和人群体中是高度且广泛反应性 的，具有广泛趋异的MHC类型(Partidos等(1991) " Immune Responses in Mice Following Immunisation with chimaeric Synthetic Peptides Representing B and T Cell Epitopes of Measles Virus Proteins" J. of Gen. Virol. 72: 1293-1299; US 5,759,551,其在本文 中引作参考)。可以根据本发明使用的Th结构域具有约10至约50 个氨基酸，例如约10至约30个氨基酸。当存在多个Th表位时，它 们可以都相同(即表位是同源的)，或可以使用超过一种类型的表位的 组合(即表位是异种的)。作为实例，Th表位包括，病原体衍生的表位，例如肝炎表面或核 心(肽50-69， Ferrari等，J.Clin.Invest， 1991, 88， 214-222)抗原Th表位、百 曰咳毒素Th表位、破伤风毒素Th表位(例如P2(EP 0 378 881 Bl,其 在本文中引作参考)和P30 (WO 96/34888、 WO 95/31480、 WO 95/26365, 其在本文中引作参考)、麻渗病毒F蛋白Th表位、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)主要夕卜月莫蛋白Th表位(例如Pll， Stagg等，Immunology, 1993,79,1-9)、耶尔森氏菌(Yersinia)侵染素、白喉类毒素、流感病毒 血细胞凝集素(haemagluttinin ) (HA)和恶性痴虫(P.falcipamm ) CS抗 原。其它Th表位记载在文献中，包括WO 98/23635; Southwood等， 1998， J. Immunol" 160: 3363-3373; Sinigaglia等，1988, Nature, 336: 778-780; Rammensee等，1995， Immunogenetics, 41: 4,178-228; Chicz 等，1993， J. Exp. Med., 178: 27-47; Hammer等，1993， Cell 74: 197-203; 和Falk等，1994, Immunogenetics, 39: 230-242， US 5,759,551; Cease 等，1987， PNAS 84， 4249-4253; Partidos等，J.Gen. Virol, 1991， 72， 1293-1299; WO 95/26365和EP 0 752 886 B。 T-细月包表位也可以是人 工序列，例如Pan D-R肽"PADRE" (WO95/07707 (US6，675，428)' 其在本文中引作参考)。在本发明的一个实施方案中，使用的载体是 PADRE。T-细胞表位可以选自结合在人中表达超过一种MHC II分子的许 多个体的表位。例如，具体预期的表位是来自TT的P2和P30表位 (Panina-Bordig画Eur. J. Immunol 1989 19 (12) 2237)。在一个实施方 案中，异源T-细胞表位是来自TT的P2或P30。P2表位具有序列QYIKANSKFIGITE(SEQIDNo: 1)，并与破伤 风毒素的氨基酸830-843相对应。P30表位(破伤风毒素的残基947-967)具有序列 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 2);可以任选地缺失该 FNNFTV序列。其它通用 T表位可以源自恶性痴虫的环子孢子 (circumsporozoite ) 蛋白,具体,具有序歹寸 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (SEQ ID NO : 3)的区域 378-398(Alexander J， (1994) Immunity 1 (9)， p 751-761)。可以使用的另一个表位源自麻瘆病毒融合蛋白的残基288-302, 其具有序列LSEIKGVIVHRLEGV(SEQIDNo: 4) (Partidos CD, 1990, J. Gen. Virol 71(9) 2099-2105)。可以使用的另一个表位源自乙型肝炎病毒表面抗原，具体地，具 有序列FFLLTRILTIPQSLD(SEQIDNo: 5)的氨基酸。可以使用的另一组表位源自白喉毒素。这些肽中的4种(氨基酸 271-290、 321-340、 331-350、 351-370)作图在毒素的片段B的T结构 域中，剩余的2种作图在R结构域中(411-430、 431-450): PVFAGANYAAWAVNVAQV工D (SEQ工D No:6) VHHNTEEIVAQS工ALSSLMV (SEQ ID No:7》 QSIALSSLMVAQA工PLVGEL (SEQ ID No:8) VDIGFAAYWFVESIINLFQV (SEQ ID No:9) QGESGHD工K工TAENTPIjPIA (SEQ ID No :10) GVLKPTIPGKLDWKSKTHI (SEQ ID No:11)(Raju K, Navaneeth咖D., Okita D., Diethdm-Okita B., McCormick D., Conti-Fine B. M. (1995) Eur. Jf. Immunol, 25: 3207-14.)
因此，本发明的免疫原性组合物可以包含本文所述Her2/neu蛋 白和/或其表位，和本文所述载体和/或Th表位，无论是作为化学缀合 物还是作为纯合成的肽构建体。免疫原可以通过间隔区(例如，Gly-Gly)，在该免疫原的N-或C-末端处连接到Th表位上。
可以包括一个或多个载体和/或非种系选择性Th表位。在一个实 施方案中，免疫原性组合物可以包含2-5个载体和/或Th表位。
在一个实施方案中，免疫原可以直接缀合到脂质体载体上，后者 可以另外包含能提供T-细胞辅助的免疫原。
缀合或融合蛋白
使用本领域熟知的缀合方法，可以偶联载体或Th表位。因而， 例如，对于直接共价偶联，可能使用碳化二亚胺、戊二醛或(N-[Y-马 来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯，使用普通的可商业得到的异双功能接 头例如CDAP和SPDP (使用生产商的说明)。偶联反应后，通过透析 方法、凝胶过滤方法、分级分离方法等，可以容易地分离和纯化缀合 物。"使用戊二醛(gluteraldehyde )或马来酰亚胺化学形成的缀合物， 可以用在本发明中。在一个实施方案中，可以使用马来酰亚胺化学。
或者，可以将载体或Th表位融合到本文所述的Her-2/neu蛋白或 表位上。例如，EP0421635B (其在本文中引作参考)描述了嵌合嗜肝 DNA病毒核心抗原颗粒用于呈递病毒样颗粒中的外来肽序列的用其由例如乙型肝炎核心抗原组成。或者，重组融合蛋白可以包含流感 病毒的免疫原和NS1。
对于形成本发明组分(b)的部分的任何重组表达的蛋白，编码所述 蛋白的核酸也形成本发明的一个方面。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以是基因工程改造的融 合配偶体的表达，任选地通过接头序列。可以将形成融合蛋白的多肽的C-末端连接到N-末端。或者，可 以将它们的C-末端连接到C-末端，N-末端连接到N-末端，或N-末端 连接到C-末端。融合蛋白的多肽可以是任意的次序。术语"多肽"和 "融合蛋白"也可以指该多肽的保守修饰的变体、多态变体、等位基 因、突变体、子序列和物种间同源物，或构成融合蛋白的多肽。通过将来自 一个蛋白序列的氨基酸链连接到来自另一个蛋白序 列的氨基酸链上，例如，通过制备连续编码融合蛋白的重组多核苷 酸，可以生产融合蛋白。融合蛋白可以包含2、 3、 4或更多个来自相 同或不同物种的不同氨基酸链。融合蛋白中的不同氨基酸链可以直接 剪接到一起，或可以通过化学连接基团或氨基酸连接基团，间接剪接 到一起。融合蛋白可以任选地包含其它组分，如本文更详细地描述 的。缀合物或融合蛋白可以是基本上无生物学活性的。在一个实施方案中，本文所述HER-2/neu蛋白或表位可以连接或 融合到重组GM-CSF上，例如人GM-CSF。在另一个实施方案中，包 含本文所述HER-2/neu蛋白或表位的组合物还可以包含GM-CSF。如本文所使用的，术语"HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白"在本文 中也称作"ECD-ICD"或"ECD-ICD融合蛋白"，指包含下述氨基酸 序列的融合蛋白或其片段(i)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白的 胞外结构域或其片段，或由它组成；和(ii)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白的胞内结构域或其片段，或由它组成。如本文所使用的，术语"HER-2/neu ECD-PD融合蛋白"也称作 "ECD-PD"或"ECD-PD融合蛋白"，指包含下述氨基酸序列的融合 蛋白或其片段(i)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白的胞外结构域 或其片段，或由它组成；和(ii)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白的 磷酸化结构域或其片段，或由它组成。如本文所使用的，术语"HER-2/neu ECD-APD融合蛋白"也称作 "ECD-APD"或"ECD-APD融合蛋白"，指包含下述氨基酸序列的融 合蛋白或其片段(i)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白的胞外结构 域或其片段，或由它组成；和(ii)氨基酸序列，其包含HER-2/neu蛋白 的APD结构域或其片段，或由它组成。在一个实施方案中，组分(b)包含免疫原性组合物，后者包含融合 蛋白"ECD-ICD"或编码该融合蛋白的多核普酸，或由它组成。在一个替代实施方案中，组分(b)包含免疫原性组合物，后者包含 融合蛋白"ECD-PD"或编码该融合蛋白的多核苷酸，或由它组成。在另一个替代实施方案中，组分(b)包含免疫原性组合物，后者包 含融合蛋白"ECD-APD "或编码该融合蛋白的多核苷酸，或由它组 成。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白不包含HER-2/neu跨膜结 构域的相当大部分。在另一个实施方案中，融合蛋白不包含任何 HER-2/neu ^争膜结构域。本发明的ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白可以是可溶 的、分泌的和在培养基中稳定的。本文所述HER-2/neu蛋白意在包括其片段、其同源物和其功能等 同物(共同地称作"变体")，例如这样的，其中插入、缺失一个或多 个氨基酸，或被其它氨基酸或非-氨基酸置换一个或多个氨基酸，这在 本发明的有些实施方案中，(i)与HER-2/neu蛋白相比增加免疫应答的 引起或增强，或(ii)与HER-2/neu蛋白相比基本上不影响免疫应答的 引起或增强(例如，变体刺激辅助T细胞或细胞毒性T细胞的应答， 或刺激抗体的生产)。在本文中引作参考的WO00/44899 (US2002/0177567)中,更详细 地描述了包含HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD 融合蛋白的示例片段、同源物和功能等同物的变体的实例。变体可以 与包含天然多肽组分的融合蛋白"基本上相同"或"基本上相似"， 并保留刺激免疫应答的能力。在本文中引作参考的WO00/44899 (US2002/0177567)中，详细描述了可以使用的变体的实例和确定这样 的变体的方法。可以形成本发明的部分的ICD可以是人、大鼠或小鼠起源的。人 ICD(图l;SEQIDNO: 12)跨Lys 676至Vall255的区域(包含端点)。 大鼠ICD如图2和SEQ ID NO: 13所述，跨Lys 677至Val 1256的区域(包含端点)。可以形成本发明的部分的PD可以是人、大鼠或小鼠起源的。人 PD如图4所示(SEQIDNO: 15的氨基酸序列1-266,等同于HER-2/neu 的氨基酸序列990-1255)。人PD可以是人APD，如图15所示(SEQID NO: 16的氨基酸序列1-59,等同于HER-2/neu的氨基酸序列990 -1050)。大鼠PD如图2和SEQDDNO: 13所示，跨Gln991至Val 1256 的区域(包含端点)。大鼠PD可以是大鼠APD，如图2和SEQIDNO: 13所示，5争Gin 991至Arg 1049的区域(包含端点)。在一个实施方案中，人ECD可以融合(i)人ICD或大鼠ICD, 或(ii)人PD或APD，或大鼠PD或APD。在另一个实施方案中，大鼠 ECD可以融合(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或APD,或大鼠 PD或APD。可以形成本发明的部分的融合蛋白可以包含融合到HER-2/neu 磷酸化结构域上的HER-2/neu胞外结构域。该蛋白可以具有与SEQ ID NO: 17的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，或与SEQ ID NO: 14的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，所述序列融合在 与SEQIDNO: 15的序列至少80%、 90%或95%—致的序列上。或者， 该蛋白可以包含与SEQ ID NO: 3的序列至少80%、 90%或95%—致 的序列，后者直接融合在一个氨基酸序列上，该氨基酸序列与SEQID NO: 13的Gin 991至Val 1256序列(包含端点)至少80%、 90°/0或 95%—致，或包含与SEQIDNO: 3(17)的序列至少80%、 90%或95% 一致的序列，后者融合在一个氨基酸序列上，该氨基酸序列与SEQID NO: 13的Gin 991至Val 1256序列(包含端点)至少80%、 90%或 95%—致。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 19的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 15的序列至少80%、 90%或95%—致，或包含与SEQIDNO: 19的序列至少80%、90%或95%—致的序列，后者融合在一个序列上， 该序列与SEQ ID NO: 15的序列至少80%、 90%或95%—致。或者， 该蛋白可以包含与SEQIDNO: 19的序列至少80%、 90%或95%—致 的序列，后者直接融合在SEQ ID NO: 13的Gin 991至Val 1256的 氨基酸序列(包含端点)上，或包含与SEQ ID NO: 19的序列至少 80%、 90%或95%—致的序列，后者融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 13的Gin 991至Val 1256氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致。 在一个替代实施方案中，融合蛋白可以包含融合到HERJ/neu磷 酸化结构域的片段上的HER-2/neu胞外结构域。在一个实施方案中， 该蛋白可以具有与SEQIDNO: 18的序列至少80%、 90%或95%—致 的序列，或与SEQIDNO: 14的序列至少80%、 90%或95%—致的序 列，所述序列融合在与SEQIDNO: 16的序列至少80%、 90%或95% 一致的序列上。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 14的序列至少 80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列上，该序列 与SEQ ID NO: 2的Gin 991至Arg 1049氨基酸序列(包含端点)至 少80%、 90%或95%—致，或包含与SEQ ID NO: 14的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 13的Gin 991至Arg 1049氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 19的序列至 少80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列上，该序 列与SEQ ID NO: 16的序列至少80%、 90%或95%—致，或包含与 SEQIDNO: 19的序列至少80%、 90°/。或95%—致的序列，后者融合 在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 16的序列至少80%、卯％或 95%—致。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 19的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 13的Gin 991至Arg 1049氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致，或包含与SEQIDNO: 19的序列至少80%、 90%或 95%—致的序列，后者融合在一个序列上，该序列与SEQIDNO: 13 的Gin 991至Arg 1049氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或 95%—致。在一个替代实施方案中，融合蛋白可以包含融合到HER-2/neu胞 内结构域上的HER-2/neu胞外结构域。或者，该蛋白可以包含与SEQ ID NO: 14的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合 在一个序列上，该序列与SEQIDNO: 12的Lys 676至Val 1255氨基 酸序列(包含端点)至少80%、90%或95%—致，或包含与SEQIDNO: 14的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者通过至少一个化学 或氨基酸连接基团融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 12的 Lys 676至Val 1255氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95% 一致。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 14的序列至少80%、 90%
或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 13的Lys 677至Val 1256氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致，或其中该蛋白包含与SEQ ID NO: 14的序列至少 80%、 90%或95%—致的序列，后者通过至少一个化学或氨基酸连接 基团融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 2的Lys 677至Val 1256氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致。或者，该 蛋白可以包含与SEQ ID NO: 19的序列至少80%、 90%或95%—致的 序列，后者直接融合在一个序列上，该序列与SEQIDNO: 12的Lys 676至Val 1255氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致， 或包含与SEQ ID NO: 19的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者通过至少一个化学或氨基酸连接基团融合在一个序列上，该序列 与SEQ ID NO: 12的Lys 676至Val 1255氨基酸序列(包含端点)至 少80%、 90%或95%—致。或者，该蛋白可以包含与SEQIDNO: 19 的序列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者直接融合在一个序列 上，该序列与SEQIDNO: 13的Lys 677至Val 1256氨基酸序列(包 含端点)至少80%、 90%或95%—致，或包含与SEQIDNO: 19的序 列至少80%、 90%或95%—致的序列，后者通过至少一个化学或氨基 酸连接基团融合在一个序列上，该序列与SEQ ID NO: 13的Lys 677至 Val 1256氨基酸序列(包含端点)至少80%、 90%或95%—致。可以在本发明中使用的ECD-ICD融合蛋白(其被理解为包含变 体)包括人和非人多肽之间的任意可能的组合。非人多肽包含来自任 意哺乳动物的多肽，例如大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、猪、羊、狗等。 在一个实施方案中，ECD-ICD融合蛋白包括(i) 人ECD -人ICD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸连 接基团，通过连接图3 (SEQIDNO: 14)的人ECD和图l(SEQIDNO: 12)所示的跨Lys 676至Val 1255的氨基酸序列(包含端点)的人ICD 形成的那些，和其变体；(ii) 大鼠ECD -大鼠ICD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基 酸连接基团，通过连接图8 (SEQIDNO: 19)的大鼠ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的跨Lys 677至Val 1256的氨基酸序列(包含端点) 的大鼠ICD形成的那些，和其变体；(iii) 人ECD -大鼠ICD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸
连接基团，通过连接图3 (SEQ ID NO: 14)的人ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的跨Lys 677至Val 1256的氨基酸序列(包含端点)的 大鼠ICD形成的那些，和其变体；和(iv)大鼠ECD -人ICD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图8(SEQIDNO:19)所示的大鼠ECD和图1 (SEQ ID NO: 12)所示的跨Lys 676至Val 1255的氨基酸序列(包含端点) 的人ICD形成的那些，和其变体。本文所述ECD-ICD融合蛋白的任何变体，都被包含作为本发明 的融合蛋白。在一个实施方案中，这样的变体与天然HER-2/neu ECD-ICD蛋白基本上一致或基本上相似，并保留刺激免疫应答的能 力。编码ECD蛋白的人DNA序列显示在例如图9(SEQIDNO: 20) 中，跨核苷酸1至核苷酸1959(包含端点)。编码ICD蛋白的人DNA 序列显示在例如图9 (SEQ ID NO: 20)中，跨核苷酸2026至核苷酸 3765 (包含端点)。可以容易地确定任何序列修饰对HER-2/neu ECD-ICD 蛋白生成免疫应答的能力的作用，例如，通过分析突变的HER-2/neu ECD-ICD蛋白诱导T细胞应答的能力，其中使用例如本文所述 方法，或通过分析突变的HER-2/neu ECD-ICD蛋白生产抗体的能 力。可以在本发明中使用的ECD-PD融合蛋白(其被理解为包含变 体)包括人和非人多肽之间的任意可能的组合。非人多肽包含例如大 鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、猪、羊、狗等。在一个实施方案中，ECD-PD 融合蛋白包括(i) 人ECD-人PD融合蛋白，如图6(SEQIDNO: 17)所示和其变 体，包括用或不用化学和/或氨基酸连接基团，通过连接图3(SEQID NO: 14)的人ECD和图4(SEQIDNO: 15)的人PD形成的融合蛋白， 和其变体；(ii) 大鼠ECD -大鼠PD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图8(SEQIDNO: 19)的大鼠ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的跨Gin 991至Val 1256的氨基酸序列(包含端点)的 大鼠PD形成的那些，和其变体；(iii) 人ECD-大鼠PD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图3 (SEQ ID NO: 14)的人ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的跨Gln991至Val 1256的氨基酸序列(包含端点)的 大鼠PD形成的那些，和其变体；和(iv)大鼠ECD -人PD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸连 接基团，通过连接图8(SEQIDNO: 19)所示的大鼠ECD和图4 (SEQ ID NO: 15)所示的人PD形成的那些，和其变体。本文所述ECD-PD融合蛋白的任何变体，都被包含作为本发明的 融合蛋白。在一个实施方案中，这样的变体与天然HER-2/neu ECD-PD 蛋白基本上一致或基本上相似，并保留刺激免疫应答的能力。编码 ECD蛋白的人DNA序列显示在例如图9 (SEQ ID NO: 20)中，跨核 苷酸1至核苷酸1959 (包含端点)。编码PD蛋白的人DNA序列显 示在例如图9(SEQIDNO: 20)中，跨核苷酸2968至核苷酸3765(包 含端点)。可以容易地确定任何序列修饰对HER-2/neu ECD-PD蛋白 生成免疫应答的能力的作用，例如，通过分析突变的HER-2/neu ECD-PD蛋白诱导T细胞应答的能力，其中使用例如本文所述方法， 或通过分析突变的HER-2/neu ECD-PD蛋白生产抗体的能力。在另一个实施方案中，ECD-PD融合蛋白是本发明的ECD-APD 融合蛋白，其被理解为包含变体，包括人和非人多肽之间的任意可能 的组合。非人多肽包含例如大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、猪、羊、狗 等。在一个实施方案中，ECD-APD融合蛋白包括(i) 人ECD-人APD融合蛋白，如图7(SEQIDNO: 18)所示和其 变体，包括用或不用化学和/或氨基酸连接基团，通过连接图3 (SEQID NO: 14)的人ECD和图5(SEQIDNO: 16)的人APD形成的融合蛋白，和其变体；(ii) 大鼠ECD -大鼠APD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图8(SEQIDNO: 19)的大鼠ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的跨Gin 991至Arg 1049的氨基酸序列(包含端点)的 大鼠APD形成的那些，和其变体；(iU)人ECD-大鼠APD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图3 (SEQ ID NO: 14)的人ECD和图2 (SEQ ID NO: 13)所示的3争Gin 991至Arg 1049的氨基酸序列(包含端点)的 大鼠APD形成的那些，和其变体；和 (iv)大鼠ECD -人APD融合蛋白，例如用或不用化学和/或氨基酸 连接基团，通过连接图8(SEQ IDNO: 19)所示的大鼠ECD和图5 (SEQ EDNO: 16)所示的人APD形成的那些，和其变体。本文所述ECD-APD融合蛋白的任何变体，都被包含作为本发明 的实施方案。在一个实施方案中，这样的变体与天然HER-2/neu ECD-APD蛋白基本上一致或基本上相似，并保留刺激免疫应答的能 力。编码ECD蛋白的人DNA序列显示在例如图9(SEQIDNO: 20) 中，跨核苷酸1至核苷酸1959 (包含端点)。编码SEQ ID NO: 16 的APD蛋白的人DNA序列显示在例如图9(SEQIDNO: 20)中，跨核 苦酸2968至核苷酸3144 (包含端点)。可以容易地确定任何序列修 饰对HER-2/neu ECD-APD蛋白生成免疫应答的能力的影响，例如， 通过分析突变的HER-2/neu ECD-APD蛋白诱导T细胞应答的能力， 其中使用例如本文所述方法，或通过分析突变的HER-2/neu ECD-APD 蛋白生产抗体的能力。在一个实施方案中，免疫原性组分(b)包含ECD-PD融合蛋白或 编码这样的融合蛋白的多核苷酸。在本发明的其中组分(b)是蛋白的实施方案中，组分(b)还可以包含 佐剂或免疫刺激剂，例如但不限于能刺激TH1类型应答的的试剂。在 本发明的一个实施方案中，组分(b)包含能刺激TH1类型应答的的佐 剂。适用于蛋白制剂的佐剂长期以来已经知道，肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的有效刺激 物，尽管它在佐剂中的应用已经受到它的毒性作用的限制。Ribi等 (1986， Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)已经描述了通过从还原端葡糖胺去 除核心碳水化合物基团和磷酸，生成的LPS的无毒衍生物单磷酰脂质 A(MPL)，且具有下述结构MPL的另一种解毒形式源自从二糖主链的3-位置去除酰基链，且 称作3-0-脱酰基单磷酰脂质A (3D-MPL)。通过GB 2122204B教导的 方法，可以纯化和制备它，该文献也公开了二磷酰脂质A和其3-0-脱酰基变体的制备。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含3D-MPL。在一个实施方案中，可以使用的3D-MPL形式是乳剂形式，它具 有直径小于0.2pm的小粒度，且它的制备方法公开在WO 94/21292 中，其在本文中引作参考。包含单磷酰脂质A和表面活性剂的含水制 剂已经记载在WO9843670,其在本文中引作参考。可以从细菌来源纯化和加工要配制进本发明组合物中的细菌脂 多糖衍生的佐剂，或者它们可以是合成的。例如，纯化的单磷酰脂质 A记载在Ribi等1986 (同上)，且源自沙门氏菌属(Salmonella sp.) 的3-0-脱酰基单磷酰或二磷酰脂质记载在GB 2220211和US 4912094。已经描述了其它纯化的和合成的脂多糖(Hilgers等，1986， Int. Arch. Allergy. Immunol" 79(4): 392-6; Hilgers等，1987， Immunology, 60(1): 141-6;和EP 0 549 074 Bl)。在一个实施方案中，细菌脂多糖 佐剂是3D-MPL。因此，可以在本发明中使用的LPS衍生物是结构与LPS或MPL 或3D-MPL类似的那些免疫刺激剂。在本发明的另一个方面，LPS衍 生物可以是酰基化的单糖，它是上述MPL结构的子部分。3D-MPL是Toll-样受体4 (TLR-4)的激动剂。在一个实施方案中， 在本发明的免疫原性组合物中可以包含一种或多种TLR-4激动剂。 TLR-4激动剂包括来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，或其片段； 热激蛋白(HSP) 10、 60、 65、 70、 75或90;表面活性剂A蛋白、乙 酰透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、血纤蛋白原肽 和b-防卫素-2和MPL,例如3D-MPL。急普教导在Lacaille-Dubois, M和Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)。急苷是广泛分布于植物和海生动物界中的类固醇或 三薛糖苷。认识到皂普可以用于在水中形成胶体溶液，它在摇动后起 泡沫，和用于沉淀胆固醇。当皂苷在细胞膜附近时，它们在膜中生成 孔-样结构，这造成膜破裂。红细胞的溶血作用是该现象的一个实例， 它是某些、但并非所有皂苷的性质。已知皂苷是全身施用的疫苗的佐剂。本领域已经广泛研究了单一 急普的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner,同上)。例如，Quil A (源自南美树Quillaja Saponaria Molina的树皮)，和其级分，记载在 US 5,057,540和"Saponins as vaccine adjuvants" ， Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55;和EP 0 362 279 Bl。称 作免疫刺激复合物(ISCOMS)的微粒结构包含Quil A级分，是溶血性 的，且已经用于制备疫苗(Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739，其在本文中引作参考)。溶血急香QS21和QS 17 (HPLC 纯化的Quil A级分)已经被描述为有效的全身佐剂，且它们的生产方 法公开在美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 Bl。已经在全身接种疫苗研究中使用的其它皂苷包括源自其它植物物种例如丝石竹属 (Gypsophila )和月巴急草属(Saponaria ) 的那些(Bomford等，Vaccine, 10(9): 572-577, 1992)。可以在本发明中使用的一种佐剂系统包含无毒的脂质A衍生物 和皂苷衍生物。可以使用的一种具体佐剂系统包含3D-MPL和QS21, 如公开在例如WO 94/00153中的，其在本文中引作参考。可以使用的 另一种系统包含3D-MPL和QS21,其中所述QS21用胆固醇猝灭，如 公开在例如WO 96/33739中的，其在本文中引作参考。
在本发明的一个替代实施方案中，组分(b)另外包含佐剂组合物，后者包含皂苷以及免疫刺激寡核苷酸。例如，该佐剂组合物可以包含QS21以及免疫刺激寡核苷酸，例如含有未曱基化的CG基序的寡核苷 酸(CpG寡核苷酸)。在本发明的 一 个实施方案中，可以包含在佐剂中的免疫刺激寡核 普酸选自SEQ ID No 22 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) SEQ ID No 23 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) SEQ ID No 24 - ACC GAT GAC GTC GCC GOT GAC GGC ACC ACG SEQ ID No 25 - TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (Q G 2006) SEQ ID No 26 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)在本发明的一个替代实施方案中，组分(b)另外包含佐剂组合物， 后者包含水包油乳剂，例如如EP 382 271所述的，其在本文中引作参 考。在另一个实施方案中，组分(b)另外包含用3D-MPL、 QS21和CpG 寡核苷酸以及脂质体或水包油乳剂载体配制的佐剂组合物，例如如 WO02/32450所述，其在本文中引作参考。这样的制剂可以生成体液 和细胞介导的应答。与仅包含QS21和3D-MPL的佐剂制剂相比，本 发明的制剂可以在小鼠中引起有利的更强的TH1应答。在本发明的另一个实施方案中，佐剂是SB62'c,即一种包含水包 油乳剂和急苷的佐剂，其中所述油是可代谢油，且可代谢油急苷的 比(w/w)在W099/11241所述的1: 1至200: 1 (水包油乳剂低剂量) 范围内，其完整教导在本文中引作参考。在一个实施方案中，可代 谢油皂苷的比(w/w)基本上是48: 1。皂苷可以是QuilA,例如QS21。 在一个实施例中，可代谢油是角豊烯。SB62'c佐剂组合物还可以包含 固醇，例如胆固醇。SB62'c佐剂组合物可以额外或备选地另外包含一 种或多种免疫调谐剂，例如3D-MPL和/或a-生育酚。在包含3D-MPL的SB62'c的实施方案中，QS21: 3D-MPL的比(w/w)可以是1: 10至10: 1，例如1: 1至1: 2.5，或1: 1至1: 20。因而，在佐剂SB62'c的一个实施方案中，可代谢油急普的比 (w/w)在1: l至200: l的范围内，或基本上是48: 1，急苷是QS21, 且佐剂也包括3D-MPL(水包油乳剂低剂量、QS21、 3D画MPL)。
在本发明的另一个实施方案中，佐剂由包含母育酚的水包油乳剂组成，例如如EP0382271所述，其在本文中引作参考。在另一个实施 方案中，可以使用的水包油乳剂包含a-生育盼。在一个实施方案中，佐剂是本文所述的佐剂组合物，呈递在脂质 体中，例如如EP822831所述，其在本文中引作参考。在另一个实施 方案中，佐剂可以包含montanide ISA51。疫苗本发明也提供了疫苗，其包含本文所述免疫原性组合物以及可药 用赋形剂、佐剂或载体。本发明也提供了生产疫苗组合物的方法，其 包含，混合本文所述免疫原性组合物和适当的可药用载体、佐剂或赋 形剂。适当的载体和赋形剂是本领域众所周知的，且包括例如水或緩 冲剂。疫苗制剂通常记载在Vaccine Design中("The subunit and adjuvant approach ，， (eds Powell M.F. & Newman MJ.) (1995) Plenum Press New York)。多核苦酸在本发明的一个实施方案中，组分(b)包含编码本文所述本发明融 合蛋白的多核普酸序列。在另一个实施方案中，多核苷酸序列可以在严格条件下与编码融 合蛋白的多核苷酸序列杂交。本文使用的术语"严格条件"和"严格 杂交条件，，指，只有当序列之间存在至少95%、且优选至少97%同一 性时，才会发生杂交。严格杂交条件的具体实例是，在42X:，在包含 下述组分的溶液中温育过夜50%曱酰胺，5x SSC (150mM NaCl， 15mM柠檬酸三钠)，50 mM磷酸钠(pH7.6)， 5x Denhardt氏溶液，10% 硫酸葡聚糖，和20微克/ml变性的、剪切的鲑精DNA，随后在约65 °C，在O.lx SSC中洗涤杂交支持物。杂交和洗涤条件是众所周知的， 且示例在 Sambrook,等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.， (1989),尤其是其中的第11 章。因此，编码融合多肽的多核香酸序列包括保守修饰的变体、多态 变体、等位基因、突变体、子序列和物种间同源物。在其中组分(b)
包含多核苷酸的实施方案中，组分(b)可以另外包含佐剂，或与佐剂或 免疫刺激剂同时或先后地施用。多核苷酸可以存在于本领域普通技术人员已知的许多递送系统 的任一种中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。许多基因递送4支术是本领域熟知的，例如Rolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198和其中引用的文献所述的那些。适当的核 酸表达系统含有在患者中表达必需的DNA序列(例如合适的启动子和 终止信号)。细菌递送系统包含施用在它的细胞表面上表达融合蛋白的 免疫原性部分或分泌这样的表位的细菌(例如卡介苗)。在一个实施方 案中，可以使用病毒表达系统或载体(例如，牛痘、痘病毒、反转录 病毒或腺病毒)，导入DNA,其可能包含使用不致病的(有缺陷的)复 制型病毒。合适的系统公开在例如Fisher-Hoch等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321; Flexner等(1989) Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103; Flexner等 (1990)Vaccine 8: 17-21;美国专利号 4,603,112、 4,769,330、 4,777,127和5,017,487; WO 89/01973; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner (1988) Biotechniques 6: 616-627; Rosenfeld等(1991) Science 252: 431-434; Kolls等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502; Guzman等(1993) Circulation 55: 2838-2848;和Guzman等(1993) Cir. Res. 73: 1202-1207。将DNA整合进这样的表达系统中的技术，是本领域普通技术人员众所周知 的。DNA也可以是"棵露的"，如例如Ulmer等(1993) Science 259: 1745-1749所述和Cohen (1993) Science 259: 1691-1692所综述。通过 将DNA涂布到可生物降解的珠上，所述珠被有效地运输进细胞，可 以增加棵露DNA的才聂入。显然，本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包含多核苷酸和多肽 组分。这样的疫苗或免疫原性组合物可以提供增强的免疫应答。可以与多核苷酸序列一起使用的免疫刺激剂包括合成的咪唑并 壹啉例如咪喹莫特[S-26308， R-837]或已知刺激Toll-样受体7的任何 其它分子(Harrison,等 'Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine '， Vaccine 19: 1820-1826， (2001)); 和雷西莫特(resiquimod ) [S-28463 ， R-848](Vasilakos，等 'Adjuvant aetivites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN', Cellular immunology 204: 64-74 (2000).), 在抗原呈递细胞和T-细胞表面组成型表达的羰基和胺的希夫碱，例如 图卡瑞索 (Rhodes, J. 等'Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs '， Nature 377: 71-75(1995) ),作为蛋白或肽的细胞因子、趋化因子和共刺激分子，这包括 促炎细胞因子，例如干扰素，尤其是干扰素和GM-CSF, IL-la， IL-1(3， TGF-a和TGF-j3， Thl诱导物例如干扰素y 、 IL-2、 IL-12、 IL陽15、 IL-18和IL-21， Th2诱导物例如IL-4、 IL画5、 TL誦6、 IL-10和IL-13, 和其它趋化因子和共刺激基因例如MCP-1、 MIP-la、 MEP-ip、 RANTES、 TCA-3、 CD80、 CD86和CD40L,其它免疫刺激耙向配体 例如CTLA-4和L-选择蛋白，细胞凋亡刺激蛋白和肽例如Fas, (49), 合成的基于月旨质的佐剂，例如vaxfectin (Reyes等，'Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Thl type immune responses to plasmid DNA immunization', Vaccine 19: 3778-3786)、角篁烯、a-生 育酚、聚山梨醇酯80、 DOPC和胆固醇，内毒素，[LPS], Beutler, B.，' Endotoxin, 'Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity', Current Opinion in Microbiology 3: 23- 30 (2000)); CpG寡-和二画核苷 酸，Sato, Y.等，'Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization', Science 273 (5273): 352-354(1996) . Hemmi, H.等，'A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA'， Nature 408: 740-745,(2000),和触发Toll受体生成Thl-诱导性细胞 因子的其它潜在配体，例如合成的分枝杆菌脂蛋白、分枝杆菌蛋白 p19、肽聚糖、磷壁酸和脂质A。其它细菌衍生的免疫刺激蛋白包括， 霍乱毒素、大肠杆菌(E.coli)毒素和其突变类毒素。用于引起主要的 Thl-类型应答的佐剂的实例包括，例如，脂质A衍生物例如单磷酰脂 质A或3-脱-0-酰基化的单磷酰脂质A。 MPL㊣佐剂可以购自Corixa Corporation (Seattle, WA;参见，例如，美国专利号4,436,727 ; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苦酸(其中CpG 二核苷酸未曱基化)也诱导主要的Thl应答。这样的寡核苷酸是众所 周知的，且记载在例如WO 96/02555、 WO 99/33488和美国专利号 6,008,200和5,856,462。免疫刺激DNA序列也记载在例如，Sato等，Science 273: 352,1996。可以使用的另 一种佐剂包含急苷，例如Quil A或其书亍生物，包4舌QS21和QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA);七叶素；毛地黄急香；或丝石竹属或Chenopodium quinoa急苷。在本发明的一个实施方案中，可以包含在佐剂中的免疫刺激寡核 苦酸选自SEQ ID No 22 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) SEQ ID No 23 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) SEQ ID No 24 - ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG SEQ ID No 25 - TCG TCG TTT TGT COT TTT GTC GTT (CpG 2006) SEQ ID No 26 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)组合组分(a)和组分(b)可以以任何治疗上适当的组合，同时或先后地组 合使用。通过同时施用组分(a)和(b)，例如通过(l)施用包含两种组分的单 一药物组合物，或(2)同时给受试者施用分开的药物组合物，它们各 自包含一种组分，可以根据本发明使用组合。在其中分开地施用组分(a)和(b)的实施方案中，组合可以同时或以 先后方式施用，在先后方式中，首先施用一种，然后施用第二种，反 之亦然。如本文所使用的，先后施用指在生物学相关的时间范围内施用组 分(a)和(b)。先后施用的实例包括，例如，在完成第一种组分的施用之 后，立即施用第二种组分；或者在受试者正在经历首先施用的组分的 生物学作用时，施用第二种组分。因而，显然地，当首先施用组分(b) 时，在免疫应答时间段期间施用组分(a)，例如在组分(b)引起的抗体和 /或T-细胞应答时间段。在本发明的一个以初次-加强方案给予组分(b) 的实施方案中，与组分(b)的"加强"施用同时给予组分(a)。当首先施用组分(a)时，在受试者体内存在组分(a)的时间段内施用 组分(b)。本领域技术人员将明白，可以以1: l以外的方式施用组分， 例如，在施用组分(a)之前，可以施用组分(b)超过1次；施用组分(b) 之后，可以在生物相关的时间范围内多次施用组分(a)，等。 在一个实施方案中，在组分(b)之前施用组分(a)。在组分(b)之前， 可以施用组分(a)—次或超过一次。在另一个实施方案中，在组分(a)之前给予组分(b)。在组分(a)之 前，可以给予组分(b)—次或超过一次。在一个实施方案中，组分(a) 可以施用给个体，其中该个体已经事先施用了免疫原性组合物(b)。应当理解，如果给予组分(b)超过一次，则一次或多次施用可以是 蛋白，且一次或多次施用可以是DNA。本发明也可以包括施用至少一种其它癌症治疗疗法，其与本发明 的组合以任意治疗适当的组合同时或先后地联合施用。其它癌症治疗 疗法可以包括放疗、外科手术治疗和/或至少 一种包含施用至少 一种其 它抗肿瘤剂的其它化疗疗法。在本发明的其中在组分(a)之前施用组分(b)的实施方案中，可以在 组分(a)之前足以产生免疫应答、例如多克隆抗体应答的时间，施用组 分(b)。在本发明的一个实施方案中，可以在针对组分(b)产生的免疫应 答的顶峰时，给予组分(a)。在一个实施方案中，可以在回忆(记忆)应 答的顶峰时，给予组分(a)。组分(a)的施用在治疗中使用时，尽管可能施用作为粗化学试剂的组分(a)的式 I、 II、 III、 IV化合物以及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物，但其可 能作为药物组合物呈递活性成分。因此，在一个实施方案中，将本发 明的组分(a)作为药物组合物提供，其包含式I、 II、 III和/或IV化合 物和其盐、溶剂化物和生理功能衍生物，和一种或多种可药用载体、 稀释剂或赋形剂。载体、稀释剂或赋形剂必须在与制剂的其它成分相容，且对其受体无害的意义上是可接受的。根据本发明的另 一 个方面，还提供了制备组分(a)的药物制剂的方 法，其包含，混合式I、 II、 III和/或IV化合物和/或其盐、溶剂化物 和/或生理功能衍生物，与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂， 并与本发明的组分(b)组合地提供这样的药物制剂。本发明的组分(a)的药物组合物的组分可以配制成通过任意途径 施用，且适当的途径取决于待治疗的具体癌症以及待治疗的受试者。
合适的药物制剂包括用于经口、直肠、经鼻、局部(包括口腔的、舌下 的和经皮的)、阴道的或肠胃外的(包括肌内的、皮下的、静脉内的和 直接进入受影响组织)施用的那些，或为适用于通过吸入或吹入施用的 形式。在适当时，制剂可以方便地以不连续的剂量单位存在，且可以 通过药剂学领域熟知的任何方法制备。适合经口施用的药物制剂可以作为不连续单位存在，例如胶嚢或片剂；粉末或颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；可食用 泡沫或搅打物(whips);或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。例如，对于片剂或胶嚢形式的经口施用，活性药物组分可以与经 口、无毒的可药用惰性载体例如乙醇、甘油、水等混合。通过将所述 化合物粉碎成适宜细大小，并与类似地粉碎的药物载体(例如可食用 碳水化合物，如淀粉或甘露糖醇)混合，制备粉末。其中还可以存在 调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。胶嚢可通过制备上述粉末混合物、并填充到成型的明胶鞘中制 备。在填充操作之前，可向所述粉末混合物中加入助流剂和润滑剂， 例如胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钓或固体聚乙二醇。当 服用胶嚢时，为了改善药物的可用性，也可以加入崩解剂或增溶剂， 例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠。另外，在需要或必要时，也可以向所述混合物中掺入适宜的粘合 剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。适宜的粘合剂包括淀粉、明胶、天然 糖例如葡萄糖或13 -乳糖、玉米增甜剂、天然和合成树胶例如阿拉伯 树胶、西黄蓍胶或藻酸钠、羧曱基纤维素、聚乙二醇、蜡等。所述剂 量形式中所用润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、 乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括，但不限于，淀粉、曱基纤维素、琼 脂、膨润土、黄原胶等。例如，通过制备粉末混合物，粒化或压制药 片(slug)，加入润滑剂和崩解剂并压制成片剂，制备片剂。粉末混合 物如下制备，即将所述化合物，适宜的是被粉碎的，与如上所述稀释 剂或基质，以及任选地与粘合剂例如羧曱基纤维素、藻酸盐、明胶或 聚乙烯吡咯烷酮，溶液阻滞剂如石蜡，回吸加速剂如季铵盐和/或吸收 剂如膨润土、高岭土或磷酸二4丐混合。所述粉末混合物可通过用粘合 剂例如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶浆或纤维素或聚合物材料溶液润湿并 使其经过筛而粒化。作为另一种粒化方法，可将粉末混合物经过压片
机，结果将未完全成型的块破碎成颗粒。通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、 滑石或矿物油，可将所述颗粒润滑，以防止粘合到形成片剂的沖模 上。然后将润滑的混合物压制成片剂。本发明化合物还可与自由流动 的惰性载体组合，并无需经过粒化或压制药片步骤直接压制成片剂。 可以提供透明或不透明的保护包衣，其包括虫胶的密封包衣、糖或聚 合材料包衣以及蜡磨光包衣组成。向这些包衣中可加入染料，以区分 不同的单位剂量。经口流体例如溶液、糖浆和酏剂可制备成剂量单位形式，从而使 得给定量含有预先确定的化合物量。糖浆可通过将所述化合物溶于适 宜的调味水溶液中制得，而酏剂可通过使用无毒醇类载体制得。悬浮 液可以通过将所述化合物分散于无毒载体中制得。也可以加入增溶剂 和乳化剂例如乙氧基化的异十八烷醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚，防腐 剂，风味添加剂例如薄荷油或或天然增甜剂或糖精或其它人工增甜剂 等。如果适宜，用于经口施用的剂量单位制剂可微嚢化。所述制剂还 可被制备以延长或持续释放，例如通过在聚合物、蜡等中包衣或者包 埋微粒材料来实现。本发明药物组合物的组分还可以以脂质体递送系统形式施用，例 如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可由许多种磷脂(例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱)形成。通过使用单克隆抗体作为与化合物分子偶联的单独载体，也可以 递送本发明药物组合物的组分。所述化合物也可与作为可靶定的药物 载体的可溶性聚合物偶联。此类聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃 共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被 棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。另外，所述化合物还可以与 一类用于实现药物控释的可生物降解聚合物偶联，所述聚合物例如聚乳酸、polepsilon己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氬 吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或两性的嵌段共聚物。适合经皮施用的药物制剂可以作为不连续的贴剂存在，以意在使 与受体表皮的紧密接触保持延长的时间段。例如，通过如 Pharmaceutical Research, 3(6)， 318 (1986) —般地描述的离子电渗疗 法，可以>^人贴剂递送活性成分。 适合局部施用的药物制剂可以配制成软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、 粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油。关于治疗眼或其它外部组织例如嘴和皮肤，可以使用作为局部软 膏或乳膏的制剂。当配制成软膏时，可以与石蜡的或水混溶性的软膏 基质一起使用活性成分。或者，可以用水包乳膏基质或油包水基质， 将活性成分配制成乳膏。适合局部施用于眼的药物制剂包括眼滴剂，其中活性成分溶于或 悬浮于合适的载体中，尤其是水性溶剂。适合局部施用于嘴的药物制剂包括糖锭、软锭剂和漱口剂。适合直肠施用的药物制剂可以作为栓剂或灌肠剂存在。适合经鼻施用的药物制剂(其中载体是固体)包括粒度为例如20 -500微米的粗粉末，它以用鼻吸的方式施用，即从靠近鼻子的粉末容 器经鼻通道快速吸入。合适的制剂(其中载体是液体，用于作为鼻喷 雾剂或鼻滴剂施用)包括活性成分的水性或油性溶液。适合吸入施用的药物制剂包括细颗粒粉尘或雾，其可以通过各种 类型的计量的、剂量加压的气溶胶、喷雾器或吹入器产生。适合阴道施用的药物制剂可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、 糊剂、泡沫或喷雾制剂存在。适合肠胃外施用的药物制剂包括，水性和非水性无菌注射溶液， 其可以含有抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期受体的血液 等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠 剂。该制剂可以存在于单剂或多剂容器中，例如密封安瓿和小瓶，且 可以保藏在冷冻干燥(冻干)条件下，紧在使用前只需要加入无菌液体 载体，例如注射用水。从无菌粉末、颗粒和片剂，可以制备临时注射 溶液和悬浮液。应当理解，除了上面具体提及的成分外，该制剂可以包括本领域 关于研究中制剂类型的其它常规试剂，例如适合经口施用的那些可以 包括调味剂。本发明药物组合物的组分(a)的治疗有效量将取决于许多因素，包 括但不限于，哺乳动物的年龄和体重，需要治疗的确切病症和它的严 重性，制剂的性质，和施用途径，且最终由主治医师或兽医判定。一 般地，本发明药物组合物的组分的治疗给予范围是每天0.1-100 mg/kg
受体(哺乳动物)体重，且更常见的范围是每天1 - 10mg/kg体重。可接 受的每日剂量可以是约0.1-约1000 mg/天，例如约0.1-约100mg/天。组分(b)的施用本文所述组分(b)的施用途径和频率以及剂量，将随个体而异，且 使用标准技术可以容易地确立。通常，免疫原性组合物和/或疫苗可以 通过注射(例如，皮内的、肌内的、静脉内的或皮下的)、鼻内地(例如， 通过吸入)或经口地施用。在一个实施方案中，可以在52周时间段内 施用1-10剂。可以施用6剂，时间间隔l个月，此后定期给予加强接 种疫苗。对于个别患者，替代方案可能是合适的。合适的剂量是，当 如上所述施用时，能促进抗肿瘤免疫应答、且比基底(即未处理)水平 高至少10-50%的化合物的量。对于疫苗，通过测量患者中的抗肺瘤抗 体，或通过能体内杀死患者肿瘤细胞的细胞溶解效应细胞的疫苗-依赖 性的产生，可以监控这样的应答。与未接种疫苗的患者相比，这样的 疫苗也能在接种疫苗的患者中造成免疫应答，后者导致改善的临床结 果(例如，更常见的减轻，完全或部分或更长的无疾病存活)。通常，对于免疫原性组合物和疫苗，存在于剂量中的每种免疫原 的量的范围是每kg宿主约1 jxg-5mg，例如100pg-5mg,或例如5 pg- 250吗。合适的剂量大小将随患者大小而变化，但是通常范围是 约0.1 ml-约5 ml。在一个实施方案中，首次或初次免疫用上述HER-2/neu免疫原性 组合物进行，例如HER-2/neu融合蛋白，其具有例如至少一个ECD和 /或ICD或PD，且还进行后续或加强免疫。适用于免疫的ECD-ICD和 /或ECD-PD融合蛋白包括本文所述的那些。本领域技术人员将明 白，当HER-2/neu免疫原性组合物是融合蛋白时，本发明预期使用完 整的HER-2/neu融合蛋白，以及将Her-2/neu融合蛋白分成许多肽。通常，适当的剂量和治疗方案提供足以提供治疗和/或预防益处的 量的活性化合物。通过确立治疗的患者与未治疗的患者相比改善的临 床结果(例如，更常见的减轻，完全或部分或更长的无疾病存活)，可 以监控这样的反应。针对HER-2/neu蛋白或融合蛋白的免疫应答的产 生或预先存在的免疫应答的增强，也可以指示足够量的组分(b)的使 用。预先存在的免疫应答的增强，可以与改善的临床结果相关联。通 常，使用标准的增殖、细胞毒性或细胞因子测定，它们可以使用在治 疗之前和之后从患者获取的样品来进行，可以评价这样的免疫应答。T细胞本发明的组分(b)也可以，或者备选地，包含对本文所述多肽或融 合蛋白特异性的T细胞。这样的细胞通常可以使用标准程序，体外或 先体外后体内制备。例如，使用可商业得到的细胞分离系统(也参见美 国专利号5,240,856和5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116和WO 92/07243)，可以从患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血的级分分离T 细胞。或者，T细胞可以源自相关的或无关的人、非人哺乳动物、细 胞系或培养物。可以用多肽、多核普酸和/或表达这样的多肽的抗原呈递细胞 (APC)刺激T细胞。可以在足以允许产生对融合多肽特异性的T细胞 的条件和时间下，进行这样的刺激。多肽或多核苷酸可以存在于递送 载体中，例如小球体，以促进特异性T细胞的产生。如果T细胞杀死包被有融合多肽或表达编码融合多肽的多核苷酸 的靶细胞，则认为T细胞是对该HER-2/neu融合多肽特异性的。使用 任一种标准技术，可以评价T细胞特异性。例如，在铬释放测定或增 殖测定中，与阴性对照相比裂解和/或增殖增加超过2倍的刺激指数， 指示着T细胞特异性。可以如例如Chen等(l994) Cancer Res. 54: 1065-1070所述，进行这样的测定。或者，通过许多已知的技术，可 以检测T细胞的增殖。例如，通过测量DNA合成的提高的速率(例如， 通过用含氣胸苷脉沖标记T细胞培养物，并测量掺入DNA中的含氚 胸苷的量)，可以检测T细胞增殖。与HER-2/neu融合多肽(100ng/ml 陽100—ml，例如200 ng/ml-25 (ig/ml)接触3-7天，应导致T细胞增 殖增加至少2倍。上述接触保持2-3小时，应导致T细胞的激活，如 使用标准的细胞因子测定测量的，其中细胞因子(例如，TNF或IFN力 释放水平增加2倍，是T细胞激活的指示(参见Coligan等，Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998))。 响 应于HER-2/neu融合多肽、多核苷酸或融合多肽-表达性APC,已经 被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。使用标准技术，可以扩 充HER-2/neu-特异性的T细胞。在有些实施方案中，T细胞源自患者、 或相关或无关的供体，且在刺激和扩充后施用给患者。对于治疗目的，可以体外或体内扩充响应于HER-2/neu多肽、多 核苷酸或APC进行增殖的CD4+或CD8+ T细胞的凄史目。可以以许多 方式，实现这样的T细胞体外增殖。例如，可以将T细胞重新暴露于 HER-2/neu多肽，其中加入或不加T细胞生长因子，例如白细胞介素 -2,和/或合成HER-2/neu多肽的刺激物细胞。或者，通过克隆，可 以扩充在有HER-2/neu蛋白存在下增殖的一个或多个T细胞的数 目。克隆细胞的方法是本领域众所周知的，且包括有限稀释。扩充后， 可以将细胞施用回患者，如例如Chang等(1996) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22: 213所述。树突细胞本发明的组分(b)也可以，或者备选地，包含对本文所述多肽或融 合蛋白特异性的树突细胞(DC)。这样的细胞通常可以使用标准程 序，体外或先体外后体内制备。可以使用的方法的实例记载在 WO01/74855,其在本文中引作参考。在一个实施方案中，本发明的方法和用途中的哺乳动物是人。组分(a)的制备方法的实例根据上面提及的1999年1月8日提交的国际专利申请号 PCT/EP99/00048、并在1999年7月15日公开的WO 99/35146所述的 方法，和2001年6月28日提交的国际专利申请号PCT/US01/20706、 并在2002年1月10日公开的WO 02/02552所述的方法，并根据下述 适当实施例，可以制备式(I)化合物的游离碱、盐酸盐和二曱苯磺酸 盐。在下面的流程图1中，显示了一种这样的制备式(I)化合物的二甲 苯磺酸盐的方法。
在流程图1中，式(III)化合物的二曱苯磺酸盐的制备以4个阶段进行阶段1:指示的双环化合物和胺的反应，以产生指示的碘代喹 哇啉衍生物；阶段2:制备对应的醛盐；阶段3:制备喹唑啉二曱苯磺酸盐；和阶段4: 一水合物二曱苯磺酸盐制备。在WO00/44899 (US2002/0177567)中，描述了如何制备组分(b)的 融合蛋白的实例。本发明的方法、用途、组合和组合物可以用于施用于受癌症折磨 的患者，例如，乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌。在一个 实施方案中，癌症是erbB2-超表达的癌症，例如erbB2超表达的乳腺 癌。如本文所使用的，"治疗癌症"不要求治愈受试者。本领域技术 人员将明白，当治疗癌症时，成功的临床结果包括更长的存活时间， 更长的疾病进展时间，部分反应，以及癌症的緩解。存活蛋白作为生物标记的用途本文提供的结果表明，组合疗法(使用双EGFR/erbB2抑制剂例 如拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-Her-2/neu抗体)后，erbB2-超表达的癌 细胞的增强的肿瘤细胞的细胞凋亡，与存活蛋白的下调的关联，比与 MAPK-Erk1/2或PI3K-Akt途径的下调的关联更紧密。这提供了使用 这种组合疗法和使用存活蛋白水平作为这种组合疗法的功效的生物 标记的生物学基本原理。存活蛋白是细胞凋亡家族蛋白的抑制剂(IAP)的 一 个成员。在用单 独的拉帕替尼处理的BT474细胞中，存活蛋白蛋白表达受到抑制(图 12 A，下图)；相反地，pAb或司徒曼布对存活蛋白几乎没有作用(图 12A，下图)。将拉帕替尼与pAb或司徒曼布相组合，更大程度地抑制 BT474细胞中的存活蛋白(图12A,下图)。类似地，与单独的拉帕替 尼相比，用组合的拉帕替尼和pAb或司徒曼布处理增强BT474细胞 中的细胞凋亡(图12 A，上图)。本文使用SKBR3细胞得到的结果显 示了组合疗法后存活蛋白抑制和增加的细胞凋亡之间的类似关系，尽 管比在BT474细胞中的程度更低(图16&17)。因而，本发明的结果表明，响应于拉帕替尼和抗-ErbB2抗体的组 合的存活蛋白下调，与增强的细胞凋亡(与pErkl/2或pAkt的下调相 比)相关。在本发明的实施例中，最大程度地抑制存活蛋白的处理条件 (拉帕替尼与pAb或司徒曼布相组合)，导致显著的肺瘤细胞凋亡。因而，本发明的另一个实施方案涉及存活蛋白作为生物标记在用 双EGFR/erbB2激酶抑制剂、例如本文所述组分(a)化合物治疗癌症中
的用途。已经提示，响应于双EGFR/erbB2酪氨酸激酶抑制剂治疗的肿瘤 组织中各种特异性蛋白水平的变化，可以用于评价患者肿瘤是否对该 疗法作出响应。参见例如，WO2005/017493; WO2004/000094。本发 明的结果表明，erbB2-超表达的肿瘤细胞或组织中的存活蛋白水平可 以用于预测具有这样肿瘤的患者有利地对本文所述双EGFR/erbB2酪 氨酸激酶抑制剂治疗或本文所述组分(a)和(b)的组合治疗作出响应的 可能性。在初始治疗时间段后肿瘤细胞具有降低的(与治疗前水平相比 降低的)存活蛋白水平的患者，比在初始治疗时间段后具有未变化的 或升高的肿瘤细胞存活蛋白水平的受试者，更可能具有对这样治疗的 有利临床响应。相反地，在初始治疗时间段后具有未变化的或升高的 存活蛋白水平的受试者，具有有利临床响应的可能性更低，且可能从 替代治疗中获益。通过本领域已知的任何适当方式，可以测量存活蛋白。如本文所 使用的，受试者或患者指遭受超表达erbB2的实体瘤的哺乳动物，包 括人。如本文所使用的，对治疗的"有利临床响应，，指，本领域技术 人员公认指示肿瘤生长速率的降低的生物学或身体响应，该降低是与 在没有任何治疗的情况下发生的肿瘤生长相比的；它不意指治愈。在 治疗前生物学相关时间段，优选地在治疗前l个月、2周、IO天或I 周，评价存活蛋白的治疗前水平。经过初始治疗时间段后，重新评价 肿瘤组织的存活蛋白水平。实施例现在，参考下面的非限制性实施例，进一步描述本发明实施例1简介如下面的实施例所示，用重组dHER2蛋白接种动物，诱导对 HER2/neu分子特异性的多克隆抗体应答。本文所述实验已经显示，多克隆抗体抑制体外模型中HER2超表 达细胞的生长。本文提供的实施例评价了这些疫苗-产生的、抗-HER2多克隆抗体(pAb)与拉帕替尼( 一种对HER2/neu和EGFR分子两者特异性的酪 氨酸激酶抑制剂)的组合对超表达HER2/neu分子的人乳腺癌细胞 (BT474和SKBR3)的抗增殖作用。方法和材料 实施例2构建编码HER2/neu蛋白的表达质粒已经确立了生产重组Her2/neu糖蛋白的稳定CH0-K1细胞系。 该蛋白分泌进细胞培养基中，随后可以将其从中纯化。简而言之，从由乳房肿瘤样品制备的mRNA开始，通过RT-PCR (Clontech),扩增与HER2/neu分子胞外结构域(ECD: AA l-653)和胞 内结构域磷酸化区域(PD)(ICD: AA 991-1255 )相对应的cDNA。然后 连接2个cDNA，并克隆进pcDNA3.1潮霉素载体，并将HindII-XbaI限 制片段(2782bp长)克隆进CHO Kl-谷氨酰胺合酶表达载体(pEE141 Celltech)。该质粒称作pEE14-ECD-PD#13，也称作pRIT 15050，且使 用经典的CaP04共沉淀方法，用于稳定转染CH0-K1细胞-(源自 Lonza's MCB 024M)。在GMEM (Glasgow基本Eagle氏培养基)中选择 转染的克隆，所述GMEM不含有谷氨酰胺，补加了 5。/。胎牛血清(New Zealand)谷氨酸、天冬酰胺、核苷和作为选择试剂的30|xM MSX。基 于它的表达水平，选择一个克隆(#13002)。重组表达的蛋白是 HER2/neu生长因子受体的截短形式，它由胞外结构域(ECD)和胞内结 构域(ICD)的C-末端磷酸化部分(PD)的融合体组成，不包括跨膜部分 和受体的磷酸激酶部分。该重组dHER2蛋白可以从CHOK1细胞有 效地分泌，并从细胞培养上清液中纯化。实施例3HER2/neu蛋白纯化(dHER2)对培养收获物进行在阴离子交换Q Sepharose FF柱(Amersham)上 的层析分离，所述柱在含有150 mM氯化钠(NaCl)的20 mM Bis-Tris 丙烷緩沖液pH6.5中平衡。通过提高相同平衡緩冲液中NaCl的浓度， 从柱洗脱抗原。加入磷酸盐后，使抗原阳性洗脱物穿过2个连续亲和 柱， 一个是在40 mM磷酸盐緩冲液pH 7.0中平衡的Macro-PrepCeramic羟基磷灰石I型柱(Bio-Rad)，随后是一个在10mM磷酸盐緩 冲液pH 7.0中平衡的Blue Trisacryl plus LS柱(Biosepra)。力口入硫酸铵 (AMS)和pH调节(7.0)后，将含有抗原的Blue Trisacryl流通物(flow-through ) 注射到疏水的Ether Toyopearl 650 M柱(TosoHaas)上，后者 在含有1.2 MAMS的10mM磷酸盐緩冲液pH7.0中平衡。通过降低 相同磷酸盐緩冲液中AMS的浓度，从柱洗脱抗原。浓缩抗原阳性洗 脱物，然后在Biomax lOkDa膜(Millipore)上，对最终5mM磷酸盐緩 冲液pH7.0中进行渗滤。将超滤保留物进行纳米过滤(nanofiltration ) 步骤(Planova 15 N membrane, Asahi),然后将得到的渗透物经过0.22 l^m Durapore膜(Millipore)无菌过滤。将纯化的材料保藏在-20。C 。实施例4疫苗或免疫原性组合物在本实施例中使用的免疫原性组合物包含ECD-PD (称作Her-2/腳的"缺失"构建体，或"dHER2")蛋白，其临时配制或在注射 GSKBio专利佐剂系统前一天配制，所述系统包含与500 pgCpG寡核 普酸2006 (也称作ODN 7909) ( Coley Pharmaceutical)相混合的50 3D-MPL (Corixa， Seattle, WA, USA)、50 QS21 (Antigenics， New York, NY，USA)的脂质体制剂。实施例5 细月包系和试剂从美国典型培养物保藏中心(Manassas， VA， USA)得到BT474和 SKBR3细胞，并在补加了 10%胎牛血清的DMEM中培养。抗-人存活蛋白抗体购自RD System (Minneapolis, MN， USA)。抗 鼠IgG购自Rockland (Gilbertsville, PA, USA)。磷酸酪氨酸和肌动蛋白 的抗体购自Sigma誦Aldrich (St Louis, MO， USA)。抗誦ErbBl (Ab-12)和 抗-ErbB2 (Ab-ll)抗体购自Neo Markers (Union City, CA， USA)。抗-磷 酸-AKT (Ser 437)购自Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA， USA)。抗-Aktl/2、抗-磷酸-Erk1/2、抗-Erkl和抗-Erk2抗体购自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz， CA USA)。 司徒曼布购自 Genentech Inc. (South San Francisco, CA, USA)。 Guava PCA 96 Nesin "i式剂盒购自Guava Technologies Inc. (Hayward， CA, USA)。 SuperSignal West Femto最大灵l文度底物购自Pierce (Rockford, DL， USA)。 G蛋白 琼脂糖购自Boehringer Mannheim (德国)。按照(Cockerill等，Bioorg Med. Chem. Lett, 11: 1401-1405 (2001))所述，合成GW572016 (拉帕替尼)。 将用于细胞培养工作的拉帕替尼溶于DMSO中(Xia等，Oncogene 21: 6255-63 (2002))。实施例6 动物用在佐剂中的dHER2蛋白接种的雌性新西兰白兔，作为体外生 长抑制实验的血清来源。简而言之，用实施例4所述配制在脂质体佐 剂系统中的100吗dHER2蛋白，分别地肌内接种兔3周。在第161 天给予加强注射，且14天后取血清。在A蛋白琼脂糖凝胶上纯化血 清的IgG级分，并浓缩至10mg/ml。通过BT474细胞的免疫沉淀和蛋白印迹分析，证实了 pAb对 ErbB2的选择性超过对ErbBl和ErbB3(数据未显示)。与单克隆抗体 例如司徒曼布相反，多克隆抗体的特征在于针对靶免疫原的多个表位 的结合亲和力谱。实施例7评价细胞凋亡膜联蛋白V染色和流式细胞术用图12A、 12C、 15A和16的图例指出的浓度的DMSO、拉帕替 尼、pAb、来自免疫前兔的血清(在本文中称作'pAB免疫前，或 TA2021)、司徒曼布和/或Gefitinib，在6孔平板中处理使用膜联蛋白 V染色和流式细胞术评价的细胞。用胰蛋白酶-EDTA收获细胞后，将 在50 nl中的5000个细胞取样到96-孔微量培养板上。用溶于IX连 接蛋白(Nexin)緩冲液中的膜联蛋白V-PE和连接蛋白7-AAD,直接 在微量培养板中对细胞染色，终反应体积为200 ^d。在室温温育20 分钟后，反应样品准备好上Guava PCA-96-系统(Guava Technology, Inc., Hayward, CA USA)。在晚期细胞凋亡细胞膜破坏后，7-AAD结合细胞核材料。膜联蛋 白-V染色指示着早期细胞凋亡变化，其在丧失细胞膜完整性之前。膜
联蛋白-V与7-氨基-放线菌素D (7-AAD)的联合使用，因而可以鉴别 早期和晚期细胞凋亡细胞。将流式细胞术结果绘制成点图结果(未显示)，其中膜联蛋白v在 X-轴上，而7-AAD在Y-轴上。低膜联蛋白V和低7-AAD指示活细 胞；低膜联蛋白V和高7-AAD指示核碎片；具有高膜联蛋白V染色 的细胞指示细胞凋亡的细胞。图12 A、 12C、 15A和16中提供的图 显示了细胞凋亡的细胞(高膜联蛋白V)相对于总细胞的百分比。实施例8细胞蛋白水平SDS-PAGE和蛋白印迹分析为了评价细胞中各种蛋白的水平，如下制备全细胞提取物从培 养皿刮下细胞，在磷酸緩冲盐水(PBS)中洗涤细胞沉淀2次，然后将 沉淀重新悬浮于2倍收集细胞体积的RIPA緩沖液(150 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl, pH 7.5， 0.25% (w/v)脱氧胆酸盐，1% NP-40, 5 mM原钒酸 钠，2mM氟化钠，和蛋白酶抑制剂混合物)。使用改进的Bradford方法 (Bio-Rad Laboratory),测定蛋白浓度。通过离心，澄清细胞裂解物； 用 3pg 抗國ErbBl (Ab-13, NeoMarkers)、 抗-ErbB2 (Ab画ll， NeoMarkers)、抗-ErbB3 (C-17, Santa Cruz Biotechnology)抗体或5pg pAb和20pl A+G蛋白-琼脂糖凝胶，从200pg裂解物分别免疫沉淀 ErbBl、 ErbB2和ErbB3。通过4-15%梯度SDS-聚丙烯酰胺琼脂糖凝 胶电泳(SDS-PAGE)，分离免疫沉淀物，并通过用抗-ErbB受体抗体进 行蛋白印迹，检测ErbB受体。通过蛋白印迹，评价存活蛋白、总ErbB2、磷酸化的ErbB2 (pErbB2 或P丁yr)、总Erkl/2、激活的Erkl/2 (p-Erk)、总pErbB3、激活的 pErbB3(pErbB3)、总AKT蛋白和激活的Akt (p-Akt)蛋白的稳态水平。 使用结合多种酪氨酸-磷酸化形式的ErbB2的抗体(即该抗体不是磷酸 化位点特异性的)，评价pErbB2的水平。肌动蛋白稳态蛋白水平用作 蛋白的等量加载的对照。对于蛋白印迹，通过在还原条件下的7.5%或4-15%梯度SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳，分辨等量的蛋白。将蛋白转移至Immobilon-P或 硝酸纤维素膜。通过丽春红S染色，评价效率和蛋白的等量加载。在 含有4% (w/v)低脂乳或3% BSA (w/v)的TBS (25 mM Tris-HCl,pH 7.4，150mMNaCl，2.7mMKCl)中，封闭膜1小时。然后用识别靶蛋白的 特异性抗体探测膜，用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物试剂 盒(Pierce)或Odyssey红外成像系统(LI-COR， Lincoln, NE USA)使其显现。实施例9体外生长抑制测定(抗增殖)使用pH]胸苷掺入方法，评价了疫苗诱导的抗HER2多克隆抗体 (pAb)与拉帕替尼组合对超表达HER2/neu分子的人乳腺癌细胞 (BT474和SKBR3细胞)的抗增殖作用。简而言之，将10e4细胞一式 三份地以200|11接种进96-孔板，并在37。C在下述培养基中温育72小 时1) 培养基；2) 培养基，只含有拉帕替尼(0.01 ^M);3) 培养基，只含有pAb(50|xg/ml);4) 培养基，含有免疫前pAb(TA2021)(50pg/ml);5) (2)拉帕替尼(0.01 pM)和(3)pAb(50^ig/ml)的组合；或6) (2)拉帕替尼(0.01 一 )和(4)免疫前pAb (TA2021) (50|xg/ml) 的组合。加入lpCi的卩H]胸苷(5Ci/mmol; Amersham)另夕卜24小时，此后， 通过胰蛋白酶消化将细胞收获在滤板上，并在P计数器中计数掺入的 放射性。以cpm为单位表达结果，并参考培养基计算生长抑制百分 比。为拉帕替尼和pAb两者确立剂量范围曲线(数据未显示)。选择每 种组分的亚适量，包括仅仅10-30%生长抑制，以能观察潜在的加性或 协同作用。来自未接种的兔的纯化IgG(pAb免疫前)用作这些测定的阴性对照、。独立地进行实验至少3次，且在图IIA和11B中，」提供了一个代 表性实验的 一 式三份孔的组合数据。实施例10
结果抗增殖作用用在强佐剂中配制的重组dHER2蛋白免疫接种兔诱导对 HER2/neu分子特异性的多克隆抗体应答。评价了这些抗HER2多克 隆抗体(pAb)与拉帕替尼( 一种对HER2/neu和EGFR分子特异性的 酪氨酸激酶抑制剂)的组合对超表达HER2/neu分子的人乳腺癌细胞 (BT474和SKBR3)的抗增殖作用。数据显示在图11A和11B中。实施例11:结果(细胞凋亡和蛋白水平)在图12A、 12C、 12D、 13、 14、 15A、 15B、 15C、 16和17中显 示的所有结果都代表至少3个独立实验。从图12 A、 B和C可以看出，拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)协同以诱导ErbB2 (HER-2/neu)超表达的BT474细胞的细胞凋亡。图12A显示了用下述物质处理指数生长的BT474的结果(i)单 独的DMSO (拉帕替尼的阴性对照)(ii)拉帕替尼(0.1 pM)， (iii) pAb (100ng/ml)， (iv)拉帕替尼和pAb， (v)TA2021 (100|xg/ml), (vi)拉帕 替尼和TA2021, (vii)司徒曼布(10pg/ml)，或(viii)拉帕替尼和司徒曼 布。72小时后，使用膜联蛋白V染色和流式细胞术，评价细胞凋亡。 72小时后，还使用蛋白印迹评价激活的磷酸-ErbB2 (p-ErbB2)、总 ErbB2和存活蛋白的稳态蛋白水平(图12 A，下图)。肌动蛋白稳态蛋 白水平用作蛋白的等量加载的对照。用载体(DMSO)或TA2021处理的 BT474细胞分别用作拉帕替尼和pAb的对照。图12B显示了使用相差显微镜术看到的各种处理条件对BT474 细胞生长的作用(72小时后)。处理条件包括关于图12A所述的那些， 以及另夕卜，gefitinib (Iressa) (0.1 jiM); gefitinib (O.lpM)和pAB (100(ig/ml); gefitinib (O.lpM)和TA2021 (lOOpg/ml);和gefitinib O.ljxM 和司徒曼布(10叫/ml)。图12C显示了使用膜联蛋白V染色和流式细胞术测得的，递增浓 度的单独的pAb或与拉帕替尼(100nM)组合的pAb对BT474细胞的 细胞凋亡的作用。图12D显示了通过蛋白印迹评价的递增条件的单独的pAb或与拉 帕替尼(100nM)组合的pAb处理的细胞中总ErbB2和p-ErbB2的稳态蛋白水平。肌动蛋白稳态蛋白水平用作蛋白的等量加载的对照。图13显示拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)引起 Erkl/2和Akt的激活状态的调控。在所述处理条件下，培养指数生长 的BT474细胞72小时。通过蛋白印迹，评价总Erkl/2、激活的磷酸 -Erkl/2、总Akt和激活的磷酸-Akt的稳态蛋白水平。用载体(DMSO) 或单独的TA2021处理的细胞用作对照。图14显示了拉帕替尼和疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)对 ErbB3的激活状态的作用。在所示的各种处理条件下，培养BT474细 胞。72小时后，收集细胞裂解物，并通过蛋白印迹评价总ErbB3和激 活的磷酸-ErbB3的稳态蛋白水平。图15显示了拉帕替尼和gefitinib之间与疫苗-诱导的抗-HER-2/neu抗体(pAb)协同诱导BT474细胞的细胞凋亡和调节存活蛋白的能 力的差异。Gefitinib (Iressa或zdl839)是EGFR蛋白酪氨酸激酶的抑 制剂。图15A显示了在指定的处理条件下，使用在指数生长期培养72 小时的BT474细胞得到的结果。使用膜联蛋白V染色和流式细胞术， 评价细胞凋亡。图15 B显示了在指定的处理条件下培养的BT474细胞中72小时 后总ErbB2、 p-ErbB2和存活蛋白的稳态蛋白水平的蛋白印迹分析结果。图15C显示了处理72小时后通过蛋白印迹评价的指定的处理条 件对BT474细胞中总Erkl/2、 p-Erkl/2、总Akt和p國Akt的稳态蛋白 水平的作用。图16显示了指定的处理条件对SKBR3细胞的作用。72小时后， 使用膜联蛋白V染色和流式细胞术，评价细胞凋亡。图H显示了处理72小时后指定的处理条件对SKBR3细胞中存 活蛋白的作用。图18显示了拉帕替尼和抗-HerJ/neu抗体对SkbR3细胞中 pTyr/ErbB12和下游生物标记的作用，如指示的。从上面讨论的图可以看出，使用拉帕替尼、pAb或司徒曼布作为 单一疗法的治疗，导致与对照(DMSO， TA2021)相比细胞凋亡的轻微 增加(图12A上图)。与任一种单独处理相比，将拉帕替尼与pAb或司 徒曼布相组合，导致增强的肿瘤细胞的细胞凋亡(图12A，上图)。升高pAb的浓度本身，对细胞凋亡具有微弱的作用(图12C)。当与固定 浓度的拉帕替尼相组合时，增加pAb的浓度导致增强的B474细胞的 细胞凋亡(图12C)。类似地，将拉帕替尼与pAb相组合也增强SKBR3 细胞(另一种ErbB2-超表达的乳腺癌细胞系)的细胞凋亡，尽管比在 BT474细胞中观察到的弱(图16)。从上面讨论的图也可以看出，单独的拉帕替尼抑制激活的、磷酸 化的ErbB2蛋白(pErbB2)的稳态水平，而不影响总ErbB2蛋白(图 12A，下图)。拉帕替尼也降低pErkl/2和pAkt的稳态水平(图13)。相 反地，pAb显著抑制总ErbB2蛋白，而不影响磷酸化的(激活的)ErbB2 (图12A，下图)。磷酸-Erkl/2和pAkt也受到pAb的显著抑制(图13)。 在本研究中，司徒曼布对总ErbB2的作用比pAb更小，尽管它轻微抑 制pErbB2 (图12 A，下图)。另外，pErkl/2和pAkt也受到司徒曼布 的抑制，尽管比用pAb观察到的弱(图13)。与单独的拉帕替尼相比， 组合拉帕替尼与pAb,导致pErbB2的进一步抑制(图12A,下图)。拉 帕替尼与司徒曼布的组合，除了抑制pErkl/2和pAkt以外，完全抑制 pErbB2稳态蛋白水平(图12 A，下图)。将pAb的浓度从20升高至 100-200 (^ig/ml，不导致总ErbB2蛋白的增强的抑制，但是导致pErbB2 的增强的抑制，尤其在高浓度的pAb时。结论如图11 A和B所示，分别使用50 pg/ml的疫苗-诱导的抗-HER2/neu多克隆血清和0.01 pM拉帕替尼，仅仅观察到两种细胞系 的适度生长抑制。组合疫苗-诱导的抗HER2/neu抗体(pAb)和拉帕替尼，导致比单一 试剂处理更显著的生长抑制。该组合显示出对BT474和SKBR3 Her2/neu超表达细胞系的协同(大于加性)生长抑制作用。
权利要求
1.治疗哺乳动物癌症的方法，其包含给所述哺乳动物施用治疗有效量的(a)式I、II、III或IV化合物，和/或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，其中R1是Cl或Br；X是CH、N或CF；且Het是噻唑或呋喃；和(b)免疫原性组合物，其包含分离的蛋白，所述蛋白包含至少一个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。
2. 权利要求l的方法，其中R!是C1; X是CH;且Het是呋喃。
3. 权利要求l的方法，其中R,是Br; X是CH;且Het是呋喃。
4. 权利要求l的方法，其中R,是C1; X是CH;且Het是噻唑。
5. 权利要求l的方法，其中所述组分(a)是式II化合物。
6. 权利要求l的方法，其中所述组分(a)和组分(b)同时施用。
7. 权利要求l的方法，其中所述组分(a)和组分(b)先后施用。
8. 药物组合，其包含治疗有效量的(a) 式I、 II、 III或IV化合物，和/或其盐、溶剂化物或生理功能 衍生物，其中R,是Cl或Br; X是CH、 N或CF;且Het是p塞唑或呋 喃5 和(b) 免疫原性组合物，其包含分离的蛋白，所述蛋白包含至少一 个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷酸。
9. 药物组合物，其包含权利要求8的组合。
10. 权利要求8或9所述的药物组合物或组合，其用于治疗。
11. 权利要求8至9中任一项所述的药物组合物或组合在制备治 疗癌症的药物中的用途。
12. 药物组合在制备治疗个体的癌症的药物中的用途，所述药物 组合包含治疗有效量的式I、 II、 III或IV化合物和/或其盐、溶剂化物 或生理功能衍生物，其中该个体已经被施用免疫原性组合物，其包含 至少一个来自HER-2/neu蛋白的表位，或编码这样的蛋白的多核苷 酸。
13. 根据任一项前述权利要求的方法、组合、组合物或用途，其 中所述免疫原性组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含与HER-2/neu磷酸化结构域融合的HER-2/neu胞外结构域。
14. 根据权利要求1-13中任一项的方法、组合、组合物或用途， 其中所述免疫原性组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含与HER-2/neu胞内结构域融合的HER-2/neu胞外结构域。
15. 根据任一项前述权利要求的方法、组合、组合物或用途，其 中所述免疫原性组合物包含佐剂。
16. 根据权利要求15的方法、组合、组合物或用途，其中所述 佐剂包含下述一种或多种胆固醇；水包油乳剂；水包油乳剂低剂量； 生育酚；脂质体；皂苷；3D-MPL和免疫刺激寡核苷酸。
17. 根据权利要求16的方法、组合、组合物或用途，其中所述 佐剂包含皂苷，以及免疫刺激寡核苷酸。
18. 根据权利要求16的方法、组合、组合物或用途，还包含脂 多糖。
19. 根据权利要求17或18的方法、组合、组合物或用途，其中 所述皂苷是QS21。
20. 根据权利要求17-19的方法、组合、组合物或用途，其中所 述脂多糖选自i. 单磷酰脂质Aii. 3 -0 -脱酰基单磷酰脂质Aiii. 二磷酰脂质A。
21. 权利要求17-20中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所 述免疫刺激寡核苷酸含有至少2个CpG基序。
22. 权利要求17-21中的任一项所述的免疫原性组合物，其中所 述免疫刺激寡核苷酸选自SEQ ID No 22 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) SEQ ID No 23 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)SBQ ID No 24 - ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG SEQ ID No 25 - TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) SEQ ID No 26 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1(568)
23. 权利要求17-22中的任一项所述的组合物，其中配制所述急 普以形成ISCOMS或脂质体。
24. 权利要求17-23中的任一项所述的组合物，其中所述皂苷存 在于水包油乳剂中。
25.根据任一项前述权利要求的方法、组合、组合物或用途，其中所述至少一个表位来自HER-2/neu蛋白的胞外区。
全文摘要
描述了一种治疗癌症的方法，其包含施用4-喹唑啉胺和靶向HER-2/neu分子的疫苗，以及一种药物组合，其包含4-喹唑啉胺和靶向HER-2/neu分子的疫苗。
文档编号A61K31/517GK101115499SQ200580047916
公开日2008年1月30日 申请日期2005年12月8日 优先权日2004年12月10日
发明者C·E·M·布鲁克, C·M·G·格拉尔 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司